CN103703023A

CN103703023A - 缩短的四连蛋白-载脂蛋白a-i融合蛋白，含有它的脂质颗粒，以及它们的用途

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Publication number: CN103703023A
Application number: CN201280036904.9A
Authority: CN
Inventors: 马丁·巴德尔; 罗伯托·法尔肯施泰因; 克里斯蒂安·尚茨
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-08-25
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2014-04-02
Also published as: AR087640A1; MX2014001920A; US9139640B2; JP2014529602A; JP6207507B2; US20130231273A1; US20150011459A1; BR112013033562A2; WO2013026860A1; JP2017171670A; EP2748191A1; KR20140054115A; CA2838070A1; US8791063B2; RU2014108240A

Abstract

在本文中报道了缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白和包含缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的脂质颗粒以及它们的用途。

Description

缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白,含有它的脂质颗粒,以及它们的用途

本发明属于脂蛋白和脂质颗粒领域。在本文中报道了缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白、包含该缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白和2种不同磷脂酰胆碱的脂质颗粒、以及所述融合蛋白和所述脂质颗粒的用途。

发明背景

血浆脂蛋白是在血液中进行脂质运输和代谢的可溶性蛋白-脂质复合物。基于它们的密度、大小、化学组成和功能，将脂蛋白分成几大类。在它们中，高密度脂蛋白(HDL)颗粒(可替换地表示为高密度脂质颗粒)由几个亚类构成，所述亚类的平均分子量在180kDa至360kDa之间变化。它们的平均脂质和蛋白含量各自为50重量％。磷脂酰胆碱(PC)占总脂质的38％，其次是胆固醇酯和少量其它的极性和非极性脂质，包括游离的胆固醇。主要蛋白组分是载脂蛋白A-I(Apo A-I)，其占人HDL中的总蛋白重量的约60％。

HDL颗粒和它的主要多肽载脂蛋白A-I参与反向胆固醇运输(RCT)。其中，载脂蛋白A-I增加胆固醇从细胞(例如从血管壁细胞)的流出、脂质的结合和卵磷脂胆固醇-乙酰基-转移酶的活化，并由此增加肝脏通过血浆流对胆固醇的消除。这是一个涉及细胞膜蛋白ATP-结合盒-转运蛋白-A-I(ABCA-I)的主动转运过程。

在上个世纪七十年代晚期和八十年代早期，已经鉴别出载脂蛋白A-I和基于载脂蛋白的治疗剂(例如重构的HDL颗粒)。就含有载脂蛋白A-I-Milano的脂质颗粒而言，可以展示出临床证据(是指动脉硬化患者中显著的斑块减少)。根据载脂蛋白A-I分子的一种天然存在的突变体，设计出载脂蛋白A-I-Milano，即野生型载脂蛋白A-I的一种二聚体形式。通过用半胱氨酸替代氨基酸残基173(精氨酸)从而允许形成二硫键，实现二聚体形成。

在WO2009/131704中报道了适用于螯合胆固醇和其它分子的纳米结构，所述纳米结构包含含有无机材料的核心。在WO2006/125304中报道了用于治疗或预防冠状动脉疾病的药物组合物。在US2002/0142953中报道了编码与脂质代谢和心血管疾病有关的载脂蛋白的组合物。在WO2005/084642中报道了脱辅基蛋白-共螯合物(cochelate)组合物。在WO2009/036460中报道了修饰的人载脂蛋白A-I多肽及它们的用途。在WO2008/017906中报道了人载脂蛋白A-I蛋白突变蛋白的二聚体和/或寡聚体形式的植物生产。在WO2007/137400中报道了用于治疗瓣膜狭窄的方法和化合物。在WO2006/100567中报道了带电荷的脂蛋白复合物和它们的用途。

在US2002/0156007中报道了载脂蛋白类似物。在US2010/0028995中报道了四连蛋白三聚化多肽。Graversen，J.H.，等人在J.Cardiovas.Pharmacol.(51(2008)170-177)中报道称，载脂蛋白A-I的三聚化会延迟血浆清除并保持抗-动脉粥样硬化性质。Sirtori，C.R.，等人(Curr.Med.Chem.Immunol.Endocrine Metabol.Agents5(2005)321-333)报道了高密度脂蛋白施用，即用于治疗心血管疾病的一种新的治疗方式。

在WO03/097696中报道了用于治疗缺血性再灌注的方法和组合物。在WO2009/097587中报道了纳米级结合的双层分子、使用方法和生产。在WO2007/098122中报道了用于治疗黄斑变性和有关的眼病症的方法。在WO02/38609中报道了载脂蛋白类似物。在WO2005/041866中报道了药物制剂。报道了用于治疗和预防冠状动脉综合征的方法和给药方案。在WO99/16409中报道了基因疗法，供给载脂蛋白A-I激动剂的方法，和它们用于治疗血脂异常(dislipidemic)疾病的用途。在WO2008/106660中报道了分离的磷脂-蛋白颗粒。在WO2010/083611中报道了使用载脂蛋白(APO A-I)模拟肽/磷脂复合物预防和治疗舒张期功能障碍的方法。在WO2008/156873中，报道了APO A-I肽模拟物。在WO2008/094905中报道了胶囊化的HDL模拟肽。在WO98/56906中报道了三聚化模块。

发明概述

在本文中报道了缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，其具有提高的生产性能、特别是更少的表达副产物形成。

已经发现，以氨基酸残基脯氨酸(P)作为第一个编码的氨基酸残基开始的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白在粗制大肠杆菌培养上清液中的比例是90％或更高，其中有效地除去N-端甲硫氨酸残基。

本文报道的一个方面是，缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，其包含SEQ ID NO∶01的氨基酸序列或它的具有至少70％序列同一性的变体作为N-端氨基酸序列，

其中SEQ ID NO∶01具有氨基酸序列

PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ，

且所述变体具有N-端氨基酸残基PIVN。

本文报道的一个方面是，脂质颗粒，其包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白和一种或多种选白以下的脂质：磷脂、溶血磷脂、半乳糖脑苷脂、神经节苷脂、脑苷脂、甘油酯、脂肪酸、甘油三酯、类固醇脂质、胆固醇、胆固醇酯，或其类似物或衍生物。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含

a)如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，

b)磷脂酰胆碱，和

c)其它脂质。

在一个实施方案中，所述其它脂质是第二磷脂酰胆碱。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒由如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白、2种不同磷脂酰胆碱和洗涤剂组成。

在一个实施方案中，所述磷脂酰胆碱和所述第二磷脂酰胆碱的差别在于1个或2个羧酸部分或羧酸部分衍生物，其被酯化至所述磷脂酰胆碱的磷酸甘油主链。

在一个实施方案中，所述磷脂酰胆碱是POPC，且所述第二磷脂酰胆碱是DPPC。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒中POPC与DPPC的摩尔比是从99∶1至1∶99。在一个实施方案中，所述脂质颗粒中POPC与DPPC的摩尔比是从99∶1至10∶90。在一个实施方案中，所述脂质颗粒中POPC与DPPC的摩尔比是从99∶1至25∶75。

在一个实施方案中，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白与POPC和DPPC非共价地结合。

在一个实施方案中，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白是包含3个单体的多聚体。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含小于0.75重量％的洗涤剂。在一个实施方案中，所述洗涤剂是基于糖的洗涤剂、或基于聚亚氧烷基的洗涤剂、或基于胆汁盐的洗涤剂、或合成的洗涤剂、或它们的组合。在一个实施方案中，所述洗涤剂是胆酸。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒能够结合选自由以下组成的组的受体：cubilin、B类1型清除受体(SR-BI)、ATP-结合盒1(ABCA-1)、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)或磷脂转移蛋白(PLTP)。

在一个实施方案中，根据本发明的脂质颗粒的特征在于，所述脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的磷脂分子的数目是40-120。在一个实施方案中，所述脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的磷脂分子的数目是50-90。

在一个实施方案中，重组地生产所述缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。

本文报道的一个方面是，药物组合物，其包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒。

本文报道的一个方面是，用作药物的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒。

本文报道的一个方面是，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒用于制备药物的用途。

本文报道的一个方面是，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒用于制备药物的用途，所述药物

-用于患有急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)的患者的二级预防，或者

-用于预防或治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis)，其中以足以在受试者中诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定(pacification)的量包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于清除/溶解/稳定受试者血管中的粥样硬化斑块，或者用于使胆固醇从受试者的动脉壁重新分配至肝脏，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄(valvular stenosis)，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克(septic shock)

-用于治疗心绞痛(angina pectoris)，或者

-用于治疗心肌梗死(myocardial infarction)，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris)，或者

-用于治疗动脉狭窄(arterial stenoses)，诸如外周动脉疾病(PAD)、颈动脉狭窄(carotis stenosis)、脑动脉狭窄(cerebral arterial stenosis)或冠状动脉狭窄(coronary arterial stenosis)，或者

-用于治疗血管性痴呆(vascular demencia)，或者

-用于治疗一时性黑矇(amaurosis fugax)。

本文报道的一个方面是，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒在药物制备中的用途。

本文报道的一个方面是，一种用于制备药物的方法，所述药物

-用于患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防，或者

-用于预防或治疗动脉粥样硬化，其中以足以在受试者中诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定的量包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克

-用于治疗心绞痛，或者

-用于治疗心肌梗死，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛，或者

-用于治疗动脉狭窄，诸如外周动脉疾病(PAD)、颈动脉狭窄、脑动脉狭窄或冠状动脉狭窄，或者

-用于治疗血管性痴呆，或者

-用于治疗一时性黑矇。

本文报道的一个方面是，一种方法，所述方法用于

-患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防，或者

-预防或治疗动脉粥样硬化，其中以足以在受试者中诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定的量包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克

-用于治疗心绞痛，或者

-用于治疗心肌梗死，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛，或者

-用于治疗血管性痴呆，或者

-用于治疗一时性黑矇。

本文报道的一个方面是，用于治疗下述病症的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒：

-急性冠状动脉综合征，或者

-动脉粥样硬化，或者

-受试者血管中的粥样硬化斑块，或者

-受试者的瓣膜狭窄，或者

-感染性休克，或者

-心绞痛，或者

-心肌梗死，或者

-不稳定型心绞痛，或者

-动脉狭窄，或者

-外周动脉疾病(PAD)，或者

-颈动脉狭窄，或者

-脑动脉狭窄，或者

-冠状动脉狭窄，或者，

-血管性痴呆，或者

-一时性黑矇。

本文报道的一个方面是，用于下述用途的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒

-诱导反向胆固醇运输，或者

-诱导斑块平定，或者

-清除或溶解或稳定粥样硬化斑块，或者

-使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏，或者

-增加HDL颗粒的数目，或者

-除去内毒素。

本文报道的一个方面是，一种治疗个体的方法，所述个体患有急性冠状动脉综合征、或动脉粥样硬化、或在血管中的粥样硬化斑块、或瓣膜狭窄、或感染性休克、或心绞痛、或心肌梗死、或不稳定型心绞痛、或动脉狭窄、或外周动脉疾病(PAD)、或颈动脉狭窄、或脑动脉狭窄、或冠状动脉狭窄、或血管性痴呆、或一时性黑矇，所述方法包括：给所述个体施用有效量的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒。

本文报道的一个方面是，一种在个体中诱导反向胆固醇运输、或诱导斑块平定、或清除或溶解或稳定粥样硬化斑块、或使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏、或增加HDL颗粒的数目、或除去内毒素的方法，所述方法包括：给所述个体施用有效量的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，以诱导反向胆固醇运输、或诱导斑块平定、或清除或溶解或稳定粥样硬化斑块、或使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏、或增加HDL颗粒的数目、或除去内毒素。

在一个实施方案中，所述非正常的脂质水平是在体液中。在一个实施方案中，所述体液是全血或血清。

在一个实施方案中，所述非正常的脂质水平是升高的胆固醇水平。

在一个实施方案中，含有脂质的沉积物是在血管中的斑块。

在一个实施方案中，所述疾病是心血管疾病。

本文报道的一个方面是，一种治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于身体部分内的非正常的脂质水平或含有脂质的沉积物，所述方法包括

i)给需要治疗或人工系统的受试者施用治疗有效量的如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，和

ii)任选地监测受试者的脂质水平或含有脂质的沉积物的变化。

本文报道的一个方面是，一种用于患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒。

本文报道的一个方面是，一种诊断组合物，其包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒，其中所述载脂蛋白或所述脂质颗粒被标记，以允许检测样品或受试者内的融合蛋白或脂质颗粒。

本文报道的一个方面是，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒用于诊断的用途。

本文报道的一个方面是，如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒用于预防或治疗受试者的用途，所述受试者遭受以非正常的脂质水平或含有脂质的沉积物的存在为特征的疾病或病症。

本文报道的一个方面是，一种核酸，其编码如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。

本文报道的一个方面是，一种细胞，其包含如本文报道的核酸。

在一个实施方案中，所述细胞选自：大肠杆菌菌株，诸如CSPZ-2、K12菌株294(ATCC31446)，B，X1776(ATCC31537)，W3110(ATCC273325)，BL21，RM_82，SCS110，G，XL-1_F-，SE_I3009，LA__5709，C600，CSH_I，TG__1，UT400和UT5600。

本文报道的一个方面是，一种多聚体，其包含3个如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A—I融合蛋白作为单体，其中所述单体没有彼此共价地结合。

发明详述

定义

术语“载脂蛋白”表示，分别被包含在脂质或脂蛋白颗粒中的蛋白。

术语“载脂蛋白A-I”表示，具有蛋白-脂质和蛋白-蛋白相互作用性质的两亲螺旋多肽。载脂蛋白A-I作为267个氨基酸残基的前载脂蛋白原由肝脏和小肠合成，所述前载脂蛋白原分泌为载脂蛋白原，后者被切割成具有243个氨基酸残基的成熟多肽。载脂蛋白A-I是由6-8个不同的氨基酸重复序列组成，每个重复序列由22个氨基酸残基组成，所述重复序列被接头部分隔开，所述接头部分经常是脯氨酸，且在有些情况下由几个残基构成的片段组成。在GenPept数据库登录项NM-000039或数据库登录项X00566；GenBank NP-000030.1(gi4557321)中，报道了一个示例性的人载脂蛋白A-I氨基酸序列。人载脂蛋白A-I(SEQ ID NO∶02)具有天然存在的变体，诸如P27H、P27R、P28R、R34L、G50R、L84R、D113E、A-A119D、D127N、K131缺失、K131M、W132R、E133K、R151C(氨基酸残基151从Arg变为Cys，载脂蛋白A-I-Paris)、E160K、E163G、P167R、L168R、E171V、P189R、R197C(氨基酸残基173从Arg变为Cys，载脂蛋白A-I-Milano)和E222K。也包括具有保守氨基酸改变的变体。

术语“心血管疾病”通常表示与心脏或血管有关的疾病或病症，诸如动脉硬化(arteriosclerosis)、冠心病(coronary heart disease)、脑血管疾病(cerebrovascular disease)、主动脉与髂动脉疾病(aortoiliac disease)、缺血性心脏病(ischemic heart disease)或外周血管病(peripheral vasculardisease)。这样的疾病可能在由诸如心肌梗死(myocardial infarct)、卒中(stroke)、心绞痛(angina pectoris)、短暂脑缺血发作(transient ischemicattacks)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、主动脉瘤(aorticaneurysm)等疾病引起的不利事件(大部分导致受试者死亡)之前难以发现。

术语“胆酸盐”是指3α,7α,12α-三羟基-5β-胆-24-酸或其盐，特别是钠盐。

术语“临界胶束浓度”和它的缩写“CMC”(它们可以可互换地使用)表示这样的表面活性剂或洗涤剂的浓度：在该浓度以上，单个的洗涤剂分子(单体)白发地聚集成胶束(胶束、圆形杆、层状结构等)。

术语“保守氨基酸改变”表示，没有影响或改变根据本发明的脂质颗粒或载脂蛋白的特征的氨基酸序列的改变。通过本领域已知的标准技术，诸如定位诱变和PCR介导的诱变，可以引入改变。保守氨基酸改变包括这样的改变：其中用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，“变体”蛋白在本文中表示这样的分子：其氨基酸序列与“母体”蛋白的氨基酸序列相差至多10个添加、缺失和/或置换，在一个实施方案中，与“母体”蛋白的氨基酸序列相差约2至约5个添加、缺失和/或置换。如Riechmann，L.，等人，Nature332(1988)323-327,和Queen，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033所述，通过基于分子建模的诱变，可以进行氨基酸序列的改变。

使用众所周知的算法，诸如BLOSUM30、BLOSUM40、BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM55、BLOSUM60、BLOSUM62、BLOSUM65、BLOSUM70、BLOSUM75、BLOSUM80、BLOSUM85或BLOSUM90，可以计算不同的氨基酸序列的同源性和同一性。在一个实施方案中，所述算法是BLOSUM30。

通过将载脂蛋白与洗涤剂增溶的脂质在它们各自的转变温度下一起温育，可以形成脂质颗粒。术语“洗涤剂”表示表面活性的化学物质。“洗涤剂”通常是具有非极性疏水部分和极性亲水部分的两性分子。术语“两性离子洗涤剂”表示这样的表面活性的化学化合物：其具有总体为零的电荷，且同时包含至少一个带正电荷的部分和至少一个带负电荷的部分。在一个实施方案中，所述洗涤剂选自基于糖的洗涤剂、基于聚亚氧烷基的洗涤剂、基于胆汁盐的洗涤剂、合成洗涤剂或它们的组合。术语“基于糖的洗涤剂”表示选自下述的洗涤剂：正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃麦芽糖苷或5-环己基戊基-β-D-吡喃麦芽糖苷及其衍生物。术语“基于胆汁盐的洗涤剂”表示选自下述的洗涤剂：胆酸钠、胆酸钾、胆酸锂、3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基氨基]-基-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-氯酰氨基丙基)二甲基氨基]-2-羟基丙磺酸盐(CHAPSO)及其衍生物。术语“基于聚亚氧烷基的洗涤剂”表示选自下述的洗涤剂：吐温20、Triton X-100、Pluronic F68、及其衍生物。术语“合成洗涤剂”表示选自下述的洗涤剂：两性洗涤剂(Zwittergent)3-6、两性洗涤剂3-8、两性洗涤剂3-10、两性洗涤剂3-12及其衍生物。

例如药物制剂等试剂的“有效量”表示，在所需的剂量和时间段，有效地实现期望的治疗或预防结果的量。

术语“高密度脂蛋白颗粒”或它的缩写“HDL颗粒”(它们可以互换使用)表示，包含载脂蛋白A-I作为主要蛋白性化合物的脂质-蛋白复合物。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换地使用，并表示其中已经引入外源性核酸的细胞，包括这样的细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，它们包括原代转化细胞和从它们衍生出的后代，不论传代的数目。后代的核酸含量可以不与亲代细胞完全相同，而是可以含有突变。在本文中包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同的功能或生物活性的突变体后代。

术语“增加脂质流出”及其语法等效描述表示，增加从细胞或斑块的脂质流出水平和/或速率、加速从细胞或斑块的脂质流出、增强从细胞或斑块的脂质流出、促进从细胞或斑块的脂质流出、上调从细胞或斑块的脂质流出、提高从细胞或斑块的脂质流出和/或增进从细胞或斑块的脂质流出。在一个实施方案中，所述脂质流出包括磷脂、甘油三酯、胆固醇和/或胆固醇酯的流出。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，家养的动物(例如，牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例，人类和非人灵长类动物诸如猴子)、兔和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。

术语“DPPC”表示磷脂1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱，也被称作1，2-二棕榈酰-磷脂酰胆碱。

术语“多聚体”表示，由2个或更多个单体组成的复合物。多聚体由单体之间的非共价相互作用形成。每个单体包含一个多聚化结构域。在一个实施方案中，所述多聚体包含2或3个单体。在另一个实施方案中，所述多聚化结构域通过在每个单体中包含的各个多聚化结构域之间的非共价相互作用而相互作用。术语“多聚化结构域”是指，能够共价地或非共价地结合2个或更多个单体分子的氨基酸序列。多聚化结构域能够与不同的、类似的或相同的氨基酸序列的多聚化结构域相互作用。在一个实施方案中，所述多聚化结构域是四连蛋白三聚化结构元件或其衍生物，其氨基酸序列与SEQ ID NO∶03的共有氨基酸序列具有至少68％同一性。在一个实施方案中，在SEQ ID NO∶03的50位处的半胱氨酸残基被不同的氨基酸残基置换，在另一个实施方案中，被丝氨酸残基或苏氨酸残基或甲硫氨酸残基置换。包含多聚化结构域的多肽可以与一个或多个也包含多聚化结构域的其它多肽结合。简单地通过在适当条件下混合所述多肽，可以引发多聚体形成。在另一个实施方案中，所述多聚化结构域具有SEQ ID NO∶03的氨基酸序列，其中已经在所述氨基酸序列的N端或C端删除或添加1-10个残基。在另一个实施方案中，所述多聚化结构域具有SEQ ID NO∶03的氨基酸序列，其中已经从所述氨基酸序列的N端删除了6个或9个氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述多聚化结构域具有SEQ ID NO∶03的氨基酸序列，其中已经删除了N-端氨基酸残基L或N-端氨基酸残基C和L。在一个实施方案中，所述多聚化结构域是四连蛋白三聚化结构元件，且具有SEQ ID NO∶03的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多聚体是同聚体。

所述多聚体可以是同聚体或异聚体，因为可以组合包含多聚化结构域的不同载脂蛋白，以整合成多聚体。在一个实施方案中，所述多聚体是三聚同聚体。

根据一个实施方案，所述多聚化结构域从四连蛋白得到。在一个实施方案中，所述多聚化结构域包含具有SEQ ID NO∶03的氨基酸序列的四连蛋白三聚化结构元件。四连蛋白三聚化结构元件的三聚化效应由卷曲螺旋结构造成，所述卷曲螺旋结构与2个其它四连蛋白三聚化结构元件的卷曲螺旋结构相互作用，以形成三聚体。所述四连蛋白三聚化结构元件可以从人四连蛋白、兔四连蛋白、鼠四连蛋白或鲨鱼软骨的C-型凝集素得到。在一个实施方案中，所述四连蛋白三聚化结构元件包含与SEQ ID NO∶03的共有序列具有至少68％、或至少75％、或至少81％、或至少87％、或至少92％同一性的序列。

术语“非共价相互作用”表示：非共价结合力诸如离子相互作用力(例如盐桥)、非离子相互作用力(例如氢键)或疏水相互作用力(例如范德华力或π-堆叠相互作用)。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”，定义为将候选序列与参照多肽序列在进行序列比对(并在必要时导入间隙)以获取最大序列同一性百分比，且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，可使用属于本领域技术的各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同一性百分比。本领域技术人员可以决定比对序列的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而，为此目的，氨基酸序列同一性百分比的值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生。ALIGN-2序列比对计算机程序的作者是Genentech，Inc.，该源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washington D.C.，20559)，其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可从Genentech，Inc.(South San Francisco，加利福尼亚)得到ALIGN-2程序，或者可以从所述源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统，包括在数字UNIX V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。

在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者这样说：给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某一氨基酸序列同一性百分比)如下计算：

分数X/Y乘以100，

其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解，当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时，A相对于B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性百分比。除非另外特别指出，如在紧前面的段落中所述，使用ALIGN-2计算机程序获得在本文中所用的所有的氨基酸序列同一性百分比的值。

术语“药物组合物”表示这样的制剂：其处于允许其中含有的活性成分的生物活性为有效的形式，且其不含有对于所述制剂将要施用的受试者而言具有不可接受的毒性的其它组分。

“药学上可接受的载体”表示药物制剂中除了活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

术语“磷脂酰胆碱”表示由一个甘油部分、两个羧酸部分和一个磷酸胆碱部分组成的分子，其中所述甘油部分通过酯键(即2个羧酸酯键和1个磷酸酯键)与每个其它部分共价地连接，其中所述磷酸酯键是与所述甘油部分的1-羟基或3-羟基相连。术语“羧酸部分”表示包含至少一个酰基(R-C(O)O)的有机部分。所述磷脂酰胆碱可以属于任意种类或来源。在一个实施方案中，所述磷脂酰胆碱选自卵磷脂酰胆碱、大豆磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二月桂基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-油酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱和它们的类似物和衍生物。

本文使用的所有磷脂可以源自任意来源，即(在适当时)源自大豆、奶、蛋或甚至除了人类以外的动物的内部器官，它们可以源自天然来源，或是半合成的或甚至完全合成的。

术语“POPC”表示磷脂1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱，也被称作1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱。

本文使用的“治疗(treatment)”(及其语法变体，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床介入，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括、但不限于防止疾病发生或复发，缓和征状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和缓解或改善的预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发生或延缓疾病的进展。

术语“变体”也包括本文报道的载脂蛋白或载脂蛋白模拟物的变体，其中在所述变体中，各个载脂蛋白或载脂蛋白模拟物的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸置换、添加或缺失。所述改变可以增加或降低所述载脂蛋白对载脂蛋白受体或载脂蛋白转换酶的亲和力，或可以增加所述载脂蛋白变体与各个载脂蛋白相比的稳定性，或可以增加所述载脂蛋白变体与各个载脂蛋白相比在水溶液中的溶解度，或可以增加在宿主细胞中/由宿主细胞实现的所述载脂蛋白变体与各个载脂蛋白相比的重组生产。

缩短的四连蛋白-载脂蛋百A-I融合蛋白

在本文中报道了缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。

所述缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白是N-端缩短的人四连蛋白三聚化结构元件和野生型人载脂蛋白A-I的融合蛋白。因而，从位置10的异亮氨酸残基开始，截掉人四连蛋白部分的氨基酸序列的前9个氨基酸，并用N-端氨基酸残基脯氨酸延伸。作为该截短的后果，已经删除了在位置4的苏氨酸残基处的天然存在的O-糖基化位点。在四连蛋白三聚化结构元件和人载脂蛋白A-I之间，除去了5个氨基酸残基“SLKGS”(SEQ ID NO∶05)。

缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白可以具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列，或者是其具有至少70％序列同一性的变体。

所述四连蛋白三聚化结构元件会提供这样的结构域：所述结构域允许形成三聚的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，所述融合蛋白包含通过单个单体中的每一个之间的非共价相互作用构成的多聚体。

在一个实施方案中，所述野生型人载脂蛋白A-I可以是包含保守氨基酸置换的变体。

通过酶方法，经由NMR光谱法，或通过使用单克隆或多克隆抗-载脂蛋白-A-I抗体，可以确定载脂蛋白A-I。因此，本文报道的其它方面是特异性地结合如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的多克隆和单克隆抗体。这样的抗体可以用本领域技术人员已知的方法得到。并且，用本领域技术人员已知的方法，可以标记在免疫测定中使用的融合蛋白、包含融合蛋白的脂质颗粒、和结合融合蛋白或脂质颗粒的抗体。

在一个实施方案中，所述野生型人载脂蛋白A-I是包含1-10个保守氨基酸置换的变体。

因而，在一个实施方案中，所述缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白具有以下氨基酸序列

PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO∶01)。

在具有更少副产物(作为具有例如一个额外N-端氨基酸的融合蛋白)的情况下，得到具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。这显示在下表中。

表.

如果在大肠杆菌中生产缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，它从包涵体得到。

脂质颗粒

在本文中报道了脂质颗粒，其包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含

a)如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，

b)磷脂酰胆碱，和

c)其它脂质。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白、第一磷脂酰胆碱和第二磷脂酰胆碱。在一个实施方案中，所述第一磷脂酰胆碱和所述第二磷脂酰胆碱的差别在于一个或两个被酯化至磷脂酰胆碱的磷酸甘油主链上的羧酸部分或羧酸部分衍生物。在一个实施方案中，所述第一磷脂酰胆碱是POPC，且所述第二磷脂酰胆碱是DPPC。

在一个实施方案中，在所述脂质颗粒中的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白、磷脂酰胆碱和其它脂质非共价地结合。

脂质组合的选择决定了包含载脂蛋白的脂质颗粒的效力和肝安全性。在使用兔进行的含有二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)的脂质颗粒的体内研究中已经发现，用30mg/kg处理的兔表现出严重的副作用，但是存活，而用100mg/kg处理的兔死亡。

体外功能试验证实，含有单一磷脂酰胆碱(诸如DPPC或POPC)的脂质颗粒会活化LCAT。

还证实，当脂质颗粒包含不同磷脂的组合时，胆固醇流出更高。在下表中显示了为体内兔研究制备的差别在于它们的脂质组成的磷脂组合所得到的结果。

表.

证实了所有组合的胆固醇动员的体内数据，也确认了这些结果。但是，对于仅含有单一磷脂酰胆碱DPPC的脂质颗粒，或DPPC和鞘磷脂(SM)的组合，确定肝酶的增加(图1)。

从技术观点看，与用纯POPC形成脂质颗粒相比，用纯DPPC形成脂质颗粒更方便。通过使用不同磷脂的组合，降低沉淀物形成的风险。并且，与相变温度为4℃的纯POPC相比，纯DPPC的41℃的相变温度使得脂质颗粒的制备更容易。并且，得到的产物是更均质的。这可以通过经由SEC-MALLS的脂质颗粒分析来证实，所述SEC-MALLS是一种也允许确定蛋白-脂质组成(蛋白-缀合物分析)的分析工具。在图2中显示了在尺寸排阻层析(UV280检测)中分辨的样品的色谱图。通过多个分离的或半分离的峰的出现，可以证实样品的不均匀性。

当使用纯POPC生产脂质颗粒时，在一个实施方案中，所述脂质颗粒中的每个载脂蛋白单体的POPC分子的数目是在40-85之间，在一个实施方案中，是在50-80之间，且在一个实施方案中，是在54-75之间。

当使用纯DPPC生产脂质颗粒时，在一个实施方案中，所述脂质颗粒中的每个载脂蛋白单体的DPPC分子的数目是在50-150之间，在一个实施方案中，是在65-135之间，在一个实施方案中，是在76-123之间，且在一个实施方案中，是在86-102之间。

当使用摩尔比为1∶3的POPC和DPPC的混合物生产脂质颗粒时，在一个实施方案中，所述脂质颗粒中的每个载脂蛋白单体的磷脂分子的数目是在约50至约120之间，在一个实施方案中，是在约65至约105之间，在一个实施方案中，是在约72至约96之间。

当使用摩尔比为1∶1的POPC和DPPC的混合物生产脂质颗粒时，在一个实施方案中，所述脂质颗粒中的每个载脂蛋白单体的脂质分子的数目是在50-120之间，在一个实施方案中，是在60-100之间，且在一个实施方案中，是在71-92之间。

当使用摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的混合物生产脂质颗粒时，在一个实施方案中，所述脂质颗粒中的每个载脂蛋白单体的脂质分子的数目是在50-90之间。在一个实施方案中，所述数目是在60-90之间。在一个实施方案中，所述数目是在60-88之间。在一个实施方案中，所述数目是在60-80之间。

就生产包含载脂蛋白和POPC的脂质颗粒而言，在一个实施方案中，采用1∶40至1∶100的载脂蛋白∶POPC摩尔比，在一个实施方案中，采用1∶40至1∶80的摩尔比，在一个实施方案中，采用约1∶60的摩尔比。

就生产包含载脂蛋白和DPPC的脂质颗粒而言，在一个实施方案中，采用1∶70至1∶100的载脂蛋∶DPPC摩尔比，在一个实施方案中，采用1∶80至1∶90的摩尔比，在一个实施方案中，采用约1∶80的摩尔比。

就生产包含载脂蛋白、POPC和DPPC的脂质颗粒而言，在一个实施方案中，采用1∶60至1∶100的载脂蛋白与POPC和DPPC摩尔比，其中POPC和DPPC处于1∶3摩尔比，在一个实施方案中，采用1∶70至1∶90的摩尔比，在一个实施方案中，采用约1∶80的摩尔比。

就生产包含载脂蛋白、DPPC和POPC的脂质颗粒而言，在一个实施方案中，载脂蛋白与POPC和DPPC(其中POPC和DPPC具有1∶1摩尔比)的摩尔比是从1∶60至1∶100，在一个实施方案中，所述摩尔比是从1∶60至1∶80，且在一个实施方案中，所述摩尔比是约1∶70。

就生产包含载脂蛋白、DPPC和POPC的脂质颗粒而言，在一个实施方案中，采用1∶50至1∶100的载脂蛋白与POPC和DPPC(其中POPC和DPPC具有3∶1摩尔比)的摩尔比。在一个实施方案中，采用1∶50至1∶70的摩尔比。在一个实施方案中，采用约1∶60的摩尔比。

在一个实施方案中，如果使用脂质混合物来生产脂质颗粒，所述混合物具有4℃至45℃的相变温度，在一个实施方案中，相变温度是10℃至38℃，且在一个实施方案中，相变温度是15℃至35℃。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含1-10个融合蛋白分子/脂质颗粒的平均数目，在一个实施方案中，1-8个融合蛋白分子/脂质颗粒，且在一个实施方案中，1-4个融合蛋白分子/脂质颗粒。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含至少1或2或3或4或5或6或7或8或9或10个融合蛋白分子/脂质颗粒的平均数目。在一个实施方案中，所述平均数目是1。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含一种或多种除了所述融合蛋白以外的其它多肽。

非限制性地，所述脂质颗粒可以充当酶辅因子和/或用于吸收脂质、特别是胆固醇的载体。

一种或多种洗涤剂可以存在于本文报道的脂质颗粒中。这样的洗涤剂可以是任意洗涤剂，即药学上可接受的洗涤剂或处于无毒浓度的其它洗涤剂，诸如非离子或离子洗涤剂。所述非离子洗涤剂可以是含有一个或多个羟基的有机化合物的环氧烷烃衍生物。

在一个实施方案中，所述非离子洗涤剂选自乙氧基化的和/或丙氧基化的醇或酯化合物或其混合物。在一个实施方案中，所述酯选自山梨醇和脂肪酸的酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯或脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、油性蔗糖酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾醇醚、聚氧乙烯-聚丙氧基烷基醚、嵌段共聚物和十六烷基醚(cethyl ether)、聚氧乙烯蓖麻油或氢化蓖麻油衍生物和聚甘油脂肪酸酯。

在一个实施方案中，所述非离子洗涤剂选自

所述离子洗涤剂可以是胆管剂。在一个实施方案中，所述离子洗涤剂选自胆酸或脱氧胆酸或它们的盐和衍生物，或选自游离脂肪酸，诸如油酸、亚油酸和其它。

在一个实施方案中，所述离子洗涤剂选自阳离子脂质(如C₁₀-C₂₄烷基胺或烷醇胺)和阳离子胆固醇酯。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含小于0.75重量％的洗涤剂。

在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含小于0.3重量％的洗涤剂。

在一个实施方案中，所述洗涤剂选自基于糖的洗涤剂、基于聚亚氧烷基的洗涤剂、基于胆汁盐的洗涤剂、合成洗涤剂或它们的组合。在一个实施方案中，所述洗涤剂是胆酸。

性能：

如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒可以用于治疗和/或诊断疾病或病症，所述疾病或病症的特征在于：非正常的脂质水平或身体部分内的脂质沉积，诸如血管中的斑块。

为了确定本文报道的脂质颗粒支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力，通过添加胆固醇的乙醇溶液，可以将胆固醇掺入脂质颗粒中。含有纯POPC的脂质颗粒是比含有DPPC的复合物更好的LCAT底物，这与它们的载脂蛋白组分无关，所述载脂蛋白组分诸如野生型载脂蛋白A-I或四连蛋白-载脂蛋白A-I(图3)。

包含POPC和DPPC的不同混合物的脂质颗粒中的胆固醇酯化的初速度表明，混合物是比单一纯的磷脂酰胆碱更好的LCAT底物。这可以从胆固醇酯化的初速度看出(参见下表和图4)。

表.

可以将巨噬细胞样人THPl细胞暴露于胆固醇受体试验化合物，所述巨噬细胞样人THPl细胞是通过将THP-1单核细胞性白血病细胞暴露于佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯得到，并加载了放射性标记的胆固醇示踪剂。

由受体试验化合物诱导的流出速度可以计算为上清液中的胆固醇放射性与细胞及它们的上清液中的放射性总和之比，并与暴露于不含受体的培养基的细胞进行对比，并通过线性拟合进行分析。可以使用暴露于和未暴露于RXR-LXR激动剂的细胞进行平行实验，已知所述RXR-LXR激动剂主要上调ABCA-1并使流出偏向ABCA-1介导的运输。

在没有用RXR-LXR脂质颗粒预处理的细胞中，可以看到与用未脂质化的四连蛋白-载脂蛋白A-I得到的流出相比更高的胆固醇流出增加。在测试的系列中可以观察到脂质混合物对流出的仅微小的影响(图5)。在用RXR-LXR预处理的细胞中，使用未脂质化的四连蛋白-载脂蛋白A-I可以看到可比较的胆固醇流出增加。与用未预处理的细胞观察到的结果相比，总增加更高。在测试的系列中可以观察到脂质混合物对流出的仅微小的影响(图6)。

在兔体内测试了不同的脂质颗粒。所述脂质颗粒作为静脉内输注进行施用，并在施用以后的96h内进行系列血液取样。确定了肝酶、胆固醇和胆固醇酯的值。就所有试验脂质颗粒而言，血浆浓度是可比较的，包含初始分布期和随后的血浆浓度对数线性下降(图7)。从下表可以看出，所有试验化合物的药代动力学参数是类似的。观察到的半衰期接近1.5天。

表.

从图8可以看出，胆固醇被动员，并在血浆中酯化。甚至在四连蛋白-载脂蛋白A-I的浓度已经在下降时，血浆胆固醇酯水平确实继续增加。当血浆四连蛋白-载脂蛋白A-I水平已经下降至约0.5mg/ml(正常野生型载脂蛋白A-I的约50％)时，仍然可以检测到增加的胆固醇酯水平。

从图1和9可以看出，包含四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒没有在兔中以及在小鼠中诱导肝酶。在静脉内施用以后2小时得到的血浆样品中，也没有能够测得溶血(图10)。

因此，本文报道的多个方面是药物组合物和诊断组合物，其包含如本文报道的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或如本文报道的脂质颗粒。

如下表所示，本文报道的脂质颗粒具有与未脂质化的载脂蛋白和其它脂质颗粒相比改善的体内性质。

表.

通过在载脂蛋白体内施用以后比较总胆固醇的各自偏移和载脂蛋白浓度，可以确定将胆固醇动员到血液中的效率。就定量评估而言，计算总胆固醇的基线校正的浓度-时间曲线下面积(AUC)除以载脂蛋白的浓度-时间曲线下面积的商。

如本文报道的脂质颗粒，特别是包含SEQ ID NO∶01的四连蛋白-载脂蛋白以及摩尔比为3∶1的POPC和DPPC的脂质颗粒，显示出增强的体内胆固醇动员。

脂质颗粒的形成

就本文报道的脂质颗粒的形成而言，已知不同的方法，诸如冷冻干燥、冻融、洗涤剂增溶接着透析、微流体化、超声处理(sonification)和匀浆化。

例如可以与纯化的载脂蛋白一起温育磷脂和洗涤剂的混合物水溶液。所述载脂蛋白可以以天然形式加入。然后通过透析或渗滤除去洗涤剂。可以如下形成包含缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的脂质颗粒：在它们各自的转变温度下，将洗涤剂增溶的脂质与单体或多聚体形式的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白一起温育。通过透析除去洗涤剂，导致脂质颗粒的形成。一种用于形成含有载脂蛋白的脂质颗粒的常见方法，是基于在例如下述文献中描述的胆酸盐方法：Jonas，A.，Methods Enzymol．128(1986)553-582或Experimental Lung Res．6(1984)255-270。通过透析除去洗涤剂，导致脂质颗粒的形成。

就脂质颗粒形成而言必须考虑的主要几点是：i)生物活性的要求，和ii)与脂质颗粒的可制造性有关的技术要求。就包含载脂蛋白的脂质颗粒的形成而言，这些要求指向相反的反向。

从技术观点看，将选择含有羧酸部分的饱和磷脂，所述羧酸部分具有16个碳原子和更短的链(例如二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DPPC；二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DMPC等)。与此相反，从生物学数据可以假定，含有具有至少16个碳原子链的羧酸部分的不饱和磷脂(例如棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，POPC；硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，SOPC)是更有效的且无肝毒性的。

磷脂酰胆碱DPPC和POPC及其混合物可以用于形成含有载脂蛋白的脂质颗粒。这些示例性的磷脂酰胆碱的差别在于一个羧酸部分，且具有一个相同的酯化至磷酸甘油主链上的羧酸部分。当使用DPPC时，脂质颗粒的生产更容易。相反，POPC在体外功能测定中更有效，特别是作为酶卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)的活化的底物，所述酶是将动员的胆固醇转化成胆固醇酯所必需的。已经发现，与包含仅一种磷脂酰胆碱的脂质颗粒相比，包含不同摩尔比的2种磷脂酰胆碱(例如POPC和DPPC)的混合物的脂质颗粒具有改善的性质(参见例如图4)。

已经报道了用于从重组载脂蛋白或源自人HDL颗粒的去脂质化载脂蛋白重构脂质颗粒的不同方法(HDL＝高密度脂蛋白)。例如，与纯化的载脂蛋白一起温育磷脂和洗涤剂的混合物水溶液。所述载脂蛋白以天然形式加入。此后通过透析或渗滤除去洗涤剂。可以如下形成包含缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的脂质颗粒：在它们各自的转变温度下，将洗涤剂增溶的脂质与缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白或其多聚体一起温育。通过透析除去洗涤剂，导致脂质颗粒的形成。

通过沉淀和/或色谱法步骤的组合，可以纯化脂质颗粒。例如，可以在疏水吸附色谱法步骤中除去多余的洗涤剂，即没有成为脂质颗粒的一部分的洗涤剂。用不含洗涤剂的溶液，可以从疏水吸附材料中回收脂质颗粒。

提供下列实施例、序列表和附图以帮助理解本发明，在后附权利要求中阐述了本发明的真实范围。应理解，可以在不脱离本发明的精神的条件下，对所述程序进行修改。

序列表的描述

SEQ ID NO：01 缩短的四连蛋白．载脂蛋白A-I融合蛋白。

SEQ ID NO：02 人载脂蛋白A-I。

SEQ ID NO：03 人四连蛋白三聚化结构域。

SEQ ID NO：04 缩短的人四连蛋白三聚化结构域。

SEQ ID NO：05 切离的肽。

附图说明

图1.用5种具有不同脂质组成的脂质颗粒进行的体内兔研究的结果。上图：胆固醇动员，并且因此可以显示所有制备批次的效力。下图：就使用DPPC作为单一磷脂制备的脂质颗粒而言，观察到肝酶的增加。

图2.根据本发明的POPC和载脂蛋白的脂质颗粒的SEC-MALLS分析；摩尔比1:20至1:160。

图3.DPPC和POPC对LCAT活性的影响。

图4.在含有POPC和/或DPPC的脂质颗粒中，胆固醇酯化的初速度。

图5.在没有用RXR-LXR激动剂激发的细胞中，胆固醇流出至THP-1衍生的泡沫细胞(foam cell)。

图6.在使用RXR-LXR激动剂进行ABCA-I途径活化以后，胆固醇流出至THP-1衍生的泡沫细胞。

图7.不同的载脂蛋白组合物的时间依赖性的血浆浓度。

图8.血浆中的胆固醇动员和酯化的时间和浓度进程。

图9.在给小鼠单次静脉内注射100mg/kg以后，包含根据本发明的载脂蛋白的不同组合物导致的肝酶释放的对比。

图10.体内兔研究-在血浆中的自发溶血。

图11.含有摩尔比为1∶20至1∶160的POPC和四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒的SEC-MALLS分析。

图12.用四连蛋白-载脂蛋白A-I进行的体内兔研究的结果，所述四连蛋白-载脂蛋白A-I用DMPC(1∶100)(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)脂质化(a)和在PBS中未脂质化(b)。

图13.在5℃和40℃保存的含有野生型载脂蛋白A-I(A)和本文报道的四连蛋白-载脂蛋白A-I(B)的脂质颗粒的SE-HPLC色谱图。

材料和方法

尺寸排阻-HPLC：

在ASI-100HPLC系统(Dionex，Idstein，德国)上用Tosoh Haas TSK3000SWXL柱进行色谱法。通过UV二极管阵列检测器(Dionex)在280nm处监视洗脱峰。在将浓缩样品溶解至1mg/ml后，用由200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾组成的缓冲液(pH7.0)洗涤该柱，直到达到稳定的基线。应用0.5ml/min的流速，在等度条件下进行分析运行，在室温历时30分钟。用Chromeleon(Dionex，Idstein，德国)手工地积分色谱图。通过将高分子量形式的曲线下面积(AUC)与单体峰的AUC进行对比，确定聚集百分比。

动态光散射(DLS)：

DLS是一种用于测量颗粒大小(一般在亚微米级大小范围)的非侵入技术。在本发明中，使用具有温控石英比色皿(25℃)的Zetasizer Nano S设备(Malvern Instruments，Worcestershire，英国)来监视在1nm至6μm之间的大小范围。在173°角，检测反散射激光的强度。该强度以依赖于颗粒扩散速度的速率波动，所述颗粒扩散速度又由颗粒大小控制。因此，可从散射光强度波动的分析产生颗粒大小数据(Dahneke，B.E(编)，Measurement ofSuspended Particles by Quasielectric Light Scattering，Wiley Inc.(1983)；Pecora，R.，Dynamic Light Scattering∶Application of Photon CorrelationSpectroscopy,Plenum Press(1985))。使用DTS软件(Malvern)的倍数狭小模式(multiple narrow mode)，计算通过强度获得的大小分布。用未稀释的样品进行实验。

SEC-MALLS：

SEC-MALLS是含有3个检测器系统的尺寸排阻层析的组合：i)紫外检测，ii)折射率检测和iii)光散射检测。就通过大小实现的分离而言，使用得自GE Healthcare的Superose6柱10/300GL柱。用PBS缓冲液pH7.4，以0.4ml/min的流速，等度地运行所述方法。3个检测器系统串联连接。通过折射率检测器监视完整的脂质颗粒(蛋白-脂质颗粒)信号，而在280nm测得的紫外吸光度确定由蛋白部分导致的信号。通过从完整信号中简单地减去蛋白紫外信号，得到脂质级分的比例。使用光散射，使得可以检测各种物质的分子质量并从而完整地且详细地描述脂质颗粒。

洗涤剂测定：

通过反相色谱法与蒸发光散射检测器联用(RP-ELSD)，测定残余的洗涤剂。使用得自Phenomenex(Aschaffenburg，德国)的Luna C18(4.6x150mm，5μm，

)作为柱。在穿过10kDa膜离心以后，使用90μL流过液进行HPLC分离。在等度条件下，用含有0.1％(v/v)三氟乙酸的74％(v/v)甲醇溶液进行洗脱。将柱温度设定在30℃。使用30℃的雾化温度、80℃的蒸发温度和1.0l/min的气体流量，通过蒸发光散射检测器进行检测。在0.22μg至7.5μg胆酸盐范围内的胆酸盐的情况下，通过建立校正曲线，进行残余洗涤剂的定量。

蛋白洳定：

使用在氨基酸序列基础上计算出的摩尔消光系数，通过测定在280nm的光密度(OD)，确定蛋白浓度。

重组DNA技术：

如在Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中所述，使用标准方法操作DNA。根据生产商的说明书，使用分子生物学试剂。

实施例1

大肠杆菌表达质粒的制备和描述

通过重组方式，制备缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。表达的融合蛋白在N端至C端方向具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列。

使用已知的重组方法和技术，通过连接适当的核酸区段，装配编码前体多肽的融合基因。通过DNA测序，验证通过化学合成制备的核酸序列。可以如下制备用于生产SEQ ID NO∶01的融合蛋白的表达质粒：

质粒1(1-pBRori-URA3-LACI-SAC)是用于在大肠杆菌中表达核心链霉亲和素的表达质粒。通过连接源自质粒2(2-pBRori-URA3-LACI-T-重复序列；参见EP-B1422237)的3142bp长的EcoRI/CelII-载体片段和编码EcoRI/CelII-片段的435bp长的核心链霉亲和素，制备它。

核心链霉亲和素大肠杆菌表达质粒包含下述元件：

-用于在大肠杆菌中复制的得自载体pBR322的复制起点(根据Sutcliffe，G.，等人，Quant.Biol.43(1979)77-90，与bp位置2517-3160相对应)，

-编码乳清苷5’-磷酸脱羧酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)URA3基因(Rose，M.等人.Gene29(1984)113-124)，其允许通过大肠杆菌pyrF突变株(尿嘧啶营养缺陷型)的互补进行质粒选择，

-核心链霉亲和素表达盒，其包含

-T5杂合启动子(T5-PN25/03/04杂合启动子，参见Bujard，H.，等人，Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber，D.，等人，Immunol.Methods IV(1990)121-152)，包括根据Stueber，D.，等人(参见前面)的合成核糖体结合位点，

-核心链霉亲和素基因，

-2个噬菌体衍生的转录终止子：λ-T0终止子(Schwarz，E.，等人，Nature272(1978)410-414)和fd-终止子(Beck，E.和Zink，B.，Gene1-3(1981)35-58)，

-得自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh，PJ.，Nature274(1978)765-769)。

可以如下制备用于表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的最终表达质粒：使用单独的侧接EcoRI和CelII限制性内切核酸酶切割位点，从质粒1切离核心链霉亲和素结构基因，并将编码所述融合蛋白的侧接EcoRII/CelII限制位点的核酸插入3142bp长的EcoRI/CelII-1质粒片段中。

实施例2

四连蛋白-载脂蛋白A-I的表达

为了表达如本文报道的融合蛋白，采用了大肠杆菌宿主/载体系统，其允许通过大肠杆菌营养缺陷体(PyrF)的互补进行无抗生素的质粒选择(EP0972838和US6,291,245)。

通过电穿孔，用表达质粒转化大肠杆菌K12菌株CSPZ-2(leuB、proC、trpE、th-1、ΔpyrF)。首先在37℃在琼脂平板上培养转化的大肠杆菌细胞。

就前发酵(pre-fermentation)而言，已经使用根据Sambrook，等人(Molecular Cloning∶A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989))的M9培养基，其中补充了约1g/l L-亮氨酸、约1g/l L-脯氨酸和约1mg/l盐酸硫胺素。

就前发酵而言，从原代种子库安瓿中取出2ml，接种在1000ml具有挡板的锥形瓶内的300ml M9-培养基。在旋转振荡器上在37℃培养13小时，直到达到1-3的光密度(578nm)。

就发酵而言，使用根据Riesenberg等人的分批培养基(Riesenberg，D.，等人，J.Biotechnol.20(1991)17-27)∶27.6g/l葡萄糖*H₂O，13.3g/l KH₂PO₄，4.0g/l(NH₄)₂HPO₄，1.7g/l柠檬酸盐，1.2g/l MgSO₄*7H₂O，60mg/l柠檬酸铁(III)，2.5mg/l CoCl₂*6H₂O，15mg/l MnCl₂*4H₂O，1.5mg/l CuCl₂*2H₂O，3mg/l H₃BO₃，2.5mg/l Na₂MoO₄*2H₂O，8mg/l Zn(CH₃COO)₂*2H₂O，8.4mg/l Titriplex III，1.3ml/l Synperonic10％消泡剂。给所述分批培养基补充5.4mg/l盐酸硫胺和各1.2g/l的L-亮氨酸和L-脯氨酸。进料1溶液含有700/l葡萄糖，其补充了19.7g/l MgSO₄*7H₂O。用于pH调节的碱性溶液是12.5％(w/v)NH3水溶液，其分别补充了50g/l L-亮氨酸和50g/l L-脯氨酸。所有组分都溶解在去离子水中。

在10l Biostat C DCU3发酵罐(Sartorius，Melsungen，德国)中进行发酵。从6.4l无菌发酵分批培养基+300ml得白前发酵的接种物开始，在37℃、pH6.9±0.2、500毫巴进行分批发酵，通气速率为10l/min。在耗尽最初补充的葡萄糖以后，将温度转换至28℃，发酵进入进料分批模式。在此时，如下将相对溶解氧值(pO2)保持在50％(DO-stat，参见例如Shay,L.K.，等人，J.Indus.Microbiol.Biotechnol.2(1987)79-85)：加入进料1，并与之组合地不断增加搅拌器速度(在10小时内从550rpm至1000rpm，和在16小时内从1000rpm至1400rpm)和通气速率(在10小时内从10l/min至16l/min in，和在5小时内从16l/min至20l/min in)。当在培养大约8小时以后pH达到调节下限(6.70)时，通过加入碱性溶液，进行额外氨基酸的供给。通过在70的光密度处加入1mM IPTG，诱导重组治疗性蛋白的表达。

在发酵结束时，使用加热步骤，使细胞质的和可溶性的表达的四连蛋白-载脂蛋白A-I转换成不溶性蛋白聚集体(所谓的包涵体)，在所述加热步骤中在收获之前将发酵罐中的整个培养液加热至50℃达1或2小时(参见例如EP-B1486571)。此后，用无逆流离心机(flow-through centrifuge)离心(13,000rpm，13l/h)发酵罐的内容物，并在-20℃保存收获的生物质，直到进一步加工。发现合成的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白仅存在于不溶性蛋白聚集体形式(所谓的包涵体(IB))的不溶性细胞碎片级分中。

从发酵罐取出样品，一个样品是在诱导之前取出，其它样品是在蛋白表达的诱导以后的指定时间点取出，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些样品。将得白每个样品的相同量的细胞(OD_目标＝5)再悬浮于5mL PBS缓冲液中，并通过在冰上的超声处理进行破碎。然后，将100μL每份悬浮液离心(15,000rpm，5分钟)，并取出每份上清液，转移至单独的瓶。这是为了区分可溶性的和不溶性的表达的靶蛋白。向每份上清液(＝可溶性的)级分中加入300μL SDS样品缓冲液(Laemmli，U.K.，Nature227(1970)680-685)，并向每份沉淀物(＝不溶性)级分中加入400μL SDS样品缓冲液。将样品在摇动下在95℃加热15分钟，以溶解和还原样品中的所有蛋白。在冷却至室温以后，将5μL每个样品转移至4-20％TGX Criterion Stain Free聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。另外，将5μL分子量标准品(Precision Plus Protein Standard，Bio-Rad)和3种量(0.3μL、0.6μL和0.9μL)的具有已知产物蛋白浓度(0.1μg/μL)的定量标准品放在凝胶上。

在200V进行电泳60分钟，此后将凝胶转移至GelDOC EZ Imager(Bio-Rad)，并用紫外辐射处理5分钟。使用Image Lab分析软件(Bio-Rad)，分析凝胶图像。利用3种标准品，以>0.99的系数计算出线性回归曲线，并由此计算出原始样品中的靶蛋白浓度。

实施例3

缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的制备

通过将收获的细菌细胞重新悬浮于Tris缓冲溶液(0.1M，补充了1mMMgSO₄，pH7.0)中，进行包涵体制备。在加入DNA酶以后，通过在900巴的压力匀浆化，破碎细胞。将包含1.5M NaCl和60mM EDTA的缓冲溶液加入匀浆化的细胞悬浮液中。在用25％(w/v)HCl调节pH值至5.0以后，在进一步的离心步骤以后，得到最终的包涵体浆。可以在一次性使用的无菌塑料袋中在-20℃保存所述浆，直到进一步加工。

将包涵体浆(约15kg)溶解在碱性氯化钾溶液中，并通过深度过滤进行澄清。可替换地，将包涵体浆溶解在盐酸胍溶液(1501，6.7M)中。

实施例4

缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的重折叠和脂质化

a)一般胆酸盐方法

以1∶1.35的磷脂∶胆酸盐摩尔比，将纯的结晶的POPC或DPPC(Lipoid，瑞士)溶解在含有胆酸盐的水性缓冲液(脂质化缓冲液)中。在氮气氛下温育所述混合物，并在室温(POPC)或在55℃(DPPC)避光，直到得到澄清溶液。将所述澄清的脂质-胆酸盐溶液冷却至4℃(POPC)或在41℃保存(DPPC)。以确定的载脂蛋白∶磷脂比，在4℃(POPC)或41℃(DPPC)加入缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。为了形成脂质颗粒，将所述反应混合物在氮气氛下在4℃(POPC)或41℃(DPPC)温育过夜，并避光。最后，通过在脂质化缓冲液中的充分透析(4℃/41℃)，除去胆酸盐。最后，离心样品以除去沉淀物。

可以如上所述制备胆酸盐增溶的含有POPC和DPPC的脂质溶液。通过以期望的比例组合脂质溶液，制备脂质混合物，随后在各自的T_m(T_m＝相变温度)贮存。如关于纯的脂质溶液所述，但是在选择的脂质混合物的各个T_m，进缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的脂质颗粒形成。

可以使用下述脂质化缓冲液：

1.补充了250mM盐酸精氨酸、7.5％蔗糖的50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5

2.补充了250mM盐酸精氨酸、7.5％蔗糖、10mM甲硫氨酸的50mM磷酸氢二钾缓冲液，pH7.5

3.补充了140mM NaCl、10mM甲硫氨酸的250mM三羟氨基甲烷(TRIS)，pH7.5

4.补充了250mM盐酸精氨酸、7％海藻糖、10mM甲硫氨酸的50mM磷酸氢二钾缓冲液，pH7.5。

通过分析SEC，可以评估形成的包含缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白样品的脂质颗粒的同质性。总体而言，与磷脂的选择相比，脂质化缓冲液的选择仅具有微小影响。DPPC-脂质颗粒作为一个主峰洗脱，而POPC-脂质颗粒显示出双峰图样。脂质颗粒形成被证实是可行的，不论脂质化缓冲液如何。在测试的各种缓冲液中，最适当的脂质化缓冲液被鉴定为：250mM Tris、140mM NaCl、10mM甲硫氨酸，pH7.4。

脂质化混合物含有确定量的融合蛋白，相应地计算各种磷脂(例如POPC)的量。脂质的摩尔量的所有计算都是基于缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白单体。

可以使用SEC-MALLS分析来获得关于脂质颗粒和它们的载脂蛋白-磷脂组合物的同质性的更详细信息(蛋白-缀合物分析)。图11显示了SEC分辨的样品的一个示例性色谱图(UV280检测)。在这里，将1∶160样品分成3个分离的峰。1∶80样品似乎含有不同大小的至少2种物质，显示为双峰。从样品1∶20得到的峰显示出最均匀的产物。

蛋白-缀合物分析使得能够计算从SEC柱洗脱的每种脂质颗粒的蛋白(蛋白MW)和脂质组分(脂质MW)的总分子量。基于缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白单体(32.7kDa)和POPC(760Da)的分子量，可以计算脂质颗粒的组成(n蛋白和n POPC)。在所有摩尔比，在脂质颗粒主峰中发现的载脂蛋白组分的分子量是大约100kDa，这与每个脂质颗粒的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白三聚体相对应。n(POPC)/n(蛋白单体)比率给出了在脂质颗粒中的每个缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白单体的POPC分子的数目。每个缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白单体的POPC分子的数目会变化。蛋白百分比值是脂质化程度的参数。脂质颗粒中的蛋白的百分比越低，脂质化程度越高。

b)用于POPC和DPPC和胆酸钠的重折叠和脂质颗粒形成的快速稀释方法

根据实施例1-3在大肠杆菌中表达缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，并进行纯化。在纯化以后，通过针对含有250mM Tris、140mM NaCl、6.7M盐酸胍的溶液(pH7.4)渗滤，交换缓冲液。将蛋白浓度调至约30mg/ml。

制备2份单独的脂质储备溶液。通过在室温将100mol/l的POPC溶解在含有250mM Tris-HCl、140mMNaCl、135mM胆酸钠的缓冲液(pH7.4)中，制备溶液A。通过在41℃将100mol/l的DPPC溶解在250mMTris-HCl、140mM NaCl、135mM胆酸钠(pH7.4)中，制备溶液B。以3∶1的比例，混合脂质储备溶液A和B，并在室温温育2小时。通过在6365ml250mM Tris-HCl、140mM NaCl(pH7.4)中稀释384ml脂质储备混合物，制备重折叠缓冲液。将该缓冲液在室温搅拌另外24小时。

通过将在250mM Tris、140mM NaCl、6.7M盐酸胍(pH7.4)中的750ml缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白溶液加入重折叠缓冲液中，引发重折叠和脂质颗粒形成。这导致盐酸胍的1∶10稀释。在不断搅拌的同时，将该溶液在室温温育至少12小时。通过渗滤，除去洗涤剂。

c)从变性蛋白或天然蛋白开始的脂质颗粒形成

在下面，使用如在前述实施例1-3中生产的SEQ ID NO∶01的四连蛋白-载脂蛋白A-I。

在项目a)中报道的方法(第一方法)需要天然载脂蛋白进行脂质颗粒形成，而在项目b)中报道的方法(第二方法)从完全变性的载脂蛋白开始进行脂质颗粒形成。

在一个示例性的第一方法中，以3.46mg/ml的蛋白浓度，针对由250mM Tris、140mM NaCl、10mM甲硫氨酸组成的缓冲液(pH7.5)充分地透析在6.7M盐酸胍、50mM Tris、10mM甲硫氨酸(pH8.0)中的变性的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白。然后加入POPC和胆酸盐的混合物，以得到6mM POPC和8mM胆酸盐在溶液中的终浓度。这对应着60个POPC分子/缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白单体分子(60∶1)的比率。随后通过渗滤除去洗涤剂。通过SEC-MALLS，分析形成的蛋白-脂质复合物。使用该方法，形成异质产物。

在一个示例性的第二方法中，在脂质化缓冲液中以1∶10(v/v)直接稀释在6.7M盐酸胍、50mM Tris、10mM甲硫氨酸(pH8.0)中的变性的缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，得到2.5mg/ml的蛋白浓度。所述脂质化缓冲液由6mM胆酸盐和4.5mM POPC组成，这对应着60∶1的脂质∶蛋白比。使用该方法形成均匀的产物。

d)25％DPPC/75％POPC

如在体实施例的项目a)中所报道的，利用下述参数相应地进行脂质颗粒形成：

蛋白：缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白

脂质化缓冲液：250mM Tris-HCl，140mM NaCl，10mM甲硫氨酸，pH7.4

脂质化：在18℃

透析：在室温

试验的摩尔比：1∶60

脂质颗粒形成是直接的。在下表中显示了SEC结果的总结(通过AUC的积分来计算百分比)。

表.

使用25％DPPC和75％POPC的脂质混合物进行缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白的脂质颗粒形成，以1∶60(蛋白∶磷脂)的摩尔比得到均匀产物。在下表中显示了25％DPPC/75％POPC和缩短的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(蛋白∶磷脂的摩尔比为1∶60)的脂质颗粒的蛋白缀合物分析的总结。

表.

实施例5

载脂蛋白的应用

a)DPPC和POPC对LCAT活性的影响

检查了包含棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)以及重组野生型载脂蛋白A-I或四连蛋白-载脂蛋白A-I的脂质颗粒它们支持通过LCAT的胆固醇酯化的能力。

通过加入胆固醇的乙醇溶液，将氚化了的胆固醇(4％；相对于磷脂酰胆碱含量，基于摩尔量)掺入脂质颗粒中。在0.2μg/ml重组LCAT酶(ROARbiochemical)于125tL(10mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM NaN₃；pH7.4；2mg/ml HuFAF清蛋白；4mMβ巯基乙醇)中的溶液存在下，在37℃测试了得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力达1小时。通过加入氯仿∶甲醇(2∶1)，终止反应，并萃取脂质。在胆固醇-胆固醇酯分离以后，通过TLC和闪烁计数，计算酯化“百分比”。如果20％或更少的示踪剂被掺入形成的酯中，那么可以认为反应速率在实验条件下是恒定的。使用XLfit软件(IDBS)，使示例性数据与MichaelisMenten方程式拟合。关于用四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)得到的结果的图形表示，参见图3。

b)DPPC/POPC混合物对LCAT活性的影响

使用胆酸盐作为洗涤剂，通过将重组野生型载脂蛋白A-I与³H胆固醇、DPPC/POPC混合物和胆酸盐以1∶4∶80∶113摩尔比混合，制备脂质颗粒。DPPC/POPC混合物含有：100％POPC；75％POPC；50％POPC；或25％POPC。

在通过透析除去胆酸盐以后，测试了得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力。通过加入胆固醇的乙醇溶液，将³H胆固醇(4％；相对于磷脂酰胆碱含量，基于摩尔量)掺入脂质颗粒中。在有0.2μg/ml重组LCAT酶(ROAR biochemical)于125tL(10mM Tris，150mMNaCl，1mM EDTA，1mM NaN₃；pH7.4；2mg/ml HuFAF清蛋白；4mMβ巯基乙醇)中的溶液存在下，在37℃测试了得到的蛋白-脂质复合物支持LCAT催化的胆固醇酯化的能力达1小时。通过加入氯仿∶甲醇(2∶1)，终止反应，并萃取脂质。在胆固醇-胆固醇酯分离以后，通过TLC和闪烁计数，计算酯化“百分比”。如果小于20％的示踪剂被掺入酯中，那么可以认为反应速率在实验条件下是恒定的。使用XLfit软件(IDBS)，使示例性数据与Michaelis Menten方程式拟合。关于四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)，参见图4。

c)向THP-1衍生的泡沫细胞的胆固醇流出

通过将THP-1单核细胞性白血病细胞暴露于佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯，可以得到巨噬细胞样人THPl细胞。随后，通过在含有³H胆固醇示踪剂的乙酰化的LDL存在下进一步培养，加载细胞。然后将这些模型泡沫细胞暴露于胆固醇受体试验化合物达4h-8h(参见下面)。

收获细胞培养上清液，并在5％NP40中裂解细胞。将流出分数计算为上清液中的胆固醇放射性相对于细胞和上清液中的放射性总和之比。减去从暴露于不含有受体的培养基的细胞的流出，并通过线性拟合来计算流出速度。使用从细胞至10μg/ml野生型载脂蛋白A-I的流出作为参照(相对流出速度)，将流出速度标准化。可以将在2个单独实验中得到的相对流出速度绘制为胆固醇受体浓度的函数，并将数据与Michaelis Menten方程式拟合。

可以使用暴露于RXR-LXR激动剂的细胞进行平行实验，已知所述RXR-LXR激动剂上调ABCA-1转运蛋白，并使胆固醇运输偏向ABCA-1介导的流出。

在用四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)试验的系列中，仅观察到脂质混合物的不大的影响(示例性的数据显示在图5中)。

d)体内研究

研究了5种包含四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)的脂质颗粒变体：

i)仅POPC

ii)仅DPPC

iii)POPC∶DPPC3∶1

iv)POPC∶DPPC1∶1

v)DPPC∶SM9∶1

以80mg/kg(n=3只兔/试验化合物)，给兔子静脉内输注0.5h，随后在输注后96h进行系列血液采样。

使用ELISA分析载脂蛋白水平：

-药物水平

-关于肝酶、胆固醇、胆固醇酯的血浆值的数据。

对于所有试验的组合物而言，血浆浓度是非常类似的，表现出不太显著的初始“分布”阶段和随后浓度的对数线性下降(图7)。下表显示了四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)的药代动力学数据。

表.

对于所有试验化合物，确定的药代动力学(PK)参数是类似的。还发现了较低的个体间变异性。确定的半衰期接近1.5天，即与野生型载脂蛋白A-I相比增加。分布容量与血浆容量(在兔中，约40mi/kg)类似。

f)胆固醇动员

在血浆中动员和酯化胆固醇。甚至在四连蛋白-载脂蛋白A-I已经在下降时，血浆胆固醇酯水平仍然继续增加。当血浆四连蛋白-载脂蛋白A-I水平已经下降至0.5mg/ml(正常野生型载脂蛋白A-I的约50％)时，对于四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)，仍然可检测到增加的胆固醇酯水平(图8)。

g)肝酶释放

包含含有POPC的四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ IDNO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)的脂质颗粒不会诱导肝酶释放(参见图1)。与兔类似，含有POPC或POPC/DPPC混合物的四连蛋白-载脂蛋白A-I的单次静脉内注射在小鼠中是安全的。含有l∶3的摩尔比的DPPC∶POPC的载脂蛋白组合物与单独的POPC是可比较的(图9)。

在输注后的2小时之前，在5种制剂中的任一种中，都没有观察到显著的溶血。在静脉内施用四连蛋白-载脂蛋白A-I以后2小时时得到的血浆样品中，通过光度测量将溶血测定为红色。将全血的100％溶血(通过0.44％Triton X-100-终浓度产生)用于校准(图10)。

h)四连蛋白-载脂蛋白A-I对人脐静脉内皮细胞的抗炎作用

将第5-10代HUVEC(人脐静脉内皮细胞)在各个四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，其具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基)制剂中温育16h，并用TNFα刺激最后4小时。通过FACS，用特异性的抗体检测VCAMl表面表达。

实施例6

脂质颗粒稳定性

如在上述实施例中所述，在大肠杆菌中表达含有N-端组氨酸标签和IgA蛋白酶切割位点的野生型载脂蛋白A-I，并通过柱色谱法进行纯化。通过IgA蛋白酶切割，除去组氨酸标签，这产生四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白，其具有SEQ ID NO∶02的氨基酸序列和额外N-端丙氨酸氨基酸残基。使用1∶150比例的蛋白∶Lipoid S100大豆磷脂混合物，装配脂质颗粒(HDL颗粒)。在含有5mM磷酸钠和1％蔗糖的缓冲液(pH值7.3)中保存所述颗粒。SE-HPLC揭示在脂质化以后温育后和温育10天的3个不同峰。在40℃温育以后，可以检测出在10.8分钟的保留时间处的优势峰(总蛋白的47％)，该峰在5℃保存的样品中不存在。该10.8分钟的峰指示由于蛋白去稳定导致的可溶性大分子量装配物的形成。

还在5℃和40℃温育含有四连蛋白-载脂蛋白A-I融合蛋白(其具有SEQ ID NO∶01氨基酸序列和额外N-端丙氨酸残基)的HDL颗粒(从POPC∶DPPC混合物(POPC∶DPPC的比例为3∶1)起始得到)。高温温育导致轻度的前峰形成，但是没有向在10.8分钟处的高分子量装配物的显著迁移(在11分钟，<2％增加)。这将指示与含有野生型载脂蛋白A-I的颗粒相比提高的HDL颗粒稳定性。

实施例7

胆固醇动员

在该实验中，分析下述物质：

-如在上述实施例中所述在大肠杆菌中表达并通过柱色谱法纯化的含有N-端组氨酸标签和IgA蛋白酶切割位点的野生型载脂蛋白A-I；通过IgA蛋白酶切割，除去组氨酸标签。使用1∶150比例的蛋白∶Lipoid S100大豆磷脂混合物，装配脂质颗粒(HDL颗粒)，

-载脂蛋白A-I Milano变体；使用1∶40比例的蛋白∶POPC，装配脂质颗粒(HDL颗粒)，

-SEQ ID NO∶02的四连蛋白-载脂蛋白A-I；使用1∶60比例的蛋白∶POPC和DPPC(POPC和DPPC的比例为3∶1)，装配脂质颗粒(HDL颗粒)。

将所述3种HDL颗粒施用给大鼠。各个AUC比例得到的值显示在下表中。

表.

Claims

1.融合蛋白，所述融合蛋白具有SEQ ID NO∶01的氨基酸序列或者是其变体，所述变体与SEQ ID NO∶01的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。

2.脂质颗粒，其包含根据权利要求1所述的融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的脂质颗粒，其包含

-根据权利要求1所述的融合蛋白，

-磷脂酰胆碱，和

-脂质。

4.根据权利要求2-3中任一项所述的脂质颗粒，其特征在于包含

-根据权利要求1所述的融合蛋白，

-第一磷脂酰胆碱，和

-第二磷脂酰胆碱。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的脂质颗粒，其特征在于包含1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱和1，2-二棕榈酰-磷脂酰胆碱。

6.根据权利要求5所述的脂质颗粒，其特征在于，1-棕榈酰-2-油酰-磷脂酰胆碱与1，2-二棕榈酰-磷脂酰胆碱的摩尔比是99∶1至25∶75。

7.根据权利要求2-6中任一项所述的脂质颗粒，其特征在于，所述融合蛋白是包含3个单体的多聚体。

8.根据权利要求2-7中任一项所述的脂质颗粒，其特征在于，结合选自以下组成的组的受体：cubilin、B类1型清除受体(SR-BI)、ATP-结合盒1(ABCA-1)、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)或磷脂转移蛋白(PLTP)。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的脂质颗粒，其特征在于，所述脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的磷脂分子的数目是40-120。

10.根据权利要求9所述的脂质颗粒，其特征在于，所述脂质颗粒中每个载脂蛋白单体的磷脂分子的数目是50-90。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒。

12.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，其用作药物。

13.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，其用作药物，所述药物

-用于患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防，或者

-用于预防或治疗动脉粥样硬化，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克

-用于治疗心绞痛，或者

-用于治疗心肌梗死，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛，或者

-用于治疗血管性痴呆，或者

-用于治疗一时性黑矇。

14.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒用于制备药物的用途。

15.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒用于制备药物的用途，所述药物

-用于患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防，或者

-用于预防或治疗动脉粥样硬化，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克

-用于治疗心绞痛，或者

-用于治疗心肌梗死，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛，或者

-用于治疗血管性痴呆，或者

-用于治疗一时性黑矇。

16.一种方法，其用于

-患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防，或者

-预防或治疗动脉粥样硬化，其中以足以在受试者中诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定的量包含根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，或者

-用于诱导反向胆固醇运输和/或斑块平定，或者

-用于预防或治疗受试者的瓣膜狭窄，或者

-用于增加受试者的HDL颗粒的数目，或者

-用于启动受试者中的反向胆固醇运输，或者

-用于除去内毒素，或者

-用于预防感染性休克

-用于治疗心绞痛，或者

-用于治疗心肌梗死，或者

-用于治疗不稳定型心绞痛，或者

-用于治疗血管性痴呆，或者

-用于治疗一时性黑矇。

17.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，其用于治疗

-急性冠状动脉综合征，或者

-动脉粥样硬化，或者

-受试者血管中的粥样硬化斑块，或者

-受试者的瓣膜狭窄，或者

-感染性休克，或者

-心绞痛，或者

-心肌梗死，或者

-不稳定型心绞痛，或者

-动脉狭窄，或者

-外周动脉疾病(PAD)，或者

-颈动脉狭窄，或者

-脑动脉狭窄，或者

-冠状动脉狭窄，或者，

-血管性痴呆，或者

-一时性黑矇。

18.根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，其用于：

-诱导反向胆固醇运输，或者

-诱导斑块平定，或者

-清除或溶解或稳定粥样硬化斑块，或者

-使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏，或者

-增加HDL颗粒的数目，或者

-除去内毒素。

19.在个体中诱导反向胆固醇运输、或诱导斑块平定、或清除或溶解或稳定粥样硬化斑块、或使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏、或增加HDL颗粒的数目、或除去内毒素的方法，所述方法包括：给所述个体施用有效量的根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒，以诱导反向胆固醇运输、或诱导斑块平定、或清除或溶解或稳定粥样硬化斑块、或使胆固醇从动脉壁重新分配至肝脏、或增加HDL颗粒的数目、或除去内毒素。

20.用于患有急性冠状动脉综合征的患者的二级预防的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用根据权利要求1所述的融合蛋白或根据权利要求2-10中任一项所述的脂质颗粒。