CZ283620B6 - Způsob výroby rekonstituovaného lipoproteinu - Google Patents
Způsob výroby rekonstituovaného lipoproteinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ283620B6 CZ283620B6 CZ943299A CZ329994A CZ283620B6 CZ 283620 B6 CZ283620 B6 CZ 283620B6 CZ 943299 A CZ943299 A CZ 943299A CZ 329994 A CZ329994 A CZ 329994A CZ 283620 B6 CZ283620 B6 CZ 283620B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- lipid
- detergent
- protein
- apolipoprotein
- solution
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
- C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1275—Lipoproteins; Chylomicrons; Artificial HDL, LDL, VLDL, protein-free species thereof; Precursors thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Heating, Cooling, Or Curing Plastics Or The Like In General (AREA)
Abstract
Způsob výroby rekonstituovaných lipoproteinů o vysoké hustotě (rHDL), při němž se vodný roztok apolipoproteinu o koncentraci 1 - 40 g proteinu/l smísí s vodným roztokem lipid-detergent, který může být prost organických rozpouštědel, přičemž je molární poměr lipidu k detergentu v rozmezí 1:0,5 až 1:4,0 a hmotnostní poměr apolipoproteinu k lipidu je v rozmezí 1:1,5 až 1:5,0, získaná směs apolipoprotein-lipid-
-detergent se pak inkubuje při teplotě v rozmezí fázového přechodu lipidů ve vodě 10 .degree. C a detergent se tímto postupem alespoň částečně oddělí. rHDL jsou využitelné pro různé profylaktické a terapeutické postupy při nemocech souvisejících s lipidy a lipidům podobnými látkami. Popisovaný způsob je zvláště vhodný pro technickou a průmyslovou výrobu.
ŕ
Description
Způsob průmyslové výroby prostředku obsahujícího rekonstituované lipoproteinové částice
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby rekonstituovaných lipoproteinů o vysoké hustotě (rHDL) z apolipoproteinů a lipidů v průmyslovém měřítku. rHDL mají schopnost vázat a přenášet lipidy a lipidům podobné látky v organismu a ovlivňovat jejich aktivity. Jsou tedy velmi užitečné pro různé profylaktické a léčebné postupy při nemocech souvisejících s lipidy a lipidům podobnými látkami.
Dosavadní stav techniky
Lipoproteiny v lidské krvi vykonávají řadu rozličných funkcí. Dobře známou funkcí lipoproteinů je transport lipidů. Lipoproteiny mají schopnost vázat ve vodě nerozpustné lipidy, transportovat je vodním prostředím a deponovat je na cílovém místě. Jednotlivé skupiny lipoproteinů byly podrobně zkoumány ve vztahu k poruchám metabolismu lipidů. Ve většině západních zemí odhalily epidemiologické studie pozitivní korelaci mezi srdečními a oběhovými chorobami a vysokou hladinou cholesterolu v plasmě, případně vysokou hladinou LDL-cholesterolu (low density lipoprotein cholesterol), a naproti tomu negativní korelaci mezi výskytem těchto chorob a vysokým HDL nebo vysokým HDL-cholesterolem. Přestože na trhu je řada léků, které snižují obsah lipidů v krvi, v určitých situacích je výhodné provést výměnu určitých lipoproteinů. V úvahu zde přicházejí v první řadě dobré lipoproteiny jako jsou HDL nebo částice podobné HDL. Tyje možno rekonstituovat z isolovaných apolipoproteinů a vhodných lipidů (rHDL).
Vedle lipidů, které jsou přijímány s potravou, mohou lipoproteiny vázat a přenášet také jiné lipidy nebo lipidům podobné látky. Tak se na lipoproteiny mohou vázat například části odumřelých buněk, které tak mohou být převedeny na novou funkci. Mezi lipidům podobné látky, které se také váží na lipoproteiny, jsou například lipopolysacharidy (LPS). Lipopolysacharidy nebo endotoxiny jsou součásti membrán gramnegativních bakterií. Pokud se do krevního oběhu dostane dostatečné množství endotoxinu, může to vést k septickému šoku nebo dokonce k úmrtí. Funkce nebo aktivita LPS může být modifikována následkem vazby na lipoproteiny. Aktivita LPS může být výrazně ovlivněna in vivo i in vitro přítomností lipoproteinů nebo jim podobných částic. Bylo zjištěno, že podání rekonstituovaných HDL in vivo potlačilo tvorbu nádorového nekrotického faktoru (tumor necrosis factor, TNF), důležité látky zprostředkující sepsi. Podání HDL nebo rHDL in vivo tak silně snížilo symptomy septického šoku.
Kromě interakce lipoproteinů nebo rekonstituovaných lipoproteinů s lipidy nebo lipidům podobnými látkami byly také popsány interakce lipoproteinů s bílkovinami: lipoproteiny mohou interagovat s jednotlivými součástmi systému komplementu a ovlivňovat tak jejich aktivitu; některé součásti systému srážení krve se také nacházejí ve frakci lipoproteinů a jsou tedy asociovány s určitými lipoproteiny; ve frakci HDL byly také nalezeny proteiny akutní fáze, například sérum amyloid A (SAA); adsorpce určitých bílkovin na povrchy může být ovlivněna předchozím vystavením účinku lipoproteinů.
Lipoproteiny mohou také ovlivnit aktivitu celých buněk tím, že se specificky nebo nespecificky váží na jejich povrch. Aktivovatelnost krevních destiček lze například snížit vazbou HDL a zvýšit přídavkem LDL. Monocyty a makrofágy mají také receptory pro lipoproteiny, a vazba nebo vstup lipoproteinů může způsobit změny funkce těchto buněk. Aktivita dalších buněk imunitního systému, jako jsou neutrofily, je také modifikována nebo modulována vazbou
- 1 CZ 283620 B6 lipoproteinů, stejně jako růst nádorových buněk, jak bylo ukázáno na příkladu buněk glyoblastomu.
Další literární údaje popisují interakce lipoproteinů s pathogeny, případně připisují lipoproteinům antimikrobiální aktivitu. Bylo zjištěno, že viry mohou být inaktivovány prostřednictvím lipoproteinů, a parasiti jako jsou trypanosomy mohou být také takto ovlivněni nebo inhibováni.
Tyto příklady ukazují na mnohočetné možnosti použití lipoproteinů nebo rHDL při profylaxi a léčbě nemocí.
Lipoproteiny se dělí do čtyř hlavních skupin: chylomikrony, tedy částice pozůstávající převážně z triglyceridů a vyskytující se za normálních podmínek v plasmě ve větším množství jen po požití tučné stravy. VLDL (very low density lipoproteins), LDL (low density lipoproteins) a HDL (high density lipoproteins) jsou skupiny, jejichž názvosloví je odvozeno od isolace lipoproteinů centrifugách Touto metodou byly lipoproteiny isolovány klasickým způsobem v hustotním gradientu. Metoda je použitelná jen v laboratorním měřítku, protože je časově a přístrojově velmi náročná. V nejlepším případě poskytuje množství několika set miligramů lipoproteinů nebo apolipoproteinů během několika dnů. Další metody isolace lipoproteinů nebo apolipoproteinů, známé rovněž delší dobu, jsou založeny na vysrážení pomoci dvojmocných kationtů a/nebo polyethylenglykolu či dextranu. Jinou možnost isolace apolipoproteinů nabízí frakční vysrážení alkoholem popsané v patentu EP 0 329 605 Bl. Tato metoda umožňuje získat větší množství apolipoproteinů A-I (apoA-I) nebo frakcí tímto apolipoproteinem obohacených, které pak lze použít pro terapeutické účely. S takto získaným apolipoproteinem A-I nebo s bílkovinnými frakcemi jím obohacenými byla provedena řada pokusů na zvířatech i na lidech. Ty na jedné straně ukázaly bezpečnost těchto látek pokud jde o viry, na druhé straně pak skutečnost, že apoA-I v použité formě nevykazoval žádné podstatné vedlejší účinky u zvířat nebo lidí. Pokusy in vitro neprokázaly žádnou z žádaných aktivit, jako je transport cholesterolu nebo působení apoA-I na buňky typu neutrofilů, makrofágů, monocytů nebo krevních destiček. Pokusy in vivo na zvířatech a na lidech ukázaly velmi krátký poločas apoA-I v plasmě. Molekulová hmotnost volného apoA-I, 28 000 Da, nabízí možnost; že apoA-I se může vylučovat ledvinami a tato látka byla skutečně stanovena v moči králíků. Tyto výsledky ukazují, že injikovaný apoA-I se nerozdělí ve větším množství do žádané frakce lipoproteinů, a že může vykonávat svoji funkci jen po velmi krátkou dobu, neboť jeho poločas je krátký. Výhodnější formou pro infúzní podávání apoA-I by tedy byla jeho kombinace s lipoproteinem nebo s částicí obsahující lipoprotein.
Způsoby výroby rekonstituovaných lipoproteinů jsou v literatuře popsány, zvláště pro apolipoproteiny A-I, A-II, A-IV, apoC a apoE (A. Jonas, Methods in Enzymology 128, 553-582 (1986)). Nejobvyklejším lipidem používaným pro rekonstituci je fosfatidylcholin extrahovaný buď z vajec, nebo ze sojových bobů. Používají se také další fosfolipidy, dále triglyceridy nebo cholesterol. Pro účely rekonstituce se nejdříve lipid rozpustí v organickém rozpouštědle, které se pak odpaří pod dusíkem. Přitom se lipid váže na stěnu skleněné baňky ve formě tenkého filmu. Poté se přidá apolipoprotein a detergent, obvykle cholát sodný, a vše se smíchá. Přidaný cholát sodný způsobí dispersi lipidu. Po vhodné době se směs dlouhodobě dialyzuje proti velkému množství pufru. Tím se odstraní většina detergentu, a současně se z lipidů a apolipoproteinů spontánně vytvoří lipoproteiny, či tak zvané rekonstituované lipoproteiny. Místo dialýzy lze použít hydrofobní adsorbenty, které specificky adsorbují detergenty (Bio-Beads SM-2, Bio-Rad; Amberlite XAD-2; Rohm & Haas) (E.A. Bonomo, J.B. Swaney, J. Lipid Res. 29, 380-384 (1988)), nebo odstranění detergentů pomocí gelové chromatografíe. Lipoproteiny lze také získat bez použití detergentů, například inkubací vodné suspenze vhodného lipidu s apolipoproteinem, přídavkem lipidu rozpuštěného v organickém rozpouštědel k apolipoproteinů (s případným dodatečným zahřátím směsi), nebo pomocí sonikace směsi apoA-I s lipidem. Těmito metodami lze například z apoA-I a fosfatidylcholinu vyrobit plátkovité částice, které odpovídají nativním
-2CZ 283620 B6 lipoproteinům. Po inkubaci se obvykle odstraní nenavázaný apolipoprotein a volný lipid centrifugací nebo gelovou chromatografií tak, aby se získaly homogenní rekontituované částice lipoproteinu.
V US-A-5 128 318 je popisován způsob výroby rekonstituovaného HDL, při němž se fosfatidylcholin převádí do roztoku pomocí organického rozpouštědla.
Výše popsané způsoby výroby rekonstituovaných lipoproteinů jsou vhodné pouze pro získání menších množství (od několika miligramů do nejvýše několika gramů) lipoproteinů v laboratorním měřítku. Mají následující nevýhody: vysoké zředění roztoků meziproduktů obvykle znemožňuje zpracování směsi v žádaném časovém rozpětí, nutná infrastruktura pro velké objemy není obvykle k dispozici, použitá organická rozpouštědla jsou pouze v omezené míře únosná pro životní prostředí, finální produkty nejsou dobře skladovatelné a jejich koncentrace je příliš nízká, takže objemy podávané pacientům infúzí by musely být příliš velké, a tyto produkty by musely být v každém případě dále čištěny, například gelovou chromatografií, aby se s dostatečnou účinností oddělil nenavázaný lipid a proteiny od částic rHDL.
Práce A. Hubsch a spol., Circulatory Shock 40, 14-23 (1993) popisuje způsob výroby rekonstituovaných lipoproteinů, při němž je použito poměru apoliproteinu k lipidu 1:200. Produkt získaný tímto způsobem obsahuje nepřiměřeně vysoký podíl volného lipidu, což nepříznivě ovlivňuje jeho terapeutické použití. Pro terapeutické nebo profylaktické využití rHDL u lidí je nutné použít gramové dávky rHDL, aby se dosáhlo signifikantního zvýšení hladiny apoA-I nebo HDL v plasmě. Ekonomicky únosná výroba rHDL pro klinické použití, tedy v kilogramových nebo ještě vy šších množstvích, není uskutečnitelná výše popsanými způsoby.
Ze spisu EP-A-O 277 849 je známa příprava rekonstruovaných LDL (low density lipoprotein). LDL se ovšem podstatně odlišují od HDL co se týká jejich vlastností jako je složení proteinů a lipidů, velikost a funkce. V dokumentu není uveden žádný poukaz na to, jakým způsobem by bylo možné ekonomicky a ekologicky příznivě vyrábět substance tohoto typu v průmyslovém měřítku. Podle tohoto dokumentu se při zpracování LDL používá detergent jako je např. natriumdeoxycholát. Na směs se poté působí účinnou látkou a závěrem se detergent odstraní, přičemž je zmiňována dialýza. Z tohoto dokumentu ovšem není možno odvodit žádné přesné údaje pro provedení reakce k výrobě rHDL v průmyslovém měřítku. Právě tak není uvedeno, jak vysoká je koncentrace volných lipidů, které mohou způsobit poškození u léčených jedinců v případě, že se neodstraní. Podle vynálezu je bez dodatečných čisticích kroků tato koncentrace již tak nízká, že preparace mohou být použity přímo k léčebným účelům.
V dokumentech WO 93/25581, EP-A-277 849, EP-A-329 605 a Jonas: Experimental Lung Research 6, 255-270 (1984) jsou popsány způsoby výroby rekonstruovaného HDL. Výroba probíhá za pomoci detergenčních činidel, přičemž se při výrobě používá částečně organických rozpouštědel jako je chloroform. Dílem obsahuje způsob rovněž postup dialýzy, jako např. cholátovou dialýzu, která ovšem není vhodná pro průmyslový způsob výroby. Dále mají uvedené způsoby tu nevýhodu, že vznikají volné lipidy, které je nutno odstraňovat dodatečnými výrobními kroky. V opačném případě mohou vykazovat u biologických systémů škodlivé účinky.
V důsledku toho existuje požadavek takového způsobu, který umožňuje výrobu v průmyslovém měřítku s minimálním počtem výrobních kroků a který poskytuje pokud možno vysoký výtěžek konečného produktu s minimálním obsahem volných lipidů. Řešení tohoto typu se ve shora zmíněných publikacích neobjevuje.
Předmětem popisovaného vynálezu je proto způsob výroby rHDL, který by byl prost výše zmíněných nevýhod a který by poskytoval produkt neobsahující žádná větší množství volného lipidu nebo volného apoA-I. Cílem je vypracovat postup, který by nevyžadoval použití organických rozpouštědel. Bylo zjištěno, že rekonstituované lipoproteiny, zvláště pak
CZ 283620 Β6 rekonstituované HDL (rHDL), mohou být vyrobeny jednoduchým, rychlým a průmyslově použitelným způsobem z apolipoproteinů a lipidů.
Podstata vynálezu
Vynález se týká způsobu průmyslové výroby prostředku obsahujícího rekonstituované lipoproteinové částice vytvořené z apolipoproteinů a lipidů, který při obsahu bílkovin 20 ± 2 g/1 a teplotě 20 °C ± 2 °C způsobí turbiditu nižší než 40 nefelometrických jednotek (NTU), a vyznačuje se tím, že vodný roztok apolipoproteinů o koncentraci 1 až 40 g proteinu/ml se smíchá s vodným roztokem lipidu a detergentu, přičemž molámí poměr lipidu a detergentu je v rozmezí 1:0,5 až 1:4,0 a hmotnostní poměr apolipoproteinů k lipidu je v rozmezí 1:1,5 až 1:5,0. Výsledná směs apolipoproteinů s lipidem a detergentem se pak inkubuje při teplotě v oblasti teploty fázového přechodu lipidu ve vodě ± 10 °C a detergent se oddělí vylučovací chromatografíí nebo adsorpcí na vhodném adsorbentu tak dalece, že se vytvoří proteinové-lipidní částice o průměru 5 až 50 nm a molekulární hmotnosti 50 000 až 1 000 000 Daltonů. V těchto částicích je vázáno bez dalšího čištění více než 95 % použitého proteinu a více než 90 % celkového lipidu.
Dále je předmětem vynálezu způsob průmyslové výroby stabilního lyofilizátu, který obsahuje rekonstituované lipoproteinové částice vytvořené z apolipoproteinů a lipidů, který se vyznačuje tím, že se vodný roztok apolipoproteinů o koncentraci 1 až 40 g proteinu/1 smíchá s vodným roztokem lipidu a detergentu, přičemž molámí poměr lipidu k detergentu je v rozmezí 1:0,5 až 1:40 a hmotnostní poměr apolipoproteinů k lipidu je v rozmezí 1:1,5 až 1:5,0. Výsledná směs apolipoproteinů s lipidem a detergentem se pak inkubuje při teplotě v oblasti teploty fázového přechodu lipidu ve vodě ± 10 °C, obvykle v rozmezí -5 °C až 42 °C, a detergent se oddělí vylučovací chromatografíí nebo adsorpcí na vhodném adsorbentu tak dalece, že se vytvoří proteinové-lipidní částice o průměru 5 až 50 nm a molekulární hmotnosti 50 000 až 1 000 000 Daltonů. V těchto částicích je vázáno bez dalšího čištění více než 95 % použitého proteinu a více než 90 % celkového lipidu. Výsledkem je kapalný produkt, který při obsahu bílkovin 20 ± 2 g/1 a teplotě 20 °C ± 2 °C způsobí turbiditu nižší než 40 nefelometrických jednotek (NTU). Tento produkt se stabilizuje lyofilizací v přítomnosti stabilizátoru vybraného ze skupiny sacharidů, například sacharosy nebo mannitolu.
Použité apolipoproteiny zahrnují například rekombinantní apolipoproteiny, apolipoproteiny z obohacené frakce apolipoproteinů A-I z lidské plasmy, fragmenty apolipoproteinů nebo přírodní, syntetické nebo rekombinantní polypeptidy s amfipatickými vlastnostmi. Fragmenty apolipoproteinů lze získat chemickou nebo enzymatickou fragmentací přírodních nebo syntetických apolipoproteinů. Příkladem chemické fragmentace je vystaveni účinku bromkyanu, příkladem enzymatického štěpení je vystavení účinku trypsinu nebo chymotrypsinu.
Roztok lipidu a detergentu podle vynálezu obsahuje jako lipid například fosfolipid pocházející ze sojových bobů nebo vajec, cholesterol, cholesterol ester, mastné kyseliny nebo triglyceridy. Detergenty jsou s výhodou žlučové kyseliny nebo jejich soli, například sodná sůl kyseliny cholové nebo deoxycholát sodný. Pro solubilizaci lipidů se přitom nepoužívají žádná organická rozpouštědla.
Výše uvedené teplotní rozmezí 20 ± 2 °C zahrnuje všechny hodnoty spadající do rozmezí 18 °C až 22 °C. Obsah proteinů 20 = 2 g/1 zahrnuje všechny koncentrace v rozmezí 18 g/1 až 22 g/1. Pojem teplota fázového přechodu ± 10 °C zahrnuje všechny hodnoty teploty, které spadají do intervalu mezi teplotou o 10 CC nižší, než je teplota fázového přechodu odpovídajícího lipidu ve vodném prostředí, a teplotou o 10 °C vyšší než je tato teplota fázového přechodu pro danou látku. Tyto hodnoty leží mezi -5 °C a 50 °C.
-4CZ 283620 B6
S výhodou používaným výchozím materiálem jsou lipoproteiny pocházející z lidské plasmy, které byly vhodným způsobem inaktivovány pokud jde o viry, například pasteurizací. Denaturované proteiny (agregáty) vznikající při tomto způsobu se následně renaturují pomocí inkubace při lehce alkalickém pH a lehce zvýšené teplotě za přítomnosti chaotropických činidel jako je močovina nebo guanidin hydrochlorid. Po tomto kroku a přepufrování proteinu v 10 mM NaCl je >70 % apoA-I přítomno ve formě monomeru (stanoveno pomocí analytické vylučovací chromatografie: 40 pg apoA-I se nanese na sloupec TSK G30005W Ultropac (LKB), eluce se provádí 10 mM fosfátem sodným, 0.02 % azidem sodným, pH 7,4, při průtoku 0,4 ml/min, měření eluátu při 280 nm).
V dalším způsobu se lipoproteiny ve vysoké koncentraci smísí s roztokem lipidů (fosfolipidy jako je fosfatidylcholin, cholesterol, triglyceridy, atd.) v roztoku žlučových kyselin nebo jejich soli (cholátu, deoxycholátu, ursodeoxycholátu). Přitom není nutno používat organických rozpouštědel. Oproti pracím popsaných Hubschem a spol. (Circulatory Shock 40, 14-23 (1993)) se poměr apolipoproteinu k lipidu zvolí tak, že se ve finálním produktu nenacházejí větší množství volného lipidu ani volného apolipoproteinu a další čištění rHDL není tedy nutné. Zvláště se sníží poměr apoA-I:PC, který leží podstatně pod hodnotou 1:200 (M:M; hmotnostní poměr 1:5,5), na hodnotu v rozmezí 1:50 až 1:180, s výhodou 1:100 až 1:150 (molámí poměr; odpovídá hmotnostnímu poměru 1:2,8 až 1:4,2 pro apoA-I a PC ze sóji). Toto snížení poměru apoA-I k PC, spolu s použitím diafiltrační metody, vede k produktu s menším obsahem volných lipidů (kvantifikovaným pomocí vylučovací chromatografie; gelová filtrace na Superose 6, viz níže) a současně k podstatně nižším koncentracím žlučových kyselin ve finálním produktu. Jak vysoké koncentrace žlučových kyselin, tak vysoký obsah volného PC mohou způsobit in vitro a in vivo poškození buněk, a musejí být tedy přesně kontrolovány. Koncentrace cholátu se optimalizuje vzhledem k poměru apoA-I:PC a současně se vyladí vzhledem k dalším přidaným lipidům, zvláště cholesterolu. Také zde se optimální koncentrace stanoví tak, aby zajišťovala co nejnižší podíl volných lipidů a volného apoA-I ve finálním produktu. Pro preparát rHDL o poměru apoA-I:PC rovném 1:150 byl nalezen molámí poměr cholátu sodného 1:200 (tedy apoA-I:PC:Na-cholát = 1:150:200 M:M:M) během inkubace popsané níže. Po 4 až 16-hodinové inkubaci při 0 °C až 2 °C (v případě PC ze sóji) se sníží koncentrace žlučové kyseliny pomoci diafiltrace s použitím ultrafiltrační membrány o velikosti pórů pro globulámí proteiny o molekulové hmotnosti 1 000 až 100 000 Da, s výhodou pod 30 000 Da. Použitý pufr vykazuje nízkou iontovou sílu (pod 100 mmol/1), s výhodou pod 10 mmol/1, při pH nad 6, s výhodou v rozmezí 7,5 až 9, a obsahem sacharidů tvořeným např. 1% sacharosou. Za těchto podmínek stačí 1 až maximálně 2 1 pufru na gram použitého proteinu k tomu, aby se dosáhlo žádaného rozdělení velikosti částic. Tyto objemy jsou mnohonásobně nižší (10 až 200 x) než u výše popsaných metod. Pokud je nutné, nastaví se koncentrace detergentu na žádanou hodnotu pomocí přídatné adsorpce na Amberlit. Za použití výše popsané diafiltrace je možno dosáhnout produktu o vysoké koncentraci (10 až 50 g protein/1), který se následně zpracuje na stabilní (kapalný nebo lyofilizovaný) produkt schopný skladování přidáním stabilizátoru, jako je sacharóza. Lyofilizát se před použitím rozpustí ve vodě, což poskytne čirý, lehce opalescentní roztok, který je lehce nažloutle zabarven podle obsahu lipidů. V tomto roztoku byla prokázána přítomnost částic rHDL ve formě prakticky totožné s tou, která byla docílena při výrobě (disky, plátky). Pomocí vylučovací chromatografie bylo zjištěno, že obsah agregátů (ponejvíce volných lipidů) je <10 % a obsah volného apolipoproteinu <5 %. Zákal nalezený v kapalném finálním produktu nebo po lyofilizaci leží při koncentraci proteinů 20 g/1 pod hodnotou 40 NTU (nefelometrických jednotek turbidity). Obsah cholátu stanovený enzymatickým barevným testem je nižší než 0,5 g cholátu sodného/g proteinu (stanovení žlučových kyselin se provádí pomocí stanovení NADH v přítomnosti NAD* za použití 3-a-hydroxysteroiddehydrogenasy; vytvořený NADH reaguje s nitrotetrazoliovou modří za katalytického působení diaforasy na modrý derivát formazanu, který se stanoví fotometricky).
V elektronovém mikroskopu mají lyofilizované částice rHDL po rozpuštění ve vhodném objemu rozpouštědla, s výhodou vody, tvar plátkovitých částic podobných nativnímu HDL, s průměrem 5 až 50 nm, obvykle 8 až 20 nm, a tloušťkou 2 až 6 nm. Analytické metody stanovení velikosti částic a její relativní distribuce, například gelová filtrace (vylučovací chromatografie) ve fyziologickém pufru na sloupci SuperosyR 6 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) ukazují, že více než 80 % částic je v rozmezí molekulární hmotnosti 100 000 až 1 000 000 Da. Gradientová gelová elektroforesa taktéž ukazuje, že více než 80 % částic je v rozmezí molekulových hmotností 50 000 až 1 000 000 Da (metoda podle A.V. Nicholse a spol., Methods in Enzymology 128, 417431 (1986)).
Jediné vyobrazení slouží k lepšímu pochopení podstaty vynálezu a k dokumentaci výše popsaných způsobů provedení. Ukazuje eluční diagram (diagram adsorpce a elučního času) gelové filtrace částic rHDL vyrobených při různých poměrech apoA-I k fosfatidylcholinu (tedy apolipoproteinu k lipidu). (Použité metody: vysokoúčinná vylučovací chromatografie apoA-I a rHDL - separace 200 pg rHDL v 100 ml 0.9 % NaCl na sloupci SuperoseR 6 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) v PBS (10 mM fosfát sodný, 150 mM NaCl, pH 7,4) při průtoku 0.5 ml/min). Adsorpce eluátu ze sloupce byla měřena při 280 nm (L.L. Rudel, C.A. Marzetta a F.L. Johnson, Methods in Enzymology 129, 45-57 (1986)). Pro stanovení obsahu jednotlivých frakcí v chromatogramu se stanoví plocha pod křivkou. Eluční křivka produktu vyrobeného při poměru 1:200 ukazuje, že volné lipidy jsou vymývány na počátku eluce, zatímco u produktů s poměry 1:100 a 1:150 tomu tak není. Pro srovnání je uvedena křivka čistého apolipoproteinu (apoA-I).
Následující příklady slouží k bližšímu popisu vynálezu, neznamenají však ohraničení nebo omezení definice vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Jeden kg apoA-I se rozpustí v 500 1 0,15 mol/1 NaCl. Roztok lipidu se vyrobí odděleně následujícím způsobem: Fosfatidylcholin ze sojového oleje (Phospholipon 90R, Nattermann, Kolín nad Rýnem) se rozpustí v pufru pozůstávajícím z 10 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0. Fosfatidylcholin (2,8 kg) a 2,325 kg cholátu sodného se rozpustí v tomto pufru a doplní na 100 1. Roztok se míchá 1 až 2 hodiny a pokud je nutno, zahřeje se na 40 °C, až se roztok vyčeří. Pak se ochladí na 4 °C a 100 1 tohoto roztoku lipidu a cholátu se smísí s 1 kg apoA-I v 500 1. Směs se pomalu míchá při 2 až 4 °C přes noc, poté se sterilně zfiltruje a diafiltruje se při 4 °C v přístroji Pellicon s kazetami PTGC o limitu propustnosti (limitní nominální molekulární hmotnost, NMWL = 10 000 Da.). Diafiltrace se provádí nejprve 4 objemy 5 mmol/1 hydrogenuhličitanu sodného a následně 2 objemy 10 sacharosy, přičemž objem roztoku produktu se udržuje konstantní. Poté se koncentrace zvolna zvýší, až se dosáhne koncentrace bílkoviny 20 g/1. Tento roztok se pak opět sterilně zfiltruje, naplní se do láhví a lyofílizuje se. Během celého pochodu je nutno dbát na to, aby zvláště roztok lipidu byl chráněn před vzduchem, světlem a příliš vysokými teplotami. Finální produkt, rozpuštěný ve vhodném množství vody tak, že koncentrace bílkovin dosáhne 20 g/1, vykazuje molámí poměr apoA-I k fosfatidylcholinu 1:100 (MokMol), a obsahuje méně než 5 % volného lipidu, je bez měřitelného obsahu volného proteinu a vykazuje zákal menší než 40 NTU.
-6CZ 283620 B6
Příklad 2
Deset kg apoA-I se rozpustí v 2 000 1 10 mmol/1 NaCl. 1,38 kg cholesterolu a 29,9 kg cholátu sodného se vmíchají do 200 1 pufru obsahujícího 10 mmol/1 Tris-HCl, 150 mmol/1 kuchyňské soli, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0. Teplota se zvýší na 65 °C a směs se 2 hodiny míchá, až se roztok vyčeří. Pak se ochladí na 20 °C a přidá se 27,9 kg fosfatidylcholinu. Roztok se ochladí na 4 °C a míchá se 2 hodiny. Pak se tato směs přidá k roztoku proteinu, zamíchá se a pak se sterilně zfiltruje. Filtrát se pomalu míchá přes noc (nejméně 16 hodin) při 4 °C. Následuje diafiltrace 4 objemy 50 mmol/1 NaCl a 1 mmol/1 EDTA, pH 7,5, po dobu 2 až 4 hodin. Poté diafiltrace pokračuje se 2 objemy 10% sacharosy. Roztok se zkoncentruje na koncentraci bílkovin 20 g/1, sterilně se zfiltruje, ochladí se ve skleněných láhvích a lyofilizuje se. Láhve se uzavřou pod vakuem a přechovávají se při 4 °C v temnotě. Tato metoda poskytuje rHDL s molámím poměrem apoA-I k fosfatidylcholinu k cholesterolu 1:100:10.
Příklad 3
Výroba rHDL s poměrem apoA-I k fosfatidylcholinu 1:150: 3,08 kg cholátu sodného se rozpustí v 25 1 pufru obsahujícího 10 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0. Ve směsi se pak rozpustí 4,2 kg fosfatidylcholinu během 2 hodin při laboratorní teplotě. Poté se přidá 1 kg apoA-I v 200 1 10 mmol/1 NaCl a směs se inkubuje přes noc při 0 až 4 °C. Následně se diafiltruje při konstantním objemu produktu proti 4 objemům 50 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 7,5 po dobu 4 hodin. Další diafiltrace probíhá proti 2 objemům 1% sacharosy. Poté se směs zkoncentruje na 20 g proteinu/1. Koncentrace sacharosy se zvýší na 10 % přidáním pevné sacharosy, roztok se sterilně zfiltruje a lyofilizuje.
Příklad 4
Výroba rHDL s poměrem apoA-I k fosfatidylcholinu k cholesterolu 1:100:10: 4,61 kg cholátu sodného se rozpustí v 25 1 pufru obsahujícího 10 mmol/1 Tris-HCl, 10 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, pH 8,0. V této směsi cholátu s pufrem směsi se pak rozpustí 138 g cholesterolu během 2 hodin při 65 °C. Směs se ochladí na laboratorní teplotu a přidá se 2,8 kg fosfatidylcholinu, který se rozpouští po dobu 1 hodiny. Přidá se 1 kg apoA-I v 200 1 10 mmol/1 NaCl a směs se inkubuje, diafiltruje a zkoncentruje jako v předchozím příkladu.
Příklad 5
Výroba rHDL s poměrem apoA-I k PC k cholesterolu 1:150:10: 5,38 kg cholátu sodného se rozpustí v pufru, jak je uvedeno v příkladech 3 a 4. Ve směsi se rozpustí 180 g cholesterolu při 65 °C po dobu 2 hodin. Poté se přidá 4,2 kg PC a rozpouští se 1 hodinu při laboratorní teplotě. Směs se přidá k 200 1 roztoku apoA-I, 5 g/1 v 10 mmol/1 NaCl a inkubuje se přes noc při 4 °C. Diafiltrace a výroba finálního produktu probíhá jak je popsáno výše.
Příklad 6
Výroba rHDL s nízkým obsahem cholátu sodného. rHDL se vyrobí jak je popsáno v příkladech až 5. Po diafiltraci a zkoncentrování se smíchá jeden objem roztoku rHDL s Amberlitem XAD- (2 objemy) a směs se inkubuje 1 hodinu při 4 °C za opatrného míchání. Po inkubaci se rHDL odfiltruje, sterilně zfiltruje a lyofilizuje jako v příkladech 1 až 5.
Příklad 7
400 g apoA-I v 80 ml 10 mmol/l NaCl se smísí s roztokem lipidu pozůstávajícím z 1,66 kg fosfatidylcholinu a 1,23 kg cholátu sodného v pufru jak je uvedeno v příkladech 3 až 6. Směs se inkubuje 16 hodin při 0 až 2 °C, poté se diafiltruje proti 4 objemům EDTA (0,1 mmol/l) a pak proti 2 až 4 objemům sacharosy (1 %). Následně se zkoncentruje na 21 až 25 g/1 proteinu. Roztok rHDL se pak nastaví na konečnou koncentraci 10 % sacharosy a 20 g/1 proteinu. Sterilně se zfíltruje, rozdělí se na dávky po 50 g (1 g rHDL v 100 ml lahvi) a lyofilizuje se.
Příklad 8
Z 980 kg předběžného precipitátu IV (P. Kistler, H. Nitschmann, Vox Sang. 7, 414-424 (1962)) se etanolickým srážením získá 11,2 kg sraženiny apoA-I. Ten se suspenduje v trojnásobném množství roztoku guanidin hydrochloridu (4 mol/1), pH se nastaví na 5,2 a roztok se pasteurizuje 10 hodin při 60 °C. Protein se solubilizuje při pH 7,5 a teplotě 45 °C, zfíltruje a provede se výměna pufru jeho gelovou filtrací za použití 10 mmol/l roztoku kuchyňské soli (Sephadex G25, Pharmacia Biotech). Získá se 160 kg roztoku apoA-I obsahujícího celkem 1040 g apoA-I. Roztok proteinu se inkubuje s roztokem lipidu 2 až 16 hodin při 0 až 2 °C. Roztok lipidu se vyrobí odděleně při laboratorní teplotě: fosfatidylcholin ze sojového oleje se rozpustí v pufru obsahujícím 10 mmol/l Tris-HCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8,0. 3203 g cholátu sodného a 4460 g fosfatidylcholinu se rozpustí v 26 kg tohoto pufru. Při následné diafiltraci (NMWL = 10 000 Da) se nejprve směs protein-lipid zkoncentruje na obsah proteinu 7 g/1. Pak proběhne diafiltrace proti 1% roztoku sacharosy, až obsah cholátu poklesne pod 4 g/1. Konečně se roztok zkoncentruje na 25 g/1 proteinu a stabilizuje se sacharosou. Finální produkt obsahuje 20 g/1 apoA-I a 100 g/1 sacharosy. Podíl volného lipidu, nalezený vylučovací chromatografii, je menší než 5 %, podíl volného apoA-I je menší než 1 %. Směs protein-lipid se pak sterilně zfíltruje, rozdělí po 50 ml dávkách a lyofilizuje. Finální produkt, rozpuštěný ve vhodném množství vody, má molámí poměr apoA-I:fosfatidylcholin 1:140 (MohMol) a obsah cholátu sodného 0,25 g/g proteinu.
Průmyslová využitelnost
Rekonstituované lipoproteiny o vysoké hustotě (rHDL) připravené způsobem podle vynálezu z apolipoproteinů a lipidů jsou použitelné pro výrobu profylaktických a léčebných prostředků účinných při nemocech souvisejících s poruchami metabolismu lipidů.
Claims (20)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob průmyslové výroby prostředku obsahujícího rekonstituované lipoproteinové částice obsahující lipoproteiny a lipidy, vyznačující se tím, že se smísí vodný roztok apolipoproteinů o koncentraci 1 až 40 g proteinu/1 s vodným roztokem lipidu a detergentu, přičemž je molámí poměr lipidu k detergentu v rozmezí 1:0,5 až 1:4,0 a hmotnostní poměr apolipoproteinů k lipidu je v rozmezí 1:1,5 až 1:5,0, získaná směs apolipoproteinů, lipidu a detergentu se následně inkubuje při teplotě v rozmezí ± 10 °C fázového přechodu lipidů ve vodě a detergent se oddělí vyloučením podle velikosti nebo adsorpcí na adsorbentu tak, že se vytvoří částice protein-lipid o průměru 5 až 50 nm a hmotnosti 50 000 až 1 000 000 daltonů, v nichž je bez dalších čisticích stupňů vázáno jak více než 95 % použitého proteinu a tak současně více než-8CZ 283620 B690 % celkového lipidu, přičemž získaný kapalný produkt vykazuje obsah proteinu 20 ± 2 g/1 a za teploty 20 °C ± 2 °C zakalení nižší než 40 NTU.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se získaný kapalný produkt dále stabilizuje lyofilizací za přítomnosti stabilizátoru vybraného ze skupiny obsahující uhlovodíky.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se použije vodný roztok apolipoproteinu v podstatě prostý organických rozpouštědel.
- 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že oddělení detergentu se provádí vylučovací chromatografíí, přičemž se použijí nejvýše 2 1 pufru na 1 g proteinu.
- 5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že po inkubaci směsi lipidapolipoprotein-detergent se detergent oddělí adsorpcí na hydrofobním adsorbentu buď vsádkovým způsobem, nebo na sloupci.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako hydrofobní adsorbent použije nerozpustný zesíťovaný kopolymer polystyrenu.
- 7. Způsob podle nároků laž6, vyznačující se tím, že se použije roztok lipiddetergent obsahující fosfolipidy, cholesterol, choleterol ester, mastné kyseliny a/nebo triglyceridy.
- 8. Způsob podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se jako apolipoprotein použije frakce lidské plasmy obohacené apolipoproteinem A-I, která se zpracuje za použití alespoň jednoho kroku inaktivace virů, inkubace ve vodném roztoku chaotropického činidla a následného pufrování v roztoku s iontovou silou nižší než 50 mmol/1, přičemž po tomto zpracování více než 70 % lipoproteinu je v monomemí formě.
- 9. Způsob podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, ž se použije roztok lipiddetergent obsahující fosfolipidy jako lipidní složku.
- 10. Způsob podle nároků laž9, vyznačující se tím, že se jako fosfolipid použije syntetický fosfatidylcholin.
- 11. Způsob podle nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že se jako fosfolipid použije přírodní fosfolipid, s výhodou extrahovaný ze sojových bobů nebo z vajec.
- 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se jako fosfolipid použije fosfatidylcholin ze sojových bobů, a že inkubace směsi apolipoprotein-lipid-fosfatidyl-cholin probíhá při teplotě 0 až 15 °C.
- 13. Způsob podle nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se použije detergent vybraný ze skupiny obsahující žlučové kyseliny nebo jejich sole.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že se jako detergent použije cholát sodný nebo deoxycholát sodný.
- 15. Způsob podle nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že se použije vodný roztok apolipoproteinu obsahující jako apolipoproteiny rekombinantní apolipoproteiny, apolipoproteiny z frakce lidské plasmy obohacené apolipoproteinem A-I, fragmenty apolipoproteinů nebo vhodné přírodní, syntetické nebo rekombinantní polypeptidy s amfipatickými vlastnostmi.-9CZ 283620 B6
- 16. Způsob podle nároků lažl5, vyznačující se tím, že po inkubaci směsi lipidapolipo-protein-detergent se obsah detergentu sníží pod 0,5 g detergentu na 1 g proteinu pomocí dialýzy nebo diafiltrace.
- 17. Způsob podle nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že před nebo po oddělení detergentu se koncentrace proteinu zvýší na 10 až 50 g/1 pomocí diafiltrace.
- 18. Způsob podle nároků lažl7, vyznačující se tím, že se vodný roztok apolipoproteinu nebo roztok lipid-detergent pufruje na pH v rozmezí 6 až 9.
- 19. Způsob podle nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že se vodný roztok apolipoproteinu nebo roztok lipid-detergent pufruje na pH v rozmezí 7,5 až 8,5.
- 20. Způsob podle nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že produkt se nastaví na koncentraci proteinu 5 až 50 g/1 a lyofilizace roztoku v přítomnosti 5 až 15 % disacharidu jako je sachara, nebo 2 až 10 % monosacharidů jako je mannitol, způsobí jeho stabilizaci.1 výkres-10CZ 283620 B6
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP93810920 | 1993-12-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ329994A3 CZ329994A3 (en) | 1995-10-18 |
CZ283620B6 true CZ283620B6 (cs) | 1998-05-13 |
Family
ID=8215104
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ943299A CZ283620B6 (cs) | 1993-12-31 | 1994-12-23 | Způsob výroby rekonstituovaného lipoproteinu |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5652339A (cs) |
EP (1) | EP0663407B1 (cs) |
JP (1) | JP3553669B2 (cs) |
KR (1) | KR0184027B1 (cs) |
CN (1) | CN1056154C (cs) |
AT (1) | ATE220072T1 (cs) |
CA (1) | CA2138925C (cs) |
CZ (1) | CZ283620B6 (cs) |
DE (1) | DE59410149D1 (cs) |
DK (1) | DK0663407T3 (cs) |
ES (1) | ES2179064T3 (cs) |
FI (1) | FI113052B (cs) |
HU (1) | HU227382B1 (cs) |
NO (1) | NO316762B1 (cs) |
PL (1) | PL185414B1 (cs) |
PT (1) | PT663407E (cs) |
TW (1) | TW434253B (cs) |
Families Citing this family (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5932536A (en) * | 1994-06-14 | 1999-08-03 | The Rockefeller University | Compositions for neutralization of lipopolysaccharides |
AUPN030794A0 (en) | 1994-12-22 | 1995-01-27 | Aruba International Pty Ltd | Discontinuous plasma or serum delipidation |
SE9702776D0 (sv) * | 1997-07-22 | 1997-07-22 | Pharmacia & Upjohn Ab | Method of preparing pharmaceutical compositions |
US6306433B1 (en) | 1997-08-12 | 2001-10-23 | Pharmacia Ab | Method of preparing pharmaceutical compositions |
US6287590B1 (en) * | 1997-10-02 | 2001-09-11 | Esperion Therapeutics, Inc. | Peptide/lipid complex formation by co-lyophilization |
CA2375868C (en) * | 1999-06-02 | 2012-10-30 | Vessel Research Laboratory Co., Ltd. | Stabilized denatured lipoprotein and method for producing thereof |
US6514523B1 (en) * | 2000-02-14 | 2003-02-04 | Ottawa Heart Institute Research Corporation | Carrier particles for drug delivery and process for preparation |
US7407663B2 (en) | 2000-06-29 | 2008-08-05 | Lipid Sciences, Inc. | Modified immunodeficiency virus particles |
AUPQ846900A0 (en) * | 2000-06-29 | 2000-07-27 | Aruba International Pty Ltd | A vaccine |
US20090017069A1 (en) | 2000-06-29 | 2009-01-15 | Lipid Sciences, Inc. | SARS Vaccine Compositions and Methods of Making and Using Them |
US7439052B2 (en) * | 2000-06-29 | 2008-10-21 | Lipid Sciences | Method of making modified immunodeficiency virus particles |
US7407662B2 (en) | 2000-06-29 | 2008-08-05 | Lipid Sciences, Inc. | Modified viral particles with immunogenic properties and reduced lipid content |
DE10035352A1 (de) * | 2000-07-20 | 2002-01-31 | Zlb Bioplasma Ag Bern | Verfahren zur Behandlung von instabiler Angina pectoris |
AU2567002A (en) | 2000-11-20 | 2002-05-27 | Univ Illinois | Membrane scaffold proteins |
US7592008B2 (en) * | 2000-11-20 | 2009-09-22 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois, A Body Corporate And Politic Of The State Of Illinois | Membrane scaffold proteins |
US20030104350A1 (en) * | 2001-06-25 | 2003-06-05 | Bomberger David C. | Systems and methods using a solvent for the removal of lipids from fluids |
WO2003000372A2 (en) * | 2001-06-25 | 2003-01-03 | Lipid Sciences, Inc. | Systems and methods using multiple solvents for the removal of lipids from fluids |
US6991727B2 (en) * | 2001-06-25 | 2006-01-31 | Lipid Sciences, Inc. | Hollow fiber contactor systems for removal of lipids from fluids |
US20030127386A1 (en) * | 2001-06-25 | 2003-07-10 | Bomberger David C. | Hollow fiber contactor systems for removal of lipids from fluids |
US20060060520A1 (en) * | 2001-06-25 | 2006-03-23 | Bomberger David C | Systems and methods using a solvent for the removal of lipids from fluids |
US20040106556A1 (en) * | 2002-08-26 | 2004-06-03 | Yanhong Zhu | Method of treating and preventing alzheimer disease through administration of delipidated protein and lipoprotein particles |
CA2515892C (en) | 2003-02-14 | 2012-10-23 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Lipophilic drug delivery vehicle and methods of use thereof |
WO2004078991A2 (en) | 2003-03-04 | 2004-09-16 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Pon polypeptides, polynucleotides encoding same and compositions and methods utilizing same |
US7375191B2 (en) * | 2003-07-03 | 2008-05-20 | Lipid Science, Inc. | Methods and apparatus for creating particle derivatives of HDL with reduced lipid content |
US7393826B2 (en) * | 2003-07-03 | 2008-07-01 | Lipid Sciences, Inc. | Methods and apparatus for creating particle derivatives of HDL with reduced lipid content |
US6960803B2 (en) * | 2003-10-23 | 2005-11-01 | Silicon Storage Technology, Inc. | Landing pad for use as a contact to a conductive spacer |
JP4534511B2 (ja) * | 2004-02-16 | 2010-09-01 | 東ソー株式会社 | リポ蛋白を含んだ凍結乾燥試料 |
US20060160721A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-07-20 | Baylor College Of Medicine | Method of plasma lipidation to prevent, inhibit and/or reverse atherosclerosis |
US7759315B2 (en) * | 2005-03-09 | 2010-07-20 | Csl Behring Ag | Treatment of inflammatory conditions of the intestine |
US20080227686A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-09-18 | Lipid Sciences, Inc. | Novel Peptides that Promote Lipid Efflux |
WO2007149355A2 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Lipid Sciences, Inc. | Novel peptides that promote lipid efflux |
US20080206142A1 (en) * | 2006-06-16 | 2008-08-28 | Lipid Sciences, Inc. | Novel Peptides That Promote Lipid Efflux |
US20080138284A1 (en) * | 2006-09-26 | 2008-06-12 | Lipid Sciences, Inc. | Novel Peptides That Promote Lipid Efflux |
US7956035B2 (en) * | 2007-03-01 | 2011-06-07 | Csl Limited | Treatment of endothelial dysfunction in diabetic patients |
PL2465519T3 (pl) | 2007-03-01 | 2014-05-30 | Csl Ltd | Leczenie dysfunkcji śródbłonka u pacjentów z cukrzycą |
US20090110739A1 (en) * | 2007-05-15 | 2009-04-30 | University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth | Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles |
US8324366B2 (en) | 2008-04-29 | 2012-12-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for delivering RNAI using lipoproteins |
US8734853B2 (en) | 2008-11-17 | 2014-05-27 | University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth | HDL particles for delivery of nucleic acids |
AU2010221419B2 (en) | 2009-03-02 | 2015-10-01 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid chemical modifications |
CN101928739B (zh) * | 2009-06-22 | 2014-02-05 | 吉林圣元科技有限责任公司 | 一种重组高密度脂蛋白的制备及其应用 |
EP2676659A1 (en) | 2009-07-16 | 2013-12-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | HDL comprising a therapeutic agent and use in therapy |
US10894098B2 (en) | 2012-04-09 | 2021-01-19 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted imaging |
WO2011044545A2 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Sigalov Alexander B | Methods and compositions for targeted imaging |
WO2011123621A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides |
WO2011133876A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs |
WO2011133871A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 5'-end derivatives |
US20130260460A1 (en) | 2010-04-22 | 2013-10-03 | Isis Pharmaceuticals Inc | Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides |
ES2617977T3 (es) * | 2010-06-30 | 2017-06-20 | Csl Limited | Una formulación de lipoproteína de alta densidad reconstituida y método de producción de la misma |
US20120190609A1 (en) * | 2010-08-30 | 2012-07-26 | Martin Bader | Method for producing a lipid particle, the lipid particle itself and its use |
EP2611417A2 (en) * | 2010-08-30 | 2013-07-10 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing a tetranectin-apolipoprotein a-1 particle, the lipid particle obtained therewith and its use |
BR112013004397A2 (pt) * | 2010-08-30 | 2017-06-27 | Hoffmann La Roche | método para produzir uma partícula de lipídio, a partícula de lipídio em si e seu uso |
KR20190084334A (ko) | 2011-12-21 | 2019-07-16 | 시에스엘 리미티드 | 아포지질단백질 제형을 위한 용량 용법 |
US9125943B2 (en) | 2012-11-02 | 2015-09-08 | Csl Limited | Reconstituted HDL formulation |
EP2745834B1 (en) | 2012-12-18 | 2016-09-28 | Jens Frauenfeld | Salipro particles |
NZ631126A (en) | 2013-08-08 | 2018-06-29 | Csl Ltd | Contaminant removal method |
PL3043814T3 (pl) | 2013-09-13 | 2021-05-17 | Salipro Biotech AB | Antygen i sposób jego wytwarzania |
EP2853259A1 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-01 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Reconstituted high density lipoproteins composition and uses thereof |
TWI576114B (zh) * | 2013-12-27 | 2017-04-01 | 國立交通大學 | 一種脂蛋白b重組脂質球,其製備方法及其用途 |
JP2018504380A (ja) | 2014-12-18 | 2018-02-15 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. | Reversir(商標)化合物 |
US20160346219A1 (en) | 2015-06-01 | 2016-12-01 | Autotelic Llc | Phospholipid-coated therapeutic agent nanoparticles and related methods |
JP2021504003A (ja) | 2017-11-22 | 2021-02-15 | エイチディーエル セラピューティクス インコーポレイテッドHdl Therapeutics, Inc. | 血漿処理システムの流体回路をプライミングするシステムおよび方法 |
JP2021509894A (ja) | 2017-12-28 | 2021-04-08 | エイチディーエル セラピューティクス インコーポレイテッドHdl Therapeutics, Inc. | ヒト血漿から抽出されたpre−β高密度リポタンパク質を保存および投与するための方法 |
CN110551207B (zh) * | 2019-08-21 | 2023-05-05 | 广州蕊特生物科技有限公司 | 一种脂蛋白纯化方法 |
WO2021191266A1 (en) | 2020-03-25 | 2021-09-30 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Aerosolization of hdl for the treatment of lung infections |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE456136B (sv) * | 1985-06-17 | 1988-09-12 | Oncholab Ab | Forfarande for framstellning av en med ett lipofilt biologiskt aktivt emne bemengd berare pa basis av rekonstituerat ldl (lagdensitetslipoprotein) |
FR2609399A1 (fr) * | 1987-01-13 | 1988-07-15 | Ire Celltarg Sa | Procede d'incorporation d'un ou plusieurs principes actifs lipophiles dans des lipoproteines, lipoproteines obtenues et composition pharmaceutique les contenant |
US5128318A (en) * | 1987-05-20 | 1992-07-07 | The Rogosin Institute | Reconstituted HDL particles and uses thereof |
WO1988009345A1 (en) * | 1987-05-20 | 1988-12-01 | The Rogosin Institute | Reconstituted hdl particles and uses thereof |
CA1335077C (en) * | 1988-02-08 | 1995-04-04 | Henri Isliker | Process for the manufacture of apolipoproteins from human blood plasma or serum |
DE69321118T2 (de) * | 1992-06-12 | 1999-06-02 | Naamloze Vennootschap Innogenetics S.A., Gent | Peptide und Proteine, Verfahren zur Ihren Herstellung und die Verwendung als Cholesterol-Annehmer |
-
1994
- 1994-12-21 US US08/361,132 patent/US5652339A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 TW TW083112032A patent/TW434253B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-12-22 CA CA002138925A patent/CA2138925C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-23 CZ CZ943299A patent/CZ283620B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-12-28 PT PT94810753T patent/PT663407E/pt unknown
- 1994-12-28 EP EP94810753A patent/EP0663407B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 DE DE59410149T patent/DE59410149D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 ES ES94810753T patent/ES2179064T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-28 DK DK94810753T patent/DK0663407T3/da active
- 1994-12-28 AT AT94810753T patent/ATE220072T1/de active
- 1994-12-28 KR KR1019940038151A patent/KR0184027B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-12-28 JP JP32873294A patent/JP3553669B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-29 PL PL94306575A patent/PL185414B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-12-29 HU HU9403830A patent/HU227382B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-12-30 FI FI946199A patent/FI113052B/fi not_active IP Right Cessation
- 1994-12-30 NO NO19945101A patent/NO316762B1/no not_active IP Right Cessation
- 1994-12-31 CN CN94119129A patent/CN1056154C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0663407A1 (de) | 1995-07-19 |
CA2138925A1 (en) | 1995-07-01 |
KR0184027B1 (ko) | 1999-04-01 |
JPH07242699A (ja) | 1995-09-19 |
FI946199A (fi) | 1995-07-01 |
ES2179064T3 (es) | 2003-01-16 |
CN1108662A (zh) | 1995-09-20 |
PL185414B1 (pl) | 2003-05-30 |
FI113052B (fi) | 2004-02-27 |
NO316762B1 (no) | 2004-05-03 |
FI946199A0 (fi) | 1994-12-30 |
KR950018039A (ko) | 1995-07-22 |
CN1056154C (zh) | 2000-09-06 |
HU9403830D0 (en) | 1995-02-28 |
DE59410149D1 (de) | 2002-08-08 |
DK0663407T3 (da) | 2002-10-28 |
JP3553669B2 (ja) | 2004-08-11 |
NO945101D0 (no) | 1994-12-30 |
EP0663407B1 (de) | 2002-07-03 |
CZ329994A3 (en) | 1995-10-18 |
TW434253B (en) | 2001-05-16 |
ATE220072T1 (de) | 2002-07-15 |
CA2138925C (en) | 2002-11-05 |
PL306575A1 (en) | 1995-07-10 |
HU227382B1 (en) | 2011-05-30 |
NO945101L (no) | 1995-07-03 |
PT663407E (pt) | 2002-11-29 |
HUT70448A (en) | 1995-10-30 |
US5652339A (en) | 1997-07-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CZ283620B6 (cs) | Způsob výroby rekonstituovaného lipoproteinu | |
JP6612186B2 (ja) | 抗体調製物 | |
Zimmerman et al. | 120-kD surface glycoprotein of Pneumocystis carinii is a ligand for surfactant protein A. | |
US5725864A (en) | Composition for suppressing infection and growth of human immunodeficiency virus | |
JPH11501046A (ja) | タンパク質の製造法 | |
JPH10509690A (ja) | 免疫原性を増強する方法、得られた産生物と医薬品組成物 | |
JP2001511174A (ja) | 乾燥された、貯蔵安定性を有する血小板を製造するための方法及び組成物 | |
JP2532535B2 (ja) | 組織タンパクpp4含有医薬 | |
CA2807448A1 (en) | Tetranectin-apolipoprotein a-i, lipid particles containing it and its use | |
MX2013001541A (es) | Metodo para producir una particula lipidica de tetranectina-apolipoproteina a-1, la particula lipidica misma y su uso. | |
AU583402B2 (en) | Method for the production of a macromolecular carrier loaded with a biologically active substance | |
Cornelius et al. | Identification of apolipoprotein AI as a major adsorbate on biomaterial surfaces after blood or plasma contact | |
AU764066B2 (en) | Purification process for production of mannan-binding lectin and an MBL medicinal product | |
ES2268071T3 (es) | Vesiculas naturales que mimetizan la apoptosis y uso de las msimas en tratamiento medico. | |
JP2005508892A (ja) | Gc−グロブリンの大規模生産のための精製方法、これにより得られる物質およびそれらの医薬用途 | |
US20040101964A1 (en) | Method of preparing virus vector | |
KR20130117760A (ko) | 테트라넥틴-아포지단백질 a-i 입자의 제조 방법, 이에 의해 제조된 지질 입자 및 이의 용도 | |
TW529953B (en) | Preparation of human recombinant erythropoietin and it's stabilized solution | |
Brockmann | Generation of a liposome based platelet substitute: insertion of GPIb-IX into liposomes | |
CZ244996A3 (cs) | Způsob výroby přírodního dietetického přípravku | |
JPH0418029A (ja) | Hiv感染細胞を殺傷するリポソーム | |
WILSON JR | A Study on Neuraminidase of Influenza Viruses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20131223 |