HU227382B1 - Process for producing reconstituted lipoproteine - Google Patents

Description

A találmány tárgya ipari eljárás rekonstituált Xipoproteibek (reoonstituted High Density Lipoproteinsi rHSL) gyártására apoliproteinekből és lipidekből» Az rHDL képes arra, hogy a sz érvé cetben levő lipideket és lipidekhez hasonló anyagokat megkösse, szállítsa és hatásaikat befolyásolja» Az rHDL-t ennélfogva tel lehet használni olyan betege égek megelőzésére és kezelésére, amely betegségek összefüggésben vannak lipidekkel és lipidekhez hasonló anyagokkal»

Az ember vérében levő lipoproteinek egy sor különböző feladatot képesek teljesíteni» Bgyik alaposan kutatott és ismert tunkolójuk a lipidek szállítása» A lipoproteineknek ugyanis megvan az a képességük, hogy a vízben oldhatatlan lipideket felvegyék, vizes közegben szállítsák, majd célba juttassák» Hosszabb ideje képezi alapos vizsgálat tárgyát a lipidanyagcsere-za var okkal összefüggésben a lipoproteinek néhány csoportja» Epidemiológiai vizsgálatokkal a legtöbb nyugati országban pozitív összefüggést mutattak ki a szív- és keringési betegségek és a magas plazmakoleszterin-tartalom vagy a magas WL-koleszterin-tartalom (Low Density Lipoprotein-Cholesterin) között, továbbá negatív korrelációt tapasztaltak a szív- és keringési betegségek, valaha mint a magas HDL~ vagy\magas HLL-koleszterin-tartalom között» Jóllehet egy sor olyan gyógyszer van forgalomban, amely lipidsz int csökkentő hatású, könnyen belátható, hogy bizonyos esetekben szükség van alkalmas lipoproteinekkel való helyettesítésre» Ilyen helyzetekben elsősorban az olyan ^ttjó” lipoproteinek jönnek számításba, mint a HOL vagy a HDL-hez hasonló anyagok, igy az elkülönített apoliproteinekből és alkalmas lipidekből rekonstituált HÜL {rHÜL}»

A táplálkozással felvett lipidek mellett a linóprot« más lipideket vagy lipidekhes hasonló anyagokat is szállítanak vagy megkötnek. így például elhalt sejtek alkotórészei képesek lipoproteinekhez kötődni és ezáltal uj szerephez jutni» A lipoprot einekhez azonban Xipidekhez hasonló anyagok is képesek kötődni, például lipopoliszachsridok. A lipopoliszacharidok vagy endotixinok a Grsm-negstiv baktériumok sejtfalát alkotó anyagok· Abban as esetben , ha a vérkeringésbe elég nagy mennyiségben jut be endotoxin, mérgezésas sokk állhat be, sőt bekövetkezhet a halál· Mvel a lipopoliszacharidok (LPS) lipoproteinekhez kötődnek, módosulhat as LPS szerepe vagy hatása· As WS-aktivitást in vivő és in vitro egyaránt lehet befolyásolni - mégpedig nagymértékben - lipoproteinek és lipoproteinekhes hasonló anyagok hozzáadásával· így például ki tudták mutatni, hogy in vivő körülmények között rekonstituált SOI· adagolásával meg lehet gátolni a tumornekrózis faktor (OT) képződését· (A ® a vérmérgezés egyik lényeges szerepet játszó médiát óra.) így tehát HDL vagy rED.L beadásával in vívó körülmények között nagymértékben meg tudták akadályozni a sokk tünetcsoportjának jelent késését«

A lipoproteinek vagy a rekonstituált lipoproteinek és a lipidek vagy a Xipidekhez hasonló anyagok kölcsönhat ása mellett ismeretesek & lipoproteinek és a proteinek közötti kölcsönhatások

- a lipoproteinek és a komplementrendszer egyes komponensei között kölcsönhatás alakulhat ki, és ezáltal a lipoproteinek képesek arra, hogy befolyásolják a komplementrendszer egyes kompoue ne oine k akt ivxt ás át $

- ismeretesek olyan, a lipoprotein-frakcióban található, a véralvadásban szerepet játszó komponensek is, amelyek mghatároa e s z oe iálódnak

X *

- a BDL~frakodóban megtalálhatók olyan, az akut fázisra jellemző proteinek, mint as A-széruaamiloid? és

- lipoproteinekkel végrehajtott előkezeléssel is lehet befolyásolni bizonyos proteinek felszíni adszorpcióját»

A lipoproteinek azonban olyan módon is képesek sejtek aktivitását befolyásolni, hogy a sejtekhez - adott esetben jellemző módon - kötődnek:

- a vérlemezkék aktiválhatósága HDL-kötődés révén csökken, LD! hozzáadására pedig fokozódik?

- a lipoproteinek receptoraiként működnek a monociták és a makrofágok is, ha tehát ezekhez a falósejtekhez lipoproteinek kötődnek, illetve ezek a falósejtek lipoproteineket vesznek fel, megváltozhat az aktivitásuk?

- az immunrendszer más sejtjeinek, igy a neutrofileknek is megváltoztatható vagy módosítható az aktivitásuk, ha lipoproteiueket kapcsolnak hozzájuk? és

- a daganat sejtek szaporodása is befolyásolható - amint ezt a glioblasztomasejtek példája is igazolja - lipoproteinekkel.

Találhatók a szakirodalomban továbbá olyan közlemények is, amelyek lipoproteinek és kórokozók közötti kölcsönhatásokkal foglalkoznak* Xgy például ismertették, hogy léteznek mikrobaellenes hatású lipoproteinek. Kimutatták, hogy lipoproteinekkel vírusok inaktiválhatók, és tripanoszómákon igazolták, hogy lipoprötéinek képesek befolyásolni, illetve gátolni a paraziták működését in«

Kzefc a példák mutatják, hogy milyen változatos alkalmazási lehetőségei vaunak a Xipoprotsíneknek vagy az rHDL-nek mind a megelőzés, mind a gyógykezelés területén*

A llpoproteinek négy főcsoportba sorolhatók» Az első főcsoportba tartoznak a kilomikronok, amelyek fotömegükben trigilcaridekből álló részecskék* A vérplazmában általában csak zsírtartalmú ételek fogyasztása után tűnnek fel nagyobb mennyiségben»

A második főcsoportot as igen kis sűrűségű llpoproteinek (VXDL) _¥ a harmadik főcsoportot a kissürüségü llpoproteinek (Wl), a negyedik főcsoportot pedig a nagysűrűségű llpoproteinek (HDL) alkotják* A főcsoportok elnevezése a llpoproteinek ultraeentrifugálással végzett elválasztásával kapcsolatos* ültracentrifugálássál a llpoproteinek sűrűségben különbözőségük szerint hagyományos módon különíthetők el egymástól* Sz a módszer csak laboratóriumi méretekben alkalmazható, minthogy időigényes és - a berendezést tekintve - nagyon költséges* Ilyen megoldással jó esetben néhány nap alatt is mindössze pár száz milligramm lipopro teint vagy apolipoproteint lehet kinyerni» Hosszú idő óta ismeretesek más módszerek is apolipoproteinek vagy llpoproteinek elválasztáséra* Ezek a módszerek többnyire kétértékű kationokkal és/vagy például polietilénglikollal vagy dextráanal való kicsapáson alapulnak* Az apoliprotelnek elválasztására további lehetőségként kínálkozik az alkoholos fraknionált kicsapás, amelyet a 529 605« sz* európai szabadalmi leírásban ismertetnek· Szzel a megoldással nagyobb mennyiségben lehet A-X-apolipoproteint (apoA~X) vagy apoA-I-ben dús frakciókat elkülöníteni gyógyászati alkalmazásra· Az ilyen módon elkülönített apoA-X vagy apoA-X-ben daa frakciók felhasználásával egy sor kísérletet végeztek embereken és állatokon egyaránt» Székkel a kísérletekkel egyrészt iga zolták, hogy ezek a termékek vírus okkal szemben biztonságot nyújtanak, másrészt bizonyították, hogy az apoA-X a felhasznált formában δβ fejt ki jelentősebb mellékhatásokat az « lati szervezetben. Az in vitro körülmények között végzett kísérletek sorén mindenesetre nem tapasztalták a kívánt jelenségek egyikét sem, így például nem volt kimutatható a koleszterínssállitás, valamint az apoA-X hatása olyan sejtekre, sitt a neutrofilek, a makrai ágok» a monoéit ák és a vér lemez kék· Úgy az állatokon, mint az embereken végzett in vivő kísérletek során igen rövid felezési időket mértek a plazmában levő apoA-X-re. Tekintettel a szabad apoA-X 28 000 dalion molekulatömegére, fennáll az a lehetőség» hogy az apoA-X a vesében kicsapódik. Házinyul vizeletében valóban ki is mutattak apoA-I-et· Székből az eredményekből az a következtetés vonható le, hogy az ilyen mádon injektált apoA-X nagyobb mennyisége nem a kívánt Xipoprotein-frakoiéba kerül & megoszlás során· Az apoA-1 Így in vivő körülmények között rövid felezési ideje miatt legfeljebb igen rövid ideig képes hatását kifejteni· Az apoA-1 egyik megfelelő adagolási formája tehát az lehet» hogy lipoproteinrészeoskékbe vagy lipoprotelnhez hasonló anyagok részecskéibe foglaltan injektálják be a szervezetbe·

Bekonstituált lipoproteinek - elsősorban A-I, A-XX, A-XV, apoO és apoS apolipoproteinek - előállítására ismertetnek a szakirodalomban eljárásokat [A, Jónás? Methods ín Enzymology, 128. 552-5S2 (1986)1. A re konstruáláshoz leggyakrabban felhasznált lipidet - a foszfatídil-kolint - tojásból vagy szójababból vonják ki· Más foszfolipideket és olyan lipideket is felhasználnak, mint a trigliceridek és a koleszterin· A rekcnstituálást úgy végzik, hogy a lipideket először feloldják valamilyen szerves oldószerben, amelyet azután nitrogénatmoszférában elpárologtatnak· Ennél az eljárásnál a lipid vékony film formájában üvegfalhoz kötődik· Ezután apolipoproteint, valamilyen detergenst és rendszerint nátrium-ke látót adagolnak a Xipidhea, és a komponenseket φ ·>· összekeverik. A beadagolt nátrium-kólát hatására lipiddiszperzió keletkezik. Megfelelő inkubációs idő eltelte után az elegyet nagymennyiségű pufferre! hosszabb ideig dializálják, hogy eltávolítsák a nátrium-kólát főtömegét» ugyanakkor lehetőséget adjanak arra hogy a lipidek és az apolipoproteinek a lipoproteinekkel vagy az úgynevezett rekonstituált lipoproteinekkel spontán módon összekerüljenek. A diaiizéiást megvalósíthatják olyan hidrofób adszorbensek alkalmzásával is, amelyek képesek detergenseket specifikusan abszorbeálni? mint például a Bohm and Haas cég Blo-Beads SM-2 és Amberlite XáD-2 elnevezésű termékei [S.A* Bonomo és J.S. S^aneys J. Lipid Bes#, 2^. 380-384 (1988)]. Bgy másik alternatív diallzálási módszer a detergeasek elválasztása gélkrossatográfiás eljárással. Lipoproteineket detergeasek nélkül is elő lehet állítani ? például olyan módon, hogy megfelelő lipid vizes szuszpenzióját apolipoproteinekkel együtt inkubálják - a lipidet valamilyen szerves oldószerben feloldva adják hozzá az apolipoproteinekhez -» majd adott esetben az inkubált elegyet még melegítik is, vagy úgy járnak el, hogy apoA-X és valamilyen lipid elegyét ultrahanggal kezelik. Bzekkel a módszerekkel például apoA-X-ből és foszfatidü-kölinból kiindulva korong alakú részecskék formájában keletkeznek lipoprötéinek. Szokásos módon úgy járnak el, hogy az inkubélást követően centrifugálással vagy gélkromatográfiás eljárással eltávolítják a meg nem kötött apolipoproteint, valamint a szabad lípidet, hogy homogén, rekonstituált lipoproteinrészeoekéket különíthessenek el.

Az 3 128 318. sz- amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban rekonstituált HüL előállítására olyan eljárást ismertetnek, amely szerint foszfatidil-kolinból valamilyen szerves oldószer felhasználásával oldatét készítenek.

A rekonstituált lipoproteinek előállítására eddig ismertetett eljárások csak laboratóriumi méretekben, kisebb mennyiségű - néhány milligramm, esetleg néhány gramm - termék előállítására alkalmasak» mert

- a köstitermékek nagymértékben felhígult oldatai nem teszik lehetővé az elegyek elfogadható időn belüli feldolgozását;

- a hagy térfogatok kezeléséhez általában nem áll rendelkezésre megfelelő infrastruktúra?

- a felhasznált szerves oldószereket csak korlátozott mennyiségben viseli el a környezet*

- a végtermékek nem tárolhatók*

- a végtermékek koncentrációja túl alacsony» ezért a betegek szervezetébe túl nagy mennyiségű anyagot kellene injektálni; és

- a termékeket általában tisztítani kell a továbbiakban

- például gélkromatográfiás eljárással -» hogy a nem kötődő lipidet vagy a nem kötődő proteint el lehessen különíteni az rHDLrészecské kt 61«

A. Kubsch és munkatársai rekonstituált lipoproteinek előállítására olyan eljárást ismertetnek [Circulatory Shock, 40»

14-2J (1995)]» amelynek megvalósításához lt200 tömegáránybam használnak fel apolipoproteint és lipidet, Snnek az az eredménye, hogy ezzel az eljárással olyan terméket lehet csak előállítani, amelynek jelentős része szabad lipidből áll, és ez hátrányosan befolyásolja a gyógyászati alkalmashatóságot♦ serek esetében az rHDL megelőzés vagy gyógykezelés céljából alkalmi nos gramm nagyságrendűnek kell lennie_; hogy jelentős mértékben növekedjék a vérplazmában az apoá-Xvagy a HDlí-koncentráoió* Az eddig ismertetett eljárásokkal nem lehet gazdaságosan előállítani kg-os vagy még nagyobb tété lekben klinikai alkalmazásokhoz rKDL~t«

A találmány kidolgozásakor olyan eljárás kifejlesztését tűztük ki célul, amellyel a felsorolt hátrányok jelentkezése nélkül lehet előállítani rüEL-t, mégpedig olyan terméket, amely nagyobb mennyiségben nem tartalmaz szabad lipidet vagy szabad apoA-I-t· Célunk volt az is, hogy a kifejlesztésre kerülő eljárást szerves oldószerek hozzáadása nélkül is meg lehessen valósítani. Ennek a fejlesztőmunkának eredményeként rá jöttünk arra, hogy apolipoproteinekből és lipidekből kiindulva egyszerű, gyors és ipari méretekben alkalmazható eljárással lehet rekonstituált lipoproteineket - elsősorban rekonstituált KDL-t (vagyis rüDl—t) előállítani.

A találmány tárgyát képező eljárás tehát -az eddigiekkel ellentétben - ipari méretekben alkalmazható olyan készítmények gyártására, amelyek rekonstituált lipoproteínrészeoskéket tartalmaznak, és 20 - 2 g/l proteintartalom esetén 20 - 2 C-on zavar os sági fokuk kisebb mint 40 KW (Mephelometric Turbidlty Unit). Az apolipoproteinekből és lipidekből kiinduló, találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy 1-40 g/l proteinkoncentréoióju, vizes apolipoproteinoldatot és lipidet, valamint detorgonát (1;0,5)-(1ϊ4,0) mólar árny bán tartalmazó vizes oldatot olyan arányban. elegyítünk, hog^ az apolipoprotein és a lipid tömegaránya <X$X,5)-(1:5,0) legyen, majd & kapott, apolipoprotsint, lipidet, detergenst és vizet tartalmazó elegyet a vízben levő lipid fáziskuliéi hőmérsékleténél legfeljebb 10 °C-kal alacsonyabb mikőmérséklet és az ennél a hőmérsékletnél legfeljebb 10 °Csal magasabb maximális hőmérséklet által meghatározott tartó.X * Φ monyban levő hőmérsékleten Inkubáljuk, és a detergenst méret szerinti kizárással vagy adesorfcsssn való adszőrbeáltatássál olyan mennyiségben választjuk ©1, hogy 5-50 nm átmérőjű,

ÖÖÖ - 1 000 000 dalton tömegű, proteinből és lipidből álló részecskék képződjenek, amelyekben minden további tisztítás nélkül jelen van kötött állapotban a felhasznált protein több mint 95 $-a és as összes lipid több mint 90 %-a*

A találmány tárgyához tartozik egy olyan eljárás is, amelynek alkalmazásával ipari méretekben lehet apolipoproteinekből és lipidekből gyártani rekonstituált lipoproteinrészecskéket tartalmazó, stabil liofilisátumokat« Az eljárás szerint 1-40 g/l proteinkoncentrációju, vizes apoXipoproteinoldatot és lipidet, valamint detergenst (Xsö,5)-{X*^,0) mólarányban tartalmazó vizes oldatot olyan arányban elegyítünk, hogy az apolipoprotein és a lipid tömegaránya (líl,5)~(Χ*5,Ο) legyen, majd a kapott, apoliponrot lipidet, detergenst és vizet tartalmazó elegyet a vízben levő lipid fázisátalakulási hőmérsékleténél legfeljebb 10 °ö~kal alacsonyabb minimális hőmérséklet és az ennél a hőmérsékletnél legfeljebb 10 °0-kai magasabb maximális hőmérséklet által mégha0 tározott tartományba eső hőmérsékleten - vagyis rendszerint -5 0 és 42 0 közötti hőmérsékleten - inkubáljuk, ezt követően a detergenst méret szerinti kizárással vagy adssorbenssn való adszorbeáltat ássál olyan mennyiségben választjuk el, hogy $-50 nm átmérőjű, 50 000 - 1 000 000 dalton tömegű, proteinből és lipidből álló részecskék képződjenek, amelyekben minden további tisztítás nélkül jelen van kötött állapotban a felhasznált protein és az Összes lipid több mint 90 %-a_f majd az

Öbb mint 95 >

Így kapott, 20

- 2 g/X proteintartalom mellett 20 ~ 2 °ö-on φφ *

* *·40 BTU-báX kisebb zavarősségi fokú cseppfolyós terméket valamilyen szénhidrát stabilisátor - például szacharós vagy mannit jelenlétében végrehajtott liofilisáláss&l stabilizáljuk·

Apolipoproteinként fel lehet használni például rekombináns apolipoproteint, emberi vérplazmából származó, dúsított apolipoprotein-A-l-frakoiőban levő apolipoproteint» apolipoprotein-fragmentumokat és amiipátikus tulajdona ágokkal rendelkező, természetes, szintetikus vao' rekombináns polipeptideket · Apolipoproteinfragmentumokat természetes v&gy szintetikus apolipoproteinek kémiai vagy enzimes fragment álásóval lehet létrehozni· A kémiai fragmentálást például bróm-oiánnal lehet végrehajtani. Az enzimes hasítást például tripezinnel vagy kimotripszinnel lehet megvalósítani·

A találmány szerinti eljárás keretében felhasználható, lipidet és detergenst tartalmazó oldat lipidként például szójababból vagy tojásból származó f oszf olipidet, koleszterint, koleszterin-észtereket, zsírsavakat vagy triglicerideket foglalhat magában. Detergensként célszerű epesavakat vagy epe savsókat - például kólsav-nátrium-sót vagy dezoxikólsav-nátrium-sót - alkalmazni.

A lipid szolubilizálásóhoz nincs szükség semmilyen szerves oldószerre.

A leírásban megadott 20 }-os hőmérséklet minden olyan hőmérsékletre vonatkozik, amely a 1S-22 ^v0-os hőmérséklet-tartó· mányban van, beleértve a két határértéket is. A proteintarta ra megadott 20-2 g/1 érték minden olyan koncentrációra vonatkozik, amely a 13-22 g/l-ss koncentráoiótartományban van, beleértve a két határértéket is. A ^Mfázisváltozási hőmérséklet o *0” adat minden olyan hőmérsékletértékre vonatkozik, amely a hőmérséklet-tartományba esik, amelynek alsó határértéke 10 ⁰ «Λ· az adott lipid vizes közegben mért fázisváltósási hőmérséklete alatt van, felső határértéke pedig 10 0-kal magasabban van, mint ez as említett, az adott anyagra jellemző hőmérséklet™ érték. A fásisváltozási hőmérsékletértékek -5 °0 és 50 °ö között vannak,

Kiindulási anyagként előnyös olyan lipoproteinekét felhasználni, amelyek alkalmas módszerekkel - például pasztörizálással késéit, inaktivált vírusokat tartalmasé humán vérplazmából származnak, Az inaktiváláskor keletkezett denaturált proteint - az úgynevezett aggregátumot ™ est kővetően valamilyen kaotrop komponens, például karbamid vagy gu&nidin-hidroklorid jelenlétében, enyhén lúgos közegben, a kör uyeseténél kissé magasabb hőmérsékleten inkubálva úgy renaturáljuk, hogy a protein 10 mM nátrium-klorid-oldatban való ^Mátpufferolása** után as apoA-X több mint ?Ö %-a monomer formában legyen jelen* [A meghatározást méret szerinti kizáráson alapuló, kromatográfiás analitikai módszerrel lehet elvégeznií 40 _zug apoA-I-et 0,02 nátrium-azidot tártálz másé, 7,4-es pB-ju, 10 mM nátrium-foszfát-oldatban 0,4 ml/min térfogatsebességgel felviszünk egy TSK GJOOOS'I Vltropac oszlopra (LKB), majd az eluátum összetételét 280 nm-en mérjük.]

Az eljárás további szakaszában epesava kát vagy epesavsőkat - például kólátokat, dezoxikólátokat vagy urzodezoxikolátokat és nagy koncentráoióban' jelenlevő lipoproteineket összekeverünk lipideket (foszfolipideket, például foszfatidil-kolint, koleszterint, triglioerideket stb.) tartalmazó oldattal. As összekeverésnél eltekinthetünk szerves oldószerek alkalmazásától* A Hubsch és munkatársai által le Írottakkal ellentétben (Circulatory Shock,

40* 14-25 (1995)1 dz apolipoprotein és a lipid mennyiségi arányát úgy választjuk meg, hogy a végtermékben ne legyen jelen

χ.>

nagyobb koncentrációban sem szabad lipid, sem szabad apolipoprotsis, mert ebben az esetben az rHDL további tisztításától el lehet tekinteni* Kiváltképpen az apoA-1 : PC menny iségi arányt csökkentjük, ame3y lényegesen alatta van mólaráay esetében az 1:200, tömegarány esetén pedig a mintegy 1:5,5 értéknek» A csökkentés eredményeként az apcA-l és a szójából származó PC mólaráBya (1:50)-(1:180), előnyös esetben (1:100)-(1:150) lesz» (Az utóbbi mólarány (1:2,8)-(1:4,2) tömegaránynak felel meg»] A mü;_xa termék ve letet diaiiltrációs módszerrel kombinálva!szabad lipideket csak csekély mennyiségben tartalma» (A szabad lipidek mennyiségét méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás módszerrel ás a továbbiakban ismertetésre kerülő, Superose 6-tal végzett gélézűréssel határozhatjuk meg.) Az igy előállított végtermékben az epesavak koncentrációja is rendkívül alacsony. Az epesavak, valamint a szabad PC koncentrációját pontosan kell szabályozni, mert mind a magas epesav-koncentráció, mind a magas PC-konoentráció károsítja a sejteket úgy in vitro, mint in vivő körülmények között» Á kólát koncentrációt optimalizálni kell az adott apoA-1 : PC mennyiségi arányra és adott esetben össze kell hangolni további lipidadalékokkal, elsősorban a koleszterinnel is» Kbben az esetben is úgy kell meghatározni az optimális koncentrációt, hogy a lehető legkisebb legyen a szabad lipid és a szabad apoA-X koncentrációja a végtermékben. Abban az esetben, ha egy rlOL-készitméöyben az apcA-I : PC mólarány 1:150, a későbbiekben ismertetésre kerülő inkubálás alatt Is150:200 apoA-X : PC : nátrium-kólát mólarányokat mérünk* Szójából szár»

PC í-b υ .nőmérsékleten 4-16 órát tartó inkubálás után az epe savak koncentrációját diafiltrációs módszerrel csökkentjük. Olyan ultraszürő membránt alkalmazunk, amelynek gömb φφφ φ

ΛΑ' profeinmolekólákra számított pórusnagysága XGQQ-IOO G00 d&Iton, előnyösen $0 000 daltonnál kisebb. A diafiltrációs művelethez szükséges puffer 6 feletti - előnyösen ?,> és 9 közötti - pH-érték és például 1 m$-os cukortartalom (szacharóztar falom) ©setén alacsony - 100 mmol/l, előnyösen 10 smol/1 alatti - ionerősségü. Ilyen körülmények között 1 g proteinfelhasználás esetén elegendő 1 I vagy legfeljebb 2 1 puffer ahhoz, hogy elérjük egyrészt a szükséges alacsony detergenskoncentrációt, másrészt a kívánt részecskeméret-eloszlást» Szék a puffertérfogatok sokkal (fizszer-kétszázszorj kisebbek, mint ez eddig ismert eljárásokhoz szükséges puffertérfogatok» Amennyiben szükséges, a detergenskoncentrációt ámberlite felhasználásával egy kiegészítő adszorpcióé művelet keretében beállítjuk a kívánt értékre» Az említett diafiltrációs technológiával a termék profeinkonoentradóját magas értékre - 10-50 g/l-re - lehet beállítani, és valamilyen stabilizátor - például szacharóz - jelenlétében stabil és tárolható cseppfolyós vagy liofilizált végterméket lehet belőle előállítani. A liofilizátumot felhasználás előtt vízben feloldva tiszta - adott esetben kissé opálos - oldatot kapunk, amely lipidtartalmától függően kissé sárgára szinezodhet» Éhben az oldatban gyakorlatilag változatlan formában ismét ki lehet mutatni a gyártási körülményektől függő méretű rHDL-részeoskéket (rHDL-korongokat), Méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás módszerrel megállapítható, hogy a főtömegében szabad lipidből álló aggregátum, mennyisége 10 m%_s a szabad apolipoprotein mennyisége pedig 5 alatt van. A cseppfolyós végtermék liofilizálás előtt vagy liof 1X1 z élés után meghatározott zavar ossága 20 g/l-es proteintartalom mellett 40 WCT alatt van. Az enzimes szinvizsgálattal megállapított koláttartalom kisebb mint 0,5 g kólnav-nátrium-só/g protein» (Az epe savakat úgy határozzuk meg, hogy NAD* jelenlétébe» 3-alfa-hidroxi-sztároid-dehidrcgenáz segítségével HADH-t képezünk, melyet diaforáz katalitikus hatása mellett nitro-tetrnzőlinm-kékksl reagáltatunk, és az igy keletkezett kék f ormát to zármazé kot fotometriáé módszerrel meghatározzuk.)

Hegfelelő térfogatú oldószerbe» - előnyöse» vízben - való feloldás után a liofilizált rHDL a nassceasz HOL-hez hasonlóan korong alak» részecskékből áll, amint ez elektronmikroszkóppal megállapítható« A korongok átmérője p~$ö nm - általában 8-20 nm mig a korongok vastagsága 2-6 nm» A részecskék méretének és relatív méreteloszlásának meghatározására alkalmas analitikai B módszerekkel - például a Pharmacia Biotech Superőse ' 6 HB 10/>0 tlpnsu oszlopán fiziológiás pufferben végzett gélszüréssel (méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás módszerrel) megállapítható, hogy a részecskék több mint 80 %-á»ak molekulatömege 100 000 daltön és 1 OCX) 000 dalion közé esik· Hasonló eredményre vezet az A.V· Nichols és munkatársai módszerével elvégzett gradiens gélelektroforézis [Uethods 1» JSnsimoXogy, 128· 417-451 (1986)]: a részecskék több mint 80 %-ának molekulatömege 50 000 dalion és 1 000 000 dalt ο» között van·

A mellékelt egyetlen ábra a találmány jobb megértését és az eddig ismertetett megoldási módok alátámasztását szolgálja. Az ábrán rHDL-részecskák gélszUrési műveleteinek eluciós diagramja (az eluálási idő függvényébe» felvett abszorpcióé diagramja) látható, amelyet különböző apoA-1 i foszfatidil-kolin (apoixpopr pid) menny iségi arányok alkalmazása mellett sdményei alapján rajzoltunk meg«[ÁpoA~I- és rHDX»-réssecskék méret szerinti kizáráson alapuló, nagyteljesítményű kromatográfiás vizsgálata, 100 _zuX 0,9 ^-os nátrium-klo16 rid-oldatban levő 200 ^ng rHDL elválasztása & Pharmacia Biotech cég Superose 6 HP 10/JO tlpusu oszlopán PBS-bsn (10 mM nátrium-foszfát, 150 mM nátrium-klorid, pH » 7,4} 0,5 ml/min térfogatsebességgel»] Az oszlopról lejött eluátum abszorpcióját X»,L. Síidéi, C«á, Marzetta és S«L» Johnson módszere szerint [Methods in Bnzymology, 129, 45-57 (1966)1 280 nm-en mértük, A kromatogram egyes frakcióinak rHDl—tartalmát az adott görbe alatti területből számítottuk ki* Az apoA-X ? Ha-kolát x 1:200 mólarány esetén kapott termék egyik eluolős görbéjéből látható, hogy az eluálás kezdetén szabad lipidek mosódtak ki, mig azokban az esetekben, ha a terméket 1:100, illetve 1:150 apoA-X : Ha-kolát mólarányok betartásával állítottuk elő, ez nem tapasztalható» A diagramon összehasonlítás céljából feltüntettük a tiszta apolipoproteih (apoA-I) görbéjét is*

A következő példákkal a találmányt részletesebben kívánjuk ismertetni, Szék a példák semmilyen vonatkozásban nem korlátozzák a találmány tárgyát képező eljárást, l».,példa

500 1 0,15 mol/1 koncentrációjú nátrium-klorid-oldatban fel* oldottunk 1 kg apoA-X-et» A lipidoldatot külön állítottuk elő, a következő módon: szójababolajból származó foszfatidil-kolinból p

(Phospholipon 90', Kattermann, Köln) 2,8 kg-ot, kőlsav-ηátrium?»* -sóból pedig 2,525 kg-ot feloldottunk 100 1 oldat előállításához szükséges mennyiségű, 8,0-as pK-jm pufferoldatbán, amely literen* ként 10 mmol Trisz/HCl-t, 150 mmol nátrium-kloridot és 1 mmol HDTA-t tartalmazott« Az igy kapott oldatot 1-2 érán keresztül , es sz?

φ Ö esetén legfeljebb 40 0-on tartottuk o.

amig ki nem tisztult. Az oldatot ezt követően 4 *C-ra hütöttük *· * * φ * * * * ♦ * *$·« « ♦ φ « *· Φ X ♦ φ φφ.

1?

majd est a lehűtött, lipidst és ko látót tartalmazó, 100 1 mennyi· ségü oldatot összekevertük 500 1 vízben levő, 1 kg mennyiségű apoÁ-X-gyel♦ Az igy kapott elegye! egy éjszakán keresztül 2-4 °C~on lassan keverhettük, majd az inkubálás után steril körülmények között szűrtük. Azután következett a 4 ^cC-on FTGOkazettákkal felszerelt Pelliconnal végrehajtott diafiltrációs művelet, amelynél a névleges molekulatömeg határértéke 10 000 dalton volt. Blőször 4 térfog&tnyi mennyiségben 5 mmol/l koncentrációju nátrium-hidrogén-karbonát-oXdatot, majd 2 térfogatnyi 10 stt—se szacharóz oldatot használtunk, miközben a termék térfogatát állandó értéken tartottuk. A koncentrációt ezután a 20 g/l-es proteintartalom eléréséig lassan növeltük, és az így kapott oldatot steril körülmények között szűrtük, üvegekbe töltöttük, majd liofilizéltük. Az egész eljárás során ügyeltünk a lipidoldatra ~ védelmet nyújt· arra, hogy - különös

sunk a levegő,	a fény és	a túl magas í
A megfelelő no:	myiségü -	on ί ο ί?/! n·
nyeső - vízben	a». ·.,· .Ά* χ»' V· xf ’»?	v é g t e r mé kb e n
~ ko lin mó la r ánj	: 1:100, a	szabad lipid

volt. A szabad proteintartalom nem érte el a mérési határ* értéket, a zavarosság pedig a 40 NTü-t.

példa mennyiségű, literenként 10 mmol nátrium-kloridot tar* talmazó oldatban feloldottunk 10 kg &pöÁ~X~et«

1,58 kg koleszterint, valamint 29,9 kg kólsav-n&trium-sót és 200 X mennyiségű, literenként 10 mmol Trisz-H01-t, l>0 mmol nátrium-kloridot és 1 mmol SDTA-t tartalmazó, 8,0 pH-értékű puf* t tartalmazó elegyét készítettünk kevertetés közben. A hőmér» 65 °Ora emeltük, majd az elegyet 2 órán keresztül ~ ί ο reφ ·*♦'* ***§ » *«* ««» » amig tiszta oldatot nem kaptunk - kevertettük. Az oldatot azután 20 °G-ra hütöttük, majd hozzáadtunk 2?,9 kg foszfatidil-kolint♦

Az igy kelet kazatt elegyet 4 °C~ra hütöttük és 2 óra hosszat kevertettük. Bzt követően az elegyet hozzáadtuk az elkészített proteinoláathoz, amellyel összekevertük, majd az igy létrejött elegyet steril körülmények között szűrtük* A szűrletet egy éjszakán o

keresztül - legalább 16 óra hosszat - lassan &evertettük 4 C~on« Szobán következett a 2-4 óra hosszat tartó diafiltrációs művelet 4 térfogatnyi mennyiségű, 7,5-ös pB-jn, literenként yö mmol hátrium-kloridot és 1 mmol WTA-t tartalmazó oldat segítségével, majd ezt követően 2 térfogatnyi mennyiségű, 10 s^-os szacharózoldattal· Az igy kapott oldatot ezután 20 g/l proteinkoneentréciósteril körülmények között szűrtük, üvegpalackokba töltöttük, majd liofilizáltuk. Az üvegpalackokat vákuumban lezártuk és 4 °C-on, sötétben tároltuk. Bzsel a módszerrel olyan rHBL-t állítottunk elő, amelyben az apoA-I s foszfatidil-kolin ? « koleszterin mólarány IsIOOslÖ volt»

j. példa

Az ebben a példában Ismertetett módon olyan rHDL-t állítottunk elő, amelyben az apoA-X s foszfatldil-kolin mőlarény 1:190 volt. 5,06 kg nátrium-kő látót feloldottunk 25 1 mennyiségű, 8,0 pH-ja pufferoldatbán, amely literenként 10 mmol Trisz-Böl-t, mmol nátrium-kloridot és 1 mmol ZOTA-t tartalmazott» Az igy keletkezett oldatban a környezet hőmérsékletén 2 óra alatt feloldottunk még 4,2 kg foszfatidil-kolibt, majd az igy kapott oldathoz hozzáadtunk 200 1 mennyiségű, literenként 10 mmol nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldatban 1 kg apoA-X-et» A keletkezett elegyet egy éjszakán át 0 °0 és 4 °C közötti hőmérsékleten éltük. A diafiltrációs műveletet állandó terméktérfogat mel19 * $ * ♦ « „ >

lett 4 órán át végeztük 4 térfogatnyl mennyiségű, Xiterenkéj 50 mmol nátrium-kloridot és 1 mmol HDTA-t tartalmazó, 7,5-ös pHju vizes oldat ellenében, majd est követően 2 térfogatnyi mennyiségű, 1 s$>-os sz&oharósóidat ellenében. A kapott oldatot végül a 20 g/l proteinkonoentráoió eléréséig töményitettük, és a szacharózkoncentrációt szilárd szacharóz beadagolásával 10 s^~ra növeltük. Az igy kapott oldatot steril körülmények között szűrtük és liofilizáltuk.

4. példa

Az ebben a példában ismertetett módon olyan rHDL-t állítottunk elő, amelyben az apoA-I : foszfatidil-kolin : koleszterin mólarány 1:100:10 volt. 4,61 kg nátrium-kolátot feloldottunk 2> 1 mennyiségű, 8,0 pH-ju oldatban, amely literenként 10 mmol Trisz-HOl-t, 10 mmol nátrium-kloridot és 1 mmol 'KDTA-t tartalmazott. As igy keletkezett pufferolt kolátoldatban ezután 6,5 °0-oa két óra alatt feloldottunk 1.3S g koleszterint, majd az igy létrejött oldatot a környezet hőmérsékletére hűtöttük, és feloldottunk benne 1 éra alatt 2,8 kg foszfatidil-kolint. Az igy kapott oldathoz 200 1 mennyiségű, literenként 10 mmol nátrium-kloridot tartalmazó vizes oldatban hozzáadtunk 1 kg apoA-l-et. Az igy létrejött oldatot a 5, példában ismertetett módon (diafiltráoió és töményités) kezeItük·

Az ebben a példában ismertetett módon olyan rHDIf-t állítottunk elő, amelyben az apoA-X : Pö s koleszterin mólarány 1:150:] volt. 5,58 kg nátrium-kolátot a 5* ás a 4. példában ismertetett módon oldottunk fel puffer oldatban, majd az igy keletkezett ol65 °o-on 2 éra alatt feloldottunk 180 g koleszterint. Az >Λ

Így kapott oldatban a környezet hőmérsékletén 1 óra alatt feloldottunk 4,2 kg PC-t, majd az igy keletkezett oldathoz 200 1 menynyiségöen hozzáöntöttünk egy olyan oldatot, amely literenként 5 g apoA-X-et és 10 uaoX nátrium-kloridot tartalmazott · Az igy létrejött oldatot egy éjszakén keresztül 4 °C~on ickuhéltuk» Szt körétőén a diafiltráoióa műveletet, valamint a végtermék elkülönítését a már ismertetett módon hajtottuk végre#

Az ebben & példában ismertetett módon alacsony nátrium-kolét· -tartalmú r'SPI-t állítottunk elé, ettől eltekintve az 1.-5# példában ismertetett módon» A diafiltrációs művelet éa a töményités után 1 térfogatnyi rHDL-oldatot 2 térfcgatnyi Amberlite XáD-2· vei összekevertünk, és az így

Kapott keveremet 4 0-on óvatos noz

R&t és S4 óra hosszat haltuk. Az inkubálást követően az rHDL-t leszűrtük, majd steril körülmények között szűrtük és liofIlizéltük , az l«-5» példában ismertetett módon#

7_«, pálda ml mennyiségű, literenként 10 mmol nátrium-kloridot tartalmazó oldatban levő 400 g apoA-X-et egy olyan, a 3»-δ» példák szerinti puff ereidet tál készült lipidoldattal elegyítettünk, amely 1,66 kg foszfatidil-koliat és 1,25 kg nétrium-kolátot tartalmazott# Az Így kapott elegyet 16 óra hosszat inkubáltuk 0-2 °C~on, ezt követően diafiltrációs műveletet hajtottunk végre először 4 térfogatai 0,1 mmol/l koncentrációjú B>TA-oldati fogatnyi 1 s^-os szach&rézoldattal» Az így kapott oldatot a 21-25 g/l-es proteinkonoentráció eléréséig töményitettük» Az rHDL~< szacharózkoncentrációjét végül 10 z$-r&, proteinkoncentrációját majd 2-4 tés

'.tál,

X %· pedig 20 g/l-re beállítva az oldatot steril körülmények között szűrtük, 50 g-os adagokban 100 ml-es üvegekbe töltöttük - egy-egy üvegben tehát 1-1 g rHDL volt majd liof iliz ált uk» * példa

980 kg Yorfállung IV”-bői (Kistler, í. és Nitschmann, H»:

Vox Sang», ?» 414-424 (1982)] etanolos kiesapással 11,2 kg apoA-1-csapadékot állítottunk elő, amelyet háromszoros mennyiségű 4 M guanidin-hidroklorid-oldatban szuszpendáltunk» Az igy kapott szusz penzió pH-ját beállítottuk $,2-re, majd a szuszpenziőt 10 órán át 60 C-on pasztőrizáltuk» A proteint ?»5-ös pH-értéken 45 0on szolubilizáltuk, a keletkezett oldatot tisztára szűrtök, majd gélszürési technikával (Sepbadex 025, Pharmacia Biotech) lö mM nátrium-klorid-oldattal puffercserét hajtottunk végre» Így 160 kg mennyiségű apoA-1-oldatot kaptunk, amelyben összesen 1040 g apoA-X- volt» A proteinoldatot egy lípidoldattal együtt 0-2 0 hőmérsékleten 2-16 érán keresztül inkubáltuk» A lipidoldatot előtte a proteinoldattól elkülönítve olyan módon készítettük el a környezet hőmérsékletén, hogy szójababból előállított foszfát!dil-kolint feloldottunk egy 8,0 pH-ju, literenként 10 mmol Trisz-HOl-t, 10 mmol nátrium-kloridot ás 1 mmol SDTA-t tartalmazó puf fér oldatban» Ennek a puffer oldat nak 26 kg-nyi menny is égében 5209 g nátr ium-kólát ot és 4460 g foszf&tidil-kolint oldottunk fel» A következő diafiltrációs művelettel (HM$L » lö 000 dalion) a proteint és lipidet tartalmazó elegyet először a 7 g/l-es proteinkoncentráció eléréséig töményitettük, majd a diafiltrációs műveletet addig folytattuk 1 amíg a a nH-érté os szaoharózoldattal szemben, érték alá nem csökkent, miközben legalább ?,5-ün tartottuk» Végül az oldatot töményitettük, amíg el nem értük a 25 g/l-es proteinkoncentrációt, majd szacharózzal stabilizáltuk. A végtermék 20 g/1 apoA-I~et és 100 g/1 szacharózt tartalmazott, Méret szerinti kizáráson alapuló kromatográfiás módszerrel megállapítottuk, hogy a szalad lipid mennyisége kisebb mint 5 a szabad apoA-I-é pedig kisebb mint 1 m/» A proteint és lipidet tartalmazó elegyet steril körülmények között szűrtük, >0 ml-es adagokban üvegekbe töltöttük, majd llofilizáltuk, A megfelelő mennyiségű vízben feloldott végtermékben az apoA-I : foszfatidil-kolin mólaráuy ls!4Ö, az 1 g proteinre jutó kólsav-nátrium-só mennyisége pedig 0,25 g volt

Claims (2)

1. I. Eljárás olyan készítmény Ipari előállítására, amely nagy sűrűségű apolipoprotein A-l-hől és és foszfatídil-kolinból származó, rekonstituált Upoproieim-részecskékel (rHDL) tartalmaz, és ± 20 mg/l protein-tartalom mellett és 20 °C ± .2 °C hőmérsékleten 40 .NTÜ-nál kisebb mértékű zavarossági fokot mutat, azzal jellemezve, hogy

   -egy apolipoprotein-Á-l-ből és foszfatídil-kolinból álló deteruens-ele&yet állítunk, elő elvan módon, hogv (a) egv 1-40 g proteín/l koncentrációjú vizes apolipoproteín-A-l oldatot, (b) egy vizes foszfatidil-kolin detergens oldattal elegyítünk szerves oldószerek alkalmazása nélkül, ahol a foszfatidilkolin és a detergens molaránya az 1:0,5 1:4,0 tartományban, és az apolípoprotein-A-1 és a foszfatidil-kolin tömegaránya az 1.; 1,5-1:5,Ö tartományban van,

   - ezután a kapott apolípoprotein-A-1 - foszfatidil-kolín detergens-elegyet a foszfatidil-kolin fázisátalakulás! hőmérséklete ± 10 °C hőmérséklet-tartományban vízben inkubáljuk,

   - a detergensí méret szerinti kizárással vagy abszorbensen adszorpcióval olyan mennyiségben választjuk el, hogy 5-SÖ mm átmérőjű és 50 000 - 1. 000 000 dalton tömegű apolípoprotein-A- 1 - foszfatidil-kolin részecskék képződjenek,

   - ahol további tisztítási lépések nélkül olyan készítményt kapunk, amely apolipoprotein-A-l-bői és foszfatídil-kolinból álló, nagy sűrűségű rekonstituált lipoprotein-részeeskéket tartalmaz, és amely készítményben a felhasznált apolipoprotein-A-l -nek több mint 95%-a és az Összes foszfatidílkolínnak több mint. 90%~a kötött állapotban van.

   φ ·φ -φφφν Φφ Φ* ΦΦ > Φ X φ Φ * Φ Φ *

   Φ' φ λφ.Φ *ΦΦ Φ *

   442. Az 1, igénypont szerinti, eljárás olyan stabil liofilizáíum-készítmény ipari előállítására, amely apolipoprotein-A~l -bői és főszíatídíl-kolínból álló, nagy sűrűségű .rekonstituált lipoprotein-részecskákét (rHDL) tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy apolípoprotein-A-1-hol és foszfatidil-koíinból állő detergens elegyet állítunk elő olyan módon, hogy (a) egy 1 -40 g proíekvliter koncentrációjú vizes apoIipoprotein-A-1 oldatot (b) egy vizes foszfatidilkolin detersens oldattal elegyítünk szerves oldószerek alkalmazása nélkül, ahol a foszfatidil-kolin és a detergens mólaránva az

   *.·· φ·

   1:0,5-1:4,0 tartományban, és az apoíipoprotein-A-1 és a foszfatidíl-koiin tömegaránya az 1:1,5-1:5,0 tartományban van, ~ ezután a kapott apolípoprotein-A-1 - foszfatidil-kolin detergens-eíegyet a foszfatidil-kolin fázisátalakulási hőmérséklete ± 10 °C hőmérséklet-tartományban vízben inknbáljuk,

   - a detergenst méret szerinti kizárással vagy abszorbensen adszorpcióval olyan mennyiségben választjuk el, hogy 5-50 mm átmérőjű és 50 000 - 1 000 000 dalion tömegű apolipoprotei.n-Á-1 · foszfatidil-kolin részecskék képződjenek, ···· ahol további tisztítási lépések nélkül olyan készítményt kapunk, amely apoli.poprotein-A-1-ből és foszfatidil-kolinból álló, nagy sűrűségű rekonstituált lipoprotein-részecskéket tartalmaz, és amely készítményben a felhasznált apolipoproteín-A-1-nek több mint 95%~a és az összes foszfatid.il-kolinnak több mint 90%-a kötött állapotban van olyan folyékony termék alakjában, amely 20 ± 2 g/1 protein-tartalom mellett és 20 ^C-C ± 2 °C hőmérsékleten 40 NTü-nál kisebb zavarossági fokot mutat, és a kapott terméket a szénhidrátok csoportjából kiválasztott stabilizátor jelenlétében liofilizá1 ássál s t a b í 1 i z á 1 i u k., φ φφφ

   Φ X X Φ φ X- φ φ Φ Φ Φ Φ φ Α Φ φ φ *· X X φ χ Φ X φ X * φφφ φ φ* * *

   3. Az 1. vagy a 2, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detergens elkülönítését méret szerinti kizáráson alapuló uhraszdréssel végezzük, ahol 1 g proteinre vonatkoztatva legfeljebb 2 1 pufféról hatot használónk fel.

   4. Az 1-3, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipidet, apolipoproteint és detergenst tartalmazó elegy inkubálása után a detergenst egy hidrofób adszorbensre adszorbeáltatjuk. olyan módon, hogy az elegyhe beadagoljuk a hidrofób adszorbenst, vagy az elegyet egy ilyen adszorbenst tartalmazó oszlopon vezetjük át,

   5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hidrofób adszorbensként oldhatatlan térhálósított polisztirol-kopolimert alkalmazunk,

   6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az apolipop.rotein-Á-1 ··- foszfatidil-koHn detergensο 1 d at fo s z £ ο 1 i p i d e ke t, k o leszterint, köles z t e rin-észiert, z s 1 r s a v a k a t és/vagy triglicerideket tartalmaz.

   7. Az 1-6. igénypontok 'bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy apolipoproteín-A-l-ként emberi vérplazma apolipoprotein-A-1 -ben dúsított olyan frakcióját használjuk fel, amelyben a vírusokat legalább egyszer egy kaotrop anyag vizes oldatában végzett inkubálással és ezt követő, 50 mmol/l ionerősségn oldatba való átpufferolással kezeljük, ami után a lipoprotein több mint 70%-a m ο η o m e r fo r m áh an v a n j e 1 e n.

   8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfatidil-kolinként szintetkus foszfatídil-kolint használunk.

   9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jelezve, hogy foszfatídií-kolínként természetes foszfatídil-kolint.

   Χ·.<

   előnyösen szójababból vagy tojásból extrahált foszfatidíl-kolínt használunk.

   1Ö. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szója-íoszfatidil-kölint használunk, és az apolípoprotein-A-1 fosz.fatid.il.~k.olin detergens-elegy inknbálását 0-15 °C hőmérsékleten végezzük.

   11. Az 1-10, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felhasznált detergenst az epesavakat vagy epesavakból képzett sókat tartalmazó osztályból választjuk.

   12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy de t erg en s k é n t kό I s a v-n át r Í um - s ó t va g y dezo x í k ó 1 s a v - n átr i n ra -sót alkalma zunk.

   13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vizes apolípoprotein-A-1 -oldatot használunk, amely rekombináns apolipoproteineket, humán vérplazmából származó apolipoprotein-A-l-ben dúsított frakcióból származó apolipoproteineket, apolipoprotein-fragraentumokat vagy amfipatikus tulajdonságokkal rendelkező, megfelelő természetes, szintetikus vagy rekombináns polipeptideket tartalmaz.

   14. Az 1-13, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az apolipoprotein-A-l - foszfatidil-kolin detergens-elegy inkubálása után a detergens tartalmát dialízissel vagy diafiltrációs művelettel 0,5 g detergens pro g protein alatti koncentr á e í ó ~ é r t. é k r e c s ö k k e n 1iÜ k.

   <>

   15. Az 1-14, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a detergens elkülönítése előtt vagy után a proteinkoncentrációt- diafiltrációs művelettel 10-50 g/l értékre növeljük.

   16. Az 1-15, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes apolipoprot.ein-A-1-oldatot vagy a lipiddetergens-oldatot 6 és 9 közötti pH-tartományban pufferoljuk.

   17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes apolipoprotein-oldatot vagy a foszfat.idi.lkolin detergens-oldatot 7,5 és 8,5 közötti pH-tartományban pufferoljuk.

   18. A 2-17, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termék protein-koncentrációját 5 g/l és 50 g/l közötit értékre állítjuk be. és az oldatnak a termék stabilizálását célzó liofilizálását S-15 tÖmeg% díszacharid -· így szacharóz ··· vagy
2. 2-iö tömeg% monoszacb.ar.id - Így mannit · jelenlétében végezzük.