PT98190B

PT98190B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas para estabilizar o plasma sanguineo durante a pasteurizacao

Info

Publication number: PT98190B
Application number: PT98190A
Authority: PT
Inventors: Myriana Burnouf; Thierry Burnouf
Original assignee: Centre Regional De Transfusion
Priority date: 1990-07-03
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 1998-12-31
Also published as: AU8062991A; DE69117920D1; DK0497929T3; HUT60148A; FI96918B; FI920934A0; FI96918C; CS57992A3; HU208404B; GR3020048T3; HU9200701D0; ZA914848B; NO920791L; EP0497929A1; CZ281431B6; JPH05501417A; LTIP264A; JP3132828B2; FR2664165A1; EP0497929B1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS À BASE DE SORBITAL, HEPARINA, CaCl₂ E LISINA PARA ESTABILIZAR O PLASMA SANGUÍNEO DURANTE A PASTEURIZAÇÃO

Ά presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de composições farmacêuticas para estabilizar o plasma sanguíneo durante a pasteurização e às soluções plasmáticas assim obtidas, particularmente destinadas a terapias de substituição de plasma e dos factores V, XI e XIII da coagulação sanguínea.

O plasma humano total ou desprovido de crioproteínas é ainda utilizado como terapêutica de substituição para os grandes *

queimados, os indivíduos com graves traumatismos ou que sofreram intervenções cirúrgicas importantes, isto é, em todos os casos em que os doentes sofrem grandes perdas de líquido.

De um modo geral utiliza-se, para este tipo de terapêutica, plasma proveniente de dadores individuais, sãos e previamente controlados, a fim de evitar os riscos de transmissão de doenças virais. Este processo não permite/ contudo, eliminar todos os riscos de contaminação por vírus em fase pré-serológica, em particular os diferentes vírus da hepatite e o vírus da SIDA.

Será, portanto, vantajoso obter um método de inactivaJÇ

ção virai que não altere as diferentes funções biológicas do plasma.

Está bem demonstrado que o vírus da Hepatite B e totalmente inactivado por aquecimento à temperatura de 60° C durante 10 horas, na presença de citrato de sódio a 0,5 M (Taborre Colab Thrombosis Res. 22, 233-238, 1981). Todavia, este tratamento implica perda da actividade biológica de certas proteínas do plasma (Taborve Colab. e Barrowcliffe e Colab. Fr. J. Haematology SS, 37-46, 1983).

As diferentes proteínas com interesse terapêutico purifi cadas a partir do plasma sanguíneo, podem ser submetidas a uma pasteurização clássica à temperatura de 60° C durante 10 horas na presença de diversos agentes estabilizantes. Verifica-se, todavia, que as moléculas que estabilizam uma actividade biológica podem ser totalmente ineficazes sobre uma outra.

Assim, pode estabilizar-se a albumina pela acção do acetil-triptofano e do caprilato (Gellis e Colab. J. Clin. Invest. 27, 239-244, 1948), embora estes agentes estabilizantes não tenham acção sobre o plasminogéneo. A trombina pode ser estabilizada por altas concentrações de glicosidos (Seegers. Arch. Biochem. 3, 363-367, 1944), enquanto que estes não protegem a protrombina. A adição de um aminoácido e de um glúcido tem dado bons resultados com o Factor VIII e com a antitrombina III (con/ %

sultar patente de invenção DE 29.16.711).

A patente de invenção europeia 0 035 204 põe em evidêni cia a estabilizaçao da ^-antitripsina, da antitrombina III, da précalicraína, da fibronectina e do Factor VIII, na presença de um poliol, o qual apenas é exemplificado pela sacarose; assinala, contudo, que nas mesmas condições, o Factor IX e a précalicraína perdem toda a actividade terapêutica.

Estes diferentes dados experimentais confirmam a ideia admitida na generalidade que a inactivação virai do plasma total (plasma fresco, plasma fresco congelado ou sobrenadante da crioprecipitação) não pode ser realizada por pasteurização.

A necessidade médica ainda existente de plasma total, le vou a requerente a procurar obter uma composição que assegurasse a protecção simultânea da actividade biológica de todos os facto res com interesse terapêutico contra a desnaturação durante a pasteurização.

Tendo observado que o sorbitol oferece uma certa protecção contra a desnaturação térmica, mas com resultados variáveis de uma amostra para outra de plasma, e com rendimentos reduzidos a Requerente procurou diferentes agentes aditivos, cuja mistura com sorbitol aumentasse o seu poder de estabilização.

Assim, a composição de acordo com a presente invenção é constituída por uma mistura de sorbitol, cloreto de cálcio, heparina e lisina. As concentrações dos diferentes componentes são ajustadas para se obter uma concentração final no plasma a pasteurizar compreendida entre

- 50 e 80¾ de sorbitol e de preferência, 60%;

- 0,1 é 1 u/ml de heparina e de preferência, 0,5 U/ml;

- 1 e 10 g/litro de lisina e de preferência, 4 g/litro;

- 3 e 5 mM de cloreto de cálcio e de preferência, 4 mM.

A composição de acordo com a presente invenção é adicionada a plasma fresco ou a plasma fresco congelado e depois descongelado ou a plasma isento das proteínas do crioprecipitado, antes de se submeter este a uma pasteurizaçao mediante aquecimento a uma temperatura de 60° + 1° C durante 10 horas.

Apôs a pasteurização, diminui-se a temperatura progressivamente até 20° C e submete-se a solução a uma diálise para eliminar o sorbitol e a heparina.

agente tampão para a diálise, a pH 7, contém citrato de sódio em uma concentração compreendida entre 4 e 10 mM, cloreto de cálcio 4 mM, cloreto de sódio 0,13 ..;M e lisina em uma concentração de 4 g/1. Pode-se, também utilizar tampões de diálise de composição diferente em função das necessidades. A solução concentra-se, em seguida, para se restabelecer a dose fisiólica das proteínas plasmáticas. Submete-se a solução resultante a uma filtraçao esterilizante acondiciona-se e por fim congela-se ou liofiliza-se.

A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para a pasteurização do plasma caracterizado pelo facto de se adicionar a composição de acordo com a presente invenção ao plasma, antes do seu aquecimento e de se/submeter, em seguida, a uma diálise o plasma pasteurizado contra o tampão anteriormente definido.

Este processo é particularmente vantajoso porque pode ser aplicado a grandes lotes de plasma proveniente ;de várias recolhas independentes. Mais particularmente, a pasteurização de lotes de 100 a 200 litros ou mais permite, depois de se ter efectuado os controlos apropriados, garantir uma constância de qualidade dos lotes.

Por outro lado, os lotes de plasma pasteurizados pelo processo de acordo com a presente invenção podem servir igualmente de produtos de substituição para os doentes que apresentam deficiências em factores da coagulaçao, dos quais não existem concentrados purificados, tais como os Factores V, XI e VIII.

A presente invenção diz Ígualmente respeito a soluções plasmáticas pasteurizadas obtidas pelo processo de acordo com a

presente invenção, e destinadas, mais particularmente, por um lado ao tratamento das deficiências em Factores V, XI e VIII da coagulação, e por outro lado, às terapêuticas de substituição que necessitam do plasma total ou do sobrenadante do crioprecipitado.

exemplo descrito em seguida constitui uma forma de realização da presente invenção sem, contudo a limitar.

Exemplo:

Em dois litros de plasma descongelado adicionam-se 1 000 Unidades de heparina, 8 g de lisina e 220 mg de cloreto de cálcio. Estes dois produtos são adicionados sob a forma de sais em pô, sendo o plasma submetido a uma agitação suave. Em seguida, adiciona-se progressivamente 1 200 g de sorbitol não dissolvido.

Realiza-se a pasteurização num recipiente de 5 litros mediante aquecimento à temperatura de 60° C durante 10 horas com o auxílio quer de um banho-maria, quer de um recipiente termostatizado. Apos a pasteurização, o sorbitol e a haperina são eliminados por diálise em rim artificial ou através de um sistema de ultrafiltração como, por exemplo, o sistema Pellicon , em cassetes utilizando-se um tampão citratado contendo lisina em uma concentração de 4 g/1, cloreto de cálcio 4 mM e cloreto de sódio

0,13 Μ. A diálise, pode ser seguida de uma concentração sobre o

mesmo material para se levar os teores dos factores da coagulaçao a cerca de 1 Xl/ml como num plasma terapêutico 'de boa qualii dade. 0 materiallê dialisado a uma osmolaridade de 370 mosmoles/ /1 e a pH 7. O produto é filtrado em seguida mediante filtração esterilizante, por exemplo, por um filtro Millipack (m) 40 (Millipore) com poros de 0,22jrm. A redistribuição do material efectua-se em sacos de plástico para congelação ou ein frascos para liofilização.

A estabilização do plasma quando da pasteurização e da ultrafiltração pela adição de cálcio, heparina e lisina permite a obtenção dos seguintes rendimentos, em relação a (designada a seguir vs) uma testemunha contendo apenas lisina e sorbitol.

FVIIIc

FVc

FVIIC

FIXc fibrinogénio cóagulável

FXIII

87	%	vs	66
77	%	vs	35
55	%	vs	52
60	%	vs	49
81	%	vs	57
77	%	vs	71

Em presença desta quantidade de cálcio nao se observam sinais de activação dos factores da coagulação. Assim, a relaçao FVII bovino/FVII coagulante e de 0,95 versus 1,09 para a testemunha. A estabilidade, testada seguindo-se a actividade do Factor VIII após 24 horas de conservação do produto no estado líquido e à temperatura ambiente, não é alterada relativamente à testemu-8nha (recuperação de 100% de actividade). Sendo isto em abono de uma taxa de PKA 2% para os produtos-.pasteurizados e para as testemunhas.

Além disso, os controlos sobre o rato, por injecção intravenosa de plasma pasteurizado deste modo, indicam a ausência de efeito hipotensor e não revelam qualquer modificação do ritmo cardíaco.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. - Processo para a preparação·de composições farma cêuticas utilizadas para estabilizar.o plasma sanguíneo durante a pasteurização, caracterizado pelo facto de se misturar sorbitol, heparina, cloreto de cálcio e lisina.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de se misturar o sorbitol em uma concentração compreendida entre 500 e 800 g/1.
3.- Processo de acordo com a reivindicação 2, carac terizado pelo facto de se misturar o sorbitol na concentração de 600 g/1.
4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de se misturar a hepari na em uma concentração compreendida entre 100 e 1000 U/l.
5. - Processo de acordo com á. reivindicação 4, carac terizado pelo facto de se misturar a heparina na concentração de 500 U/l.
6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de se misturar o cloreto de cálcio em uma concentração compreendida entre 3 e 5 mM.
7. - Processo de acordo com· a reivindicação 6, carac terizado pelo facto de se misturar o cloreto de cálcio na concen tração de 4 mM.
8. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se misturar a lisina em uma concentração compreendida entre 1 e 10 g/1.
9. - Processo de acordo com.a reivindicação 8, carac terizado pelo facto de se misturar a lisina na concentração de

4 g/l.
10. - Processo para a pasteurização de plasma sanguí_ neo, caracterizado pelo facto de se adicionar ao plasma, antes do aquecimento, uma composição preparada pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 9 e de se eliminar segui damente a citada composição por diálise.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se realizar a diálise a pH7 contra um tampão contendo citrato de sõdio em uma concentração compreendida entre 4 e 10 mM, · cloreto de cálcio 4mM, cloreto de sódio 0,13 M e lisina na concentração de 4 g/l.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo facto de se proceder à pasteurização de uma quantidade de plasma compreendida entre 1 litro e algumas centenas de litros.
13. - Processo para a preparação· de soluções plasma ticas para utilização terapêutica destinadas a compensar a defi ciência em Factores V, XI e XIII da coagulação sanguínea, carac terizado pelo facto de se utilizar a técnica descrita em uma qualquer das reivindicações 10 a 12.
14. - Processo para a preparação de plasma total pa ra utilização terapêutica, caracterizado pelo facto de se proce der a uma pasteurização pelo processo de acordo- com uma qualquer das reivindicações 10 a 12.
15. - Processo para a preparação de sobrenadante de plasma crioprecipitado e desprovido de crioproteínas para utili zação terapêutica, caracterizado pelo facto de se proceder a uma pasteurização pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 10 a 12.