DE4192335C2

DE4192335C2 - T-Zell-Epitope

Info

Publication number: DE4192335C2
Application number: DE4192335A
Authority: DE
Inventors: Gregory John Russel-Jones; Andrew Francis Geczy
Original assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Current assignee: Biotech Australia Pty Ltd
Priority date: 1990-09-18
Filing date: 1991-09-17
Publication date: 1996-02-08
Anticipated expiration: 2011-09-18
Also published as: WO1992005192A1; US5928644A; US5500366A; CH683101A5; DE4192335T1

Description

Technisches Fachgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte oder synthe tische Sequenzen von oder abgeleitet von TraT (einem Protein molekül, isoliert aus der äußeren Membran von bestimmten Stäm men von Escherichia coli) die als T-Zell-Epitope wirken. Sol che Sequenzen können bei der Herstellung von denjenigen Impf stoffen eingesetzt werden, bei denen Trägerpeptide verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern gegen ein Immunogen zu steigern und/oder starke zellvermittelte Immunität gegen das Immunogen zu stimulieren, wodurch die Verwendung von grö ßeren Trägerproteinmolekülen vermieden wird.

Stand der Technik

Die Erzeugung einer Immunantwort gegen einen Krankheits erreger (bakteriell, viral oder parasitär) hängt in erster Li nie von der Einwirkung des geeigneten Stimulus auf das Immun system des Wirtes ab. Der Krankheitserreger oder das infektiö se Agens führt mehrere immunstimulierende Verbindungen oder Antigene in den Wirt ein, diese sind üblicherweise große Mole küle, wie z. B. Proteine, Polysaccharide oder Glykoproteine. Diese Antigene können einen oder mehrere verschiedene Reak tionstypen im Wirt auslösen, die den eindringenden Organismus zerstören oder eliminieren sollen. Demgemäß kann das Antigen T-Zellen stimulieren, welche die zellvermittelte Immunität be reitstellen, und/oder ein Antigen kann B-Zellen stimulieren, um die Synthese und Ausschüttung von Antikörpern in Gang zu bringen (humorale Immunität). Die Entwicklung und Aufrechter haltung der schützenden Immunantwort des Individuums auf ein fremdes Antigen ist üblicherweise davon abhängig, daß ein kri tischer Wert der Stimulation von zellvermittelter und auch hu moraler Immunität erreicht wird.

Bei der Erzeugung einer schützenden Immunantwort ist häu fig ein bestimmter T-Zelltyp, eine T-Helferzelle, erforder lich, um die B-Zelle bei Wachstum und Sekretion von löslichem Antikörper zu unterstützen. Diese T-Helferzellen treten auch mit den Antigenen in Wechselwirkung und erkennen sie auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen, wie z. B. Makro phagen, und vermitteln durch Freisetzung von löslichen Fakto ren (Cytokinen) die Aktivierung und Differenzierung von B-Zel len.

Bestimmte kleine Moleküle, die Haptene genannt werden und beispielsweise kurze Peptide sind, sind üblicherweise schwach immunogen, während größere Moleküle, wie z. B. Proteine und ei nige Polysaccharide, üblicherweise so immunogen sind, daß sie eine befriedigende schützende Antwort auslösen. Zur Lösung der Probleme bei der Induktion von Immunität gegen schwach immuno gene Moleküle wurden Versuche unternommen, ihre Immunogenität zu steigern, indem sie an "Träger"-Moleküle gebunden wurden. Diese Träger sind üblicherweise immunogene Proteine, die wir ken, indem sie die kooperative T-Zell-Wirkung stimulieren, die bei naturgemäß immunogenen Molekülen auftritt. Das heißt, wenn ein schwach immunogenes Antigen an einen Träger gebunden wird, kann es die Hilfe der T-Zellen bei der Produktion von Antikörpern auslösen. Aufgrund der Reaktion der T-Zellen mit den Trägerdeterminanten beginnen die B-Zellen damit, Antikör per nicht nur gegen den Träger selbst sondern auch gegen die gebundene antigene Determinante zu produzieren.

Das Trägerprinzip gilt zwar allgemein als wirksames Ver fahren, um die Wirksamkeit von Impfstoffen zu verbessern, die Zahl solcher Proteine, die zur Verwendung als mögliche Träger proteine für den Einsatz beim Menschen zugelassen sind, ist jedoch relativ begrenzt. Diese umfassen Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid. Die begrenzte Zahl von verfügbaren Träger proteinen bedeutet, daß eines dieser Proteine bei einer großen Zahl von Impfstoffprodukten eingesetzt wird und daß durch mehrfache Immunisierungen mit Produkten, die an diese Träger konjugiert sind, die Wahrscheinlichkeit steigt, daß uner wünschte Reaktionen gegen diese Träger auftreten. Außerdem sind diese Träger hauptsächlich nicht aufgrund ihrer immun stimulierenden Eigenschaften ausgewählt worden sondern eher deshalb, weil sie bereits für den Einsatz beim Menschen zuge lassen waren. Somit ist klar, daß ein anderer Träger als die bisher in konjugierten Impfstoffen benützten Träger benötigt wird, der die mit diesen Impfstoffen einhergehenden immunolo gischen Probleme löst und trotzdem die gleiche oder eine ver besserte Immunogenität wie die Impfstoffe aufweist, die gegen wärtig in Verwendung sind.

Während des letzten Jahrzehnts wurde deutlich, daß von T- Zellen vorzugsweise bestimmte Proteinfragmente, und nicht das gesamte Proteinmolekül, in Assoziation mit einem geeigneten Selbst-(Klasse I- oder Klasse II-)Antigen erkannt werden. Diese Fragmente sind als T-Zell-Epitope bekannt, und ihre Co- Erkennung (d. h., in Verbindung mit bestimmten Klasse I- oder Klasse II-Molekülen) durch T-Zellen stellt die "T-Zell-Hilfe" sicher, wodurch eine B-Zelle aktiviert und deren Differenzie rung zur Sekretion von Antikörper ausgelöst wird.

Es ist allgemein anerkannt, daß die T-Zell-Erkennung von Proteinen komplexer ist als die Antikörperbindung und daß man die Vorgänge außerdem schlechter versteht, obwohl unser Wissen über die T-Zell-Epitope kürzlich Fortschritte gemacht hat. Mitte der achtziger Jahre wurde jedoch vermutet, daß T-Zell- Determinanten (Epitope) dazu tendieren, stabile helikale Strukturen zu bilden, wobei sich die hydrophilen Gruppen auf der einen Oberfläche der Helix aufreihen, während sich die hydrophoben Reste auf der gegenüberliegenden Oberfläche auf reihen. In diesem Modell wird vorgeschlagen, daß die hydro phobe Oberfläche normalerweise in Assoziation mit dem MHC-An tigen gefunden wird, während die hydrophilere Oberfläche dem T-Zell-Rezeptor dargeboten wird. Demgemäß wurde ein Al gorithmus entwickelt, um eine gegebene Proteinsequenz für Be reiche mit einer Neigung zur Bildung von helikalen amphipathi schen Strukturen zu suchen, und dieser wurde auf mehrere Pro teinmodelle angewendet (De Lisi und Berzofsky, PNAS 82, 1985, 7048). Im Gegensatz dazu bestehen einige Forscher darauf, daß T-Zell-Determinanten mit ß-Schleifen innerhalb des Proteins assoziiert sind. Diese Algorithmen haben jedoch häufig keinen Erfolg beim Aufspüren von T-Zell-Epitopen, im Gegenteil, sie selektieren häufig Sequenzen, die nicht als T-Zell-Epitope wirken. Außerdem können diese Algorithmen nicht verwendet wer den, um die Stärke oder Kreuz-Spezies-Funktionalität von aus gewählten Sequenzen zu definieren. Eine allumfassende Hypothe se darüber, welche Faktoren für die Vorhersage von T-Zell-Epi topen wichtig sind, muß erst noch aufgestellt werden, außerdem ist sowohl die Identifizierung solcher Epitope als auch die Bestimmung ihrer Stärke eine noch sehr empirische Übung. Ob wohl noch nicht klar ist, was eine T-Zelle erkennt, besteht bei mehreren Gruppen unter Verwendung von verschiedenartigen Modellen Übereinstimmung, daß ein Bereich mit einer Länge von 7 bis 17 Aminosäureresten für die Erkennung erforderlich ist.

T-Zell-Epitope aus Diphtherie-Toxin, Tetanus-Toxin und kreuzreagierendem Material von Diphtherie-Toxin wurden in PCT/US89/00388 beschrieben. Sie unterscheiden sich von den T- Zell-Epitopen dieser Erfindung.

In einer früheren Arbeit (PCT/AU87/00107) wurden mehrere integrale Membranproteine auf ihre Fähigkeit untersucht, Serumantikörperantworten in Abwesenheit von Adjuvans zu er zeugen. Es wurde gezeigt, daß diese Proteine, die TraT umfas sen, hohe Serumantikörpertiter in Mäusen, Ratten, Meerschwein chen und Kaninchen stimulieren. Die Antikörpertiter, die durch Injektion von TraT in Kochsalzlösung ausgelöst werden, werden durch Zusatz von Adjuvantien auf Öl-Basis, wie z. B. inkom plettem Freundschen Adjuvans (FIA) oder Montanide/Marcol, nicht signifikant erhöht. Die kovalente Anknüpfung von Rinder serumalbumin oder der Dinitrophenylgruppe oder eines Peptid antigens an TraT führt zu einer signifikanten Steigerung der Immunantwort auf das konjugierte Material im Vergleich zu der Antwort, die erhalten wird, wenn das Immunogen ohne Adjuvans oder nicht an TraT konjugiert injiziert wird. Die Antikörper antwort auf diese Konjugate wird durch Zusatz von FIA nicht signifikant erhöht. TraT ist ein selbst als Adjuvans wirkendes Trägermolekül, das hohe Antikörpertiter sowohl gegen sich selbst als auch gegen daran angeknüpfte Moleküle erzeugen kann.

Aus der Literaturstelle Molecular Microbiology 1990, 4(8), S. 1259-1268, gehen strukturelle Eigen schaften eines TraT-Proteins hervor. Dieses Protein ist geeignet, als Vehikel für den Transport fremder antigener Determinanten zur Zelloberfläche von E. coli Zellen zu dienen. Ferner werden in der ge nannten Literaturstelle B-Zellen-Epitope beschrie ben, die als monoklonale Antikörper erkannt werden. Die Literaturstelle bezieht sich daher auf Berei che, die durch Antikörper identifiziert werden, und zwar insbesondere auf monoklonale Antikörper. Diese Bereiche sind als solche gesehen B-Zellen-Epitope.

Abkürzungen

AlOH - Aluminiumhydroxid
CPM - Impulse pro Minute
DEAE - Diethylaminoethyl
DMF - Dimethylformamid
DT - Diphtherie-Toxoid
EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure
FIA - Inkomplettes Freundsches Adjuvans
HPLC - Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
FCS - Fetales Kälberserum
LAL-Test - Limulus Amoebocyt-Lysat-Test
LHRH - luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon
LIP - Liposom
LPS - Lipopolysaccharid
MBS - m-Maleinimidobenzoesäure-n-hydroxysuccinimidester
PBS - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
PHA - Phytohämagglutinin
PMSF - Phenylmethylsulfonylfluorid
QA - Qualitätssicherung
QC - Qualitätskontrolle
RPMI - Gewebekulturmedium
RT - Raumtemperatur
SAP - Saponin
SDS - Natriumdodecylsulfat
SDS-PAGE - Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
TFA - Trifluoressigsäure
VYDAC - Warenzeichen von Chromatographiesäule
ZWIT - Zwittergent

Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß isolierte Peptidsequenzen von oder abge leitet von TraT, die selbst unerwartet hohe immunstimulierende Eigenschaften in verschiedenen Arten aufweisen, sind identi fiziert und verwendet worden. Die hier beschriebenen spezifi schen Sequenzen T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 4 bzw. 6) werden von mehreren phylogenetisch verschiedenen Arten, einschließlich Primaten, erkannt.

Nach Wissen der Erfinder sind T-Zell-stimulierende Pep tidsequenzen, die mehrere Speziesgrenzen überschreiten, bisher noch nicht beschrieben worden.

Der Befund, daß TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) ein starkes, selbst als Adjuvans wirkendes Trägermolekül war, führte die Erfinder dazu, in Betracht zu ziehen, daß es besondere Peptid sequenzen innerhalb dieses Proteins geben könnte, die von T- Zellen bevorzugt erkannt werden. Als Ergebnis der genauen Prü fung des TraT-Moleküls und der Betrachtung von Faktoren, wel che die Aktivität als T-Zell-Epitop steigern können, wurden sieben, vom TraT-Molekül abgeleitete Peptide synthetisiert und sodann in T-Zell-Proliferations-Tests unter Verwendung von T- Zellen aus verschiedenartigen Tieren getestet, die mit dem na türlichen TraT-Molekül in Kochsalzlösung immunisiert worden waren. In den vier untersuchten Tierarten wurde ein hierarchi sches Muster der Ansprechbarkeit auf die Peptide beobachtet, insbesondere zeigten vier der Peptide (T1, T2, T4, T6: SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 4 bzw. 6) sehr starke Antworten in allen vier ge testeten Arten. Da diese Peptidsequenzen mehrere Spe ziesgrenzen überschreiten, besteht die Möglichkeit, daß sie von T-Zellen sowohl innerhalb der Art als auch außerhalb der Art erkannt werden.

Die Aminosäuresequenz der sieben Moleküle sind:

T1: GlyAlaMetSerThrAlaIleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGln MetSerGluThrIleTrpLeuGlu (SEQUENZ ID-Nr. 1)
T2: GlyLeuGlnGlyLysIleAlaAspAlaValLysAlaLysGly (SEQUENZ ID-Nr. 2)
T3: SerGlnTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAlaAlaLeu GlyAlAGlyIleThrGly (SEQUENZ ID-Nr. 3)
T4: GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAsp ValAsn (SEQUENZ ID-Nr. 4)
T5: AspValGlnIleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsnVal AlaAlaLeuArgGln (SEQUENZ ID-Nr. 5)
T6: SerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGlnThrArgValValSerAsn AlaAsnLys (SEQUENZ ID-Nr. 6)
T7: LysValAsnLeuLysThrGluGluAlaLysProValLeuGluAspGlnLeu AlaLys (SEQUENZ ID-Nr. 7)

Die TraT-Sequenzen, welche diesen Molekülen entsprechen, sind in Fig. 5 dargestellt und sehen folgendermaßen aus:

TraT(T1)
GlyAlaMetSerThrAlaIleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGlnMetSerGluThrIleTr-pLeuGlu
	(SEQUENZ ID-Nr. 1)
TraT(T2)	GlyLeuGlnGlyLysIleAlaAspAlaValLysAlaLysGly
	(SEQUENZ ID-Nr. 2)
TraT(T3)	GluSerGlnGlyTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAlaAlaLeuGlyAlaGlyIl-eThrGly
	(SEQUENZ ID-Nr. 23)
TraT(T4)	GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAspValAsn
	(SEQUENZ ID-Nr. 4)
TraT(T5)	AspValGlnIleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsnValAlaAlaLeuArgGln
	(SEQUENZ ID-Nr. 5)
TraT(T6)	SerThrGluThrGlyAsnGlnHisLysTyrGlnThrArgValValSerAsnAlaAsnLys
	(SEQUENZ ID-Nr. 24)
TraT(T7)	LysValAsnLeuLysPheGluGluAlaLysProValLeuGluAspGlnLeuAlaLys
	(SEQUENZ ID-Nr. 25)

T1, T2, T4 und T5 sind identisch mit den Sequenzen, die in der natürlichen TraT-Sequenz erscheinen. T3, T6 und T7 sind im Vergleich zu TraT(T3), TraT(T6) und TraT(T7) modifiziert. In T3 sind die vier aminoterminalen Reste GluSerGlnGly von TraT(T3) durch SerGln ersetzt. In T6 ist der Lys-Rest aus Po sition 9 von TraT(T6) durch His ersetzt. In T7 ist der Phe- Rest aus Position 6 von TraT(T7) durch Thr ersetzt. Diese Ab änderungen der natürlichen Sequenzen wurden durchgeführt, um die Aktivität dieser Peptide als T-Zell-Epitope zu erhöhen.

Gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Er findung wird ein T-Zell-Epitop bereitgestellt, das einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins TraT umfaßt.

Typischerweise ist das T-Zell-Epitop Spezies-übergreifend wirksam.

Spezifische T-Zell-Epitope der vorliegenden Erfindung um fassen Teile von TraT mit Aktivität als T-Zell-Epitope oder Derivate davon, wie z. B. T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 4 und 6), welche die vorstehend beschriebenen Sequenzen aufweisen.

Jedes der erfindungsgemäßen T-Zell-Epitope kann modifi ziert werden. Erfindungsgemäße Modifikationen umfassen die Ad dition eines N-terminalen Pyroglutaminsäurerestes, die Sub stitution eines N-termialen Glutaminsäurerestes durch einen Pyroglutaminsäurerest und/oder die Addition oder Substitution eines C-terminalen Cysteinamids und außerdem die in T3, T6 und T7 durchgeführten und vorstehend beschriebenen spezifischen Modifikationen. Modifizierte T-Zell-Epitope der Erfindung fal len in den Rahmen der vorliegenden Erfindung und sind in der Bezeichnung "T-Zell-Epitop" enthalten, wenn ihre Verwendung hier geeignet ist, und sie sind auch in Bezugnahmen auf be sondere T-Zell-Epitope der Erfindung enthalten, sofern diese geeignet sind. Bei der Herstellung von erfindungsgemäßen Fu sionsproteinen können Modifikationen zum Epitop, wobei innen liegende Aminosäuren oder terminale Reste geändert werden, posttranslational oder in der codierenden Sequenz durchgeführt werden, wie es geeignet ist. Bei den Modifikationen sollte die Aktivität des parentalen Moleküls als T-Zell-Epitop erhalten bleiben.

Die Erfindung stellt auch einen Komplex bereit, der min destens ein T-Zell-Epitop der ersten Ausführungsform umfaßt, das an mindestens ein Immunogen gebunden ist, wobei das Immu nogen und das Epitop so verbunden sind, daß das mindestens eine T-Zell-Epitop noch als T-Zell-Epitop wirken kann und das mindestens eine Immunogen noch mindestens eine antigene Deter minante darbietet, gegen die eine Immunantwort ausgelöst wer den kann.

Die Erfindung stellt ferner einen Impfstoff bereit, der einen erfindungsgemäßen Komplex in Kombination mit einem phar mazeutisch verträglichen Träger, Exzipienten, Verdünnungsmit tel und/oder Adjuvans umfaßt.

Die erfindungsgemäßen Komplexe können über verschiedene Wege hergestellt werden. Sie können direkt oder durch chemi sche Kupplung unter Verwendung von geeigneten Bindungs- oder Kupplungsmitteln oder durch Modifikation von Resten zur Be reitstellung von Bindungsstellen hergestellt werden. Sie kön nen auch mit rekombinanten Mitteln als Fusionsproteine her gestellt werden.

Das mindestens eine "Immunogen", das Teile eines erfin dungsgemäßen Komplexes ausmacht, ist ein beliebiges Molekül, dessen Verwendung für die Auslösung einer Immunantwort wün schenswert ist. Typischerweise ist das mindestens eine "Immu nogen" ein Molekül, das schwach immunogen ist, jedoch sind auch immunogene Moleküle nicht ausgeschlossen. Das mindestens eine "Immunogen" umfaßt Peptide, Oligosaccharide, Polypeptide, Polysaccharide, und spezifische Beispiele umfassen: Zirkum sporozoit-Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum (CSP); das synthetische Immunogen NH₂ Cys (Asn Pro Asn Ala)₄ (SEQUENZ ID-Nr. 8) abgeleitet von CSP; das ganze oder einen Teil von luteinisierendem Hormon oder Somatostatin; und immunogene Proteine, die vollständig oder ein Teil sind von: dem 5-Pro tein von Hepatitus B-Virus; dem AIDS-Virus; Influenza-Virus; oder Maul- und Klauenseuche-Virus; Inhibin und FSH.

Hinsichtlich der Konstruktion von Fusionproteinen stellt die Erfindung ein hybrides erstes Polynucleotidmolekül bereit, das aus dem Folgendem besteht: einer Polynucleotidsequenz, die als codierende Sequenz für mindestens ein erfindungsgemäßes T- Zell-Epitop wirkt, fusioniert an eine Polynucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz von mindestens einem Immunogen co diert.

Das hybride Polynucleotidmolekül kann Sequenzen umfassen, die das Folgende codieren: mindestens ein isoliertes T-Zell- Epitop der Erfindung, das an mindestens ein Immunogen fusio niert ist; mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop, das innerhalb eines Immunogens eingefügt ist; oder das ganze oder ein Teil des TraT-Moleküls mit dem mindestens einen Immunogen, das angrenzend an ein erfindungsgemäßes T-Zell- Epitop eingefügt ist.

Es ist klar, daß nach Bereitstellung einer Sequenz, die ein bestimmtes Fusionsprotein von Interesse codiert, für einen Fachmann die Möglichkeit besteht, diese Sequenz auf solche Weise zu verändern, daß sie immer noch ein Fusionsprotein mit der Aktivität des parentalen Fusionsproduktes codiert. Ein Grund dafür, warum solche veränderten Fusionsproteine herge stellt werden können, besteht in der Degeneration des geneti schen Codes. Ferner wird einem Fachmann klar sein, daß es mög lich ist, Codons für Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften an bestimmten Stellen innerhalb eines Proteins zu substitu ieren, ohne die Aktivität des Moleküls im Vergleich zum paren talen Molekül zu beeinträchtigen. Ferner kann ein wünschens wertes Fusionsprodukt oder ein wünschenswerter Komplex nach seiner Identifizierung durch Einschluß von Multimeren des T- Zell-Epitops und/oder Immunogen und/oder Einführung von weite ren erfindungsgemäßen T-Zell-Epitopen modifiziert werden. Sol che veränderten Moleküle liegen auch im Umfang dieser Erfin dung.

Bevorzugte hybride Polynucleotidsequenzen sind DNA-Se quenzen.

Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Sequenzen, die mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop codieren, an eine DNA-Sequenz, die die Aminosäuresequenz des mindestens einen Immunogen codiert, auf solche Weise gebunden, daß das resultierende TraT-Fusionsprotein auf der Zelloberfläche des Wirts erscheint und dort dargeboten wird.

Eine erfindungsgemäße hybride DNA-Sequenz, die an einen portablen Promotor fusioniert ist, bildet ein fusioniertes Gen. Ein derartiger Promotor ist z. B. der P_L-Promotor des Bakte riophagen Lambda.

Ein rekombinantes DNA-Molekül kann eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz und Vektor-DNA umfassen. Der Vektor ist typischerweise Plasmid-, Bakteriopha gen-, virale oder Cosmid-DNA.

Ein rekombinantes DNA-Molekül kann eine Expressionskontrollsequenz, die mit der er findungsgemäßen DNA-Sequenz funktionell verbunden ist, enthalten.

Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz kann in einem Verfahren zur Herstel lung eines rekombinanten DNA-Moleküls verwendet werden, wobei dieses Verfahren den Schritt umfaßt, in dem eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Vektor-DNA eingeführt wird.

Das Verfahren umfaßt vorzugsweise außerdem den Schritt, wobei eine Expressionskontrollsequenz in den Vektor eingeführt wird.

Die Erfindung stellt außerdem einen transformierten Wirt mit der genetischen Information zur Biosynthese eines Komple xes bereit, der mindestens ein Immunogen und mindestens ein erfindungsgemäßes T-Zell-Epitop umfaßt, so daß das resultie rende Fusionspeptid auf der Oberfläche der Wirtszelle darge boten wird.

Jedoch können auch transformierte Wirte verwendet werden, welche das Fusionsprodukt nur intrazellulär exprimieren, wobei das Fusionsprodukt aus den Zellen nach Standard-Reinigungsver fahren gereinigt wird.

Geeignete Wirte umfassen prokaryotische oder eukaryoti sche Zellen, einschließlich: Bakterien, z. B. E. coli, Pseudo- Inonas-Arten, Salmonella-Arten und Bacillus-Arten; Hefen oder andere Pilze, z. B. Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus- Arten; Insektenzellen, z. B. Zellinien, die aus Spodoptera fru giperda und Bombyx mori stammen; und Säugerzellen, z. B. Ovar- Zellen des Chinesischen Hamsters und andere Zellinien.

Der transformierte Wirt wird durch ein Verfahren zur Transformation eines Wirts erhalten, das den Schritt umfaßt, wobei ein vorgenanntes rekombinantes DNA-Molekül in einen Wirt eingeführt wird.

Ein Expressionsprodukt eines transformierten Wirts der Erfindung umfaßt einen erfin dungsgemäßen Komplex.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die T-Zell-Antwort auf T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15), PHA und TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) in immuni sierten Tieren.

Fig. 2 zeigt die Präsentation von T1 bis T7 (SEQUENZ ID- Nr. 9 bis 15), PHA und TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) durch fixierte und Kontroll-Makrophagen.

Fig. 3 zeigt T-Zell-Antworten auf Träger und Peptid in Affen, die mit PreS2-TraT oder PreS2-DT in verschiedenen For mulierungen immunisiert wurden.

Fig. 4 zeigt die Struktur von p TraT (c), einem TraT-Ex pressionsvektor. P_L = Linker Promotor von Lambda; TT = Tran skriptionsterminator; Ampr = Ampicillinresistenz-Gen; Bereich 1302 bis 3597 gleicht etwa dem Bereich 2066 (alte PvuII- Stelle) bis 4367 (alte EcoRI-Stelle) von pBR322; Diagramm nicht maßstäblich.

Fig. 5 zeigt die codierende Sequenz von TraT und die Lage von TraT-(T1 bis T7). (SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 23, 4, 5, 24 und 25).

Beste Art und Weise zur Durchführung der Erfindung

Die DNA-Rekombinations-Techniken, Techniken der chemi schen Synthese, Formulierung und Impfung, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind Standardtechniken, die dem entsprechen den Fachmann bekannt sind. Zur Formulierung der erfindungsge mäßen Impfstoffe wird eine wirksame Menge eines erfindungsge mäßen Komplexes mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Excipienten und/oder Adjuvans formuliert, wodurch ein Impfstoff zur Verabreichung an einen Wirt bereit gestellt wird, der eine Immunisierung mit dem betreffenden Immunogen benötigt.

Feste Dosierungsformen, die zur oralen Verabreichung ge eignet sind, können Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granula umfassen. In solchen festen Dosierungsformen kann min destens ein Komplex mit mindestens einem inerten Verdünnungs mittel, wie z. B. Saccharose, Lactose oder Stärke, gemischt werden. Solche Dosierungsformen können, wie es normalerweise üblich ist, zusätzlich zu den inerten Verdünnungsmitteln noch weitere Substanzen umfassen, wie Gleitmittel, z. B. Magnesium stearat. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform auch Puffer enthalten. Tabletten und Pillen können des weiteren mit magensaftresistenten Überzügen verse hen werden.

Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung können in Form von pharmazeutisch verträglichen Emulsionen, Sirups, Lösungen, Suspensionen und Elixieren vorliegen, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, wie z. B. Wasser. Solche Zusammensetzungen können auch Netzmittel, Emulgatoren und Suspensionsmittel, au ßerdem Süßstoffe, Geschmackstoffe und Duftstoffe umfassen, einschließlich Zucker, wie z. B. Saccharose, Sorbit, Fructose usw., Glykole, wie z. B. Polyethylenglykol, Propylenglykol usw., Öle, wie z. B. Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl usw., Antiseptika, wie z. B. Alkylparahydroxybenzoat usw., und Geschmackstoffe, wie z. B. Erdbeergeschmack, Pfefferminz usw.

Geeignete Excipientien, Träger und/oder Verdünnungsmittel zur Verwendung bei der Herstellung von injizierbaren Formen können auch bei der Herstellung von injizierbaren Impfstoffen verwendet werden.

Andere Ausführungsformen können Nasensprays und andere Verabreichungswege über Schleimhäute umfassen, wie z. B. Sup positorien.

Der Begriff "pharmazeutisch verträgliches Adjuvans" kann entweder für die Standardmittel stehen, die für Verabreichung an Menschen geeignet sind, oder er kann für die typischen Ad juvantien stehen, die bei Impfungen von Tieren verwendet wer den.

Zur Zeit ist Alaun das einzige zugelassene Adjuvans zum Einsatz beim Menschen, andere Adjuvantien werden gerade für den Einsatz beim Menschen getestet, wobei man voraussagen kann, daß diese anderen Adjuvantien für die Verwendung zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Impfung von Menschen ge mäß dieser Erfindung geeignet sind.

Geeignete Adjuvantien zur Impfung von Tieren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Saponin, Ölemulsionen, wie z. B. komplettes und inkomplettes Freundsches Adjuvans (nicht geeignet für die Verwendung bei Nutztieren), Marcol 52: Monta nide 888 (Marcol ist ein Warenzeichen von Esso, Montanide ist ein Warenzeichen von SEPPIC, Paris), Squalan oder Squalen, Ad juvans 65 (enthält Erdnußöl, Mannidmonooleat und Aliuminium monostearat), Mineralgele, wie z. B. Aluminiumhydroxid, Alumi niumphosphat, Calciumphosphat und Alaun, grenzflächenaktive Mittel, wie z. B. Hexadecylamin, Octadecylamin, Lysolecithin, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, N,N-Dioctadecyl-N′,N′-bis- (2-Hydroxyethyl)propandiamin, Methoxyhexadecylglycerin und "pluronic" Polyole, Polyanionen, wie z. B. Pyran, Dextransul fat, Polyacrylsäure und Carbopol, Peptide und Aminosäuren, wie z. B. Muramyldipeptid, Dimethylglycin, Tuftsin und Trehalosedi mycolat. Die erfindungsgemäßen Komplexe können auch verab reicht werden, nachdem sie in Liposomen oder andere Mikroträ ger eingearbeitet, an Polysaccharide, Proteine oder Polymere konjugiert oder mit Quil-A zur Bildung von immunstimulierenden Komplexen kombiniert wurden.

Es hat sich gezeigt, daß die Festlegung einer geeigneten Dosierung für einen bestimmten Wirt durch eine Anzahl von Fak toren beeinflußt wird. Solche Faktoren umfassen das Alter, Ge wicht, Geschlecht, den allgemeinen Gesundheitszustand und den gleichzeitigen Krankheitsstatus des Wirts. Die für den jewei ligen Wirt geeignete Dosierung wird durch pharmazeutische Standardtechniken festgelegt.

Die Stärke der von TraT abgeleiteten Peptidsequenzen wur de deutlich, als gezeigt wurde, daß Konjugate aus TraT und ei nem Peptid HepB-PreS2 133 bis 152: SEQUENZ ID-Nr. 17 (wobei PreS2 die Aminosäuren 120-145 des PreS2-Bereichs von Hepatitis B-Oberflächenantigen darstellt) in "Squirrel"-Affen eine viel stärkere T-Zell-Antwort induzierten als Konjugate aus Diphthe rie-Toxoid (DT) und PreS2. DT ist ein wirksames Trägerprotein mit mehreren T-Zell-Epitopen, das zur Verwendung als Träger in Impfstoffen für den Menschen zugelassen ist.

Beispiel 1 Synthese von Peptiden, die von TraT abgeleitet sind

Die sieben Peptide, T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 1 bis 7), wurden auf einem Peptid-Synthesizer Nr. 430A von Applied Bio systems mit N-terminalem PyroGlu und C-terminalem Cys-NH₂ synthetisiert. Die Peptide wurden durch Chromatographie auf G- 25 Sephadex (Pharmacia) in 10% Essigsäure gereinigt, worauf eine Umkehrphasen-HPLC auf einer VYDAC C-18-Säule unter Ver wendung eines linearen Gradienten von 5 bis 60% Acetonitril in 0,1% TFA folgte. Die Sequenzen der synthetisierten Peptide se hen folgendermaßen aus:

T1: PyroGluGlyAlaMetSerThrAlaIleLysLysArgAsnLeuGluValLysThr GlnMetSerGluThrIleTrpLeuGluCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 9)
T2: PyroGluGlyLeuGlnGlyLysIleAlaAspAlaValLysAlaLysGlyCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 10)
T3: PyroGluSerGlnTrpLeuAsnArgGlyTyrGluGlyAlaAlaValGlyAlaAla LeuGlyAlaGlyIleThrGlyCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 11)
T4: PyroGluGlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGlu AspValAsnCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 12)
T5: PyroGluAspValGlnIleAlaGluArgThrLysAlaThrValThrThrAspAsn ValAlaAlaLeuArgGlnCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 13)
T6: PyroGluSerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGlnThrArgValValSer AsnAlaAsnLysCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 14)
T7: PyroGluLysValAsnLeuLysThrGluGluAlaLysProValLeuGluAspGln LeuAlaLysCys-NH₂ (SEQUENZ ID-Nr. 15)

Reinigung von TraT

E. coli-Zellen (Stamm BTA 1349, enthaltend das Plasmid pBTA439, ein Derivat von Plasmid pBR329, in welches ein 6,0 kB großes EcoRI-Fragment aus dem R100-Plasmid eingefügt worden war, das die für TraT codierende DNA-Sequenz enthält, expri miert vom linken Lambda-Promotor P_L) wurden in einem Fermenter bei 30°C gezüchtet und 2 Stunden bei 42°C induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen in einem Amicon DC10LA-Konzentra tor (0,1 µm-Hohlfaser-Patrone) eingeengt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden aus dem Konzentrator ent fernt und die integralen Membranproteine aus den Zellen durch Zu satz einer Lösung extrahiert, die 0,2 M Natriumacetatpuffer, pH 2,5, 2% Cetrimid (Sigma) in 20% Ethanol plus 0,2 M CaCl₂ (Endkonzentration) enthielt. Die Extraktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt und danach die Bakterien abzentrifugiert (17000×g, 20 Minuten).

TraT wurde aus dem Überstand durch Zusatz von Ethanol bis auf 50% ausgefällt und anschließend abzentrifugiert (4000 × g, 10 Minuten). Sodann wurde es in 1% Zwittergent, 20 mM Natrium acetatpuffer, pH 6,5, 20 mM EDTA, resuspendiert und sodann durch Chromatographie auf DEAE-Sepharose (Pharmacia) in 20 mM Natriumacetatpuffer, pH 6,5, enthaltend 0,1% Zwittergent (Cal biochem) und 20 mM EDTA, weiter gereinigt. Proteine wurden un ter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl im Auftragspuffer eluiert. Fraktionen, die die integralem Membranpro teine enthielten, wurden vereinigt, mit Ethanol gefällt und in 10% SDS resuspendiert und sodann durch Größenausschluß-Chroma tographie auf S-300 Sephacryl (Pharmacia) in 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, enthaltend 2% SDS, 20 mM EDTA, weiter gereinigt. Das nach diesem Verfahren gereinigte TraT wanderte bei Analyse in PAGE als einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 28 000, außerdem wurde gefunden, daß es frei von LPS war, wenn es ei ner SDS-PAGE unterworfen und nach dem Verfahren von Tsai und Frasch (Anal. Biochem. 119, 1982, 115) mit Silber gefärbt wur de. Bei Durchführung des LAL-Tests (Webster, J. Clin. Micro biol. 12, 1980, 644) wurde gefunden, daß das TraT-Protein mit weniger als 0,005 ng LPS/mg Protein verunreinigt war.

Immunisierung von Tieren und Wertung der T-Zell-Proliferation

Tiere wurden mit 50 µg (Mäuse), 200 µg (Hunde und Affen) oder 500 µg (Rinder) TraT in Kochsalzlösung intramuskulär im munisiert und 14 bis 28 Tage später mit einer gleichartigen Impfung geboostert. Vierzehn Tage nach der letzten Injektion wurden periphere Blut-Lymphocyten (Hunde, Affen und Rinder) oder Lymphknotenzellen (Mäuse) als Quelle von T-Lymphocyten verwendet, die sodann in vitro mit verschiedenen Konzentra tionen der Peptide stimuliert wurden [in Fig. 1 sind die Ant worten auf 50 µg TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) bzw. 50 µg T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15), außerdem auf 2 µg PHA dargestellt). T-Lymphocyten wurden nach dem Verfahren von Adorini et al., J. Exp. Med. 168, 1988, 2091, aus Lymphknoten isoliert, das Ver fahren von Chouaib et al. (PNAS 85, 1988, 6875) wurde zur Iso lierung von T-Zellen aus peripherem Blut befolgt. Das Verfah ren von Adorini et al. wurde zur Wertung der T-Zell-Prolifera tion verwendet. Die Ergebnisse werden als Stimulations-Indizes ausgedrückt, die berechnet werden, indem die cpm in Gegenwart von Antigen durch die cpm in Abwesenheit von Antigen dividiert werden. Standardfehler der Mittelwerte von Dreifachkulturen betrugen weniger als 10% des Mittelwertes.

Ergebnisse

Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, wurde in allen vier Ar ten eine signifikante T-Zell-Ansprechbarkeit auf 50 µm T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 9, 10, 12 bzw. 14) und auch auf TraT beobachtet, wobei T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 10, 12 bzw. 14) besonders starke Antworten zeigten. Die hochgradige Kon servierung der Antworten auf diese Peptide in mehreren Arten läßt vermuten, daß diese Peptide sowohl in einer Reihe phylo genetisch verschiedener Arten als auch in einer Reihe gene tisch verschiedener Individuen innerhalb einer Art starke An tikörperantworten auslösen können. Peptidsequenzen zur Stimu lation von T-Zellen, die mehrere Artgrenzen überschreiten, sind unseres Wissens in der Literatur noch nicht beschrieben worden.

Primäre und sekundäre T-Zell-proliferative Antworten von pe ripheren Blut-Lymphocyten vom Menschen auf TraT und auf die T- Zell-Epitop-Peptide

Die starken proliferativen in vitro-Antworten, die in den vier untersuchten Tierarten auf die T-Zell-Peptide (insbeson dere auf T2, T4 und T6: SEQUENZ ID-Nr. 10, 12 bzw. 14) beob achtet wurden, ließen vermuten, daß sich ein ähnliches hierar chisches Muster der Ansprechbarkeit auch bei Menschen zeigen würde. T-Zell-Epitop-Peptide, die eine permissive Assoziation mit Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekülen zeigen und aus diesem Grund vorzugsweise von T-Zellen erkannt werden, sind attraktive Kandidaten für die Herstellung von Unterein heit-Impfstoffen, da man von ihnen erwartet, daß sie bei den meisten Individuen einer menschlichen Nicht-Inzucht-Population eine Immunantwort induzieren. Daher wurde beschlossen, die T- Zell-Antworten auf die von TraT abgeleiteten T-Zell-Epitope bei Menschen zu untersuchen.

Wegen der logistischen Probleme, die durch Immunisierung von Menschen mit TraT gestellt wurden (unseres Wissens war keiner der Blutspender gezielt mit TraT immunisiert worden), wurde ein alternatives Verfahren unter Verwendung von in vi tro-Immunisierung durchgeführt.

Um die "Vielseitigkeit" der von TraT abgeleiteten T-Zell- stimulierenden Peptiden bei Menschen zu testen, wurden hepari nisierte Blutproben von zwanzig zufällig ausgewählten Spendern einer Blutbank verwendet. Periphere Blut-Lymphocyten (PBL) die eine angereicherte T-Zell-Population darstellen, wurden in vitro mit TraT oder mit T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) in Primärkulturen stimuliert, außerdem wurde ein Teil der PBL in sekundären Kulturen mit TraT-gepulsten mononuclearen Zellen wiederstimu liert. Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß in einem drei tägigen primären T-Zell-Proliferations-Test die PBL von 8 der 20 Donoren (40%) auf mindestens drei (T2, T4, T6: SEQUENZ ID- Nr. 10, 12 bzw. 14) der T-Zell-Peptide und außerdem auf TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) ansprachen (Stimulations-Index 3). Nach einer sekundären in vitro-Immunisierung mit TraT-gepulsten PBL wurde jedoch beobachtet, daß alle von den zwanzig Spendern stammenden Kulturen ansprachen (Tabelle 2), außerdem wurde eine signifikante Boosterwirkung bei den Zellkulturen gezeigt, die auf die primäre Stimulation angesprochen hatten. Die wich tige Folgerung dieser Arbeit besteht darin, daß T-Zell-stimu lierende Peptide, wie z. B. T2, T4, T6 (SEQUENZ ID-Nr. 10, 12 und 14) und möglicherweise T1 (SEQUENZ ID-Nr. 9), als Träger in Untereinheit-Impfstoffen eingesetzt werden könnten, wodurch die bei Menschen beobachtete Nichtansprechbarkeit als Folge der MHC-Einschränkung aufgehoben werden könnte.

Tabelle 1

Primäre T-Zell-proliferative Antworten von peripheren Blut-Lymphocyten des Menschen auf TraT und die T-Zell-stimu lierenden Peptide

Periphere Blut-Lymphocyten (PBL) wurden aus heparinisiertem Blut durch Ficoll-Paque (Pharmacia) Gradientenzentrifugation abgetrennt. Mit wenigen Worten, 10 ml Blut wurden auf 6 ml Fi coll-Paque geschichtet und eine angereicherte T-Zell-Popula tion durch vierzigminütige Zentrifugation bei 400 × g abge trennt. PBL (10⁵ in 0,2 ml RPMI-Medium, enthaltend 10% mensch liches AB-Serum) wurden in Platten mit flachem Boden mit 50 µg TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) oder einem der T-Zell-stimulierenden Peptide (T1 bis T7; SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) oder mit 2 µg PHA 3 Tage bei 37°C gezüchtet. 16 Stunden vor der Ernte wurden die Zellen mit 0,5 µCi tritiiertem Thymidin markiert, geerntet und in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Die Ergeb nisse werden als Stimulations-Indizes ausgedrückt, die errech net werden, indem die Impulse pro Minute (cpm) in Gegenwart von Antigen durch die cpm in Abwesenheit von Antigen dividiert werden.

Tabelle 2

Sekundäre T-Zell-proliferative Antworten von peripheren Blut-Lymphocyten des Menschen auf TraT und die T-Zellen-stimu lierenden Peptide

PBL (6 bis 7×10⁶) wurden mit 50 µm TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) 30 Minuten bei 37°C gepulst und anschließend dreimal mit RPMI- Medium gewaschen, das 10% menschliches AB-Serum enthielt. Die mit Antigen gepulsten Zellen wurden in 3 ml Kulturmedium in 30 ml-Kulturkolben (Costar) gebracht und sodann aufrecht 8 Tage bei 37°C inkubiert. Ein Teil der PBL wurde abgenommen und in 10% Dimethylsulphoxid eingefroren und anschließend zur Sti mulation der primären Kulturen verwendet. Am Ende der primären Inkubation wurden die Zellen 10 Minuten bei 150 × g zentrifu giert und anschließend mit 2 × 10⁶ TraT-gepulsten, gefrorenen und aufgetauten PBL stimuliert und sodann die wiederstimulier ten Kulturen in Kulturkolben weitere 3 Tage bei 37°C inku biert. Lebensfähige Zellen (3 bis 4×10⁶), die am Ende der sekundären Kultur gewonnen wurden, wurden zweimal gewaschen und mit einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in Kulturmedium und 10% menschlichem AB-Serum resuspendiert. Die wiederstimu lierten PBL (10⁵ in 0,2 ml Kulturmedium) wurden schließlich in Platten mit flachem Boden mit TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16), T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) oder PHA 3 Tage wie vorstehend beschrieben gezüchtet (vgl. Legende zu Tabelle 1).

T-Zell-stimulierende Peptide aus TraT sind stärker als dieje nigen aus Diphtherie-Toxoid (DT)

Die in vitro-Aktivitäten der von TraT abgeleiteten Pepti de (T1 bis T6: SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 14) wurden mit denjenigen von vier Peptiden verglichen, die von anderen Autoren be schrieben wurden (D1 und D2: SEQUENZ ID-Nr. 19 und 20; Bixler et al. PCT/US89/00388), oder für die vorhergesagt wurde (D3 und D4: SEQUENZ ID-Nr. 21 und 22), daß sie eine starke T-Zell stimulierende Aktivität aufweisen, wenn sie mit N- und/oder C- terminaler Modifizierung hergestellt werden. DT wird verbrei tet als Trägermolekül zur Bereitstellung von T-Zell-Hilfe für daran konjugierte Immunogene eingesetzt. Aus ethischen Gründen war es nicht möglich, Menschen mit TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) zu immunisieren. Daher wurden normale Blutspender ausgewählt, de ren Lymphocyten in vitro sowohl auf DT als auch auf TraT rea gierten; etwa 60% von zufällig ausgewählten Blutspendern rea gieren in vitro auf TraT (vgl. Tabelle 1). Die Daten der nach stehenden Tabelle 3 zeigen, daß bei vier von fünf solchen In dividuen die Antworten auf das TraT-Molekül mindestens so hoch waren wie diejenigen auf DT. Außerdem waren die durch T4 (SE- QUENZ ID-Nr. 12) und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 14) induzierten proli ferativen Antworten zwei- bis dreimal höher als die Antworten, die durch ein beliebiges, von DT stammendes Peptid (D1 bis D4: SEQUENZ ID-Nr. 19 bis 22) induziert wurden. Es ist zu beach ten, daß die Antworten auf T6 (SEQUENZ ID-Nr. 14) fast so stark sind wie diejenigen auf das TraT-Molekül selbst, dies läßt vermuten, daß T6 eine extrem hohe Bindungsaktivität für MHC aufweist. Im Gegensatz dazu sind die Antworten auf D1 und D4 (SEQUENZ ID-Nr. 19 und 22) viel schwächer als auf das natürliche DT-Molekül.

Diese Ergebnisse zeigen, daß mindestens zwei der von TraT abgeleiteten Peptide eine stärkere T-Zell-stimulierende Akti vität als eine der vier ausgewählten, von DT abgeleiteten Se quenzen aufweisen, somit zeigen die Werte den überlegenen Nut zen dieser Moleküle in Impfstoffzubereitungen für den Men schen.

Tabelle 3

T-Zell-stimulierende Aktivität von Peptiden aus TraT und Diphtherie-Toxoid (DT)

Beispiel 2 Das (Die) immunogene(n) Fragment(e) das (die) als Folge von "natürlicher" Prozessierung von TraT erzeugt wird (werden) scheint (scheinen) mit Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II-Antigenen mindestens so wirksam in Wechselwirkung zu treten wie die Peptide T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 4 und 6) Immunisierung von Tieren und Antigen-Präsentation durch Ma krophagen

Mäuse (CBA oder C57BL/6J) wurden mit 50 µg TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) in Kochsalzlösung subcutan immunisiert, sodann er hielten die Tiere 10 Tage nach der ersten Injektion intraperi toneal 1 ml Marcol-Öl, um ein Peritoneal-Exsudat (PE) zu indu zieren. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet, das PE ge wonnen und die Makrophagen abgetrennt, wie von Buus und Werde lin beschrieben (J. Immunol. 136, 1986, 452). Makrophagen wur den mit Paraformaldehyd fixiert, im wesentlichen wie es von Buus und Werdelin (a.a.O.) beschrieben wird. Mit wenigen Wor ten, die Makrophagen (5 × 10⁶) wurden 2 Minuten mit 1% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS behandelt und die Umsetzung durch Zusatz von 0, 15 M Glycin-PBS-Puffer abgestoppt. Die fixierten Makrophagen wurden dreimal mit Puffer gewaschen, in RPMI (10% FCS) suspendiert und 10⁵ Zellen mit TraT (SEQUENZ ID-Nr. 16) (50 µg), PHA (2 µg) oder mit den Peptiden T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) (50 µg) 30 Minuten bei 37°C gepulst; nicht fixierte oder Kontroll-Makrophagen wurden auch 30 Minuten bei 37°C mit Antigen gepulst. Nach drei Waschgängen zur Entfernung von überschüssigem Antigen wurden 10⁵ mit Antigen gepulste, mit Paraformaldehyd fixierte oder unbehandelte Makrophagen mit 10- TraT-immunen T-Lymphocyten (hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben) kombiniert und die Zellen 72 Stunden bei 37°C in kubiert. Die Stimulation wurde, wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben, bestimmt.

Ergebnisse

Wie in Fig. 2 dargestellt, waren die fixierten Makro phagen fast ebenso effizient wie unbehandelte Makrophagen darin, die vier Peptide T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 9, 10, 12 und 14) den T-Lymphocyten zu präsentieren, obwohl T6 (SEQUENZ ID-Nr. 14) anscheinend mehr Prozessierung erfordert als die anderen drei Peptide. Im Gegensatz dazu waren fixierte Makrophagen nicht in der Lage, das natürliche TraT-Molekül zu präsentieren, vermutlich weil TraT von lebensfähigen Makropha gen prozessiert werden muß, bevor es von T-Zellen erkannt wird. Die Werte lassen daher vermuten, daß die Fragmente, die aus der natürlichen Prozessierung von TraT hervorgehen, den von TraT abgeleiteten Peptiden in Bezug auf ihre Wechselwir kung mit Klasse II-Molekülen auf der Oberfläche der Makropha gen sehr ähnlich sein müssen. Wenn die von TraT abgeleiteten Peptidfragmente von den natürlich prozessierten Fragmenten sehr verschieden wären, würden sie nicht ohne eine weitere Prozessierung mit den Makrophagen in Wechselwirkung treten, wodurch T-Zellen stimuliert werden. Es ist interessant, daß diese Klasse II-Moleküle trotz der Behandlung mit Paraformal dehyd anscheinend intakt bleiben. Diese Beobachtungen lassen ferner vermuten, daß die vier Peptide T1, T2, T4 und T6 (SEQUENZ ID-Nr. 1, 2, 4 und 6) in der Tat in vivo eine wich tige Rolle bei der Erzeugung von Antikörperantworten spielen können.

Beispiel 3 In "Squirrel"-Affen induzieren die PreS2-TraT-Konjugate stär kere T-Zell-Antworten als PreS2-Konjugate mit Diphtherie-To xoid (DT) Synthese von Peptid und seine Konjugation an den Träger

Ein Peptid, das einen Teil des hochimmunogenen PreS2-Pep tids (Aminosäuren 120 bis 145 der PreS2-Region von Hepatitis B) plus eine weitere Sequenz enthielt, die aus den Aminosäuren 133 bis 152 bestand, nämlich,
Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser- Ser-Gly-Thr-Val-Cys: SEQUENZ ID-Nr. 17), wurde auf einem Pep tid-Synthesizer Nr. 430A von Applied Biosystems synthetisiert. Das Peptid wurde durch Chromatographie auf G-25-Sephadex (Pharmacia) in 10% Essigsäure und anschließend durch Umkehr phasen-HPLC auf einer VYDAC C-18-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 5 bis 60% Acetonitril in 0,1% TFA gereinigt.

Diphtherie-Toxoid (DT) (Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australia, 1570 Lf-Einheiten/ml) wurde in 80% Etha nol gefällt und in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, resuspen diert. Anschließend wurde es mit einem 60fachen molaren Über schuß von m-Maleinimidobenzoesäure-N-hydroxysuccinimidester (MBS, Sigma Chemical Co; angesetzt mit 10 mg/ml in DMF) 30 Mi nuten bei 22°C aktiviert. Das aktivierte DT wurde mit 80% Ethanol gefällt, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, resuspen diert und mit einem 20fachen molaren Überschuß von PreS2-Pep tid 3 Stunden bei 22°C gemischt. Das Konjugat wurde über Nacht gegen PBS dialysiert.

TraT wurde in 50% Ethanol gefällt, in 50 mM Phosphatpuf fer, pH 7,0, enthaltend 1% Zwittergent, resuspendiert und mit dem 10fachen von MBS 30 Minuten bei 22°C aktiviert. Das akti vierte TraT wurde mit einem 14fachen molaren Überschuß von PreS2-Peptid (SEQUENZ ID-Nr. 17) drei Stunden bei 22°C ge mischt. Das Konjugat wurde sodann über Nacht gegen PBS, ent haltend 0,1% Zwittergent, dialysiert. Die durchschnittliche Zahl von PreS2-Gruppen (aufgrund der Aminosäureanalyse) pro Molekül Proteinträger war 2 (TraT) bzw. 10 (DT).

Formulierungen

Alhydrogel: PreS2-TraT oder PreS2-DT (2,5 mg in 0,5 ml) wurde zu 0,5 ml Alhydrogel zugesetzt und mit PBS und Zwittergent (0,5%) auf 2,5 ml gebracht.
Saponin: PreS2-TraT oder PreS2-DT (2,5 mg in 0,5 ml) wurde zu 2,5 mg Saponin hinzugefügt und sodann mit PBS auf 2,5 ml gebracht.
Zwittergent: TraT- oder DT-Konjugate (2 mg in 0,5 ml) wurden mit PBS und Zwittergent (0,5%) auf 2 ml gebracht.
Liposomen: (A) TraT- oder DT-Konjugate wurden nach der Fällung mit 80% Ethanol in 1 ml 10% Octylglucosid in 10 mM Hepes resuspendiert.
(B) 1 ml Chloroform, enthaltend Phosphatidylethanolamin (16 mg) und Phosphatidylcholin (4 mg) wurden in einen Kolben gegeben und das Chloroform unter vermindertem Druck abgedampft.
1 ml der Octylglucosid-Lösung (A) wurde zu (B) zugegeben und die Formulierung durch Beschallung solubilisiert und anschließend über Nacht gegen PBS dialysiert.

"Squirrel"-Affen wurden an den Tagen 0 und 42 mit 200 µg von jedem der Konjugate (PreS2-TraT oder PreS2-DT) in den ver schiedenen Formulierungen (zwit = Zwittergent; AlOH = Alhydro gel; Sap = Saponin; Lip = Liposomen) intramuskulär immuni siert. Periphere Blut-Lymphocyten, die am Tag 56 abgenommen worden waren, wurden als Quelle von T-Zellen verwendet, die sodann in vitro mit verschiedenen Konzentrationen von TraT, DT oder PreS2 stimuliert wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Ergebnisse (proliferative Antworten auf 50 µg TraT, DT oder PreS2) werden als Stimulations-Indizes ausgedrückt. Standard fehler der Mittelwerte von Dreifachkulturen betrugen weniger als 10% des Mittelwertes.

Ergebnisse

Die Ergebnisse in Fig. 3 zeigen, daß die T-Zell-prolife rativen Antworten auf TraT zwei- bis dreifach höher waren als auf Diphtherie-Toxoid. Außerdem waren die Anti-PreS2-Antworten in den mit PreS2-TraT immunisierten Affen drei- bis viermal höher als in den mit PreS2-Diphtherie-Toxoid immunisierten Tieren. Die hervorragenden T-Zell-Antworten, die als Reaktion auf TraT gebildet werden, lassen vermuten, daß dieses Protein (oder eine seiner T-Zell-stimulierenden Sequenzen) ein nützli cher Bestandteil von Impfstoffen sein könnte, insbesondere von Impfstoffen gegen virale und parasitäre Erkrankungen. Es liegt eindrucksvolles Beweismaterial vor, daß bei vielen viralen und parasitären Infektionen die Effektor-T-Zellen primär dafür verantwortlich sind, daß die Infektion beseitigt wird.

Beispiel 4 Peptidsequenzen (T2, T4, T6: SEQUENZ ID-Nr. 2, 4 und 6), die von TraT stammen, lösen starke Antikörperantworten auf ein Peptid aus, das an sie angelagert ist

Nachdem wir die Existenz von starken T-Zell-stimulieren den Peptidsequenzen innerhalb von TraT identifiziert und doku mentiert hatten, mußte festgestellt werden, ob die bezeichne ten Bereiche von TraT als wirksame Trägermoleküle fungieren können. Das Peptid gp120 (Aminosäuren 254 bis 274 des konser vierten Bereichs der gp120-Region von HIV1) wurde zur Bereit stellung einer antigenen Determinante verwendet. Die Fähigkeit von T-Zell-stimulierenden Sequenzen, die T-Zell-Hilfe auszu lösen und auf diese Weise Antikörperantworten auf daran ange lagerte Peptide in Gang zu bringen, ist ein wichtiges Merkmal von T-Zell-Epitop-Peptiden. Demgemäß wurden Mäuse mit Glutar aldehyd-Konjugaten aus jeweils einem der sieben Peptide T1 bis T7 (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) und dem gp120-Peptid, emulgiert in Montanide/Marcol (9 : 1)-Adjuvans, immunisiert und 21 Tage nach der ersten Immunisierung geboostert. Die in diesen Tieren ausgelösten Antikörperantworten sind in Tabelle 4 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Peptide (T2, T4 und T6: SE- QUENZ ID-Nr. 10, 12 und 14), die starke T-Zell-Antworten aus lösten, auch die höchsten Antikörperantworten gegen das Peptid gp120 in Gang brachten, wodurch ihr Nutzen als Träger demon striert wurde. Da diese Peptide eine starke T-Zell-sti mulierende Aktivität aufweisen, wurden als Reaktion auf die starken Peptide selbst (T2, T4 und T6: SEQUENZ ID-Nr. 10, 12 und 14) nur schwache oder vernachlässigbare Antikörperspiegel erhalten.

Herstellung von Glutaraldehyd-Konjugaten aus gp120-Peptid und den T-Zell-Epitop-Peptiden

Das zweistufige Glutaraldehyd-Verfahren von Avrameus et al. (Scand. J. Immunol. 8, 1978, 7) wurde eingesetzt. In weni gen Worten, das gp120-Peptid (1 mg/ml) in 0,1 M PBS, pH 6,8, wurde mit 0,2% Glutaraldehyd 2 Stunden bei 22°C umgesetzt. Nach einer Dialyse über Nacht gegen 0,1 M Carbonat/Bicarbonat- Puffer, pH 9,5, wurde das mit Glutaraldehyd aktivierte gp120 in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 zu den verschiedenen Pep tiden (T1 bis T7: SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) zugegeben und 24 Stunden bei 22°C umgesetzt. Die Konjugate wurden in 1 ml PBS suspendiert und in Montanide/Marcol (9 : 1) emulgiert.

Gruppen mit jeweils fünf weiblichen C57BL/6J-Mäusen (20 bis 25 g) wurden an den Tagen 0 und 21 mit 100 µg Glutaral dehyd-Konjugaten aus jeweils einem der Peptide (T1 bis T7: SE- QUENZ ID-Nr. 9 bis 15) und dem gp120-Peptid, emulgiert in Mon tanide/Marcol (9 : 1), oder mit dem gp120-Peptid in Kochsalz lösung subcutan immunisiert. Den Tieren wurde 14 Tage nach der zweiten Injektion Blut entnommen und die Reaktionen gegen Träger (T1 bis T7: SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) und Peptid (gp120) durch einen Standard-ELISA bestimmt, wobei Platten verwendet wurden, die mit den T1- bis T7-Peptiden (SEQUENZ ID-Nr. 9 bis 15) oder mit pg120 beschichtet waren.

Ergebnisse

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß die T-Zell-stimu lierenden Peptide T2, T4, T6 (SEQUENZ ID-Nr. 10, 12 und 14) und möglicherweise T1 (SEQUENZ ID-Nr. 9) die höchsten Anti körperantworten auf das an sie angelagerte Peptid (gp120) in Gang brachten. Wie vorausgesagt, zeigten sich schwache bis vernachlässigbare Antikörpertiter als Reaktion auf diese Pep tide (T1, T2, T4 und T6: SEQUENZ ID-Nr. 9, 10, 12 und 14). Da sie T-Zell-Epitope sind, ist es unwahrscheinlich, daß sie B- Zellen gut stimulieren. Dagegen zeigte sich im wesentlichen keine Reaktion in Tieren, die mit gp120 in Kochsalzlösung im munisiert worden waren. Somit können diese T-Zell-stimulieren den Peptide nützlich sein, um Antikörperantworten auf Peptid antigene in Gang zu bringen. Solche Antigene mit kommerziellem Nutzen können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, lutei nisierendes Hormon, Somatostatin, Inhibin, FSH, Maul- und Klauenseuche-Peptid, Hepatitis B PreS2-Peptid, Malaria-Pep tide, Herpes- oder Influenza-Peptide.

Tabelle 4

Anti-Träger- und Anti-Peptid-Reaktionen in Mäusen, die mit Konjugaten aus gp120 und T-Zell-stimulierendem Peptid immuni siert worden waren

Antikörper-Antwort

Antikörpertiter werden als arithmetisches Mittel des rezipro ken Wertes der Antiserum-Verdünnung ausgedrückt, die nach 45 Minuten bei 25°C einen ELISA-Wert von 0,5 ergab.

Die starke T-Zell-Stimulation, die mit diesen Peptiden beobachtet wurde, welche B-Zell-Reaktionen gegen das angela gerte Immunogen in Gang bringen, könnte auch durch Einbau der T-Zell-Epitop-Sequenzen in solche Fusionsproteine erreicht werden, die spezifisch für die Präsentation von Peptidantige nen entworfen wurden.

Immunogene Fusionsproteine, umfassend die T-Zell-Epitope und Protein- oder Peptidantigene, können aus einem rekombinan ten Gen, welches das Fusionsprotein codiert, hergestellt wer den, wenn dieses in einem geeigneten Wirt-Vektor-System expri miert wird. Diese chimären Proteine können verschiedene Formen aufweisen. Das Antigen kann neben dem T-Zell-Epitop liegen, wie z. B. T2 (SEQUENZ ID-Nr. 2) oder T6 (SEQUENZ ID-Nr. 24), wobei TraT im wesentlichen intakt ist, (z. B. luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon [LHRH]/TraT-Fusionen); auch können nur die T-Zell-Epitope innerhalb des Proteinantigens eingefügt werden. Beispielsweise kann T2 (SEQUENZ ID-Nr. 2) oder T6 (SE- QUENZ ID-Nr. 6 oder 24) in das Zecken-Antigen BM86 (beschrie ben als WGL⁺ in PCT/AU87/00401) eingefügt werden; oder Teile von TraT, die T2 (SEQUENZ ID-Nr. 2) und/oder T6 (SEQUENZ ID- Nr. 24) tragen, können in der Nähe der antigenen Bereiche ei nes Proteins liegen (z. B. T2,T6/TraT und luteinisierendes Hor mon).

Eine geeignete Quelle von DNA, welche die erfindungsge mäßen T-Zell-Epitope codiert, ist ATCC 67331.

Beispiel 5 Verbesserung der Wirksamkeit von Impfstoffen durch Verwendung von starken universelle T-Zell-Epitopen

Einer der wichtigsten Hemmnisse bei der Entwicklung von wirksamen Impfstoffen gegen Krankheiten, wie z. B. AIDS, be steht darin, daß in sonst immunogenen Molekülen, wie z. B. gp120 (einem immundominanten externen Hüllprotein von HIV), "Suppressor-Regionen" vorliegen, die die Entwicklung von wirk samen Immunreaktionen gegen diese Proteine stören. Um schüt zende Immunreaktionen gegen diese Proteine auszulösen, wurde vorgeschlagen, diese Sequenzen zu entfernen und sie durch im munogenere Sequenzen zu ersetzen.

T-Zell-Epitop-Sequenzen, die von TraT abgeleitet sind, besitzen in einer Reihe von phylogenetisch verschiedenen Arten unerwartet hohe immunstimulierende Eigenschaften. Von diesen verschiedenen T-Zell-Epitop-Peptiden, die eine permissive Assoziation mit den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Mo lekülen zeigen und die daher vorzugsweise von T-Zellen erkannt werden, erwartet man, daß sie in den meisten Individuen einer Nicht-Inzucht-Population eine starke T-Zell-Immunität auslö sen.

Es wurde gezeigt, daß zwei Suppressor-Bereiche, entspre chend den Aminosäuresequenzen 735 bis 752 und 846 bis 860 des Transmembran-Glykoproteins von HIV, eine deutliche Hemmung der menschlichen blastogenen Antworten auf Mitogene und Alloanti gene bewirken (Chanh, T. C., Kennedy, R. C. und Kanda, K., Cell Immunol. 111, 1988, 77-86).

Unter Verwendung von DNA-Rekombinations-Technik werden die "Suppressor-Bereiche" in mehreren Schutzimpfstoff-Protei nen, umfassend gp120, entfernt und durch immunstimulierende Peptide ersetzt, die von TraT stammen. Durch dieses Vorgehen werden Impfstoffe erhalten, die bei Wirten aus einem breiten Spektrum von MHC-Hintergründen eine starke schützende Immuni tät auslösen. In erster Linie wird durch die Entfernung von Suppressor-Bereichen die Immunogenität des Moleküls ver bessert, außerdem führt das Ersetzen von Suppressor-Bereichen durch immunstimulierende Bereiche zu einer weiteren Steigerung der Immunogenität des modifizierten Moleküls. Das Ersetzen des (der) Suppressor-Bereichs (Bereiche) durch einen starken T- Zell-stimulierenden Bereich, wie z. B. T6, führt zur Steigerung der Immunogenität des modifizierten rekombinanten Moleküls. Dieses Molekül kann an Stelle des natürlichen gp120-Moleküls eingesetzt werden, wobei dieses modifizierte Molekül als Basis für einen Impfstoff, z. B. einen Untereinheit-Impfstoff oder als Teil von inaktivierten Viruspartikeln, verwendet wird.

Beispielsweise wird die Suppressor-Region von HIV, ent sprechend der Aminosäuresequenz (735 bis 752):

Tyr-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-Ile-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly- (735)
Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Gly-Cys (SEQUENZ ID-Nr. 18) (752)

durch das von TraT abgeleitete Peptid:

Ser-Thr-Glu-Thr-Gly-Asn-Gln-His-His-Tyr-Gln-Thr-Arg-Val-Val- Ser-Asn-Ala-Asn-Lys (SEQUENZ ID-Nr. 6)

ersetzt.

Gewerbliche Verwertbarkeit

Die vorliegende Erfindung ist bei der Herstellung von Impfstoffen für den Einsatz bei Tieren und Menschen nützlich. Die Verwendung von T-Zell-Epitop-Peptiden als Trägermoleküle steigert die Produktion von Antikörpern und stimuliert die zellvermittelte Immunität, wobei viele der Nachteile vermieden werden, die bei Verwendung von größeren Proteinträgermolekülen auftreten.

Hinterlegung von Stämmen

BTA 1349 wurde gemäß den Maßgaben des Budapester Vertrags bei der "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852, USA, am 2. März 1987 unter der Hin terlegungsnummer ATCC 67331 hinterlegt.

Referenzen

Adorini et al., J. Ex. Med. 168 (1988), 2091;
Avraemeus et al., Scand. J. Immunol. 8 (1978), 7;
Bolivar et al., Gene 2 (1977), 95;
Chanh et al., Cell Immunol. 111 (1988), 77-86;
Chouaib et al., PNAS 85 (1988), 6875;
De Lisi und Berzofsky, PNAS 82 (1985), 7048;
Ogata et al., J. Bacteriol. 151 (1982), 819;
Perumal und Minkley, J. Biol. Chem. 259 (1984), 5359;
Tsai und Frasch, Anal. Biochem. 119 (1982), 115;
Webster, J. Clin. Microbiol. 12 (1980), 644;
Buus und Werdelin, J. Immunol. 136 (1986), 452;
PCT/US89/0O388;
PCT/AU87/00107.

SEQUENZ-LISTE

Claims

1. T-Zell-Epitop, umfassend einen Teil der Aminosäuresequenz des Proteins TraT.

2. Das T-Zell-Epitop:
GlyAlaMetSerThrAlaIleLysLysArgAsnLeuGluValLysThrGln MetSerGluThrIleTrpLeuGlu.

3. Das T-Zell-Epitop:
GlyLeuGlnGlyLysIleAlaAspAlaValLysAlaLysGly.

4. Das T-Zell-Epitop:
GlyLeuAlaAlaGlyLeuValGlyMetAlaAlaAspAlaMetValGluAsp ValAsn.

5. Das T-Zell-Epitop:
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisHisTyrGlnThrArgValValSerAsnAlaAsnLys.

6. Das T-Zell-Epitop:
SerThrGluThrGlyAsnGlnHisLysTyrGlnThrArgValValSerAsnAla AsnLys.

7. T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aminosäuresequenz des T-Zell-Epitops modifiziert ist.

8. T-Zell-Epitop nach Anspruch 7, umfassend einen weiteren N-terminalen Rest oder einen modifizierten N-terminalen Rest.

9. T-Zell-Epitop nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, umfassend einen weiteren oder modifizierten C-terminalen Rest.

10. T-Zell-Epitop nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß der Rest ein N-terminaler Pyroglut aminsäurerest ist.

11. T-Zell-Epitop nach Anspruch 9, dadurch gekenn zeichnet, daß der Rest ein C-terminaler Cystein amidrest ist.

12. Komplex, umfassend mindestens ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gebunden an mindestens ein Immunogen, so daß das mindestens eine T-Zell-Epitop seine Funktion als T-Zell-Epitop beibehält und das mindestens eine Immunogen mindestens eine antigene Determinante prä sentiert, gegen die eine Immunantwort ausgelöst werden kann.

13. Komplex nach Anspruch 12, in dem das mindestens eine Im munogen aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Zirkumsporozoit- Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum, dem synthetischen Immunogen NH₂-Cys-(Asn-Pro-Asn- Ala)₄, abgeleitet von Zirkumsporozoit-Oberflächenprotein von Plasmodium falciparum, dem ganzen oder einen Teil vom luteinisierenden Hormon oder Somatostatin und immunogenen Proteinen besteht, die das ganze oder einen Teil des S- Proteins von Hepatitis B-Virus, vom AIDS-Virus, Influenza- Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus, von Inhibin oder FSH darstellen.

14. Impfstoff, umfassend einen Komplex nach Anspruch 12 oder 13, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Excipienten, Verdünnungsmittel und/oder Adjuvans.

15. Hybrides Polynucleotidmolekül, das aus einer Polynucleotid sequenz besteht, die als codierende Sequenz für mindestens ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 11 wirkt, fusioniert an eine Polynucleotidsequenz, die als codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt.

16. Hybrides Polynucleotidmolekül, das aus einer Polynucleotid sequenz besteht, die als codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt, in die mindestens eine Polynucleotidsequenz eingefügt ist, die als codierende Sequenz für ein T-Zell-Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 7 wirkt.

17. Hybrides Polynucleotidmolekül, bestehend aus einer ersten Polynucleotidsequenz, die als codierende Sequenz für das ganze oder einen Teil des TraT-Moleküls wirkt, und einer Polynucleotidsequenz, die als codierende Sequenz für mindestens ein Immunogen wirkt, die in die erste Polynucleotidsequenz angrenzend an mindestens ein T-Zell- Epitop nach einem der Ansprüche 1 bis 6 eingefügt ist.

18. Hybrides Polynucleotidmolekül nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Molekül ein DNA-Molekül ist.

19. Hybrides DNA-Molekül nach Anspruch 18, wobei das resul tierende Fusionsprotein auf die Oberfläche der Wirtszelle gebracht und dort dargeboten wird.

20. Transformierter Wirt, der die genetische Information für die Biosynthese eines Komplexes nach Anspruch 12 oder 13 trägt.

21. Transformierter Wirt nach Anspruch 20, wobei der Komplex auf der Zelloberfläche des transformierten Wirtes exprimiert wird.