FI113052B - Menetelmä rekonstituoidun lipoproteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

113052

Menetelmä rekonstituoidun lipoproteiinin valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää rekonsti-tuoitujen lipoproteiinien (reconstituted High Density Li-5 poproteins; rHDL) valmistamiseksi apolipoproteiineista ja lipideistä teollisessa mittakaavassa. rHDLrillä on sellainen omiaisuus, että ne sitovat ja kuljettavat organismissa lipidejä ja lipidin kaltaisia aineita ja voivat vaikuttaa niiden aktiivisuuteen. rHDL:t ovat siksi hyödyllisiä sel-10 laisten erilaisiin sairauksien ennalta ehkäiseviin ja terapeuttisiin hoitoihin, jotka ovat yhteydessä lipideihin ja lipidin kaltaisiin aineisiin.

Ihmisveren lipoproteiinit kykenevät harjoittamaan joukkoa erilaisia funktioita. Lipoproteiinien perusteelli-15 sesti tutkittu ja tuttu funktio on lipidien kuljetus. Lipoproteiinit kykenevät sitomaan veteen liukenemattomia lipidejä, kuljettamaan ne vesiympäristöön ja viemään ne niiden määränpäähän. Jo pitemmän aikaa on yksittäisiä lipo-proteiiniluokkia tutkittu tarkemmin lipidiaineenvaihdunnan 20 häiriöiden yhteydessä. Useimmissa länsimaissa voitiin epidemiologisten tutkimusten avulla osoittaa positiivinen korrelaatio sydän- ja verenkiertosairauksien ja korkean ;·. plasmakolesterolin tai korkean LDL-kolesterolin (Low Den- * · ,,: sity Lipoprotein - kolesteroli) välillä, ja negatiivinen . 25 korrelaatio korkeaan HDL:ään tai korkeaan HDL-kolestero- * · '] liin. Vaikkakin markkinoilla on saatavana koko joukko ;; lääkkeitä, jotka osoittavat lipidejä laskevaa vaikutusta, > · on ajateltavissa, että tietyissä tilanteissa sopivien lipoproteiinien korvaaminen on paikallaan. Tällaisissa ta-’.· 30 pauksissa tulevat kyseeseen ensisijassa "hyvät" lipopro teiinit kuten HDL, tai HDL:n kaltaiset partikkelit, kuten , : eristetyistä apolipoproteiineista ja sopivista lipideistä , rekonstituoitu HDL (rHDL).

. Lipidien ohella, jotka tulevat ravinnon välityksel lä i 35 lä, voivat lipoproteiinit kuljettaa tai sitoa myös muita > t » 2 113052 lipidejä ja lipidin kaltaisia aineita. Esimerkiksi kuolleiden solujen osat voivat sitoutua lipoproteiineihin ja niille voidaan antaa uusi funktio. Lipoproteiineihin voidaan kuitenkin myös sitoa lipidin kaltaisia aineita, kuten 5 esim. lipopolysakkaridi (LPS). Lipopolysakkaridit tai en-dotoksiinit ovat osia gran-negatiivisten bakteerien memb-raaneissa. Jos riittävän suuria määriä endotoksiinia joutuu verenkiertoon, voi tämä johtaa septiseen shokkiin tai myös kuolemaan. Seurauksena LPS:n sitoutumisesta lipopro-10 teiineihin voidaan LPS:ien funktiota tai aktiiviteettia moduloida. LPS:n aktiivisuuteen voidaan in vivo ja in vitro vaikuttaa huomattavasti antamalla lipoproteiineja tai lipoproteiinin kaltaisia partikkeleita. Täten voitiin osoittaa, että in vivo antamalla rekonstituoitua HDL:ää 15 voidaan kasvainkuoliotekijän (TNF), joka on sepsiksen tärkeä välittäjä, muodostumista estää. In vivo voitiin siten antamalla HDL:ää tai rHDL:ää huomattavasti vähentää shokin oireita.

Lipoproteiinien tai rekonstituoitujen lipoproteii-20 nien vuorovaikutuksen lipidien tai lipidin kaltaisten aineiden kanssa ohella kuvataan myös lipoproteiinien vuoro-vaikutuksia proteiinien kanssa: lipoproteiinit voivat toimia vuorovaikutuksissa komplementtisysteemin yksittäisten rakenneosien kanssa ja • · . 25 siten vaikuttaa niiden aktiivisuuteen; • # • · ‘; samoin tunnetaan hyytymissysteemin rakenneosat, ·;; jotka voidaan löytää lipoproteiinifraktiosta, toisin sa- • ♦ '· ’ noen ne ovat assisioituneita määrättyihin lipoproteiinei hin;

* 30 akuuttifaasiproteiineja kuten seerumiamyloidi-A

!. .* (SAA) löydetään HDL-fraktiosta; ; ja edelleen voidaan tiettyjen proteiinien pinta-ad- * · ! sorptioon vaikuttaa esikäsittelyllä lipoproteiineilla.

- I · 1 · 113052 3

Lipoproteiinit voivat kuitenkin myös spesifisen tai ei-spesifisen sitoutumisen soluihin välityksellä vaikuttaa näiden aktiivisuuteen; verihiutaleiden aktivoitavuutta voidaan sitomalla 5 HDLrään vähentää ja antamalla LDL:ää stimuloida; monosyyteillä ja makrofageilla on samoin reseptoreita lipoproteiineille; lipoproteiinien sitoutuminen tai otto voi johtaa näiden solujen aktiivisuuksien muutoksiin; immuunisysteemin muiden solujen kuten neutrofiilien 10 aktiivisuutta voidaan samoin modifioida tai moduloida sitomalla lipoproteiineihin; edelleen voidaan myös kasvainsolujen solukasvuun, joka osoitetaan esimerkiksi glyoblastoomasoluilla, vaikuttaa lipoproteiineilla.

15 Kirjallisuudesta löydetään muita kuvauksia, jois sa kuvataan lipoproteiinien vuorovaikutuksia patogeenien kanssa, esimerkiksi lipoproteiineille kuvataan antomikro-biaalista aktiivisuutta. Osoitettiin että viruksia voitiin inaktioida lipoproteiinien avulla, tai esimerkiksi trypa-20 nosomeilla voitiin vaikuttaa parasiitteihin tai estää niitä.

Nämä esimerkit osoittavat moninaisia mahdollisuuk-siä lipoproteiinien tai rHDL:n käyttämiselle ennalta eh-käisevään ja terapeuttiseen käyttöön.

• I

25 Lipoproteiinit jaetaan neljään pääluokkaan: kylo- "! mikronit, jotka ovat partikkeleita, jotka koostuvat val taosin triglyserideistä ja joita esiintyy normaalisti • ' plasmassa suuremmissa määrin vain rasvapitoisten ruokai lujen jälkeen. VLDL, Very Low Density Lipoproteins, LDL, 30 Low Density Lipoproteins, ja HDL, High Density Lipopro-: teins. Nimistö on johdettu lipoproteiinien eristämisestä : ultrasentrifugoimalla. Näillä menetelmillä lipoproteiinit = t ! eristetään perinteiseen tyyliin ja perinteisellä tavalla tiheysgradienteilla. Tämä menetelmä on käyttökelpoinen • 35 vain laboratoriomittakaavassa, jossa se on ajallisesti ja * 113052 4 laitteiston osalta hyvin käyttökelpoinen. Parhaimmassa tapauksessa voidaan sillä muutamassa päivässä saada muutamia satoja milligrammoja lipoproteiineja tai apolipoproteiine-ja. Muita menetelmiä apolipoproteiinien tai lipoproteii-5 nien eristämiseksi tunnetaan samoin jo pitemmän ajan takaa; ne perustuvat monasti saostukseen kaksivalenssisil-la kationeilla ja/tai esimerkiksi polyetyleeniglykolilla tai dekstraanilla. Toinen mahdollisuus apolipoproteiinien eristämiseksi on saostaminen alkoholifraktioinnilla, kuten 10 kuvataan EP-patenttijulkaisussa nro 0 329 605 Bl. Tällä viimemainitulla menetelmällä on mahdollista eristää ja antaa terapeuttiseen käyttöön suurempia määriä apolipopro-teiineja A-I (apoA-I) tai fraktioita, jotka ovat rikastuneet apoA-I:n suhteen. Näin eristetyllä apoA-I:llä tai 15 apoA-I:n suhteen rikastetuilla proteiinifraktioilla suoritettiin koko joukko kokeita, sekä eläimissä että myös ihmisissä. Näiden kokeiden perusteella voitiin yhtäältä osoittaa näiden tuotteiden varmuus viruksia vastaan, mutta myös se, ettei apoA-I käytetyssä muodossa johda minkään-20 laisiin merkitseviin sivureaktioihin ihmisessä tai eläimessä. Kuitenkaan in vitro -kokeilla ei voitu todeta mi-tään haluttuja aktiivisuuksia kuten esimerkiksi kolesteroli·, Iin kuljetus tai apoA-I:n vaikutus soluihin kuten neutro- fiilit, makrofagit, monosyytit tai verihiutaleet. In vivo • · . 25 -kokeilla sekä eläimissä että myös ihmisissä havaittiin hyvin lyhyitä apoA-I:n puoliintumisalkoja plasmassa. Va-paan apoA-I:n molekyylipainon (28 000 daltonia) perusteel- ♦ * * ' ‘ * la syntyy mahdollisuus, että munuaiset erittävät apoA-I:n.

ApoA-I voitiin tosiasiassa osoittaa kaniinien virtsasta. 30 Nämä tulokset osoittavat, että näin ruiskutettu apoA-I ei jakaudu suuremmissa määrin haluttuun lipoproteiinifrak-: tioon. Apo-A-I voi siksi lyhyen puoliintumisaikansa in vivo johdosta harjoittaa vaikutustaan korkeintaan hyvin lyhyen ajan. Sopiva antomuoto on siksi, että apoA-I ruis- 113052 5 kutetaan lipoproteiini- tai lipoproteiinin kaltaiseen partikkeliin.

Menetelmiä rekonstruoitujen lipoproteiinien valmistamiseksi kuvataan kirjallisuudessa, erityisesti apo-5 lipoproteiineille A-I, A-II, A-IV, apoC ja apoE [A. Jonas, Methods in Enzymology 128 (1986) 553 - 582]. Yleisin lipidi, jota käytetään rekonstituutiossa, on fosfatidyyliko-liini, joka uutetaan joko munista tai soijapavuista. Muitakin fosfolipidejä käytetään kuten myös lipidejä kuten 10 triglyseridit tai kolesteroli. Rekonstituution suorittamiseksi lipidit liuotetaan ensiksi orgaaniseen liuotti-meen, joka sitten haihdutetaan pois typpisuojakaasussa. Tällä menettelyllä lipidi sitoutuu ohuena kalvona lasisei-nämään. Sitten lisätään apolipoproteiinia ja detergenttiä, 15 normaalisti natriumkolaattia, ja sekoitetaan. Lisätty nat-riumkolaatti saa aikaan lipidin dispersion. Sopivan inku-bointiajan jälkeen seosta dialysoidaan vastaan suurempaa määrää puskuria pitemmän ajan; tällöin yhtäältä natriumko-laatti valtaosin poistuu ja samanaikaisesti lipidit ja 20 apolipoproteiinit kerrostuvat lipoproteiineiksi tai ns. rekonstituoiduiksi lipoproteiineiksi yhteen. Vaihtoehtona dialyysille ovat käytössä hydrofobiset adsorbentit, jotka voivat adsorboida spesifisesti detergentte j ä (Bio-Beads * · · SM-2, Bio Rad; Amberlite XAD-2, Rohm & Haas) [E.A. Bonomo, • · 25 J.B. Swaney, J. Lipid Res. 29 (1988) 380 - 384], tai de-tergenttien erottaminen geelikromatografisesti. Lipopro- ;; teiineja voidaa valmistaa myös ilman detergenttejä, esi- » merkiksi inkuboimalla sopivan lipidin vesisuspensiota apo-lipoproteiineilla, lisäämällä lipidiä liuotettuna orgaani-30 seen liuottimeen apolipoproteiineihin seosta lämmittäen : tai lämmittämättä, tai käsittelemällä apoA-I-lipidi-seosta : ultraäänellä. Näillä menetelmillä voidaan lähtien esim.

! apoA-I:stä ja fosfatidyylikoliinista saada levynmuotoisia partikkeleita, jotka vastaavat syntyviä lipoproteiineja.

· 35 Inkuboinnin jälkeen tavallisesti sitoutumatta jäänyt apo- 113052 6 lipoproteiini ja vapaa lipidi erotetaan sentrifugoimalla tai geelikromatografisesti homogeenisen, rekonstruoitujen lipoproteiinipartikkelien eristämiseksi.

US-patenttijulkaisussa 5 128 318 kuvataan menetel-5 mää rekonstruoidun HDL:n valmistamiseksi, jossa menetelmässä fosfatidyylikoliini liuotetaan käyttäen orgaanista liuotinta.

Edellä kuvatut menetelmät rekonstituoitujen lipo-proteiinien valmistamiseksi sopivat vain pienemmille mää-10 rille muutamasta milligrammasta korkeintaan yhteen grammaan laboratoriomittakaavassa: liuosten korkeat laimennokset sivutuotteissa tekevät mahdottomaksi seosten työstön vaaditusssa ajassa; infrastruktuuria suurille tilavuuksille ei normaa-15 listi ole saatavilla; käytetyt orgaaniset liuottimet ovat vain rajallisesti ympäristöystävällisiä; lopputuotteet eivät ole varastointikelpoisia; lopputuotteiden pitoisuus on liian pieni, jolloin 20 potilaisiin ruiskutettavat tilavuudet tulevat liian suuriksi; .tuotteita täytyy normaalisti puhdistaa edelleen, esimerkiksi geelikromatografisesti sitoutumattoman lipidin ’ . tai sitoutumattoman proteiinien erottamiseksi rHDL-partik- , 25 keleistä.

* ♦ ·

Edelleen julkaisussa A. Hubsch et ai., Circulatory : Shock 40 (1993) 14 - 23, kuvataan menetelmää rekonstituoi- V ‘ tujen lipoproteiinien valmistamiseksi, jossa käytetään apolipoproteiini/lipidi-suhdetta 1:200. Tästä menettelystä 30 seuraa, että saatu tuote sisältää huomattavan osuuden va- : paata lipidiä, mikä vaikuttaa sen terapeuttiseen käyttö- ’ . kelpoisuuteen epäsuotuisasti.

! rHDL:n terapeuttiseksi tai ennalta ehkäiseväksi • * · · . käyttämiseksi ihmisissä ovat annosta kohden rHDL-määrät j 35 gramma-alueella tarpeellisia merkittävien kohoamisten * · • · « · · 113052 7 plasman apo-A-I- tai HDL-peileissä saavuttamiseksi. rHDL:n teollinen tuotanto kliinisiin käyttöihin kg- tai vielä suuremmassa mittakaavassa ei ole edellä kuvatuilla menetelmillä mahdollista.

5 Tämän johdosta esillä olevan keksinnön tehtävänä on antaa käyttöön menetelmä rHDL:n valmistamiseksi, joka menetelmä on vapaa edellä mainituista puutteista ja jonka tuote erityisesti ei sisällä mitään suurempia osuuksia vapaata lipidiä tai vapaata apo-A-I:tä. Eräs päämäärä on an-10 taa käyttöön menetelmä, joka voidaan suorittaa lisäämättä orgaanisia liuottimia. Todettiin, että rekonstruoituja lipoproteiineja, erityisesti rekonstituoitua HDL:ää (rHDL), voitiin valmistaa yksinkertaisella, nopealla ja teollisesti käyttökelpoisella menetelmällä apolipoproteii-15 neista ja lipideistä.

Esillä olevan keksinnön kohde on siten menetelmä valmisteen teolliseksi valmistamiseksi, joka valmiste sisältää rekonstituoituja lipoproteiinipartikkeleita, ja joka osoittaa proteiinipitoisuudessa 20 ± 2 g/litra ja läm-20 pötilassa 20 ± 2 °C vähäisempää samennusta kuin 40 NTU (Nephelometric Turbidity Unit), apolipoproteiineista ja lipideistä, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että vesipitoinen apolipoproteiiniliuos, jossa pitoisuus on 1 -‘ . 40 g proteiinia/ml, sekoitetaan vesipitoiseen lipidi-de- 25 tergenttiliuokseen, jolloin lipidin moolisuhde detergent- *· tiin on noin 1:0,5 - 1:4,0, ja apolipoproteiinin painosuh- ► « de lipidiin on noin 1:0,5 - 1:5,0, saatua apolipoproteii- V 1 ni-lipidi-detergenttiseosta inkuboidaan sitten lämpötilas sa lipidin faasimuutoslämpötilan vedessä ± 10 °C alueella, ,·1 30 detergentti erotetaan kokoerotuksella tai adsorptiolla ad- ; sorbenttiin siinä määrin, että proteiini-lipidi muodostaa ,·' . partikkeleita, joiden halkaisija on 5 - 50 nm ja joiden ! massa on 50 000 - 1 000 000 daltonia, ja joihin ilman mui- » 1 1 1 · ta puhdistusvaiheita sekä enemmän kuin 95 % käytetystä

» · I

» i i 113052 8 proteiinista että myös enemmän kuin 90 % kokonaislipidistä on sitoutunut.

Esillä olevan keksinnön kohde on samoin menetelmä stabiilin lyofilisaatin teolliseksi valmistamiseksi, joka 5 sisältää rekonstituoitu lipoproteiinipartikkeleita, apo-lipoproteiineista ja lipideistä, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että vesipitoinen apolipoproteiiniliuos, jossa pitoisuus on 1 - 40 g proteiinia/litra, sekoitetaan vesipitoiseen lipidi-detergenttiliuokseen, jolloin lipidin 10 moolisuhde detergenttiin on noin 1:0,5 - 1:4,0, ja apoli-poproteiinin painosuhde lipidiin on noin 1:1,5 - 1:5,0, saatua apolipoproteiini-lipidi-detergenttiseosta inkuboi-daan sitten lämpötilassa, joka on suunnilleen lipidin veteen faasimuutoslämpötila ± 10 °C, normaalisti noin -5 -15 42 °C, detergentti erotetaan kokoerotuksen tai adsorption adsorbenttiin avulla siinä määrin, että muodostuu proteii-ni-lipidipartikkelita, joiden halkaisija on 5 - 50 nm massan ollessa 50 000 - 1 000 000 daltonia, ja joihin ilman lisäpuhdistusvaiheita on sitoutunut sekä enemmän kuin 95 % 20 käytetystä proteiinista että myös enemmän kuin 90 % kokonaislipidistä, jolloin saadaan nestemäinen tuote, joka . proteiinipitoisuudessa 20 ± 2 g/litra ja lämpötilassa 20 ± , 2 °C osoittaa alle 40 NTU:n sameutta, ja saatu tuote sta- . biloidaan lyofilisoimalla stabilisaattorin läsnä ollessa, , 25 joka valitaan hiilihydraattien ryhmästä, esimerkiksi käyt- ' ; täen sakkaroosia tai mannitolia.

t · : Käytetyt apolipoproteiinit ovat esimerkiksi yhdis- v * telmä-DNA-apolipoproteiineja, apolipoproteiineja apolipo- proteiinin A-I ihmisplasmasta rikastetusta fraktiosta, j 30 apolipoproteiinifragmentteja tai luonnollisia, synteetti- ; : siä tai yhdistelmä-DNA-polypeptidejä, joilla on amfipaat- . tisia ominaisuuksia. Apolipoproteiinifragmentit voidaan ! saada kemiallisesti tai entsymaattisesti fragmentoimalla • * · , luonnollisia tai synteettisiä apolipoproteiineja. Esimerk- · 35 kinä kemiallisesta fragmentoinnista mainitaan käsittely 113052 9 bromisyaanilla. Esimerkkinä entsymaattisesta pilkkomisesta esitetään trypsiini tai kymotrypsiini.

Keksinnön mukaisesti käytetty lipidi-detergentti-liuos sisältää lipidinä esimerkiksi fosfolipidiä, joka voi 5 olla peräisin soijapavuista tai munista, kolesterolia, ko-lesteroliesteriä, rasvahappoja tai triglyseridejä. Deter-gentit ovat edullisesti sappihappoja tai niiden suoloja, esim. koolihapon natriumsuola tai natriumdesoksikoolihap-po. Lipidien liuottamiseksi ei tällöin tarvita mitään or-10 gaanisia liuottimia.

Esillä olevassa kuvauksessa ilmoitetut lämpötila-arvot 20 ± 2 °C käsittävät kaikki arvot, jotka ovat alueella 18 - 22 °C. Proteiinipitoisuus 20 ± 2 g/lit- ra käsittää kaikki pitoisuudet alueella 18 g/litra -15 22 g/litra. Ilmaus "faasimuutoslämpötila ± 10 °C" käsittää kaikki lämpötila-arvot, jotka ovat alueella, joka on sen lämpötilan, joka on 10 °C matalampi kuin vastaavan lipidin faasimuutoslämpötila vesiympäristössä, ja sen, joka on 10 °C korkeampi kuin tämä ainespesifinen arvo, välissä. 20 Nämä arvot ovat -5 - +50 °C.

Edullisia lähtömateriaaleja ovat lipoproteiinit, . jotka ovat peräisin ihmisplasmasta, josta on inaktivoitu • > · , ;>t virukset käyttäen sopivia menetelmiä, kuten esim. pastö- • » · ’ , rointia. Tässä menettelyssä syntyvät denaturoidut prote- * « , 25 niinit (aggregaatit) renaturoidaan sitten inkuboimalla ;* kevyesti alkalisessa pH:ssa ja kevyesti korotetussa läm- • i · pötilassa kaotrooppisten aineksien kuten esim. urea tai

' * I

’.* * guanidiinihydrokloridi läsnä ollessa, jolloin proteiinin uudelleenpuskuroinnin jälkeen 10 mM NaCl-liuokseen > 70 % ' : 30 apo-A-I:stä on monomeerisessä muodossa (määritys analyyt- tisellä kokoekskluusiokromatografiällä: 40 pg apoA-I:tä

panostettiin TSK G3000SW Ultropac -kolonniin (LKB) 10 mM

* · [ natriumfosfaatissa, 0,02 % natriumatsidi, pH 7,4, virtauk- f i * * sen ollessa 0,4 ml/min; eluaattien mittaus 280 nmtssä).

i · > · • · > * · 113052 10

Toisessa menetelmässä lipoproteiineja sekoitetaan korkeana pitoisuutena lipidien (fosfolipidejä kuten fos-fatidyylikoliini, kolesteroli, triglyseridi jne.) liuokseen sappihappojen tai niiden suolojen (esim. kolaatti, 5 desoksikolaatti, ursodesoksikolaatti) liuoksessa, jolloin voidaan olla käyttämättä orgaanisia liuottimia. Vastoin kuin Hubschin et ai. kuvaamissa töissä [Circulatory Shock 40 (1993) 14 - 23] apolipoproteiinien suhde lipidiin valitaan siten, että lopputuotteessa ei ole sen paremmin 10 suurempia määriä vapaata lipidiä kuin vapaata apolipopro-teiinia, jolloin rHDL:n lisäpuhdistuksesta voidaan luopua. Erityisesti apoA-I:PC-suhdetta alennetaan sen ollessa oleellisesti alle 1:200 (M:M; painosuhde noin 1:5,5), nimittäin suhde, joka on alueella 1:50 - 1:180, ja edulli-15 sesti 1:100 - 1:150 (moolisuhde; vastaa painosuhdetta 1:2,8 - 1:4,2 apoA-I:lle ja PC:lie soijasta). Tämä yhdistettynä diasuodatusmenetelmään johtaa tuotteeseen, jossa on alhainen pitoisuus vapaita lipidejä (kvantitoidaan kokoekskluusiokromatografisesti; geelisuodatuksella Su-20 perose-valmistetta 6 käyttäen; ks. alla), ja samanaikaisesti huomattavasti matalampaan sappihappopitoisuuteen . lopputuotteessa; molemmat, korkea sappihappopitoisuus ja » » · korkea vapaan PC:n pitoisuus voivat in vitro ja in vivo » * · johtaa solujen vaurioitumiseen, ja niitä on siksi kontrol-

• MM

25 loitava tarkasti. Kolaattipitoisuus optimoidaan yhtäältä 1 » * ’ apoA-I:PC-suhteeseen ja joka tapauksessa samanaikaisesti * t · . viritetään lisälipidilisäyksiin, erityisesti kolestero- ! » v · Iin. Myös tässä optimaalinen pitoisuus määritettiin mah dollisimman pieneen osuuteen vapaita lipidejä ja vapaani 30 ta apoA-I:tä lopputuotteessa; rHDL-valmisteelle, jossa apoA-I:PC-suhde on 1:150, todettiin natriumkolaatin moo-, lisuhde 1:200 (eli apoA-I:PC:Na-kolaatti = 1:150:200, | M:M:M, seuraavassa kuvatun inkuboinnin aikana). 4 - 16 • · » * tunnin inkuboinnin 0-2 °C:ssa (PC:lie soijasta) jälkeen : 35 sappihappojen pitoisuutta alennetaan diasuodatuksella, < » · • I *

* I

t I I

113052 11 ultrasuodatusmembraanilla, jonka huokoskoko pallomaisille proteiineille on 1 000 - 100 000 daltonia, edullisesti alle 30 000 daltonia. Tähän tarvittava puskuri osoittaa matalaa ionivahvuutta alle 100 mmol/litra, edullisesti alle 5 10 mmol/litra, pHzssa yli 6, edullisesti 7,5 - 9, ja soke ripitoisuutta esimerkiksi 1 % sakkaroosia; näissä olosuhteissa riittää 1 - korkeintaan 2 litraa puskuria kohden lisättyä proteiinigrammaa, yhtäältä tarvittavaan matalaan detergenttipitoisuuteen ja toisaalta haluttuun partikkeli-10 kokojakaumaan pääsemiseksi; nämä puskuritilavuudet ovat moninkertaisesti pienempiä (10 - 200x) kuin aiemmin kuvatuissa menetelmissä. Mikäli tarpeen detergenttipitoisuus säädetään ylimääräisellä adsorptiovaiheella Amberlitella haluttuun pitoisuuteen. Yllä kuvatulla diasuodatusteknii-15 kalla tuote säädetään korkeaan pitoisuuteen 10 - 50 g pro-teiinia/litra, ja työstetään sitten stabilisaattorin kuten sakkaroosin läsnä ollessa stabiiliksi, varastointikelpoi-seksi lopputotteeksi (nestemäiseksi tai kylmäkuivatuksi). Lyofilisaatti liuotetaan ennen käyttöä veteen, jolloin 20 saadaan kirkas, joka tapauksessa lievästi opalisoiva liuos, joka aina lipidipitoisuuden mukaan on kevyesti kellertäväksi värjääntynyt. Tästä liuoksesta voidaan valmistuksen mukaan mitatut rHDL-partikkelit (kiekot, levyt) > > · osoittaa käytännöllisesti katsoen muuttumattomasssa muo- * * » » 25 dossa; käyttämällä kokoekskluusiokromatografiaa todetaan • · ·’ osuus < 10 % aggeraatteja (valtaosin vapaata lipidiä) ja osuus < 5 % vapaata apolipoproteiinia. Nestemäisestä lop- v · putuotteesta ennen tai jälkeen lyofilisoinnin määritetty

sameus on proteiinipitoisuudessa 20 g/litra alle 40 NTU

: 30 (Nephelometric Turbidity Unit). Entsymaattisella värites- tiliä mitattu kolaattipitoisuus on alle 0,5 g koolihappo- . natriumsuolaa/g proteiinia (sappihappomääritys tapahtuu ; NADHrn muodostuessa NAD+:n läsnä ollessa käyttäen 3-a-hyd- • · roksisteroididehydrogenaasia; muodostunut NADH reagoi nit-: : 35 rotetratsoliumsinisen kanssa diaforaasin katalysoivasta ' t * · 1 I t 12 113052 vaikutuksesta siniseksi formatsaanijohdannaiseksi, joka määritetään fotometrisesti).

Lyofilisoitu rHDL on tarkasteltaessa elektronimikroskoopilla liuotuksen jälkeen sopivaan tilavuuteen liuo-5 tinta, edullisesti vettä, levynmuotoisina partikkeleina analogisesti syntyvään HDL:ään, joiden partikkelien halkaisija on 5 - 50 nm, normaalisti 8-20 nm, ja paksuus 2 - 6 nm. Analyysimenetelmillä partikkelikokojen ja niiden suhteellisen jakauman määrittämiseksi, esimerkiksi geeli-10 suodatuksella (kokoekskluusiokromatografia) fysiologisessa puskurissa käyttäen SuperoseR 6 HR 10/30 -kolonnia (Pharmacia Biotech), ovat yli 80 % partikkeleista molekyylipaino-alueella 100 000 daltonia - 1 000 000 daltonia. Samoin yli 80 %:lla partikkeleista on molekyylipainojakauma 50 000 -15 1 000 000 daltonia gradienttigeelielektroforeesin perus teella [menetelmä A.V. Nicholsin et ai. mukaan. Methods In Enzymology 128 (1986) 417 - 431].

Ainoan kuvan tarkoitus on tehdä keksinnöstä ymmärrettävämpi edellä esitetyn tueksi; se esittää eluutiodia-20 grammia (absorptio-eluutioaikadiagrammi) geelisuodatuksis-ta rHDL-partikkeleilla, jotka valmistettiin käyttämällä .· . apoA-I:n eri suhteita fosfatidyylikoliiniin (apolipopro- * i » t·;^ teiini-lipidisuhteita). [High Performance Size Exclusion * I ·

Chromatography apoA-I- ja rHDL-partikkeleille; 200 pg:n 25 rHDL:ää erotus 100 pl:ssa 0,9-%:ista NaClrää Superose8 6 HR

* r t 10/30 -kolonnissa (Pharmacia Biotech) PBS:ssä (10 mM nat-riumfosfaatti, 150 mM NaCl, pH 7,4) virtauksen ollessa * 0,5 ml/min]. Kolonnieluaatin absorptio mitattiin 280 nm:ssä [L.L. Rudel, C.A. Marzetta ja F.L. Johnson, Methods : 30 In Enzymology 129 (1986) 45 - 57]; yksittäisten fraktioi- : .· den pitoisuuden kromatogrammissa määrittämiseksi lasketaan . alueet kuvaajan alla. 1;200-tuotteen eluutiokuvaajan koh- » ; dalla on huomattavissa, että eluution aluksi vapaita li pidejä peseytyy pois, kun taas tuotteilla 1:100 - 1:150 i · 11305? 13 asianlaita ei ole näin. Verrokiksi esitetään myös puhtaan apolipoproteiinin (apoA-I) kuvaaja.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on esillä olevan keksinnön havainnollistaminen, jolloin niitä ei tule 5 tulkita keksintömäärittelyn rajoituksiksi.

Esimerkki 1

Yksi kg apoA-I:tä liuotettiin 500 litraan 0,15 mol/litra NaCl:ää. Lipidiliuos valmistettiin erikseen seuraavasti: fosfatidyylikoliinia soijapapuöljystä (Phos-10 pholipon 90R, Natterman, Köln) liuotettiin puskuriin, joka koostui pitoisuuksista 10 mmol/litra Tris-HCl, 150 mmol/ litra NaCl, 1 mmol/litra EDTA, pH 8,0. 2,8 kg fosfatidyylikoliinia ja 2,325 kg koolihapon natriumsuolaa liuotettiin tähän puskuriin ad 100 litraa. Sekoitettiin 1 -15 2 tunnin ajan ja mikäli tarpeen lämmitettiin noin 40 °C:seen, kunnes liuos oli kirkas. Sitten jäähdytettiin 4 °C:seen ja 100 litraa tätä lipidi-kolaattiliuosta sekoitettiin 1 kg:aan apoA-I:tä 500 litrassa. Seosta sekoitettiin yön yli 2 - 4 °C:ssa hitaasti. Tämän inkuboinnin jäl-20 keen steriilisuodatettiin ja diasuodatettiin 4 °C:ssa käyttäen Pellicon PTGC-kasetteja, nominal molecular weight limit (NMWL) = 10 000 daltonia; ensin 4 tilavuudella 5 4 ‘ · mmol/litra natriumvetykarbonaattia ja sitten 2 tilavuu-‘ . della 10-%:ista sakkaroosia, jolloin tuotteen tilavuus 25 pidettiin vakiona. Sitten pitoisuutta kohotettiin hitaasti ’ kunnes saavutettiin proteiinipitoisuus 20 g/litra. Tämä > * · liuos steriilisuodatettiin jälleen ja täytettiin pulloihin V · ja lyofilisoitiin sitten. Koko menettelyn ajan huolehdit tiin siitä, että erityisesti lipidiliuos oli suojattu il-30 malta, valolta ja liian korkeilta lämpötiloilta. Lopputuote liuotettuna sopivaan määrään vettä, joka antoi proteii- . nipitoisuuden 20 ± 2 g/litra, osoitti apoA-I:n moolisuh- t I detta fosfatidyylikoliiniin 1:100 (mol:mol), jolloin va paata lipidiä oli alle 5 %, vapaata proteiinia ei ollut : 35 mitattavia osuuksia ja sameus oli alle 40 NTU.

» v t 113052 14

Esimerkki 2: 10 kg apoA-l:tä valmistettiin 2 000 litraan 10 mmol/litra NaCl:ää. 1,38 kg kolesterolia ja 29,9 kg koo-lihapon natriumsuolaa sekoitettiin 200 litraan puskuria, 5 joka sisälsi 10 mmol/litra Tris-HCl:ää, 150 mmol/litra keittosuolaa, 1 mmol/litra EDTA:ta, pH 8,0. Lämpötila kohotettiin 65 °C:seen ja seosta sekoitettiin 2 tunnin ajan, kunnes liuos oli kirkas. Sitten se jäähdytettiin 20 °C:seen ja lisättiin 27,9 kg fosfatidyylikoliinia. 10 Liuos jäähdytettiin 4 °C:seen ja sekoitettiin 2 tunnin ajan. Tämä seos lisättiin proteiiniliuokseen, sekoitettiin ja steriilisuodatettiin sitten. Suodosta sekoitettiin yön yli (vähintään 16 tuntia) 4 °C:ssa hitaasti. Sitten seurasi diasuodatus 4 tilavuudella 50 mmol/litra NaClrää, 15 1 mmol/litra EDTA:ta, pH 7,5, 2-4 tunnin ajan. Sitten diasuodatettiin jälleen käyttäen edelleen 2 tilavuutta 10-%:ista sakkaroosia. Tämä liuos konsetroitiin sitten proteiinipitoisuuteen 20 g/litra, steriilisuodatettiin, täytettiin lasipulloihin ja kylmäkuivattiin. Pullot sul-20 jettiin tyhjössä ja ne varastoitiin 4 °C:seen pimeään. Tällä menetelmällä saatiin rHDL:ää, jossa apoA-I:n mooli-suhde fosfatidyylikoliiniin ja kolesteroliin oli 1:100:10.

Esimerkki 3: i rHDL:n valmistus, jossa apoA-I:n suhde fosfatidyy- < t 25 likoliiniin on 1:150: 3,08 kg natriumkolaattia liuotettiin 25 litraan puskuria, 10 mmol/litra Tris-HCl, 10 mmol/litra »

NaCl, 1 mmol/litra EDTA, pH 8,0. Tähän liuotettiin edel-, * leen 4,2 kg fosfatidyylikoliiinia 2 tunnin aikana huoneen lämpötilassa. Sitten lisättiin 1 kg apoA-I:ta 200 litrassa ; 30 10 mmol/litra NaCl:ää ja seosta inkuboitiin yön yli 0 - ; 4 °C:ssa. Sitten tuotteen vakiotilavuuksissa diasuodatet- , tiin vastaan 4 tilavuutta 50 mmol/litra NaCl:ää, 1 mmol/ litra EDTA, pH 7,5, 4 tunnin ajan. Edelleen diasuodatettiin vastaan 2 tilavuutta l-%:ista sakkaroosia. Lopuksi j 35 konsentroitiin pitoisuuteen 20 g/litra proteiinia. Sakka- 113052 15 roosipitoisuus kohotettiin lisäämällä kiinteää sakkaroosia 10 %:iin. Liuos steriilisuodatettiin ja kylmäkuivattiin. Esimerkki 4: rHDL:n valmistus, jossa suhde apoA-I/fosfatidyyli-5 koliini/kolesteroli on 1:100:10: 4,61 kg natriumkolaattia liuotettiin 25 litraan puskuria, joka sisälsi pitoisuudet 10 mmol/litra Tris-HCl:ää, 10 mmol/litra NaCl:ää, 1 mmol/ litra EDTA:ta, pH 8,0. 138 g kolesterolia liuotettiin 65 °C:ssa 2 tunnissa tähän puskuri-kolaattiseokseen. Sit-10 ten jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja seokseen liuotettiin 2,8 kg fosfatidyylikoliinia 1 tunnin aikana. 1 kg apoA-l:tä 200 litrassa 10 mmol/litra NaCl:ää lisättiin. Inkuboitiin kuten edeltävässä esimerkissä, sekä diasuoda-tettiin ja konsentroitiin kuten edellä.

15 Esimerkki 5:

ApoA-I/PC/kolesteroli 1:150:10: 5,38 kg natriumkolaattia liuotettiin ja sekoitettiin esimerkkien 3 ja 4 mukaiseen puskuriin. 180 g kolesterolia liuotettiin seokseen 65 °C:ssa 2 tunnissa. Sitten lisättiin 4,2 kg PC:tä, jo-20 ka liuotettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnissa. Seokseen lisättiin 200 litraa apoA-I-liuosta, 5 g kohden litraa . 10 mmol/litra NaCl:ää ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa.

, ·. Lopputuote diasuodatettiin ja valmistettiin kuten edellä.

» ·

Esimerkki 6: , 25 rHDL:n valmistus, jossa natriumkolaattipitoisuus on • · ; matala. rHDL valmistettiin kuten esimerkeissä 1 - 5 on < · esitetty. Diasuodatuksen ja konsentroinnin jälkeen tila-*·' ’ vuus rHDL:ää sekoitettiin Amberlite XAD-2 -valmisteeseen (2 tilavuutta) ja tätä seosta inkuboitiin tunnin ajan 30 4 °C:ssa varovaisesti liikutellen. Inkuboinnin jälkeen rHDL suodatettiin eroon, steriilisuodatettiin ja kylmäkui-’ . vattiin kuten esitettiin esimerkeissä 1-5.

Esimerkki 7: * t » 400 g apoA-l:tä 80 ml:ssa mmol/litra NaCl:ää sekoi-j 35 tettiin lipidiliuokseen, joka koostui 1,66 kg:sta fosfati- 16 113052 dyylikoliinia, 1,23 kg:sta natriumkolaattia esimerkeissä 3-6 kuvatun mukaisessa puskurissa. Seosta inkuboitiin 16 tunnin ajan 0 - 2 °C:ssa. Sitten diasudoatettiin 4 tilavuudella EDTA:ta (0,1 mmol/litra) ja sitten 2-4 tila-5 vuudella sakkaroosia (l-%:inen liuos), minkä jälkeen konsentroitiin 21 - 25 g:n/litra proteiinipitoisuuteen. rHDL-liuos säädettiin sen jälkeen loppupitoisuuteen 10 % sakkaroosia ja 20 g/litra proteiinia. Se steriilisuodatettiin ja täytettiin 50 g:n erinä (1 g rHDLrää 100 ml pulloon) ja 10 kylmäkuivattiin.

Esimerkki 8: 980 kg:sta esisaostetta IV [Kistler, P., Nitsch-mann, H.; Vox Sang 7 (1962) 414 - 424] saatiin etanolilla seostamalla 11,2 kg:n apoA-I-sakka. Tämä suspendoitiin 15 kolminkertaiseen määrään 4 molaarista guanidiinihydroklo-ridiliuosta. pH säädettiin 5,2:ksi ja pastöroitiin 10 tunnin ajan 60 °C:ssa. pHrssa 7,5 ja 45 °C:ssa proteiini liukeni. Kirkassuodatuksen jälkeen suoritettiin 10 mM keitto-suolaliuoksella puskurinvaihto geelisuodatuksella (Sepha-20 dex G25, Pharmacia Biotech). Saatiin 160 kg apoA-I-liuos-ta, jossa oli kaikkiaan 1 040 g apoA-I:tä. Proteiiniliuos- .· *. ta inkuboitiin lipidiliuoksen kanssa 2-16 tunnin ajan » · •' 0-2 °C:ssa. Lipidiliuos valmistettiin erikseen huoneen lämpötilassa: fosfatidyylikoliinia soijapapuöljystä liuo- • · , 25 tettiin puskuriin, joka koostui pitoisuuksista 10 mmol/

’ ·;’ litra Tris-HCl, 10 mmol/litra NaCl, 1 mmol/litra EDTA, pH

> 8,0. 26 kg:aan tätä puskuria liuotettiin 3 203 g natrium- v * kolaattia ja 4 460 g fosfatidyylikoliinia. Seuranneessa diasuodatuksessa (NMWL = 10 000 daltonia) konsentroitiin : ’ : 30 ensiksi proteiini-lipidiseos proteiinipitoisuuteen 7 g/ litra. Sitten diasuodatettiin vastaan l-%:ista sakkaroosi- * » » . liuosta kunnes saavutettiin kolaattipitoisuus alle 4 g/ • ; litra. pH pidettiin tällöin aina vähintään 7,5:ssä. Lopuk- • ♦ » I t si liuos konsentroitiin pitoisuuteen 25 g/litra proteiinia : 35 ja stabiloitiin sakkaroosilla. Lopputuote sisälsi 20 g/ » 1 113052 17 litra apoA-I:tä ja 100 g/litra sakkaroosia. Kokoekskluu-siokromatografiassa todettiin vähemmän kuin 5 % vapaata lipidiä ja vähemmän kuin 1 % vapaata apoA-I:tä. Proteiini-lipidiseos steriilisuodatettiin, se täytettiin kulloinkin 5 50 mlrksi ja kylmäkuivattiin. Lopputuote liuotettuna sopi vaan määrään vettä osoitti apoA-I:fosfatidyylikoliinimoo-lisuhdetta 1:140, mol:mol, ja koolihapon natriumsuolapi-toisuutta 0,25 g/g proteiinia.

* · » 1

* T t I

* 1 » : I 1 * ' t * f 1

S S I

* · * · I »

Claims (18)

113052

1. Menetelmä valmisteen teolliseksi valmistamiseksi, joka valmiste sisältää rekonstituoituja HDL-partikke-5 leita (rHDL) apolipoproteiini A-I:stä ja fosfatidyyli-koliinista ja jonka sameus on alle 40 NTU proteiinipitoisuudessa 20 ± 2 g/litra ja lämpötilassa 20

± 2 °C, tunnettu siitä, että valmistetaan apolipoproteiini A-I-fosfatidyylikoliini-detergenttiseos sekoittamalla (a) 10 vesipitoinen apolipoproteiini A-I-liuos, jonka pitoisuus on 1 - 40 g proteiinia/litra, (b) vesipitoiseen fosfati-dyylikoliini-detergenttiliuokseen, käyttämättä orgaanisia liuottimia, jolloin fosfatidyylikoliinin moolisuhde detergenttiin on noin 1:0,5 - 1:4,0 ja apolipoproteiini A-15 I:n painosuhde fosfatidyylikoliiniin on 1:1,5 - 1:5,0, minkä jälkeen saatua apolipoproteiini A-I-fosfati- dyylikoliini-detergenttiseosta inkuboidaan lämpötilassa, joka on fosfatidyylikoliinin faasimuutoslämpötila ± 10 °C vedessä, detergentti erotetaan kokoon perustuvalla erotuk-20 sella tai adsorptiolla adsorbenttiin siihen saakka, kunnes muodostuu apolipoproteiini A-I-fosfatidyylikoliinipar-tikkeleita, joiden halkaisija on 5 - 50 nm ja massa on 50 000 - 1 000 000 daltonia, ja joissa ilman lisäpuhdis- >iit; tusvaiheita saadaan valmiste, joka sisältää apolipo- • · , 25 proteiini A-I:sta ja fosfatidyylikoliinista rekonsti- • · tuoituja korkean tiheyden lipoproteiinipartikkeleita * t · ·; * (rHDL), joissa enemmän kuin 95 % käytetystä apolipo- *·* * proteiini A-I:sta, ja enemmän kuin 90 % kokonais- fosfatidyylikoliinista on sitoutunut. * ',·* 30 2. Menetelmä stabiilin lyofilisaattivalmisteen : : teolliseksi valmistamiseksi, joka valmiste sisältää . rekonstituoituja HDL-partikkeleita (rHDL) apolipoproteiini * *» ”, A-I:sta ja fosfatidyylikoliinista, tunnettu siitä, * » » * t . että valmistetaan apolipoproteiini A-I-fosfatidyyli- Jt· | 35 koliini-detergenttiseos, siten, että (a) vesipitoinen • » 11305? apolipoproteiini A-I-liuos, jonka pitoisuus on 1 - 40 g proteiinia/litra, sekoitetaan vesipitoiseen fosfatidyyli-koliini-detergenttiliuokseen käyttämättä orgaanisia liuottimia, jolloin fosfatidyylikoliinin moolisuhde deter-5 genttiin on 1:0,5 - 1:4,0 ja apolipoproteiini A-I:n paino-suhde fosfatidyylikoliiniin on 1:1,5 - 1:5,0, minkä jälkeen saatua apolipoproteiini A-I-fosfatidyylikoliini-detergenttiseosta inkuboidaan lämpötilassa, joka on fosfatidyylikoliinin faasimuutoslämpötila ± 10 °C vedessä, 10 detergentti erotetaan kokoon perustuvalla erotuksella tai adsorptiolla adsorbenttiin siihen saakka, kunnes muodostuu apolipoproteiini A-I-fosfatidyylikoliinipartikkeleita, joiden halkaisija on 5 - 50 nm ja massa on 50 000 -1 000 000 daltonia, jossa ilman lisäpuhdistusvaiheita 15 saadaan valmiste, joka sisältää apolipoproteiini A-I:sta ja fosfatidyylikoliinista rekonstituoituja HDL-partikke-leita, jossa enemmän kuin 95 % käytetystä apolipoproteiini A-I:sta ja enemmän kuin 90 % kokonaisfosfatidyyli- koliinista on sitoutunut, nestemäisenä tuotteena muodossa, 20 jonka sameus on alle 40 NTU proteiinipitoisuudessa 20 ± 2 g/ litra ja lämpötilassa 20 ± 2 °C, ja saatu tuote . stabiloidaan kylmäkuivaarnalla hiilihydraattien ryhmästä , valitun stabilisaattorin läsnä ollessa. * » ·

3. Jonkin patenttivaatimuksen 1-2 mukainen mene- , 25 telmä, tunnettu siitä, että detergentin erottami- » · nen suoritetaan kokoon perustuvalla erotuksella ultra- ? * · *·· suodattamalla, jolloin käytetään korkeintaan 2 litraa V * puskuria grammaa käytettyä proteiinia kohden.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen mene- t t I • ’#ί 30 telmä, tunnettu siitä, että lipidi-apolipopro- teiini-detergenttiseoksen inkuboinnin jälkeen detergentti tl» .* . sidotaan adsorboimalla hydrofobiseen adsorbenttiin joko eräadsorptiolla tai kolonnimenetelmällä. * » * * · > • t » » * » 113052

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että hydrofobinen adsorbentti on liukenematon ristikytketty polystyreenikopolymeeri.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen mene-5 telmä, tunnettu siitä, että apolipoproteiini A-I- fosfatidyylikoliini-detergenttiliuos sisältää fosfolipide-jä, kolesterolia, kolesteroliestereitä, rasvahappoja ja/tai triglyseridejä.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen mene-10 telmä, tunnettu siitä, että apolipoproteiini A- I:na käytetään ihmisen plasmasta apolipoproteiini-A-I:n suhteen rikastettua fraktiota, jota käsitellään vähintään yhdellä viruksen inaktivointivaiheella käyttäen inkuboin-tia kaotrooppisen aineen vesiliuoksessa ja sitä seuraavaa 15 puskurinvaihtoa liuokseen, jonka ionivahvuus on alle 50 mmol/litra, minkä jälkeen enemmän kuin 70 % lipopro- teiineista on monomeerisessä muodossa.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfatidyylikoliini 20 on synteettistä fosfatidyylikoliinia.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen me- . '. netelmä, tunnettu siitä, että fosfatidyylikoliini on luonnollinen fosfatidyylikoliini, edullisesti soija- • · tiit. pavuista tai munista uutettu fosfatidyylikoliini. * · . 25

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, • · t « "I tunnettu siitä, että käytetään soijafosfatidyyli- > · · koliinia, ja apolipoproteiini A-I-fosfatidyylikoliini- * · V ’ detergenttiseoksen inkubointi tapahtuu lämpötilassa 0 - 15 °C. » i · j 30

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen me- : netelmä, tunnettu siitä, että käytetty detergent- . ti valitaan sappihappojen tai niiden suolojen ryhmästä.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, * » » · ,* tunnettu siitä, että detergentti on koolihapon l j 35 natriumsuola tai natriumdeoksikoolihappo. t » » * · 113052

13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen apoli-poproteiini A-I liuos sisältää rekombinantteja apolipo-proteiineja, apolipoproteiineja ihmisen plasman apolipo- 5 proteiini-A-I:n suhteen rikastetusta fraktiosta, apolipo- proteiinifragmentteja tai sopivia luonnollisia, synteettisiä tai rekombinantteja polypeptidejä, joilla on amfipaattisia ominaisuuksia.

14. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen me-10 netelmä, tunnettu siitä, että apolipoproteiini Ä- I-fosfatidyylikoliini-detergenttiseoksen inkuboinnin jälkeen detergenttipitoisuutta lasketaan käyttäen dialyysiä tai diasuodatusta pitoisuuteen alle 0,5 g detergenttiä grammaa proteiinia kohden.

15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-14 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että ennen detergentin erotusta tai sen jälkeen proteiinipitoisuus kohotetaan diasuodatuksen avulla 10 - 50 g:ksi/litra.

16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-15 mukainen me-20 netelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen apolipoproteiini A-I-liuos tai lipidi-detergenttiliuos on ; puskuroitu pH-arvoon pH 6 - 9.

17. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vesipitoinen apoli- . 25 poproteiiniliuos tai fosfatidyylikoliini-detergenttiliuos ; on puskuroitu pH-arvoon pH 7,5 - 8,5.

18. Jonkin patenttivaatimuksen 2-17 mukainen me- ’ netelmä, tunnettu siitä, että tuote säädetään proteiinipitoisuuteen 5-50 g/litra ja liuoksen kylmäkui- • '/· 30 vaus tuotteen stabiloimiseksi tapahtuu 5 - 15 %:n disakka- : ridia, kuten sakkaroosia tai 2 - 10 %:n monosakkaridia, >' . kuten mannitolia läsnä ollessa. • · » * »· • » lit·· • · • I · * * · i*i a » » · • · > · I t I 113052