JPS63165328A - 組織タンパクｐｐ４含有医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組織タンパクＰＰ４を含有する血液凝固阻害
剤、ＰＰ４の製造方法、その低温殺菌方法およびＰＰ４
の使用に関する。

例えば胎盤に存在する糖タンパクは、ＤＥ３３１５００
０Ａ１（ＵＳ特許第４．５０ス２２９号）に記載されて
いる。

ＰＰ４は３５，０００±ｓ、ｏｏｏダルトンの分子量お
よび〆１４．８５±０．１５の等電点範囲を有する。

抗凝固剤タン・ぞりはそれらの作用様式に応じていくつ
かのグループに分けることができる。

プロテイカーゼ阻害剤群、例えば抗トロンビン■および
プロテイナーゼ群、例えば活性化タン、ＲりＣには、抗
凝固剤療法にとって不利な性質がいくつか伴う。何故な
らばそれらは凝固酵素が活性化される段階に到るまで働
かないか、あるいは　凝固因子をタンパク分解して「消
費」してしまうことにより失活させてしまうからである
。

そこで、本発明の目的は、血液凝固を阻害し、かつ凝固
因子の消費を伴うことなく血液凝固を妨げることのでき
る剤を入手可能にすることにある。

ＤＥ　３５３３５１６ＡＩ　（６〜８頁）に記載の抗凝
固剤タンパクは４．４〜４．６の等電点範囲を有するも
のと報告されている。これらのタンパクは主要血管、例
えば大動脈または贋帯の内膜から単離される。

同様に、Ａｃｔａ　０ｂｓｔ、　Ｇｙｎａｅｃ、　Ｊｐ
ｎ、　３６，４１２　＋２５８３〜２５９２（１９８４
）には、４５．０００ダルトンの分子量を有する胎盤か
らの抗凝固剤タンパクが記載されている。更に、ＰＰ４
の性質がＤＥ３３１５０００Ａ１（ＵＳ特許第４．５０
ス２２９号）に次のとおり記載されている。α１および
α２グロブリンの間の電気泳動移動度；３．３±０．２
８の沈降係数６２０．Ｗ　；　５．９±０．６の吸光係
数Ｋ　”　（２８０ｎｍ）　；　２．４±０．９４％１
Ｃ胃 （ｆ／１０（１）Ｏ炭水化物含量（マフ　／　−ス０．
３±０．２％、ガラクトースＣＬＡ±０．２％　、　＊
シｏ　−；ｘ。

０．１±０．０４％、グ／Ｉ／　コー　ス０．２±０．
１％、グルコサミン１．０±２チ、ノイラミン酸０．４
±ｏ、２％）および次のアミノ酸組成： リジン　　　　　　　６．９５　　　　　　１．１４ヒ
スチジン　　　　　０．９７　　　　　１７．４アルギ
ニン　　　　　５．４４　　　　　１．７７アスパラギ
ン酸　　　　１１．４１　　　　　　　１．６８トレオ
ニン　　　　　６．７８　　　　　２．４０セリン　　
　　　　　６．２１　　　　　２．２６グルタミン酸　
　　　　１ｚ２５　　　　　　　α４３プロリン　　　
　　　　ｉ、９６　　　　　　６．２０グリシン　　　
　　　６．６８　　　　　　′５．８５アラニン　　　
　　　７．９２　　　　　１．６７シスチン１／２　　
　　０．７７　　　　　１９．５バリン　　　　　　５
．５４　　　　５８０メチオニン　　　　　１．９８　
　　　　６ＣＩＯイソロイシン　　　　５．２１　　　
　　２．２５０イシン　　　　　　１１．５０　　　　
　０．４５チロシン　　　　　　！１．５５　　　　　
４．２１フエニルアラニン　　　４．０７　　　　　　
五７７トリプトフアン　　　　　Ｑ、９５　　　　　２
５．９驚くべきことに、この糖タンノぜりＰＰ４が抗凝
固剤特性を有することが見出された。

すなわち、本発明は、糖タンノぐりＰＰ４を血液凝固阻
止のために使用することに関する。

本発明はまた、有効量のＰＰ４と薬学的に適当なビヒク
ルおよび／または安定化剤を含有する止血障害の治療ま
たは予防剤にも関する。

溶液中におい【、このタイプの剤は、好ましくは、溶液
１ＷＬｌあたり０．００１〜１００ダのＰＰ４を含有す
る。それは、ポーラスまたは連続点滴として１日に１回
または数回、例えば体重１ゆあたり０．００１〜５０＃
の用量で投与される。

このタイプのＰＰ４含有剤は、適切な場合には、安定化
剤および添加剤例えばアルブミン、ゼラチン、塩類、糖
および／またはアミノ酸などと共に凍結乾燥物の形であ
るいは一血液と等張で適切な場合には殺菌剤および安定
化剤、例えばアルブミン、ゼラチン、塩類、糖類および
／またはアミノ酸などを含有する水性溶液の形で調製す
るのが好ましい。その溶液は、例えば非経腸注射または
潅流により投与することができる。

更にまた、本発明においては、遺伝子操作によって調製
されたＰＰ４を用いることもできる。

医薬として用いるには比較的多量のＰＰ４が必要とされ
る。このため、組織からの簡単な単離方法が望まれる。

驚くべきことに１組織抽出液または溶液からのＰＰ４は
疎水性担体マトリクスに結合させることができ、次いで
段階的または濃度勾配溶出により、不純物を極めてよく
除去できることを見出した。

従って、本発明は、ＰＰ４含有溶液、好ましくはＰＰ４
含有組織抽出液を水に不溶性の疎水性吸着剤と接触させ
、上清溶液から吸着剤を取り出し、適切な場合には緩衝
液で洗浄し、そしてＰＰ４を溶出することより成るＰＰ
４の精製方法に関する。

こｏ−ｔロセスの前または後において、適切な場合には
、他の既知の精製方法例えばイオン交換クロマトグラフ
ィ、ｒル濾過または燐酸カルシウムまたはとＰロキシア
パタイトへの吸着を行うこともできる。

好ましいＰＰ４精製手順においては、ＰＰ４含有溶液を
、５．５〜９５の−、０℃〜４０℃の温度で、また塩類
添加後例えば５０〜２５０９／Ｉｃ溶液）の硫酸アンモ
ニウム、硫酸マグネシウムまたは０、５−３モル／ｌの
ＮａＣ２，ＬｉＣ２またはＫＣｔの添加後、水に不溶性
の疎水性吸着剤、例えば、脂肪族、芳香族または芳香脂
肪族基を有する担体物質と接触させる。使用し得る担体
物質の例としては、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標名）、
アガロースまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標名）などが
挙げられる。使用される好ましい脂肪族基は、１〜１０
個の炭素原子を有するアルキル基、例えばブチルまたは
オクチル基、および例えば所望により置換されたフェニ
ルまたはフェニルアラニル基またはベンジルまたは置換
インジル基などである。次いで吸着剤を溶液から除去し
、適切な場合には、例えば５０〜２５０　ｔ／ｌ硫酸ア
ンモニウムまたは０，５〜３モル／１ＮａＣ４，ＬｉＣ
２またはＫＣＬ含有の溶液で洗浄し、そして比較的低イ
オン強度の液体を用い、適切な場合には濃度勾配を用い
てＰＰ４を溶出する。

特に好ましい態様においては、ＰＰ４含有溶液をＰＨ６
〜８でまた１４４〜２４３　ｆ／ｌ硫酸アンモニウム含
有溶液の添加後、例えばフェニル−またはフェニルアラ
ニル−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標名）またはアガロー
スなどと接触させるのであるが、ｐ！４４５〜７．８で
、また１７０〜２００ｔ／ｌ硫酸アンモニウム含有溶液
の添加後、フェニル−３ｅｐｈａｒ０８ｅ（商標名）と
接触させるのがｆｚＫ好ましい。次いで吸着剤を溶液か
ら除去し、例えば１７６〜１９６ｔ／！（溶液）硫酸ア
ンモニウム含有溶液で洗浄し、そしてＰＰ４を１１４−
１４４９／ｌ　（溶液）硫酸アンモニウム含有溶液によ
り溶出する。

更に、病気（肝炎、ＡＩＤＳ）伝達の危険から、人間に
用いるべき生物学的治療剤は加熱して伝染性生物を殺し
ておくと好都合である。しかしながも、このことは通常
、生物学的活性物質の失活を意味する。

驚くべきことに、ＰＰ４の水性溶液は、カルシウムイオ
ンおよび少くとも一種の単糖類またはオリゴ糖または糖
アルコール、および適切な場合にはアミノ酸の存在下に
おいては、抗凝固作用を全面的に保持させつつ加熱でき
ることを見出した。

従って、本発明はまた、ＰＰ４含有溶液を、カルシウム
イオン、および少くとも一種の単糖類またはオリゴ糖ま
たは糖アルコール、および適切な場合にはアミノ酸の存
在下において病原生物が死滅するような条件下に加熱す
ることより成るＰＰ４含有溶液の低温殺菌方法にも関す
る。

ＰＰ４含有溶液の好ましい低温殺菌方法においては、そ
の溶液の−を５．０〜９．５に調節し、そして３０〜１
ｓｏｒ／１ｏｏｄ（溶液）の少くとも一種の単糖類また
はオリゴ糖または糖アルコールおよびα００５〜２モル
／ｌのカルシウムイオン、そして適切外場合には０．１
〜１．５モル／ｌのアミノ酸ヲ添加する。カルシウムイ
オンは、例えばカルシウム塩、例えばＣａＣ２２または
酢酸カルシウムの形で導入することができる。

格別に好ましい態様においては、１００〜１５０ｔ７１
ｏｏｍｔ（溶液）のスクロースと３０〜１００ミリモル
／　ｌ　ＣａＣｌ２をＰＰ４を含有し６．５〜８．５の
声を有する溶液に添加する。成分が溶解後、その溶液を
例えば４０〜８０℃に１〜２０時間、好ましくは５５〜
６５℃に８〜１５時間加熱することができる。ＰＰ４の
含量は２０μｆ／ｍｌ　（溶液）より低くすべきではな
い。加熱後、その溶液を更に、例えば濃縮、透析、滅菌
テ過および／ま゛　たは凍結乾燥により処理してもよい
。

前述の製造および低温殺菌方法により得られる生成物は
、ＰＰ４から不純物が全面的に除去されしかもその抗凝
固作用は全面的に存在する点で特に優れている。

ＰＰ４医薬は固体または液体状の生理学的に許容し得る
そして薬学的に適当なビヒクル、そして適切な場合には
、更なる添加剤、例えば安定化剤および補助剤力とを用
いて常法により製造することができる。

従って、本発明はまた、適切な場合には添加剤および安
定化剤例えばアルブミン、ゼラチン、塩類、糖類および
／またはアミノ酸を添加したＰＰ４含有溶液を調製し、
そしてこの溶液を乾燥形態、適切な場合には凍結乾燥物
に変えることより成る止血障害の治療および／または予
防用ＰＰ４含有医薬の装造方法にも関する。

次の実施例は、本発明を例示するためのものである。

実施例　１ 胎盤組織からのＰＰ４の単離、およびその低温殺菌２ゆ
の冷凍保存胎盤を組織ミンサー中でホモジナイズした。

ホそジナイゼートを各１ノの生理学的ＮａＣＬ溶液で３
回洗浄した。その胎盤組織を遠心分離により上清溶液か
ら除去した。洗浄した胎盤ホモジナイゼートを３！のＴ
ｒｉｔｏｎ　（商標）　Ｘ　１００含有緩衝液Ａ（２０
ミリモル／１ｔｒｉｓ、　ＨＣｌ、　５０ミリモル／　
ｌ　ＮａＣ１，２ｆ／　１００ｄＴｒｉｔｏｎ　（商標
名）　Ｘ　１００、ｐＨ７，４）に懸濁し、そしてその
懸濁液を一夜攪拌した。抽出液を遠心分離により除去し
、そして、その組織をもう一度２ノの緩衝液Ａで一夜抽
出した。それら二つの抽出液を合一（４，８Ｊ）して、
緩衝液Ｂ（２０ミリモル／）　ｔｒｌｓ、Ｉ（Ｃｔ１５
０ミリモル／　ｌ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，５）で１５１ま
で希釈した。０．７５ｆ／ｌ（溶液）のＤＴＬｋＢ　−
８ｅｐｈａｄｅｘ　（商標名）Ａを添加し次いで懸濁液
を１時間攪拌し、そして吸着物を溶液から除去し、４０
１の緩衝液Ｂで洗浄し、次いで１００ミリモル／　ｌ　
ＮａＣＬを含む６００−の緩衝液Ｂで洗浄し、そしてＰ
Ｐ４を５００ミリモル／ノＮａＣＬを含む緩衝液Ｂで溶
出した。１７６　？／ｌ硫酸アンモニウムをその溶出液
（６００ｍ）に添加し、そしてその混合物をパッチ法ま
たはカラム上で３００−のフェニル−５ｅｐｈａｒｏｓ
ｅ　（商標名）で処理した。

そのフェニル−３ｅｐｈａｒｏａｅ　（商標名）を飽和
濃度の’Ａｏの硫酸アンモニウムを含有する緩衝液Ｂ中
で平衡させた。同じ緩衝液で洗浄後、ＰＰ４を飽和濃度
の１Ａの硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ｂで溶出した。

ＰＰ４は、硫酸アンモニウム濃度を８５２７１００−ま
で高めることにより析出させるか、または、限外濾過に
より濃縮した上で更ＩＣＡＣＡ　５４でのｆ　ＡＩｆｐ
過により精製した。

ＡＣＡ　５４カラム（３×１００ｃＩｎ）は５００ミリ
モル／１ＮａＣ１を含有する緩衝液Ｂ中で平衡させた。

ＰＰ４含有画分を合一した。

必要に応じ、この後に実施例３に記載するような低温殺
菌を続けることもできる。しかしながら、加熱は、別の
段階例えばＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ａ５
０溶出液またはフェニル−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標
名）処理からの溶出液に対して行うこともできる。

実施例　２ ＰＰ４の抗凝固活性の測定 改変プロトロンビン時間（ＦＴ）および改変部分的トロ
ンボプラスチン時間（ＰＴＴ）を用いて実施例１のとお
り製造されたＰＰ４の抗凝固活性を測定した。

ａ）改変ＰＴ測測 定５０μ７の緩衝液Ａ（２０ミリモル／　ｌ　　ｔｒｉ
ａ、Ｈｃム１４２ζリモル／Ｉ　Ｎａ（Ｊ、　ｐＨ７，
５）、２５　ｐｌの検体または緩衝液Ｂ（２０ミリモに
／　Ｉ　　ｔｒｉａ、Ｈｃｔ、　５００ミリモル／ｌ　
ＮａＣｔｌＰＨ７，５）および２５μｊのトロンボプラ
スチン溶液を５０μ！の標準ヒト血漿に添加した。３７
℃で３分間インキュベーション後、２５０　ＡＩのＣａ
ＣＡ２含有溶液Ｃ（１Ｏミリモル／！乞ｒｉｇ、　ＨＣ
Ｌ、　　８０ミリモル／ｌ　ＮａＣ２，２０ミリモに／
１ｃａｃｊ２５ＰＨ７９）の添加により凝固を開始し、
そして凝固時間をＳｃｈｎｉｔｇｅｒ　−Ｇｒａｓｓ凝
固計で測定した。緩衝液Ｂ含有コントロールの凝固時間
は６０秒であった。

ＰＰ４濃度（μ２／ｄ）　　　０　　５　　１０　　１
５　　２０改変ＰＴ　（秒）　　　６０　６８　８９　
１１１　１３２．５ｂ）改変ＰＴＴ測定 ２５μｌの検体と７５μノの１００ミリモル１ｌｌｋｃ
ｔ含有緩衝液Ａを１００μｌの標準ヒト血漿に添加し、
その混合物を３７℃で３分間インキュベートし、５０　
ｆｉｔのＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ　（商標名）試薬溶液を
添加し、インキュベーションを３７℃で６分間続け、次
いで５０μｌのカオリン懸濁液を混合し、そして３７℃
で更に２分後、１００μ！のＣａＣＬ２溶液Ｃの添加に
より凝固を開始した。

検体は５００ミリモル／ｌ　　ＮａＣＡ含有緩含有緩衝
対人て予め透析しておいた。Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ　（
商標名）試薬溶液の一つの容器の内容物を１−の９ｆ／
　ｌ　ＮａＣＬ溶液に溶解した。凝固時間を８ｄｎｉ　
ｔｇｅｒ−Ｇｒｏｓａ凝固計で測定した。緩衝浪人含有
コントロールの凝固時間は７０秒であった。

ＰＰ４　濃縮（４ｆ／ｄ）　　０　　１３　　１７．７
　２６改変ＰＴＴ　（秒）　　　７０　８４　９８　１
２９実施例　３ ＰＰ４含有、容液の低温殺菌 ５００ｒ１１ｅのＰＰ４含有溶液（１００ｔｔ？／ｍｌ
　ＰＰ４　）を２０　ミ　リモル／ｌ　ちｒｉｓ、Ｈｃ
ｔ、　　１５０ミリモル／ｌ　ＮａＣＬ１ｐＨ７，５に
対して透析した。次いで１００グ／１００ｍＡ’（溶液
）スクロースを秤量混合した。そのスクロースが完全に
溶解したら、５０ミリモル／　１ＣａＣ１２を添加した
。その溶液は、加熱（６０℃／１０時間）後、２０ミリ
モル／ｌクエン酸トリナトリウム、６０ミリモル／　ｌ
　ＮａＣｔ、　　１０グ／ｌグリシン、ＰＩ（７，０に
対して透析しそして濾過により滅菌しそして凍結乾燥す
ることができる。

溶液中のｐｐ４（１００μ？／ｍ）の低温段−Ｆ’Ｐ４
の安定性に対するカルンウムイオンの効果改変ＰＴ　（
秒）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）有効量のＰＰ４および薬学的に適したビヒクルおよ
   び／または安定化剤を含有する、止血障害の治療または
   予防用剤。 ２）血液と等張であり、そして適切な場合には殺菌剤を
   含有する水性溶液の形の特許請求の範囲第１項記載の剤
   。 ３）適切な場合には添加剤および安定化剤を含有する凍
   結乾燥物の形の特許請求の範囲第１項記載の剤。 ４）液体の形であって１ｍｌあたり０．００１〜１００
   ｍｇのＰＰ４を含有する特許請求の範囲第１項記載の剤
   。 ５）凍結乾燥形態の特許請求の範囲第１項記載の剤。 ６）ＰＰ４含有溶液、好ましくはＰＰ４含有組織抽出液
   を水に不溶性の疎水性吸着剤と接触させ、上清溶液から
   吸着剤を取り出し、適切な場合には緩衝液で洗浄し、そ
   してＰＰ４を溶出することより成るＰＰ４の精製方法。 ７）吸着剤が脂肪族または芳香族基を有する担体物質で
   ある特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）ＰＰ４含有溶液を、カルシウムイオン、および少く
   とも一種の単糖類またはオリゴ糖または糖アルコール、
   および適切な場合にはアミノ酸の存在下において病原生
   物が死滅するような条件下に加熱することより成るＰＰ
   ４含有溶液の低温殺菌方法。 ９）組織タンパクＰＰ４の血液凝固阻害のための使用。