TWI576114B - 一種脂蛋白ｂ重組脂質球，其製備方法及其用途 - Google Patents

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Description

一種脂蛋白B重組脂質球，其製備方法及其用途
本發明係關於一種脂蛋白B重組脂質球及其製備方法，尤其是，以該脂蛋白B重組脂質球作為傳輸疏水性物質之用途。
低密度脂蛋白是由單一的脂蛋白B與數種脂質(包括膽固醇酯(cholesteryl ester，CE)、游離膽固醇(free cholesterol，FC)、三酸甘油脂(triglyceride，TG)、以及磷脂(phospholipids，PL))所合成，其大小為18至25 nm。除了合成低密度脂蛋白外，脂蛋白B也是組成極低密度脂蛋白(very low-density lipoproteins，VLDL)及乳糜微粒(chylomicrons)的主要蛋白質。在人體中，脂蛋白B主要有兩種形式，全長的脂蛋白B蛋白質(apolipoprotein B-100，apoB-100)包含4563個胺基酸，而經由mRNA修飾所產生包含48% N端序列的脂蛋白B-48(apolipoprotein B-48，apoB-48)則含有2153個胺基酸，脂蛋白B-100出現在肝臟，並且會在肝臟合成極低密度脂蛋白與低密度脂蛋白，而脂蛋白B-48則是在小腸形成乳糜微粒。在生理上，低密度脂蛋白扮演脂質代謝的角色，將膽固醇及三酸甘油脂由肝臟帶至其他組織以供細胞利用(超過2/3的膽固醇由此系統運送，細胞可利用細胞外的受器辨識脂蛋白B並吞噬低密度 脂蛋白。脂蛋白B為擁有明顯的α-螺旋(α-helical)及β平板(β-sheet)結構的蛋白質，並且可以被分類為β α 1、β 1、α 2、β 2、以及α 3部分。
低密度脂蛋白上的脂蛋白B會被細胞表面的低密度脂蛋白受體所辨認結合並進入細胞。當低密度脂蛋白經由胞噬作用(endocytosis)進入細胞後，會形成核內體(endosome)，接下來核內體會與溶小體(lysozyme)融合。低密度脂蛋白會在此時被水解為膽固醇、胺基酸及脂肪酸，被水解的膽固醇可用來轉化固醇類賀爾蒙、合成細胞膜或被細胞儲存等，而低密度脂蛋白受體則可被回收再利用。
目前已經有許多研究指出，低密度脂蛋白受體會大量表現於多種癌細胞。舉例來說，膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM，腦癌的一種)，會大量表現低密度脂蛋白受體。相對而言，正常的腦組織的低密度脂蛋白受體表現量相對較低。所以，以低密度脂蛋白為基礎的藥物輸送系統可應用於癌症的標靶治療。
低密度脂蛋白由脂蛋白B與脂質組合而成，但直到目前為止，仍有部份的低密度脂蛋白的生合成路徑上不清楚。另外，現行有許多藥物為脂溶性，在生理環境中不易在體內運送。
本發明希望經由重摺疊/重組裝低密度脂蛋白，了解低密度脂蛋白生合成之機制，為蛋白質摺疊研究開創新頁。且低密度脂蛋白在人體中扮演攜帶並運送脂溶性物質的角色，且低密度脂蛋白具有穩定、高度親水性及被受體辨認吞噬等特性，所以吾人嘗試利用重組低密度脂蛋白來當作新一代的藥物載體系統。
本發明提供一種製備脂蛋白B重組脂質球之方法，其步驟包括：(a)將脂蛋白B與脂質溶解於含有2M至8M尿素及1 wt%至15 wt%兩親性化合物之第一緩衝液中以形成混合物；以及(b)將該混合物與第二緩衝液進行1至多次透析，以降低該混合物中尿素及兩親性化合物的濃度，其中，該第二緩衝液中之尿素濃度為0至2M，且兩親性化合物之濃度為0 wt%至0.5 wt%。
於本發明之一具體實施例中，復包括將疏水性物質溶解於組成相同於該步驟(a)之第一緩衝液的緩衝液中，過濾該具有疏水性物質之緩衝液，將其再加入步驟(a)之該混合物中。
再於本發明之一具體實施例中，先將疏水性物質與脂質溶解於上述第一緩衝液中形成疏水性物質與脂質混合物，再將溶解於上述第一緩衝液中的脂蛋白B加入該疏水性物質與脂質混合物。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，該疏水性物質可選自顯影劑或親脂性藥物。較佳者，該顯影劑係選自由超順磁性氧化鐵奈米粒子、錳福地吡(Mangafodipir)、釓塞酸(Gadoxetic acid)、釓噴酸(Gadopentetic acid)、釓貝酸(Gadobenic acid)、釓特酸(Gadoteric acid)及Vistarem所組成群組之至少一者。較佳者，該親脂性藥物係為M4N(四-O-甲基降二氫癒創木酸)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多柔比星(doxorubincin)所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，上述第一緩衝液之pH值係為11。較佳者，上述第二緩衝液係於pH 8.8至pH 11之範圍內。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，上述脂蛋白B選自天然脂蛋白B或人工重組脂蛋白B。較佳者，該脂蛋白B可選自脂 蛋白B-100、B-29及B-48所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，該脂質可選自磷脂質、膽固醇及三甘油酯所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，該兩親性化合物可選自非離子性介面活性劑或膽汁酸類。較佳者，該非離子性介面活性劑係為采酮X-100。較佳者，該膽汁酸類係為去氧膽酸。
本發明進一步提供一種人工脂蛋白B重組脂質球，包含外部脂蛋白B及脂質所組成之層及脂質核心，其中該外部脂蛋白B及脂質層包含至少一個脂蛋白B，且該脂質核心含有至少一個疏水性物質。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，上述脂蛋白B選自天然脂蛋白B或人工重組脂蛋白B。較佳者，該脂蛋白B可選自脂蛋白B-100、B-29及B-48所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，該脂質可選自磷脂質、膽固醇及三甘油酯所組成群組之至少一者。
於本發明之一具體實施例中，較佳者，該疏水性物質可選自顯影劑或親脂性藥物。較佳者，該顯影劑係選自由超順磁性氧化鐵奈米粒子、錳福地吡(Mangafodipir)、釓塞酸(Gadoxetic acid)、釓噴酸(Gadopentetic acid)、釓貝酸(Gadobenic acid)、釓特酸(Gadoteric acid)及Vistarem所組成群組之至少一者。較佳者，該親脂性藥物係選自由M4N(四-O-甲基降二氫癒創木酸)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多柔比星(doxorubincin)所組成群組之至少一者。
本發明再進一步提供一種利用本發明之脂蛋白B重組脂質球作為疏水性物質傳輸系統之用途。
第1圖係顯示低密度脂蛋白之萃取與脂蛋白B-29/脂蛋白B-48製備；(a)低密度脂蛋白之萃取結果；(b)脂蛋白B-29/脂蛋白B-48於原核表現系統經由IPTG誘導後表現；S為上清液，P為沉澱物；(c)藉由超高速離心分離的脂蛋白B-29/脂蛋白B-48(密度為1.08 g/ml)，BSA為控制組； 第2圖係顯示低密度脂蛋白與脂蛋白B重組脂質球之螢光影像；(a)(上圖)脂蛋白B-29/脂蛋白B-48、低密度脂蛋白、(中圖)采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)之摺疊中間體及(下圖)去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球(BS-rABL)之摺疊中間體的脂質/脂蛋白螢光圖；(b)圖(a)之量化圖；紅色部分為脂蛋白B蛋白質，綠色為脂質部分；比例尺為1μm； 第3圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之毒性測試，以不同濃度(5、10、20μg/ml)的低密度脂蛋白及脂蛋白B重組脂質球與THP-1；(a)及A549；(b)細胞共同培養11小時後，用Trypan blue染色並計算細胞死亡比例；為添加PBS；為添加采酮X-100添加的摺疊過程中透析的PBS；為低密度脂蛋白；為去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球(BS-rABL)；為采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)；(c)UV-vis測量1%采酮X-100(虛線)；采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(點線)；低密度脂蛋白(虛-點線)；采酮X-100添加的摺疊過程中透析的PBS(實線)； 第4圖係顯示采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球之毒性分析；西方點墨法分析A549(a)與THP-1(b)攝入采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)後之細胞生理反應；NC為只加入 PBS的控制組；Oxa為oxaliplatin； 第5圖係顯示脂蛋白B重組脂質球可被細胞吞噬A549(a)與THP-1(b)cells分別處理添加PBS(NC)、LDL、rABL並培養11小時；藍色部分為細胞核，紅色部分為脂蛋白B蛋白質，綠色為細胞骨架(Actin)，比例尺為30μm； 第6圖係顯示低密度脂蛋白受體之競爭測試；低密度脂蛋白/脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白受體之競爭測試；Ab為低密度脂蛋白受體之抗體；對照組添加等量之PBS；**P<0.01； 第7圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之細胞生理反應分析；西方點墨法分析A549(左圖)與THP-1(右圖)攝入低密度脂蛋白及脂蛋白B重組脂質球後之細胞生理反應；NC為只加入PBS的控制組；Oxa為oxaliplatin； 第8圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之水合粒徑分析；低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL)與包覆M4脂蛋白B重組脂質球(M4N@rABL)之水合粒徑大小分析； 第9圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之表面電位分析；低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL)與包覆M4脂蛋白B重組脂質球(M4N@rABL)之表面電位分析； 第10圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之組成分析；利用傅立葉轉換紅外光譜儀分析低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL)與包覆M4N脂蛋白B重組脂質球(M4N@rABL)之組成；箭號為蛋白 質/脂質訊號；星號為3-Aminopropyl triethoxysilane(超順磁性氧化鐵奈米粒子之表面修飾劑)；三角型區域為M4N訊號； 第11圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之藥物釋放圖譜分析；包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL)與包覆M4N脂蛋白B重組脂質球(M4N@rABL)之藥物釋放圖譜分析； 第12圖係顯示脂蛋白B重組脂質球之電子顯微鏡影像；利用高解析度的水相穿透式電子顯微鏡解析包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL；上圖)與低密度脂蛋白(下圖)；比例尺為20 nm； 第13圖係顯示包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球之應用；注射包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球的老鼠之活體影像，在注射包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球後，使用核磁共振攝影觀測活體老鼠之肝臟；上圖為冠狀面(coronal view，上圖)；中圖為橫切面(axial view)；紅色區域為老鼠肝臟；箭頭標示處為核磁共振訊號減弱區域；下圖為訊號對背景值之相對比例；原始數據中，未注射老鼠之訊號對背景值之比例為16.96±0.41； 第14圖係顯示包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球之應用；A549細胞處理包覆M4N的重組蛋白B之細胞存活率；其中低密度脂蛋白/包覆M4N的重組蛋白B同時加入之實驗組為測試其之間之競爭能力；NC為只使用PBS的對照組；*P<0.05；**P<0.01；
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習 此專業之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之優點及功效。本發明亦可藉由其它不同之實施方式加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明所揭示之精神下賦予不同之修飾與變更。
本發明提供一種製備脂蛋白B重組脂質球之方法，其步驟包括：(a)將脂蛋白B與脂質分別溶解於含有2M至8M尿素及1重量%(wt%)至15 wt%兩親性化合物之第一緩衝液中，然後將兩者混合以形成混合物；以及(b)將該混合物與第二緩衝液進行1至5次透析，以降低該混合物中尿素及兩親性化合物的濃度，其中，該第二緩衝液中之尿素濃度為0至2M，且兩親性化合物之濃度為0 wt%至0.5 wt%。於一具體實施例中，該含有2M至8M尿素及1重量%(wt%)至15 wt%兩親性化合物之第一緩衝液意指為變性緩衝液，含有0至2M尿素及0 wt%至0.5 wt%兩親性化合物之第二緩衝液係意指為摺疊緩衝液，於該第一緩衝液及第二緩衝液中不同的尿素以及兩親性化合物濃度均可將蛋白質及脂質變性，唯低濃度之尿素與兩親性化合物所配製的變性緩衝液對於蛋白質及脂質之溶解度較低。
本發明進一步提供一種人工脂蛋白B重組脂質球，包含由脂蛋白B及脂質所組成之外部層及內部核心，其中，該外部層包含至少一個脂蛋白B，且該內部核心含有至少一個疏水性物質。
本發明提供一種利用本發明之脂蛋白B重組脂質球作為疏水性物質傳輸系統之用途。
於本發明所使用之術語「準靜態過臨界點摺疊法」係意指蛋白質摺疊過程中溶液置換過程緩慢或溶液置換變因極小近似皆處 於平衡態之過程為「準靜態」；臨界點摺疊法係意指多步驟溶液變換方法使蛋白質摺疊呈過臨界點連續反應之過程。
於本發明所使用之術語「超順磁性氧化鐵奈米粒子」係意指於磁場下會產生磁性，當外在磁場消失時，其磁性即消失，此特性可以避免超順磁性氧化鐵奈米粒子聚集的情形產生。超順磁性氧化鐵奈米粒子可由沉澱法、水熱法或是化學還原法等方式製作。其中以化學還原法方式製作的超順磁性氧化鐵奈米粒子可保有較佳的均一化粒徑，但所產生之成品為有機相，無法溶解在水溶液中，如果要應用於生物醫學方面，則需要經過適度的修飾。近來，有許多研究嘗試將超順磁性氧化鐵奈米粒子當作核磁共振影像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)的顯影劑，因為超順磁性氧化鐵奈米粒子擁有不易聚集的特性，可降低顯影劑本身偽訊號的產生，因此，超順磁性氧化鐵奈米粒子具有作為良好的顯影劑之潛力。除了當作核磁共振影像之顯影劑外，超順磁性氧化鐵奈米粒子目前也被研究其藥物傳導及磁熱效應之應用潛力。於本發明中使用無表面修飾之超順磁性氧化鐵奈米粒子進行脂蛋白B重組脂質球之實驗。
於本發明所使用之術語「M4N(四-O-甲基降二氫癒創木酸，tetra-O-methyl nordihydroguaiaretic acid)」係意指從蒺藜科植物中純化的一種無毒化合物。於長期餵食小鼠條件下，並無發現小鼠有顯著體重改變或是導致死亡的情形。在功能上，M4N可以藉由抑制Sp1轉錄因子而抑制HIV病毒轉譯及導致癌症細胞死亡。在腫瘤細胞中，M4N會接合至富含G/C的去氧核醣核酸序列，並使細胞生長停留在G2/M期。此外，M4N也可以抑制腫瘤細胞之細胞 週期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdc2)與生存素(survivin)之表現以造成癌症細胞死亡。於本發明中，將M4N當為疏水性藥物並測試其包覆入脂蛋白B重組脂質球之可能性。
於本發明所使用之術語「太平洋紫杉醇(paclitaxel)」係意指最早是由太平洋紫杉之樹皮所萃取，目前廣泛被應用於癌症的治療上，其作用機轉為穩定細胞分裂時的所產生的微管(microtubules)，使細胞分裂時，無法降解微管，而導致細胞分裂無法完成並造成細胞死亡。但是由於太平洋紫杉醇之高度疏水性，在使用太平洋紫杉醇時，必須適度的添加助溶劑，目前常使用的助溶劑為聚氧乙烯蓖麻油(cremophor)與脫水酒精的混合物。此一混合物雖然可以幫助太平洋紫杉醇溶解並順利到達病灶，可是卻容易造成過敏反應，導致給藥的過程容易出現不易預期的副作用。有鑑於此，美國FDA於2005年優先審核通過奈米白蛋白紫杉醇顆粒的上市，奈米白蛋白紫杉醇顆粒為使用白蛋白包覆之太平洋紫杉醇，其大小約為130 nm，因為包覆了白蛋白，所以奈米白蛋白紫杉醇顆粒可以溶解於水溶液中。另外，在癌症細胞生長時，需要包含白蛋白等大量營養物，奈米白蛋白紫杉醇顆粒可藉由此機制進入癌細胞中並造成癌細胞的死亡。
實施例1 材料
除了有額外提到的，所有的化學藥品皆從默克(Merck，Rahway,NJ)或西格瑪(Sigma，St.Louis,MO)兩間公司購買。人類血清來自於健康的捐贈者，並由馬偕紀念醫院機構審查委員會所批准(IRB No.10MMHIS082)。無特定病原體，4-5週齡BALB/c小鼠採購自國家實驗動物中心，並依據中央研究院動物護理和使用委員會規 範進行實驗。表面無修飾之2奈米超順磁性氧化鐵奈米粒子可由商購或自行合成。M4N可由商購或自行合成。Anti-apoB(C1.4，單株抗體)、anti-LDLR、anti-p53與anti-Erk抗體由Santa Cruz Biotechnology Inc.(Santa Cruz，CA)所購買；anti-apoB之多株抗體則是向Roche(Branford，CT)公司所購買；接合cy3的二級抗體是向Jackson Immuno Research Laboratories(West Grove，PA)購買；anti-p-p53(ser-15)、anti-p-Erk、anti-p38及anti-p-p38的抗體是向Cell Signaling Technology(Beverly，MA)購買；anti-caspase 3抗體是向Abcam(Cambridge，UK)購買；Hoechst 33342是向Invitrogen(Carlsbad，CA)購買；anti-3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase(HMGR)抗體是向Millipore Corporation(Billerica，MA)購買；phalloidin接合之anti-actin抗體是向Molecular Probe，Life Technologies(New York)所購買；膽固醇定量試劑組(cholesterol assay kit)則是向Cayman Chemical Company(Ann Arbor,MI)公司所購買。
實施例2 低密度脂蛋白之純化
將全血以5000×g的速度離心十分鐘以分離血球與血漿，將血漿收集後，以超高速離心機使用45000×g離心16小時去除極低密度脂蛋白。因為人體中低密度脂蛋白之密度為1.060 g/ml至1.063 g/ml，所以利用溴化鉀(KBr)調整密度到此區間，並再度使用超高速離心機(45000×g，20小時)分離並純化低密度脂蛋白。
實施例3脂蛋白B-100之分離
將純化後的低密度脂蛋白緩慢滴入甲醇/乙醚混合液中(甲醇：乙醚=3：1，-80℃))並混合均勻。將混合物利用3000×g的速 度離心5分鐘，沉澱部份即為分離出來之脂蛋白B-100。
實施例4 脂蛋白B-29/脂蛋白B-48的樣品製備
挑選含有pET24-apoB29/pET24-apoB48的菌株，放入LB培養液中培養至生長期後，加入IPTG誘導脂蛋白B-29/脂蛋白B-48的表現，將經過誘導的菌液以高壓破碎機破菌後，離心將產物分為上清液以及沉澱物。利用溴化鉀將上清液調整密度至1.08 g/ml，並使用超高速離心機(45,000×g，20小時)分離並純化脂蛋白B-29/脂蛋白B-48。
實施例5 膽固醇與脂蛋白B之定量
脂蛋白B之濃度是利用布拉德福德方法(Bradford method)所定量。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)為標準曲線建立時所使用的標準品。而膽固醇的濃度則由膽固醇定量試劑組所定量。另外，在低密度脂蛋白中，膽固醇的濃度幾乎為恒定(60%)，所以可以使用膽固醇的量回推低密度脂蛋白的脂質含量。
實施例6 脂蛋白B-100之重組
先將2毫克(mg)的脂蛋白B-100與6.5 mg的脂質分別使用1毫升(ml)的變性緩衝液(表1)溶解，將溶解的脂質及脂蛋白B-100以0.22微米(μm)大小的濾膜過濾後，將兩者混合在一起並於4℃下緩慢攪拌1小時，依照準靜態過臨界點摺疊法，將混合物裝入透析膜中並放入2500 ml摺疊緩衝液1中透析兩次，一次24小時，放入2500 ml摺疊緩衝液2中透析兩次，一次12小時。放入2500 ml摺疊緩衝液3中透析兩次，一次12小時。放入2500 ml摺疊緩衝液4中透析兩次，一次12小時。放入2500 ml摺疊緩衝液5中透析兩次，一次12小時。最後，將樣品放入2500 ml的PBS中透 析三次即成。為了避免脂質氧化，所有的緩衝液均先充填氮氣。
實施例7製作包含有超順磁性氧化鐵奈米粒子與M4N的脂蛋白B重組脂質球(SPIO@rABL與M4N@rABL)
將超順磁性氧化鐵奈米粒子與M4N分別以適量變性緩衝液溶解後，配製成含有超順磁性氧化鐵奈米粒子的變性緩衝液(鐵離子最終濃度為100μg/mL)與含有M4N的變性緩衝液(M4N最終濃度為10 mM)；同時，將6.5 mg的脂質使用1 ml的變性緩衝液溶解，最後將含有超順磁性氧化鐵奈米粒子或是含有M4N的變性緩衝液與預先溶解於變性緩衝液的脂質混合反應。將混合物以0.22μm大小的濾膜過濾，並於4℃下緩慢攪拌1小時。其間充填氮氣以避免脂質氧化。另外，將2毫克(mg)的脂蛋白B-100使用1ml的變性緩衝液溶解，將溶解的脂蛋白B-100以0.22微米(μm)大小的濾膜過濾後，再將溶解的脂蛋白B-100與含有超順磁性氧化鐵奈米粒子或是含有M4N的變性緩衝液與脂質的混合物混合，並於4℃下緩慢攪拌1小時，依照準靜態過臨界點摺疊法，將混合物裝入透析膜中並放入2500 ml摺疊緩衝液1中透析兩次，一次24小時，放入2500 ml摺疊緩衝液2中透析兩次，一次12小時。放入 2500 ml摺疊緩衝液3中透析兩次，一次12小時。放入2500 ml摺疊緩衝液4中透析兩次，一次12小時。放入2500 ml摺疊緩衝液5中透析兩次，一次12小時。最後，將樣品放入2500 ml的PBS中透析三次即成。為了避免脂質氧化，所有的緩衝液均先充填氮氣。
實施例8低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、脂蛋白B-29/脂蛋白B-48之螢光影像觀察
將脂蛋白B的抗體(Rorch，多株抗體)滴在蓋玻片上於37℃反應1小時，再加入含有3%牛血清白蛋白的磷酸緩衝液反應30分鐘，避免非專一性的鍵結。將樣品(低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、脂蛋白B重組過程之摺疊中間體及脂蛋白B-29/脂蛋白B-48)滴在有固定抗體的玻片上，在37℃反應1小時，用PBS清洗掉未與玻片上抗體接合的蛋白質。再加入脂蛋白B抗體(Santa Cluz)於37℃反應1小時後，用磷酸緩衝液清洗多餘抗體，接下來再使用螢光物質接合(cy3-conjugated，Jackson)二級抗體呈現脂蛋白B訊號，而脂質則是利用3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO；DiOC18(3)，Invitrogen)染色，使用螢光顯微鏡觀察脂蛋白B與脂質的螢光影像並以CCD攝影機紀錄。
實施例9 脂蛋白B重組脂質球之粒徑大小分析
將樣品(低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包含有超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球與包含M4N的脂蛋白B重組脂質球)濃度調整為0.2 mg/ml並使用動態光散射儀分析樣品粒徑大小。動態光散射儀的量測是使用Brookhaven Instruments Corp.(Holtsville，NY)的儀器。入射雷射光之波長為532.15 nm， 並在90°角收集散射光，量測時溫度保持在20℃，並使用非負最小二乘法(non-negative least squares，NNLS)方法計算出粒徑大小。
實施例10脂蛋白B重組脂質球之表面電位測量
將樣品(低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包含有超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球與包含M4N的脂蛋白B重組脂質球)的濃度調整為0.5 mg/ml，並使用界面電位分析儀(DelsaTM NanoC photon correlation spectrometer,Beckman Coulter Inc.，Brea，CA)分析樣品之表面電位。
實施例11 脂蛋白B重組脂質球之藥物釋放圖譜分析
將包含有超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球與包含M4N的脂蛋白B重組脂質球放置於透析袋中，並以PBS透析48小時，於特定時間收取PBS並測量其中之鐵離子及M4N之濃度。M4N的濃度可由280 nm之吸收得到。在鐵離子濃度定量方面，需將100微升(μl)的12N HCl加入100μl的樣品於室溫反應30分鐘後，再將混合物移至烘箱1小時。加入200μl的1%過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)，再加入400μl的0.1 M硫氰酸鉀(potassium thiocyanate，KSCN)並於室溫反應5分鐘。最後使用495 nm的吸收定量鐵離子濃度。
實施例12 脂蛋白B重組脂質球之組成分析
將樣品抽乾後與溴化鉀(KBr)混合後打錠，利用傅立葉轉換紅外光譜儀(PerkinElmer Spectrum 100 FTIR spectrometer，PerkinElmer，Waltham，MA)分析低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球與包覆M4N脂蛋白B重組脂質球之組成。每個數據來自32次掃描， 解析度為4 cm-1，掃描範圍為4000-450 cm-1。
實施例13 細胞培養
THP-1與A549細胞培養於RPMI-1640培養液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，並添加10%的胎牛血清與100 U/ml的盤尼西林(penicillin)及10μg/ml的鏈黴素(streptomycin)。
實施例14 細胞吞噬觀察
將A549與THP-1細胞以不含血清之培養液培養16小時後，將脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白(最終濃度100μg/ml)分別加入A549與THP-1細胞中，放入培養箱培養11個小時。去除培養液後，加入PBS清洗兩次，去除原先培養液中未被細胞攝取的低密度脂蛋白。使用4%的多聚甲醛(para-formaldehyde)固定細胞後，以0.25%的采酮X-100打破細胞膜以利染劑進入。脂蛋白B、細胞骨架與細胞核分別以脂蛋白B抗體、毒蠅虎蕈鹼(phalloidin)接合之抗肌動蛋白(anti-actin)抗體及赫斯特(Hoechst 33342)染色，再以共軛焦顯微鏡觀察。
實施例15 細胞毒性測試
將A549與THP-1細胞以不含血清之培養液培養16小時後，分別加入脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白(最終濃度為5、10、20μg/ml)，放入培養箱培養11個小時。細胞死亡率是由台酚藍(trypan blue)染色方式計算，在每組實驗中，至少有400個以上的細胞被計算。
實施例16 低密度脂蛋白競爭測試
將A549細胞以不含血清之培養液培養16小時後，加入anti-LDLR的抗體(最終濃度為10μg/ml)並培養1小時，(anti-LDLR 的抗體須先使用PBS透析以移除殘留之疊氮化鈉(sodium azide)。加入PBS清洗兩次，去除原先培養液中未被結合的anti-LDLR抗體。將脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白(最終濃度10μg/ml)加入A549細胞中，放入培養箱培養5小時。去除培養液後，加入PBS清洗兩次，去除原先培養液中未被細胞攝取的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白。使用4%的多聚甲醛(para-formaldehyde)固定細胞後，以0.25%的采酮X-100打破細胞膜以利染劑進入。脂蛋白B、細胞骨架與細胞核分別以脂蛋白B抗體、phalloidin接合之anti-actin抗體及Hochest 33342染色，再以螢光顯微鏡觀察。
實施例17 細胞生理反應分析
將A549與THP-1細胞以不含血清之培養液培養8小時後，分別加入脂蛋白B重組脂質球(最終濃度為20μg/ml)、低密度脂蛋白(最終濃度為20μg/ml)與奧沙利鉑(oxaliplatin)(最終濃度為10μM)，並放入培養箱培養11個小時。將細胞裂解後，以傳統西方點墨法的方式，使用anti-HMGR、anti-p53、anti-p-p53(ser-15)、anti-Erk、anti-p-Erk、anti-p38、anti-p-p38、anti-caspase 3及anti-actin的抗體偵測細胞生理反應。
實施例18 脂蛋白B重組脂質球之電子顯微鏡影像
將0.5μl的樣品(包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白)密封於自我對準濕元件(self-aligned wet(SAW)cell)中，以場發射槍穿透式電子顯微鏡(field emission gun(FEG)-TEM,JEM-2010F,JEOL,Tokyo,Japan)觀察其型態。
實施例19 活體核磁共振影像
將300μl的包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂 質球(內含250μg/ml的鐵離子與500μg/ml的低密度脂蛋白，最終小鼠體內鐵濃度為5 mg/kg)經由靜脈注射入4-5週齡BALB/c小鼠中。使用9.4-T的磁場觀察其核磁共振影像(Bruker BioSpec 94/20 USR)。ParaVision 5.0及Matlab 6.0軟體用來分析核磁共振影像訊號。肝臟的訊雜比(signal-to-noise ratio，SNR)以下列公式計算SNR=signal intensity of the liver/SD of the background noise (1)
實施例20 包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球功能性測試
將A549細胞以不含血清之培養液培養16小時後，分別加入低密度脂蛋白(最終濃度為20μg/ml)、M4N(最終濃度為100μM)、包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球(最終濃度為20μg/ml脂蛋白B重組脂質球與100μM的M4N)與包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球(最終濃度為20μg/ml脂蛋白B重組脂質球與100μM的M4N)加上低密度脂蛋白(最終濃度為40μg/ml)，並培養24小時。去除培養液後，加入PBS清洗兩次，加入含有血清的培養液培養48小時，細胞的死亡率由trypan blue染色觀察。
統計分析
所有的定量分析均重複3-10次，數據表示為平均值±標準誤差(SEM)的平均值。P值小於0.05被認為有統計上的意義。
結果與討論 (1)脂蛋白B的製備
藉由超高速離心從人類血漿中分離出低密度脂蛋白(d=1.062-1.063 g/ml)(第1圖)，在使用冰冷的甲醇/乙醚混合液萃取後，即可得到脂蛋白B。在本發明中，每分升的血清約可得到20-40 mg的脂蛋白B蛋白質(20-40 mg/dl)。在脂蛋白B-29/脂蛋白 B-48表現部分，加入IPTG誘導蛋白質在原核表現系統大量表現後收取菌液，使用高壓破碎機破菌並將上清液以超高速離心後，即可得到脂蛋白B-29/脂蛋白B-48。
(2)脂蛋白B蛋白質可藉由準靜態過臨界點摺疊法進行體外重摺疊
為了避免脂蛋白B-100在摺疊過程中因環境劇烈變化而沉澱，本發明使用修飾過的準靜態過臨界點摺疊法來重新摺疊脂蛋白B，將摺疊緩衝液分為五部份，利用透析方式達成環境緩慢變化的目的，並藉此收集摺疊中間體觀察脂蛋白B-100與脂質之間聚合情形。脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白藉由免疫染色的方式半定量脂蛋白B與脂質之結合比例。螢光顯微鏡下，去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球(BS-rABL)之脂質/脂蛋白B比例(I1/IapoB=2.01±0.23)、采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)之脂質/脂蛋白B比例(2.00±0.04)，其比例與低密度脂蛋白相似(2.06±0.14)，表示在摺疊過程中，不論是使用采酮X-100或是去氧膽酸，均可幫助脂蛋白B-100回復成低密度脂蛋白。摺疊中間體的分析顯示，使用去氧膽酸摺疊的脂蛋白B重組脂質球，呈現出兩狀態轉移(Two-state transition)的現象(第2圖)，從摺疊初期(M1)即呈現與低密度脂蛋白相似的結果，且一直到摺疊的最後階段(M5)皆沒有太大的改變，指出在使用去氧膽酸摺疊的脂蛋白B重組脂質球，可能直接從變性態(denature state)直接達到摺疊完成態(refolded state)，中間並無經過任何的中間態(intermediate state)。采酮X-100摺疊組則呈現不同的情形(第2圖)，在摺疊初期(M1)只有少數的脂質會與脂蛋白B-100聚合，隨者摺疊緩衝液越來越接近自然緩衝液狀態時，越來越多的脂質會與脂蛋白B-100 聚合(M1：0.70±0.08，M2：0.74±0.07，M3：1.27±0.01，M4：1.96±0.26，M5：2.00±0.04)，顯示在摺疊過程中，因為采酮X-100與脂蛋白B-100的鍵結逐漸被脂質-脂蛋白B-100所取代，所以呈現了脂質逐步增加的現象。而脂蛋白B-29/脂蛋白B-48的脂質/脂蛋白B比例分別為0.82±0.05及1.18±0.20。表示在原核系統表現下，脂蛋白B-29/脂蛋白B-48也會包含部份的脂質。
為了近一步確定其準確的脂質/脂蛋白B比例，本發明分別將膽固醇與蛋白質定量，並得出其比例。其中，脂蛋白B重組脂質球的脂質/脂蛋白B比例為1.978±0.102，而低密度脂蛋白的脂質/脂蛋白B比例為1.968±0.073(表2)，兩者皆與之前的研究相同。另外，脂蛋白B重組脂質球製作完成後，可以穩定的存在於4℃環境下長達數個月。
(3)脂蛋白B重組脂質球之細胞毒性分析
本發明使用單核球細胞株THP-1(第3圖(a))與非小細胞肺癌細胞株A549(第3圖(b))測試采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)及去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球(BS-rABL)之毒性。在分別加入最終濃度為5、10、20μg/ml的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白後，於37℃培養11小時，利用Trypan blue 染色並區別活細胞與死細胞。在本實驗中，采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球在細胞實驗中呈現明顯的細胞毒性，而去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白呈現相類似的結果，並無明顯細胞毒性的產生。在光譜分析下(第3圖(c))，可發現采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球內仍然有采酮X-100的殘留。
(4)采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球之毒性分析
為了確定采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)所造成的毒性是來自於殘留的采酮X-100，本發明將采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球添加至A549細胞(第4圖(a))與THP-1(第4圖(b))細胞株內共同培養1小時，並使用西方點墨法偵測其細胞生理反應。其中，在A549細胞中，加入采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球會增加p-p38與p-Erk的表現量，代表其引起的毒性是經由滲透壓的改變而導致MAPK路徑活化而造成細胞死亡。而在去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球處理的細胞實驗中，則未發現與低密度脂蛋白相異的地方。
(5)脂蛋白B重組脂質球之細胞吞噬能力分析
上述之實驗證實了采酮X-100添加的脂蛋白B重組脂質球(T-rABL)具有強烈的細胞毒性，所以接續之生理功能測試之實驗均使用去氧膽酸添加的脂蛋白B重組脂質球(BS-rABL，後續接簡稱為rABL)。此外，為了要證實脂蛋白B重組脂質球於功能上是否與低密度脂蛋白相同，本發明使用A549(第5圖(a))與THP-1(第5圖(b))細胞株測試脂蛋白B重組脂質球是否被細胞吞噬。將最終濃度100μg/ml的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白分別加入 A549與THP-1細胞並於37℃培養11小時，利用共軛焦顯微鏡觀察脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白被攝入細胞中的情形，由第5圖可知，不論是脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白，均可被A549與THP-1細胞攝入體內，並且有相似的分布。
(6)脂蛋白B重組脂質球可經由低密度脂蛋白受體進入細胞
為了進一步確定脂蛋白B重組脂質球是經由受體調節之胞吞作用(receptor-mediated endocytosis)所辯認並攝取入細胞中，本發明使用A549細胞進行低密度脂蛋白受體競爭測試(因為THP-1細胞有清道夫受體(scavenger receptor)，故不適合本實驗)，在加入低密度脂蛋白受體抗體培養後，脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白被細胞吞噬的比例均有大幅度的下降(脂蛋白B重組脂質球：38.4±11.9%；低密度脂蛋白：39.5±13.1%；第6圖)。顯示脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白，可經由低密度脂蛋白受體辨認並進入細胞。
(7)脂蛋白B重組脂質球之細胞生理反應分析
當低密度脂蛋白被細胞吞噬後，會有一連串的生理反應發生。為了證實脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白之相似度，本發明將脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白分別處理細胞後，收取細胞裂解液並使用西方點墨法分析其細胞生理反應的差異性(第7圖)。在處理脂蛋白B重組脂質球或低密度脂蛋白後，p-p53(ser-15)、p-p38與p-Erk等對應氧化壓力的蛋白質被磷酸化的程度並無明顯的差異性，細胞凋亡的標記蛋白質-半胱天冬酶(caspase 3)的活化程度也沒有顯著的增加。另外，與對照組相比，處理脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白後，膽固醇合成的速率決定酵素-3-羥基 -3-甲基戊二醯基-輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)的表現量被降低。綜合第6圖與第7圖的結果，可以證實脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白一樣，可經由低密度脂蛋白受體辨認進入細胞並提供膽固醇給細胞。這些結果也支持了脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白在生理功能上非常類似。
(8)開發可攜帶藥物的脂蛋白B重組脂質球
在確定脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白相似後，本發明進一步測試脂蛋白B重組脂質球是否具有攜帶外來疏水性分子的能力。為了測試這個想法，本發明將疏水性的超順磁性氧化鐵奈米粒子以及親脂性的小分子抗癌藥物M4N(分子量358 Da)於脂蛋白B重組脂質球的第一個步驟將其加入重組反應混合物中。當置備完成後，本發明利用動態光散射儀、界面電位分析儀及傅立葉轉換紅外光譜儀分析其理化特性。在動態光散射儀測量中，脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球以及包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球水合直徑分別為21.5±0.93、19.9±1.33及23.9±1.6 nm，此大小分布與所測量到的低密度脂蛋白相似(第8圖)，並符合之前研究的低密度脂蛋白大小(18-25 nm)。在表面電位方面，低密度脂蛋白、脂蛋白B重組脂質球、包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球以及包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球分別為-19.8±1.84、-19.5±0.67、-18.79±0.56以及-20.5±2.32 mV(第9圖)。在傅立葉轉換紅外光譜儀分析中，可以證實脂蛋白B重組脂質球的組成與低密度脂蛋白相似，而且超順磁性氧化鐵奈米粒子與M4N也成功的包埋至脂蛋 白B重組脂質球中(第10圖；表3)。另外，因為本發明希望包埋藥物的脂蛋白B重組脂質球可以應用於藥物載體系統，故其穩定性也必須要考慮。在藥物釋放圖譜分析中，可以證實包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球以及包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球非常穩定，並不容易在PBS環境下將藥物釋放出來(第11圖)。
(9)脂蛋白B重組脂質球之電子顯微鏡影像
為了觀察低密度脂蛋白與脂蛋白B重組脂質球之單分子影像，本發明使用高解析度的水相穿透式電子顯微鏡。當脂蛋白B重組脂質球包埋了超順磁性氧化鐵奈米粒子後，因為鐵奈米粒子的有較高的電子密度，所以在顯微鏡觀察下，會產生較強對比之影像。相對的，低密度脂蛋白影像的對比較弱(第12圖)。另外，在顯微鏡下觀察到的低密度脂蛋白與脂蛋白B重組脂質球之粒徑大小約為20 nm，與之前的動態光散射儀結果相同(第8圖)。
(10)包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球可當作 T2顯影劑
將包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球經由靜脈注射進入小鼠體內後(最終濃度為5 mg/kg)，使用核磁共振儀觀測其核磁共振影像的改變。在注射包覆超順磁性氧化鐵奈米粒子的脂蛋白B重組脂質球半小時後，可以發現老鼠肝臟的訊雜比(signal to noise，SNR)變弱(第13圖)。因為大部分的低密度脂蛋白會被肝臟的低密度脂蛋白所結合並回收，所以老鼠肝臟的T2核磁共振訊號會快速的減弱，此外，本發明所使用的超順磁性氧化鐵奈米粒子的濃度約為前人實驗的1/4，而造成的SNR下降的值則類似。顯示脂蛋白B重組脂質球有攜帶疏水性顯影劑的潛力。
(11)包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球可降低癌細胞之存活率
在先前的研究中，M4N可以降低癌細胞的存活率。在本發明中，將A549細胞分別處理M4N與包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球，並參照先前的研究方式觀測細胞存活率之變化。於第14圖中，可以發現單獨添加M4N的細胞有大約40%的存活率，而添加包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球造成的細胞存活率比單獨添加M4N的細胞存活率更低(大約30%)，可証明有藥物載體的幫助，M4N對於降低癌細胞的存活率效果更加。另外，在額外加入低密度脂蛋白後，包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球所造成的細胞存活率有回升的情形(大約55%)，可以證明包覆M4N的脂蛋白B重組脂質球與低密度脂蛋白共用相同的胞吞路徑。
上述實施例僅例示性說明本發明之原理及其功效，而非用於限制本發明。任何熟習此項專業之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，舉凡所屬技 術領域中具有此項專業知識者，在未脫離本發明所揭示之精神與技術原理下所完成之一切等效修飾或改變，仍應由後述之申請專利範圍所涵蓋。

Claims (13)

  1. 一種製備脂蛋白B重組脂質球之方法，其步驟包括：(a)將脂蛋白B與脂質溶解於含有2M至8M尿素及1wt%至15wt%兩親性化合物之第一緩衝液中以形成混合物；(b)將該混合物與第二緩衝液進行1至5次透析，以降低該混合物中尿素及兩親性化合物的濃度，其中，該第二緩衝液中之尿素濃度為0至2M，且兩親性化合物之濃度為0wt%至0.5wt%；以及(c)重複步驟(b)，且該重複之步驟(b)中之該第二緩衝液的尿素濃度及兩親性化合物濃度係小於或等於前次操作之步驟(b)中該第二緩衝液的尿素濃度及兩親性化合物濃度；其中，該脂質係選自磷脂質、膽固醇及三甘油酯所組成群組之至少一者；以及，該兩親性化合物係選自非離子性介面活性劑或膽汁酸類。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，復包括將疏水性物質溶解於組成相同於該步驟(a)之第一緩衝液的緩衝液中，過濾該具有疏水性物質之緩衝液，將其再加入步驟(a)之該混合物中。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該疏水性物質係選自顯影劑或親脂性藥物。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該顯影劑係選自由超順磁性氧化鐵奈米粒子、錳福地吡(Mangafodipir)、釓塞酸(Gadoxetic acid)、釓噴酸(Gadopentetic acid)、釓貝酸(Gadobenic acid)、釓特酸(Gadoteric acid)及Vistarem所組成群組之至少一者。
  5. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該親脂性藥物係選自由M4N(四-O-甲基降二氫癒創木酸)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多柔比星(doxorubincin)所組成群組之至少一者。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該第一緩衝液之pH值係為11。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該第二緩衝液之pH值係於8.8至11之範圍內。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該脂蛋白B係選自天然脂蛋白B或人工重組脂蛋白B。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，該脂蛋白B係選自脂蛋白B-100、B-29及B-48所組成群組之至少一者。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該非離子性介面活性劑係為采酮X-100。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該膽汁酸類係為去氧膽酸。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該脂蛋白B重組脂質球包含由脂蛋白B及脂質所組成之外部層及內部核心，其中，該外部層包含至少一個脂蛋白B，且該內部核心含有至少一個疏水性物質。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該脂蛋白B重組脂質球作為疏水性物質傳輸系統之用途。
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