PT86393B - Processo para a preparacao de agentes terapeuticos e profilaticos contendo proteina tecidual pp4 e para a purificacao desta proteina - Google Patents

Processo para a preparacao de agentes terapeuticos e profilaticos contendo proteina tecidual pp4 e para a purificacao desta proteina Download PDF

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Description

MEMÓRIA DESCRITIVA
A presente invenção refere-se a um processo para a purificação da proteína tecidual PP4# dum agente para a inibição de coagulação do sangue contendo a referida proteína bem como da respectiva pasteurização.
Na patente de DE 3315 000 A 1 (USP 4 507 229) descreve-se a glicoproteína PP4 que se encontra# por exemplo# na placenta. Esta proteína apresenta um peso molecular de 35 000+ 5000 Dalton e um domínio isoeléctrico a um pH de 4#85 + 0#15.
As proteínas que inibem a coagulação do sangue podem ser classificadas em vários grupos de acordo com o respectivo modo de acção. Tanto os grupos dos inibidores de proteinases# como por exemplo a antitrobina III# como os das proteinases# como por exemplo a proteina C activada possuem em parte algumas propriedades inconvenientes para uma terapia inibidora de coagulação do sangue, uma vez que ou apenas actuam na primeira fase da activação das enzimas de coagulação ou desactivam estas por meio duma proteólise de factores de coagulação que são consumidos.
objectivo da presente invenção era, por conseguinte, pôr à disposição um agente inibidor de coagulação de sangue com a finalidade de conseguir combater a coagula ção do sangue sem recurso a factores de coagulação.
Na patente DE 35 33 516 A 1 (páginas 6 a 8) descrevem-se proteínas inibidores da coagulação de sangue para as quais é apontado um domínio isoeléctrico de 4,4 a 4,6. Estas proteínas são isoladas da camada íntima das gran des attérias, como por exemplo da aorta ou do cordão umbilical .
Em Acta Obst. Gynaec. Jpn. 36, N2. 12, 25832592 (1984) é igualmente descrita uma proteína da placenta inibidora da coagulação do sangue com um peso molecular de 45 000 Dalton. Na patente DE 33 15 000 A 1 (USP 4 507 229) descrevem-se também as seguintes propriedades da proteína PP4:
uma mobilidade electrofcrética num domínio entre a da globulina alfa^ ea da glolulina alfa2; um coeficiente de sedimentação s
1%
E lcm (280
20,w de 3,3 +0,2 S; um coeficiente de extinção nm de 5,9 + 0,6; uma fracção de hidratos de car bono de 2,4 + 0,94% (g/lOOg) (manose 0,3 + 0,2 %, galactose
0,4 + 0,2%, xilose 0,1 + 0,04%, glucose 0,2 + 0,1%, glucosamina 1,0 + 2%, ácido neuramínico 0,4 + 0,2 %) e a seguinte composição de ácidos aminados:
Ácido aminado
Resíduos por 100 resíduos (mol%)
Coeficiente de variação
Lisina 6,95 1,14
Histidina 0,97 17,4
Arginina' 5,44 1,77
Ácido Aspártico 11,41 1,68
Treonina 6,78 2,40
Serina 6,21 2,26
Ácido glutâmico 12,25 0,43
Prolina 1,96 6,20
Glicina 6,68 3,83
Alanina 7,92 1,67
Cistina 1/2 0,77 19,5
Valina 5,34 3,80
Metionina 1,98 6,00
Isoleucina 5,21 2,23
Leucina 11,50 0,45
Tirosina 3,55 4,21
Penilalanina 4,07 3,77
Triptofano 0,93 23,9
Descobriu-se surpreendentemente que esta proteína PP4 apresenta propriedades de inibição da coagulação do sangue.
Constitui por conseguinte um objectivo da presente invenção um processo para a preparação de um agente para a terapia ou para a profilaxia de pertubações hemostáticas contendo uma quantidade activa da proteína PP4 em conjunto com uma substância veicular farmacêutica adequada e/ou com um estabilizante.
Um agente terapêutico como o referido contêm numa solução entre 0,001 e 100 mg de PP4/ml de solução. Deve ser administrado numa dose de, por exemplo, 0,001 a 50 mg por Kg de peso corporal uma ou várias vezes por dia sob a forma duma pi ula ou duma infusão de administração prolonga.
Um agente contendo a proteína PP4 como o referido é de preferência preparado sob a forma de um liofilizado
eventualmente com estabilizantes e aditivos como por exemplo albumina, gelatina, sais, açúcares e/ou ácidos aminadoe ou então sob a forma duma solução aquosa contendo eventual, mente bactericidas e estabilizantes como por exemplo albumina, gelatina, sais, açúcares e/ou ácidos aminados. A solução pode ser administrada, por exemplo por injecção parenteral ou por perfusão.
Inclui-se no âmbito da presente invenção a utilização de proteína PP4 preparada por técnicas de manipulação genética.
Para a utilização como me .ticamento utiliza-se PP4 em quantidades mais elevadas. Por esta razão é desejável dispor de um processo simples de obtenção da proteína a partir de tecidos.
Surpreendentemente descobriu-se que a proteína PP4 se liga a uma matriz de suporte hidrófoba a partir dum extracto de tecidos ou duma solução e que pode ser liberta da das impurezas consideralvemente por meio duma fase final de eluição por gradiente.
Por conseguinte é também objectivo da presente invenção um processo para a purificação de PP4 caracteriza do por se pôr uma solução contendo PP4 de preferência um extracto de tecidos contendo PP4, em contacto com um absorvente hidrófobo insolúvel em ádjua, separar o adsorvente da solução sobrenadante, lavar eventualmente com um tampão e eluir a proteína PP4.
Antes ou depois deste processo podem ainda levadas a efeito outras técnicas de purificação como sejam cromatografia por permuta iónica, filtração em gel ou absor ção em fosfato de cálcio ou em hidroxiapatite.
Numa variante processual preferida para a purificação de PP4 faz-se contactar uma solução contendo PP4 a um valor de pH de 5,5 a 9,5, a uma temperatura de 02C a 402 C e após adição de sais, por exemplo após adição de 50 a 2 250g de sulfato de amómno por litro de solução, de sulfato de magnésio ou de NaCl, LiCl ou KC1 a 0,5 a 3 mol/1, com um absorvente hidrófobo insolúvel em água, por exemplo com com um material de suporte contendo grupos alifáticos, aromáticos ou aralifáticos. Para material de suporte pode usar-se, por exemplo, Sepharose, agarose ou Fractogel. Os grupos alifáticos usados são de preferência grupos alquílicos com 1 a 10 átomos de carbono, por exemplo, radicais butilo ou octilo, ou ainda por exemplo, radicais fenilo ou fenilalanilo eventualmente substituídos ou radicais benzilo substituído. Por fim separa-se o absorvente da solução, lava-se eventualmente com uma solução contendo 50 a 250 g/1 de sulfato de amónio ou 0,5 a 3 mol/1 de NaCl, LiCl ou KC1 e elui-se a proteína PP4 com um líquido de for ça iónica reduzida, eventualmente utilizando a técnica de gradiente.
Numa forma de concretização especialmente preferida da presente invenção faz-se contactar uma solução contendo PP4 a um valor de pH de 6 a 8, após adição de uma solução contendo de 144 a 243 g de sulfato de amónio por litro, com por exemplo, fenil-Rsepharose, Pro fim separa-se o absorvente da solução, por exemplo, com uma solução contendo por exemplo 176 a 196 g/1 de sulfato de amónio e elui-se a proteína PP4 com uma solução contendo 114 a 144 g/1 de sulfato de amónio.
Além disso, em virtude do perigo de contágio de doenças (hepatite, SIDA), é conveniente para utilização humana de determinados produtos terapêuticos biológicos efectuar-se um tratamento térmico a fim de matar os organis mos infecciosos. Este tratamento provoca, no entanto, na maioria das vezes uma perda de actividaae dos produtos biológicos.
Descobriu-se surpreendentemente que uma soluçãc aquosa de PP4 na presença de iões cálcio e de pelo menos um monossacarídeo ou umligossacarídeo ou de poli-alcóois derivados de açúcares e eventualmente de um ácido aminado pode ser aquecida, conservando-se consideralvemente inalterada a propriedade de inibição de coagulação do sangue.
Por conseguinte é também um objectivo da presente invenção um processo para a pasteurização duma solu-
ção contendo PP4 caracterizado pose aquecer esta solução na presença de iões de cálcio bem como de pelo menos um monossacarídeo ou um oligossacarídeo ou um poli-álcool derivado de açúcares e eventualmente de um ácido aminado sob condições apropriadas de modo a que os organismos patogénicos sejam mortos.
Numa variante processual preferida para a pasteurização duma solução contendo PP4 ajusta-se o pH da solução a um valor de 5,0 a 9,5 e adicionam-se 30 a 150 g/ 100 ml de solução de pelo menos um monossacarídeo ou um oligossacarídeo ou um poli-álcool derivado dum ácuçar e 0,005 a 2 mol/1 de iões cálcio bem como eventualmente 0,1 a
1,5 mol/1 dum ácido aminado. Os iões cálcio podem ser intro duzidos por exemplo sob a forma de CaCl2 ou de acetato de cálcio·
Numa forma de concretização especialmence preferida da presente invenção ajusta-se o pH duma solução con tendo PP4 a um valor de 6,5 a 8,5, trata-se com 100 a 150g de sacarose/100 ml de solução e 30 a 100 mmol/1 de CaCl2 Apôs a dissolução dos componentes a solução pode ser aquecida por exemplo de 1 a 20 horas a uma temperatura entre 40 e 80 C, de preferência de 8 a 15 horas a uí.ia temperatura de 55 a 65 C. 0 conteúdo em PP4 não deve descer abaixo de 20 ug/ml de solução. Depois do aquecimento a solução pode ser submetida ainda a tratamentos adicionais, por exemplo por concentrazação, por diálise, por filtração esterilizante e/ou por liofilização.
Um preparado obtido de acordo com o processo de preparação e de pasteurização acima descrito caracterização, especialmente pela presença duma proteína PP4 consideravelmente isenta de impurezas e cuja actividade de inibição de coagulação do sangue não foi alterada.
A proteína PP4 pode ser incorporada numa composição sob forma sólida ou líquida de acordo com as técnicas habituais com uma substância veicular fisiologicamente acei tável e farmaceuticamente apropriada e integrada num medica mento juntamente com eventuais aditivos, como sejam estabi- 6 -
lizadores e adjuvantes.
O objectivo da presente invenção inclui, por conseguinte, um processo para a preparação dum medicamento contendo a proteína PP4. Para a terapia e/ou a profilaxia de pertubações hemostáticas, carasterizado por se preparar uma solução contendo PP4, se adicionarem eventualmente aditivos e estabilizadores, como por exemplo albumina, gelatina, sais, açúcar e /ou ácidos aminados e por se secar essa solução eventualmente por liofitização.
A presente invenção é elucidada mais em pormenor por intermédio dos exemplos que se seguem.
Exemplo 1
Obtenção de PP4 a partir de tecido de placenta e sua pasteu rização
Homogeneizaram-se 2 Kg de placenta congelada num destroçador de tecidos. Lavou-se o produto homogéneo 3 vezes com 1 litro de cada vez de solução fisiológica de NaCl. 0 tecido de placenta foi separado do sobrenadante por centrifugação. 0 produto homogeneizado de placenta foi susn penso em 3 litros de tampao A x 100 contendo Triton (tris
R
HCL 20 mmol/1, NaCl 50 mmol/1, Triton 2 g/100 ml X 100, pH 7,4) e agitou-se dum dia para o outro. 0 extracto foi separado por centrifugação e o tecido foi novamente extraído dum dia para o outro com 2 litros de tampão A. Os dois extractos foram reunidos (4,8 litros) e foram diluídos com tampão B (tris HC1 20 mmol/1, NaCl 50 mmol/1, pH 7,5) até um volume de 15 1. Depois de se ter adicionado 0,75 g de
R solução de DEAE- Sephadex A a 50/1 agitou-se a solução durante 1 hora, separou-se o adsorvato da solução, lavou—se com 40 litros de tampão B e em seguida com 600 ml do mesmo tampão B mas contendo 100 mmol/1 de NaCl e eluiu-se a proteína PP4 com tampão B mas contendo 500 mmol/1 de NaCl. Adi cionou-se ao eluído (600 ml) sulfato de amónio até 176 g/1 e tratou-se de modo descontínuo ou numa coluna com 300 ml
M » de fenil Sepharose. Ecuilibrouse a fenil- Sepharose em tam pão B que continha sulfato de amónio a 3/10 da concentração
de saturação. Depois de lavar com o mesmo tampão, eluiu-se a proteína PP4 com tampão B contendo sulfato de amónio a 1/5 da concentração da saturação. A proteína foi precipitada por elevação da concentração de sulfato de amónio até 85 g/100 ml ou então foi concentrada por meio de ultrafiltração e foi purificada ainda por filtração em gel através de ACA 54. A coluna ACA 54 (3 X 100 cm) tinha sido equilibrada em tampão contendo 500 mmol/1 de NaCL. As fracções contendo PP4 reunidas.
Em caso de necessidade pode ainda levar-se a efeito uma pasteurização final, como descrito no Exemplo 3 o tratamento térmico pode no entanto também ser efectuado numa outra fase, como por exemplo no eluido de DEAE- Sephadex A50 ou no eluido do tratamento com fenil- Sepharose.
Exemplo 2
Determinação da actividade de inibição de coagulação do sangue da proteína PP4
Para determinação da actividade de inibição de coagulação do sangue da proteína PP4 obtida de acordo com o Exemplo 1 utilizou-se a determinação do tempo de protrombina (TP) modificada e a determinação do tempo parcial de tromboplastina (TPT) modificada.
a) Determinação do TP modificada
A 50 ul de plasma humano normal adicionaram-se 150 ul de tampão A (tris.HCl 20 mmol/1, NaCl 142 mmol/1 pH 7,5), 25 ul da amostra ou de tampão B (tris.HCl 20 mmol/1, NaCl 500 mmol/1 pH 7,5) e 25 ul de solução de tromboplastina. Depois duma incubação de três minutos a 37°c provocou-se a coagulação por adição de 250 ul duma solução C contendo CaC12 (tris.HCl 10 mmol/1, NaCl 80 mmol/1, CaC12, pH 7,9) e o tempo de coagulação foi determinado num coagulómetro de Schnitger-Gross. 0 tempo de coagulação do branco com tampão B foi de 60 s.
Dependência do tempo de coagulação na determinação do TP modificada em função do conteúdo de PP4 da solução
Concentração de PP4 (ug/ml) 0 5 10 15 20
Tempo de promtrombina raodif. (s)60 68 89 111 132,5
b) Determinação do PTP modificada
A 100 ul de plasma humano normal adicionaram-se 25 ul de amostra e 75 ul de tampão A contendo 100 mmol /1 de NaCl, incubou-se durante três minutos a 37°C, adicio
R naram-se 50 ul de solução de reagente de Pathromtin, incu bou-se novamente durante 6 min a 37°c. Em seguida misturou -se uma suspensão de 50 ul de caolino e depois de um novo periodo de 2 min a 37°C provocou-se a coagulação por adição de 100 ul duma solução C contendo CaC^.
A amostra foi previamente dialisada contra tampão A contendo 500 mmol/1 de NaCL. Dissolveu-se uma emR balagem de solução le reagente Pathromtin em 1 ml de solu ção de NaCl a 9g/l. C tempo de coagulação foi determinado num coagulómetro de Schnitger-Gross. 0 tempo de coagulação do branco com tampão A foi de 70 s.
Dependência do tempo de coagulação na determinação do TPT modificada em função do conteúdo de PP4 da solução
Concentração de PP4 (ug/ml) 0 13 17,7 26
Tempo parcial de tromboplast. mod.(s)
84 98 129
Exemplo 3
Pasteurização duma solução contendo PP4
500 ml duma solução contendo PP4 (100 ug de PP4/ml)foram dialisados contra uma solução de tris.HCl a 20 mmol/1 NaCl a 150 mmol/1 a pH 7,5. Em seguida adicionou-se sacarose na concentração de 100 g/100 ml de solução. Depois da dissolução completa da sacarose adicionaram-se 50 mmol/1 de CaC^ Depois do tratamento térmico (lh a 60 C) a solução pode ser dialisada contra citrato trissódico a 20 mmol/1, Nacl a 60 mmol/1 e glicina a 10 g/1 a pH 7,0, esterilizada por filtração e liofilizada.
Pasteurização de PP4 em solução (100 ug/ml)-Influência dos iSes cálcio na estabilidade da proteína PP4.
Tempo de Pt modificado (s) antes do aquecimento aquecimento com aquecimento sem cálcio 50 mmol/1 de cálcio (68 ) (60) (68)

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - ia -
    Processo para a preparação dum agente para a terapia ou para a profilaxia de pertubaçÔes hemostáticas” caracterizado por se incorporar numa forma apropriada para a utilização uma quantidade activa de proteína tecidual PP4 em conjunto com uma substância veicular farmacêutica adequada e/ou com um estabilizante.
    - 2s -
    Processo de acordo com a reivindicação 1 carac terizado por a substância veicular ser uma solução aquosa isotónica em relação ao sangue e por o estabilizante eventualmente existente ser um bactericida.
    Processo de acordo com a reivindicação 1 carac terizado por se liofilizar uma solução de PP4 que eventual mente contém aditivos e estabilizantes.
    Processo de acordo com a reivindicação 2 carácter izado por a solução conter entre 0,001 e 100 mg de PP4.
    - 5- -
    Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por se utilizarem como estabilizantes e aditi vos albumina, gelatina, sais, açúcares e/ou ácidos aminados .
    - -
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a substância veicular ser uma solução aquosa isotónica em relação ao sangue e por os estabilizan tes utilizados serem albumina, gelatina, sais, açúcares e/ou ácidos aminados.
    - 7â -
    Processo para a purificação de PP4 caracterizado por se pôr uma solução contendo PP4, de preferência um extracto de tecidos contendo PP4, em contacto com um absorvente hidrófobo insolúvel em água, separar o absorvente da solução sobrenadante, lavar eventualmente com um tampão e eluir a proteína PP4·
    - 8â -
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o adsorvente ser um material de suporte contendo grupos alifáticos ou aromáticos.
    - ga _
    Processo para a pasteurização duma solução contendo PP4 caracterizado por se aquecer a solução em contacto com iões de cálcio bem como com pelo menos um monossacarídeo ou um oligossacarídeo ou com álcoois derivados de açúcares e eventualmente com um ácido aminado sob condições tais cue se matem os germes patogénicos.
    A Requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 18 de Dezembro de 1986, sob o n2 p 36 43 182.6.
PT86393A 1986-12-18 1987-12-17 Processo para a preparacao de agentes terapeuticos e profilaticos contendo proteina tecidual pp4 e para a purificacao desta proteina PT86393B (pt)

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