DK144023B - Fremgangsmaade til ekstraktion af aktive forbindelser af plasminogentypen fra placenta - Google Patents

Description

(19) DANMARK \W/

fj| (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (11) 1 ί+4023 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 6570/74 (51) IntCI.3 A 61 K 35/50 (22) Indleveringsdag 17· dec. 1974 (24) Løbedag 17· dec, 1974 (41) Aim. tilgængelig 19· jun. 1975 (44) Fremlagt 23- nov. 1981 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. “

(30) Prioritet 18. dec, 1973, 7345289, FR

(71) Ansøger CHOAY S.A., 75782 Parle, FR.

(72) Opfinder Jean-Claude Lormeau, FR: Jean Goulay, FR: Edmond

Vairel, FR.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Budde, Schou & Co.

(54) Fremgangsmåde til ekstraktion af aktive forbindelser af plasminogen= typen fra placenta.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til ekstraktion af aktive forbindelser af plasminogentypen fra placentamasse, især af human oprindelse, befriet for placentablod, ved hvilken fremgangsmåde placentamassen macereres i en vandig opløsning, hvorefter placentamassen fjernes, og den vandige opløsning renses for urenheder, der hovedsagelig er af proteinnatur, på i og for sig kendt måde.

Q

g Plasminogen, der ligeledes benævnes profibrinolyqin, er et 3 protein, der normalt findes i plasma, og som kan omformes til plasmin j- (eller fibrinolysin) ved indvirkning af en aktivator, f.eks. kinase.

" I betragtning af, at plasmin besidder den egenskab at bevirke en hur- c 2 144023 tig opløsning af blodkoaguleringen, er det allerede blevet foreslået at anvende plasminogen som det aktive princip i trombolytiske medikamenter .

Forskellige fremgangsmåder til ekstraktion af plasminogen er allerede blevet foreslået. Fortrinsvis, især når man betragter dets anvendelse som aktivt princip i trombolytiske medikamenter, skal dette plasminogen være af human oprindelse. De kilder for plasminogen, der kommer i betragtning, består hovedsagelig af blodplasma og, dog i mindre grad indtil i dag, human placenta.

Plasma forekommer faktisk a priori at udgøre valget for udgangsmateriale for plasminogen. Dette findes i opløst tilstand i plasma sammen med andre proteiner, fra hvilke det kan fraskilles på forholdsvis let måde ved hjælp af fraktioneringsteknik, idet man især anvender den fraktionerede udfældning.

Det er f.eks. blevet foreslået at anvende de kendte egenskaber af visse plasminogeninhibitorer til at forøge' dettes opløselighed i et let surt miljø, især ved en pH-værdi mellem 5,3 og 6, for at bevirke en udfældelse af visse mængder af proteiner, som ledsager plasminogen i de plasmatiske præparationer.

Da plasma generelt skal reserveres til andre formål, er man begyndt at interessere sig for humane placenta, især for placentablod, som mulig kilde for plasminogen. Det må imidlertid erkendes, at ekstraktionsteknikken for plasminogen, når der gås ud fra plasma, ikke kan overføres som sådan til ekstraktion af plasminogen, når der gås ud fra placentablod, og dette skyldes uden tvivl den forskellige natur af proteinerne og lipiderne, som ledsager plasminogen i henholdsvis plasma og placentablod. Dette indeholder især forøgede doser af plasmin. Fra-skillelsen af plasminogen fra plasmin er vanskelig at udføre.

Det skal især bemærkes, at alle de kendte metoder til ekstraktion af plasminogen ud fra human placentablod foregår i et surt ekstraktionsmiljø, især for at undgå en aktivering af plasminogen til plasmin under indvirkning af de naturlige aktivatorer, som ledsager plasminogen i dette udgangsmateriale.

Man skal imidlertid erindre, at pH-værdien i ekstraktionsmiljøet ikke er uden indvirkning på de fysiske egenskaber af de opnåede plasminogener. En syrning af miljøet til især pH-værdier under 5-6 bevirker især en ændring af visse fysiske egenskaber af plasminogen.

I dette tilfælde formindskes stabiliteten og opløseligheden i neutralt miljø af et plasminogen opnået i et surt miljø meget i forhold til stabiliteten og opløseligheden af naturligt plasminogen.

3 144023

Opløseligheden af plasminogen opnået under disse betingelser kan eventuelt forbedres en smule, i øvrigt på en reversibel måde, ved tilsætning til miljøet af visse inhibitorer fop aktiveringen af plasminogen eller ved modifikation af de ioniske kræfter i miljøet, især ved tilsætning af salte, der besidder bestemte egenskaber. Tilstedeværelsen af disse inhibitorer eller salte i de opnåede opløsninger gør det imidlertid vanskeligt, hvis ikke umuligt, at anvende disse opløsninger til fremstillingen af medikamenter, især når det drejer sig om medikamenter, der skal indgives parenteralt. Alle forsøg på at fraskille fortrinsvis disse inhibitorer eller salte bevirker en udfældelse af plasminogen i opløsningerne, I fransk patentskrift nr. 1.347.029 beskrives en fremgangsmåde til ekstraktion, idet der i dette tilfælde gås ud fra helt størknet og findelt placenta, af et middel, der udviser plasminogens egenskaber, især hvad angår at gøre okseblod følsomt over for indvirkningen af streptokinase. Det drejer sig imidlertid endnu engang om en ekstraktion i et surt miljø. Man får et produkt, som kan opløses til en vis grad, især når man søger tilflugt til de ovenfor beskrevne kunstgreb. Det indeholder imidlertid betydelige mængder proteiner, især plasmin. Man iagttager forøvrigt, at tilstedeværelsen af disse andre proteiner spiller en ikke-negligerbar rolle ved opløsningen af produktet, fordi alle forsøg på en yderligere fraskillelse af proteiner ledsages af en udfældelse af fraktionen beriget med plasminogen aktivitet.

Opfindelsen har til formål at afhjælpe disse ulemper, især at tilvejebringe et produkt, der indeholder en forbindelse af plasmino-gentypen, der har en forøget renhedsgrad, i kendelig grad eller helt er fri for plasmin og fuldstændig er opløselig i et neutralt miljø, selv i fraværelse af aktiveringsinhibitorer for plasminogen eller mineralsalte, ved en fremgangsmåde til ekstraktion af dette produkt, idet der gås ud fra placenta, helt i fraværelse af det mellemliggende syrningstrin.

Opfindelsen bygger på den erkendelse, at det er muligt at ekstrahere tilbageholdte forbindelser af plasminogentypen, ja endog fikseret i placentavæv, efter eliminering af placentablod, ved at macerere dette væv ved en neutral pH-værdi i nærværelse af en aktiveringsinhibitor for plasminogen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at pH-værdien af den vandige opløsning er fra ca. 5 til ca. 10, fortrins- 4 144023 vis 7, og at nævnte vandige opløsning indeholder en aminosyre som inhibitor for plasminogenaktivering, og at inhibitoren fjernes under rensningsprocessen, hvorved de ønskede aktive forbindelser af plasminogentypen, der er opløselige i destilleret vand, opnås.

Man får således efter fraskillelse af inhibitoren en rå produktopløsning, der indeholder de ovennævnte forbindelser af plasminogentypen, som undertiden i det følgende samlet af sproglige hensyn betegnes med udtrykket "placentaplasminogen".

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan placentamassen befriet for placentablod udgøres af et vanduopløseligt materiale, der fås fra massen af koaguleret placenta efter fjernelse af den flydende fraktion indeholdende placentablod.

Det er interessant at konstatere, at metoden til at tilbageholde plasminogen på placentavæv i en vis grad er beslægtet med metoden til at fiksere et enzym på et affinitets-chromatografisk substrat, idet enzymet derpå elueres ved hjælp af en inhibitoropløsning specifik for dette enzym.

Denne ekstraktion kan f.eks. udføres i fraværelse af alle mineralsalte, altså i vand. Man konstaterer imidlertid, at det er fordelagtigt at arbejde med en fysiologisk neutral opløsning, fortrinsvis en isotonisk natriumchloridopløsning, især 0,9% opløsning af natrium-chlorid. Man observerer faktisk, at ekstraktionen af de fremmede proteiner i så fald reduceres til et minimum hvilket giver mulighed for ved denne ekstraktionsoperation at opnå fraktioner meget beriget med hensyn til forbindelserne eller stofferne, der har egenskaberne af placentaplasminogen og kan aktiveres til plasmin. I det følgende refereres der med "potentiel plasminaktivitet" til disse forbindelser eller stoffer.

En yderligere vigtig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at den tilvejebringer en effektiv beskyttelse af placentaplasminogen overfor dets aktivatorer ved en fysiologisk pH-værdi under selve ekstraktionen af placentaplasminogen, dvs. i det øjeblik, hvor det normalt er underkastet en aktivering.

Foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at inhibitoren er L-lysin, £-amino-capronsyre eller trans-4-aminoethyl-cyclohexancarboxylsyre, og at aminosyreinhibitoren anvendes i en molær koncentration mellem ca.

0,001 og 0,1 M, fortrinsvis af størrelsesordenen 0,035 M. Det har nemlig vist sig, at de nævnte foranstaltninger giver optimale resultater af fremgangsmåden.

1U023 5

De aktiveringsinhibitorer for plasminogen, som især er af interesse i forbindelse med udøvelsen af den her omhandlede fremgangsmåde, er som nævnt L-lysin med formlen nh2-ch2-ch2-ch2-ch2-cooh nh2 med en molekylvægt på 146,1, £-aminocapronsyre (A£AC) med formlen nh2-ch2-ch2-ch2“CH2-ch2-cooh med en molekylvægt på 131,1 eller 4-trans-aminomethylcyclohexancarboxylsyre (AMCHA) med formlen , CHL-CH0 / 2 2v

NH-CH,-CH nCH-COOH

CK2-CH^ med en molekylvægt på 157,20.

Man får således direkte uden fraskillelse af inhibitorerne i et macereringsbad en plasminogenopløsning under saltholdige betingelser og ved et fysiologisk pH.

Udførelsen af den samme macereringsoperation, men i fraværelse af en inhibitor for plasminogen, giver kun ekstraktion af en meget lille, hvis ikke negligerbar, mængde af placentaplasminogen, således som det fremgår af de efterfølgende eksempler.

Det skal understreges, at placentaplasminogenet, der er indeholdt i de opnåede opløsninger, er opløseligt i fysiologiske miljøer, idet alle fraskillelses- og macereringsoperationer er blevet udført ved en pH-værdi, der kan forenes med bevaringen af denne tilstand.

Man kan følgelig fortsætte med separationen af plasminogen-inhibitoren ved hjælp af klassiske metoder, hvis anvendelse ofte bliver så meget desto mere simplere, fordi molekylvægten af forbindelsen af plasminogentypen på den ene side og af inhibitoren på den anden side er meget forskellige. Man kan eksempelvis nævne den separationsteknik, der anvender en fraktioneret udfældning ved hjælp af midler, der ikke ændrer de enzymatiske egenskaber af kompositionerne af plasminogentypen.

6 144023

Det foretrukne middel består af ammoniumsulfat, som især er billigt, og som giver meget koncentrerede vandige opløsninger. Man kan naturligvis anvende andre salte til det samme formål, f.eks. ammoniumchlorid, magnesiumsulfat eller natriumsulfat. Man kan ligeledes anvende andre fraktionsudfældningsmidler, f.eks. en alkohol, idet plasminogen så kan fraskilles i udfældet tilstand ved hjælp af aminosyrer, som forbliver i opløsning.

Man kan ligeledes anvende separationsmetoder af fysisk vej, især ved dialyse, ved filtrering på en molekylsigte, f.eks. på en gel kendt under handelsbetegnelsen "Sephadex"

Man kan ligeledes anvende en ionbytning i neutralt miljø eller let alkalisk miljø, f.eks. ved en pH-værdi på 8, idet inhibitoren kan elueres, mens plasminogen forbliver absorberet på harpiksen. Det er indlysende, at de beskrevne metoder kun tjener til en illustrering af den store lethed, med hvilken forbindelserne af plasminogentypen kan genudvindes, idet der gås ud fra en udvaskningsopløsning.

Opløsningen af rå placentaplasminogen indeholder foruden pla-centaplasminogen selv urenheder, af hvilke størstdelen, især 90-95%, er af proteinnatur.

Fraskillelsen af disse proteinurenheder udføres på kendt måde, ifølge opfindelsen fortrinsvis ved en udførelsesform, som er ejendommelig ved, at nævnte opløsning underkastes en fraktioneret udfældning af forbindelserne af plasminogentypen og af proteinurenheder, især ved hjælp af de ovennævnte salte, bundfaldet indeholdende forbindelserne af plasminogentypen genudvindes og genopløses i en vandig opløsning, der underkastes en dialyse, dialysatet genudvindes, hvorpå det underkastes en affinitetschromatografi på et substrat, på hvilket en plasminogeninhibitor, fortrinsvis lysin, er fikseret ved hjælp af covalente bindinger, de på substratet tilbageholdte forbindelser af plasminogentypen elueres, fortrinsvis med £-aminocapronsy-re og eluatet redialyseres til opnåelse af en opløsning af rensede forbindelser af plasminogentypen, fri for inhibitor for plasmi-nogenaktiveringen, hvorhos de ovennævnte trin udføres ved en pH-vær-di over 5. Denne udførelsesform har den yderligere fordel, at den potentielle plasminaktivitet af de således rensede placentaplasmi-nogenet er ekstremt høj, således som de farmakologiske egenskaber, som er vist i det følgende, tilkendegiver.

m023 7

En analytisk undersøgelse af placentaplasminogen har vist, at det indeholder forøgede mængder af peptider, i det følgende benævnt "præaktive plasminogener", hvilket skyldes tab fra hel eller "oprindelig" plasminogen af peptidfragmenter, der indeholder et antal aminosyrer, af størrelsesordenen 68, der har en molekylvægt af størrelsesordenen 7000-8000, fra den ende af den peptide kæde, som danner oprindelig plasminogen, som afslutter sig med en aminosyre med en fri NH2~gruppe, hovedsageligt glutaminsyre. (Den anden ende af peptidkæden, som danher plasminogen, består ifølge Robbins et al, J.biol.Chem. 242, 2333-2342 (1967) hovedsagelig af asparagin, hvis COOH-gruppe er fri). De tilbageblivende mængder af forbindelserne med potentiel plasminaktivitet indeholdt i placentaplasminogenet er, bortset fra næsten indifferente urenheder, sammensat af naturlig plasminogen.

Blandt de præaktive plasminogener noterer man især den dominerende tilstedeværelse af peptidkæder, der har en endestillet aminosyre meden fri NH2~gruppe bestående af methionin. I det følgende betegnes denne præaktive plasminogen med udtrykket "methionin-plasminogen".

Man noterer ligeledes tilstrækkelig store mængder af en præaktiv plasminogen, der har en endestillet aminosyre med en fri NH2~gruppe bestående af valin, i det følgende betegnet med udtrykket "valin-plasminogen".

Opfindelsen angår således udvindingen af forbindelser af typen plasminogen, der indeholder en betydelig mængde, mindst ca. 40%, methionin-plasminogen.

Placentaplasminogenet indeholder især methionin-plasminogen i en mængde på 40 til 60 vægtprocent.

Opfindelsen angår især udvindingen af midler, der indeholder disse forbindelser med potentiel plasminogenaktivitet der indeholder:

Ca. 40 til ca. 60 vægtprocent methionin-plasminogen, ca. 10 til ca. 20 vægtprocent valin-plasminogen og ca. 20 til ca. 50 vægtprocent naturlig plasminogen.

Det skal erindres om, at molekylvægten af naturlig plasminogen er ca. 90000 - 5000, og at molekylvægten af præaktiveret plasminogener er af størrelsesordenen 83.000 - 5000.

144023 δ

Opfindelsen angår endvidere udvindingen af placentaplasminogener af typen, som defineres i det følgende, med en renhedsgrad, som kan nå, ja endog overstige, 95%, idet resten består af proteiner eller indifferente urenheder, idet disse rensede placentaplasminogener er blevet opnået ved at gå ud fra de ovennævnte rå plasminogener ved klassiske rensningsoperationer for plasminogener, f.eks. af den type, der beskrives i det følgende.

Der kan fremstilles medikamenter, i hvilke de ovennævnte placentaplasminogener er forbundet med et sterilt væskegrundlag, der kan injiceres, eller en steril perfusionsvæske.

Man kan generelt anvende den i det følgende beskrevne generelle fremgangsmåde, der især kan anvendes til human placenta. Skønt der i det følgende refereres til ekstraktion af plasminogen, skal det naturligvis opfattes som "placentaplasminogen", således som det er defineret ovenfor.

Placenta, som er koaguleret ved leveringen, opbevares ved -20°C. Det finfordeles mekanisk i koaguleret tilstand.

Det opnåede findelte materiale dekoaguleres ved kontakt med et vandbad ved en temperatur på +30 til +40°C under mekanisk omrøring. Dekoaguleringen opnås, når det findelte materiale når en temperatur over 1°C, fortrinsvis 4°C.

Den opnåede flydende masse centrifugeres ved 2500 omdrejninger pr. minut for at fraskille placentablod, som indeholder mindre plasminogen, men en betydelig mængde proteiner, og plasmin.

Den tørrede findelte masse udvaskes i 3 timer i et bad af en isotonisk natriumchloridopløsning ved en temperatur mellem 0 og 20°C, fortrinsvis ved +4°C.

Dette bad indeholder en svag molaritet af de ovenfor beskrevne inhibitorer, i en molkoncentration over 0,001 M fortrinsvis nær 0,035 M. Der foretages ingen korrigering af pH-værdien af blandingen, som således forbliver ved 7,2. Efter udløbet af udvaskningsperioden centrifugeres blandingen ved 2500 omdrejninger pr. minut, for at fraskille den findelte masse fra ekstraktionsbadet.

9 144023

Man får således en liter ekstraktionsvæske pr. kg. anvendt placenta/ der indeholder 120 UCA (kaseinolytiske enheder, der er den mængde plasminogen, der efter aktivering med streptokinase eller urokinase giver en mængde plasmin, der er i stand til at hydrolysere en mængde kasein, der på sin side giver nedbrydningsprodukter, der ved behandling med perchlorsyre giver 450 /ag tyrosin, målt ved spektro-fotometri) og svarer til 15 mg ren plasminogen. Den anvendte doseringsmetode er den, der er kendt under navnet "kaseinolytisk metode".

Plasminogenet indeholdt i de opnåede opløsninger kan genvindes og renses ved anvendelse af kendte metoder. Man foretager fordelagtig en fraktioneret udfældning af proteinerne og det indeholdte plasminogen i opløsningen ved hjælp af ammoniumsulfat. Ved tilsætning af en opløsning af en mængde ammoniumsulfat svarende til en mætning på 20% af saltet i opløsningen (idet det forudsættes, at en opløsning er mættet 100%, når den indeholder 540 g ammoniumsulfat pr. liter) tillader en udfældelse af en del af proteinerne i opløsningen, idet procenten af mætningen af ammoniumsulfat forøges til 40%, hvilket tillader en udfældelse af plasminogen. Disse operationer udføres ved en pH-værdi mellem 5,5 og 9,5, fortrinsvis ved en neutral pH-værdi. Det udfældede plasminogen genopløses derpå i en pufferopløsning, med en pH-værdi mellem ca. 6,5 og ca. 9,5, der tillader en yderligere rensning ved dialyse, især for at fjerne resterende ammoniumsulfat. Dialysatet underkastes derpå en endelig rensningsoperation ved affinitetschromatografi, f.eks. i nærværelse af dinatriumsaltet af ethylendiamintetraeddikesyre på en kolonne, der indeholder et substrat, fleks. en agar-agar-gel, på hvilken der er fikseret en aktiveringsinhibitor for plasminogen, fortrinsvis lysin, ved hjælp af covalente bindinger, idet plasminogenet derpå genvindes ved eluering med en puffer fortrinsvis ved en pH-værdi på 6-9 og indeholdende en aktiveringsinhibitor for plasminogen, fortrinsvis ε-aminocapronsyre. Eluatet kan eventuelt endnu engang underkastes en yderligere rensning ved dialyse, især for at fjerne inhibitoren .

,Λ 144023

IQ

Disse operationer kan generelt udføres som beskrevet i litteraturen, idet det forudsættes, at de valgte operationsmåder vælges således, at det under alle omstændigheder er muligt at arbejde ved en pH-værdi over 5.

Man får således et produkt, der har en forøget plasminogen-aktivitet, hvis indhold af plasminogen kan være over 4 UCA/mg, og hvis indhold af plasmin er mindre end 0,04 UCA/mg.

Det er i det foregående forudsat, at indholdet af plasminogen udtrykkes efter aktivering ved hjælp af urokinase, og at indholdet af plasmin repræsenterer spontant plasmin.

Det placentaplasminogen, som kan fremstilles ifølge opfindelsen, er bemærkelsesværdigt ved, at det efter rensningen er monodispers ved elektroforese, at det er opløseligt i vand, i isotoniske chloridopløs-ninger og i pufferopløsninger sædvanligvis til en neutral pH-værdi, at det er stabilt ved en neutral pH-værdi, at det er apyrogent i doser på op til 10 UCA/kg hos kaniner, og at det er blottet for toksicitet i forbindelse med grise i doser på 10 UCA pr. gris.

Effektiviteten af fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved hjælp af sammenligning af resultater, som opnås ved udøvelse af de operationer, der beskrives i det efterfølgende eksempel 1, på den ene side i nærværelse af og på den anden side i fraværelse af en aktiveringsinhibitor for plasminogen.

Eksempel 1.

Ekstraktionseffekt af aktiveringsinhibitoren for plasminogen.___ 3 1500 g human placenta, koaguleret ved -20°C, finfordeles i en pulverisator af typen STEPHAN.

Den opnåede masse afkoaguleres ved manuel omrøring i en rustfri stålbeholder i kontakt med et vandbad med en temperatur på 40°C. Dekoaguleringen varer i 40 minutter. Sluttemperaturen af massen er +6°C.

Placentablodet fraskilles derpå ved centrifugering fra den de-koagulerede masse i en centrifugeskål afkølet til +4°C ved 2500 omdrejninger pr. minut i 1 time.

Der fås 740 ml placentablod (790 g), der indeholder 290 g proteiner og en mængde plasminogen mindre end 70 UCA.

u 144023

Den opnåede findelte masse (700 g) deles i tre lige store dele på 233 g: Del nr. 1, del nr. 2 og del nr. 3. Disse tre dele behandles samtidigt og under de samme betingelser med undtagelse af sammensætningen af macereringsbadet og det på følgende måde:

Del nr. 1. Underkastes en macerering i 500 ml af et bad sammensat som følger: destilleret vand 500 ml

NaCl 4,5 g phenol (bacteriostatisk middel) 0,5 g

Temperaturen af badet + 5°C

Del nr. 2. Underkastes på samme måde en macerering i et bad sammensat som følger: destilleret vand 500 ml

NaCl 4,5 g phenol 0,5 g

t-aminocapronsyre 2,5 g dvs. 0,038M

temperatur af badet + 5°C

Del nr. 3. Underkastes en macerering i: destilleret vand 500 ml

NaCl 4,5 g phenol 0,5 g trans-4-aminomethylcyclo-

hexancarboxylsyre (AMCHA) 2,5 g dvs. 0,032M

temperatur af badet + 5°C.

Disse tre macereringer udføres parallelt i tre literbægere, ved +4°C ved konstant omrøring i tre timer. pH-værdien får lov til at blive ved den værdi, den indstiller sig til i de tre tilfælde, nemlig 7,2.

Når macereringen er afsluttet centrifugeres de tre suspensioner samtidig i afkølede centrifuger ved +4°C i 1 time ved 2500 omdrejninger pr. minut.

Masserne fjernes, og man får et supernatant-volumen som følger: volumen 1: 500 ml volumen 2; 500 ml volumen 3: 505 ml.

12 144023

De tre supernatanter bringes til 40%'s mætning med ammoniumsulfat ved tilsætning af 240 g/liter af dette krystalliserede salt og omrøres mekanisk. Omrøring fortsættes i de tre tilfælde i 20 minutter efter afslutningen af tilsætningen af saltet. pH-værdien får lov til at indstille sig af sig selv til 6,9 i de tre tilfælde.

De tre opløsninger centrifugeres samtidig i afkølede centrifuger ved +4°C ved 25 omdrejninger pr. minut i 1 1/2 time. De tre supernatanter fjernes, og man samler de tre bundfald, der er som følger: bundfald 1: 23 g bundfald 2: 23,2 g bundfald 3: 24 g

De tre bundfald er sammensat af omtrent 90% moderludsvæske og 10% proteiner.

De tre bundfald opløses i hver 50 ml af en phosphatpuffer på 0,1 M og med en pH-værdi på 7,5 og dialyseres derpå i tre timer mod strømmende demineraliseret koldt vand. En afsluttende dialyse udføres i 15 timer mod 40 liter phosphatpuffer på 0,01 M og med en pH-værdi på 7,5 ved +4°C.

De opnåede tre dialysater er karakteriseret som følger: dialysat 1: rumfang 80 ml, pH-værdi 7,5, ledningsevne: 950 /i mhos dialysat 2: rumfang 82 ml, pH-værdi 7,5, ledningsevne: 940 /1 mhos dialysat 3: rumfang 94 ml, pH-værdi 7,5, ledningsevne: 980/u mhos

Deres plasminogenaktivitet er som følger: dialysat 1: 0,16 UCA/ml x 80 ml = 12,8 UCA

dialysat 2: 0,85 - x 82 ml = 69,5 UCA

dialysat 3: 0,75 - x 94 ml = 70,5 UCA

En undersøgelse af de sidstnævnte resultater viser klart kvaliteten af ekstraktionsresultaterne, som den foreliggende opfindelse gør det muligt at opnå.

Eksempel 2.

Der gennemføres et forsøg med L-lysinhydrochlorid som inhibitor under de samme betingelser som eksempel 1.

Ved anvendelse af L-lysinhydrochlorid i en koncentration på 0,05 M fås 80 UCA plasminogen pr. kg placenta. Ved anvendelse af en koncentration på 0,12 M fås 140 UCA plasminogen pr. kg placenta.

å 13 144023

Anvendelsen af L-lysin giver således meget tilfredsstillende resultater. Da inhibitorvirkningen af L-lysin er noget lavere end virkningen af £-aminocapronsyre og AMCHA, er det ønskeligt at anvende lysin i noget højere koncentrationer end de to andre inhibitorer.

I det følgende eksempel 3 beskrives en særlig vigtig ekstraktionsrækkefølge af et placentaplasminogen, idet der gås ud fra placenta (industriel målestok).

k

Eksempel 3.

A: Ekstraktion af plasminogen.

500 kg human placenta koaguleret ved -20°C formales ved hjælp af en finfordeler af typen PALMANN.

Den opnåede masse dekoaguleres ved omrøring i en æltemaskine af typen WERNER, gennem hvis dobbelte hylster man etablerer en vandcirkulation ved en temperatur på 40°C.

Dekoaguleringen varer i 2 1/2 time, og sluttemperaturen af massen er +4°C.

Placentablod fraskilles derpå ved centrifugering af den dekoa-gulerede masse i en centrifuge af typen ROUSSELET ved 2500 omdrejninger pr. minut i 5 omgange af 15 minutter.

Der fås således 238 kg finfordelt masse og 260 kg blod.

Masserne overføres derpå i et macereringsbad med følgende sammensætning:

Fysiologisk natriumchloridopløsning: 500 liter S-aminocapronsyre: 2500 g (0,038 M) phenol (bakteriostatisk middel): 500 g (1%)

temperatur af badet: + 4°C

Blandingen omrøres derpå i tre timer ved +40°C. pH-værdien modificeres ikke, den er 7,2.

Ekstraktionsvæsken fraskilles derpå fra massen ved centrifugering i en centrifuge af typen ROUSSELET ved 2500 omdrejninger pr. minut i 5 omgange å 15 minutter.

Ekstraktionsvæsken har da en temperatur på 8°C, en pH-værdi på 7,2 og et rumfang på 510 liter.

14 144023 B: Rensning af plasminogen.

Rensningen af plasminogen indeholdt i den opnåede opløsning kan gennemføres ved at gå frem på følgende måde.

Den anvendte rensningsmetode er en variant af metoden, kendt under navnet affinitetschromatografi.

Ekstraktionsvæsken klarfiltreres først i nærværelse af et filtreringshjælpemiddel, således som det forhandles under betegnelsen "SOLKA FLOC BW 20" (klarfiltrering) eller centrifugeres ved stor hastighed efter tilsætning af en mængde ammoniumsulfat svarende til en mætning på 20%. Denne klarfiltrering eller centrifugering har til formål at fjerne de fine partikler fra massen, idet de ellers forbliver i opløsningen.

Ekstraktionsvæsken underkastes derpå en mætning til 40% med ammoniumsulfat, hvorpå plasminogen udfældes.

Klarfiltreringen (eller centrifugeringen) og udfældningen udføres ved pH-værdi mellem 5,5 og 9,5, fortrinsvis ved 7 (pH opnået naturligt uden tilsætning af syre eller base til miljøet).

Det opnåede bundfald genopløses i en opløsning af koldt demineraliseret vand med inhibitor som beskrevet ovenfor især den, der anvendes under ekstraktionen (molaritet mellem 0,001 M og 0,05 M), således at der opnås en ledningsevne under 20.000 mikromhos, fortrinsvis 12.000 mikromhos.

pH-værdien indstilles derpå til en værdi mellem 5,2 og 7, fortrinsvis 5,5.

Ved filtrering fjerner man filtreringshjælpestoffet, der blev tilsat tidligere, og ligeledes inaktive urenheder.

Det opnåede filtrat indstilles til en pH-værdi mellem 5,5 og 9, fortrinsvis 7,2, og det fortyndes derpå 1 gang ved tilsætning af det samme rumfang koldt demineraliseret vand. Det vejer 2400 g

Man udfælder derpå det aktive stof i den opnåede opløsning, idet denne bringes til en 40% mætning med ammoniumsulfat.

Bundfaldet samles ved centrifugering.

960 g af dette bundfald (svarende til 200 kg koaguleret udgangsplacenta) opløses i en phosphatpuffer med en molaritet på 0,1 til 0,5 M, fortrinsvis 0,3 11, og en nH-værdi på 6,5-9,5, fortrinsvis 7,5, og dialyseres derpå i 7 til 8 timer med koldt demineraliseret vand, på hvilken måde der opnås en ledningsevne på mellem 6000 og 10000 mikromhos.

15 144023

Dialysatet centrifugeres derpå, eller klarfiltreres, til fjernelse af uopløste stoffer, der er dannet i løbet af dialysen.

Til den klarfiltrerede eller centrifugerede opløsning sættes 1% (rumfangsdele) dinatriumsalt af ethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA), og pH-værdien indstilles til en værdi mellem 6 og 9, fortrinsvis 7,5, ved hjælp af natronlud og orthophosphorsyre.

Opløsningen ledes derpå gennem en kolonne, der indeholder en agar-agar-gel, på hvilken lysin er fikseret ved kovalente bindinger, og indstilles på forhånd til ligevægt med en phosphatpuffer med en molaritet på 0,05 til 0,4 M, fortrinsvis 0,15 M, og en pH-værdi på 6-9, fortrinsvis 7,5 (puffer nr. 1). Når hele opløsningen har passeret kolonnen, skylles denne med puffer nr. 1, indtil der ikke mere findes proteiner i eluatet. Pufferen fra denne udskylning erstattes derpå med en phosphatpuffer med en molaritet på 0,05-0,4 M, fortrinsvis 0,1 H, og en pH-værdi på 6-9, fortrinsvis 7,5 (puffer nr. 2). Kolonnen elueres derpå med puffer nr. 2 indeholdende 0,01 M-0,5 M £-aminocapronsyre, fortrinsvis 0,2 M.

Eluatet samles. Det indeholder størstedelen af det ekstraherede plasminogen. Det dialyseres derpå i 24 timer mod en puffer med en svag molaritet og en pH-værdi på 6-9, fortrinsvis en phosphatpuffer på 0,01 M og pH 7,5, og lyofiliseres derpå.

Man får således mellem 100 og 120 UCA plasminogen pr. kg finfordelt placentamasse.

Idet der gås ud fra ovennævnte udgangsekstraktionsopløsning fås 5,2 g lyofiliseret pulver, der har følgende egenskaber: indhold af plasminogen: 4,4 UCA/mg indhold af plasmin: <"0,04 UCA/mg indhold af proteiner: 52% (de resterende 48% udgøres af phosphater)

Dette pulver er karakteriseret ved en fuldstændig opløselighed ved en pH-værdi af størrelsesordenen 7 i destilleret vand, isotoniske chloridopløsninger og løbende pufferblandinger og har generelt alle de egenskaber, der er nævnte ovenfor.

Generelt kan man derfor sige at produktet af piasminogentypen ekstraheret fra placentamasse har et indhold af plasminogen over 4 UCA/mg og et indhold af plasmin under 0,04 UCA/mg.

Det således opnåede placentaplasminogen har en god farmakologisk virkning og glimrende terapeutiske egenskaber.

16 144023

En farmakologisk undersøgelse af plasminogen under anvendelse af den teknik, der beskrives af R. Courbier et Coll., Ann. Chir., 1963, 17, nr. 5-6, side 331-338, på hunde, hos hvilke man har provokeret en eksperimentel akut, arteriel trombose, viser, at plasminogen inducerer en hurtig formindskelse af det koagulerede rumfang og endog i de fleste tilfælde en total opløsning.

Det er i denne forbindelse interessant at observere, at en mængde af produktet fremstillet ifølge opfindelsen og som indeholder 13 mg proteiner og titreres til 100 UCA, i de ovennævnte beskrevne farmakologiske forsøg har en aktivitet hovedsagelig analog med den opnåede aktivitet med en mængde af et produkt, der er fremstillet ifølge fransk patentskrift nr. 1.347.029 og indeholder 240 mg proteiner.

Placentaplasminogenet kan generelt anvendes til behandling af mangler i den fibrinolytiske funktion.

Anvendelsen af human placentaplasminogen er fordelagtig, især i de følgende kliniske tilfælde: a) akut åndenød hos nyfødte og for tidlig fødte, hos hvilke der findes en fuldstændig eller delvis mangel på plasminogen, et syndrom, der normalt er forbundet med en fibrinansamling i lungeblærer, b) blodpropper og venetromboser, især hos de patienter, hos hvilke forbruget af plasminogen er større end produktionen i leveren, idet en indgivelse af plasminogen derfor anbefales for at forberede de pågældende patienter på en trombolytisk behandling med et medikament, f.eks. streptokinase eller urokinase, c) især hjernemikroblodpropper, d) lokaliserede og akut spredte intravaskulære koaguleringer, subakutte og kroniske med extensiv tendens på grund af mangel på plasminogen.

Indgivelsen af placentaplasminogen kan f.eks. indgives som fortsatte veneperfusioner i en mængde på 1000 til 1200 UCA fordelt over en varighed på 24 til 36 timer eller ved langsom injektion (for en mand med en middelvægt på 60 kg).

Hos diende børn kan man anvende doser på 200 UCA hver sjette time indgivet ved en langsom perfusion i en isotonisk 0,9% chlorid-opløsning, indstillet til en pH-værdi på 7,4 i løbet af 24 timer.

For disse indgivelsesformer har man anvendt opløsninger af plasminogen i et farmaceutisk acceptabelt grundlag, især en fysiologisk opløsning, fortrinsvis glycose.