PT94859B

PT94859B - Processo para a pasteurizacao de uma mistura de proteinas contendo fibrinogenio

Info

Publication number: PT94859B
Application number: PT94859A
Authority: PT
Original assignee: Fond Nat Transfusion Sanguine
Priority date: 1989-08-01
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1997-07-31
Also published as: IE902766A1; PT94859A; IE70455B1; EP0436712A1; FR2650508A1; DE69023470T2; ATE129903T1; DE69023470D1; WO1991001762A1; DK0436712T3; ES2080155T3; FR2650508B1; EP0436712B1

Description

A presente invenção refere-se a uma cola pasteurizada para reunir os tecidos humano ou animal.

Conhece-se desde há muito a utilização de substan cias favorecendo a coagulação do sangue para parar hemor xagias ou cicatrizes feridas.

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07

Nas primeiras propostas que foram feitas neste domínio, utilizou-se, em primeiro lugar, tampões ou plaquetas de fihrina realizando-se a seguir colagens de tecidos com a ajuda de plasma sanguíneo.

Este tipo de cola é de um modo geral um concentra do de factores de hemostase coaguláveis pela trombina rica em fibrinogénio.

É constituída por dois componentes essenciais que são misturados extemporaneamente quando da utilização.

primeiro componente é constituído por uma mistura de proteínas extraídas do plasma humanos fibrinogénio, fibrinectiha e factores XIII (ou factores estahelizadores da fibrina). 0 segundo componente é constituído por trombina cálcia que pode ser de origem animal, bovina por exemplo,

A fim de evitar qualquer risco de contaminação virai quando da aplicação desta cola, é necessário efe_c tuar, durante o curso da sua preparação, uma etapa de inactivação virai do primeiro componente com base em prO teínas de origem plasmática. A pasteurização que é um método apropriado para este tipo de operação põe, com efeito, problemas devido à instabilidade térmica de certas proteínas presentes neste primeiro componente.

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fim da presente invenção é de propor uma nova cola pasteurizada essencialmente caracterizada pelo processo de obtenção do primeiro componente extraído do plasma humano, incluindo este processo um passo de inactivação virai.

Mais, particularmente, a presente invenção refere-se a um processo de pasteurização de uma mistura de proteína contendo principalmente fibrinogénio por aquecimento da referida mistura nas condições que asseguram a pasteurização, caracterizado por a referida mistura ser pasteurizada na presença de um monossaeárido e de um açúcar alcoólico.

Mod. 71 -10000 ex. -89/07

De preferência, e com a diferença dos numerosos processos da técnica anterior, principalmente o processo descrito na EP - B - 0103196, a mistura de proteínas pasteurizada não contém praticamente ião cálcio e é, de preferência, exemplo de inibor da trombina.

Na aplicação preferida deste processo, a mistura de proteínas contém igualmente o factor XIII plasmático e pode ser obtido a partir de um crioprecipitado de pias ma humano posto em solução e precipitado na presença de heparina; 0 precipitado obtido reposto em solução constitui a mistura a pasteurizar.

Os inventores tem, com efeito, posto em evidência que a presença de um monossaeárido e de um açúcar alcoólico, quando da pasteurização da solução proteica, permite estabilizar as referidas proteínas e por consequência, conservar as suas actividades biológicas.

As concentrações em monossaeárido e açúcar alcoólico utilizadas para estabilizar as proteínas dependem, bem entendido, da natureza, concentração das proteínas

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Z ir '1 na solução proteína e da natureza do proprio monossacárido e do açúcar alcoólico utilizados e são em geral de 1000 e 1400 g para o monossacárido e entre 200 e 400 g para o açúcar alcoólico adicionados por litro de solução proteica.

De acordo com o modo de realização preferido da invenção, utiliza-se, de preferência, a glucose como monossacárido e o sorbitol como açúcar alcoólico para concentrações de 1200 g para a glucose e da ordem de 300 g para o sorbitol adicionados por litro de solução proteica.

De acordo com a invenção, pasteuriza-se a solução proteica a uma temperatura vizinha dos 60°C durante cerca de 10 horas ou nas condições de pasteurização equivalentes, quer dizer a temperaturas e duração de tratamento suficientes para permitir neutralizar quaisquer vestígios de virus presente no produto, em particular, o virus da hepatite. Esta pasteurização será efectuada nas condições próximas das condições fisiológicas a fim de não perturbar as proteínas. 0 pH utilizado será assim, de preferência, proximo de 8.

A invenção refere-se igualmente numa cola para reunir os tecidos humano ou animal do tipo que compreende dois componentes.

a) uma mistura de proteínas extraídas do plasma humano contendo principalmente fibrinogénio e o factor XIII e»

b) da trombina cálcica, misturados extemporaneamente no momento da colagem,

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Sb caracterizado por a mistura de proteínas contendo principalmente fibrinogénio e factor XIII ser pasteurizada pelo processo descrito atrás.

A descrição detalhada de uma forma de realização da invenção, apresentada a seguir, a título não limitativo, permitirá pôr em evidência outras características da invenção,

O crioprecipitado é obtido por técnicos conhecidos a partir do plasma humano descongelado a uma temperatura compreendida entre O e 4°C e depois eentrifugado, crioprecipitado é em seguida reposto na solução num tampão Tris de pH7.

A concentração em proteínas está então compreendida entre 15 a 35 g/l·

A mistura de proteínas é precipitada da solução obtida pela heparina. Utiliza-se, de preferência, entre 10 a 40 U/ml de heparina e uma temperatura compreendida entre 10 e 35°C.

O precipitado obtido é então recuperado por centrifugação e a porção sobrenadante é eliminada.

precipitado obtido é em seguida solubilizado num tampão de pH 8 contendo agentes estabilizantes, em particular, aminoácidos tais como glicina e arginina, bem como inibidores da fibrinolise tais como o ácido ζ_ aminocaproico e a aprotinina (inibidos da plasmina).

A concentração proteica da solução é neste caso de 40 a 70 g/l. Nesta fase, é possível imaginar um passo de ~4*62525 fi. uí ·..

7/k . - ' k/ I •i ' a filtração para eliminar os produtos insolúveis.

Não é, pois, senão no momento da fase de pasteurização que as substâncias estabilizantes de pasteurização, propriamente ditas, quer dizer, o monossacárido e o açúcar alcoólico, são introduzidas. A solução proteica contendo estes estabilizantes é então aquecida a uma temperatura vizinha de 6O°C durante cerca de 10 horas.

Com o fim de eliminar as substâncias estabilizantes após o tratamento de inactivação virai e de concentrar as proteínas, poder-se-á utilizar os métodos usuais do tipo precipitação, diálise ou filtração, por exem pio.

Deste modo, a solução pasteurizada poderá ser diluída num tampão de um pH situado entre 6 e 7 contendo NaCl 0,015 M - citrato trissódico 5 mM, ácido £ aminocaproico 25 mM e arginina 17 mM. A solução diluída numa referência l/5 a l/lO (V/v) e arrefecida ate uma temperatura compreendida entre -1°C e -5°C. As proteínas são precipitadas pela adição de álcool a 10% conservando uma temperatura inferior a -1°C e superior a - 5°θ > o precipitado recuperado após centrifugação e as substâncias sobrenadantes eliminadas.

O resíduo da centrifugação é em seguida reposto em solução com um tampão de pH 7,5 contendo NaCl 0,06 M-citrato trissódico 1 mM - glicina 6θ níM - ácido ζ aminocaproico 20 mM e arginina 20 mM. A solução obti da é submetida a diálise contra o mesmo tampão, depois concentrado para atingir uma concentração proteica compreendida entre 30 e 40 g/l.

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Nesta fase, pode adicionar-se agentes que favorecem a solubilidade do produto após liofilização, como por exemplo, poli-sorbato e/ou caprilato de sódio, A solução ó depois filtrada de modo estéril com a ajuda de filtros que possuem uma porosidade de 0,2 jira, repartida em frascos e depois liofilizada, liofilizado pode ser reposto com uma solução de água PPI podendo conter um inibidor da plasmina (apro tinina, por exemplo). A solução obtida deve conter no mínimo, uma concentração de fibrinogénio de 7θ g/l· produto reconstituído contém fibrinogénio da fibronectina nas proporções seguintes: respectivamente 65 a 85$ e 7 a 1*Z referidos ás proteínas totais. Contém igualmente o factor XIII bem como heparina (50 a 200 u/ml.

exemplo dado aqui a seguir, a título não limitativo, permitirá pôr em evidência outras características da presente invenção.

EXEMPLO 1:

A partir de 280 1 de plasma, a crioprecipitação permitiu recuperar 2 Kg de precipitado (crioprecipitado), As proteínas que entram na composição da cola são obtidas após reposições em solução deste precipitado ( 1 kg/ 4 litros) num tampão tris 20 mM pH 7, seguindo-se uma precipitação à temperatura de 25°C após adição de heparina a 32 U/ml. A suspensão obtida é centrifugada, o resíduo (cerca de 1 Kg) é recuperado, depois reposto em solução num citrato trissódico 7θ mM - glicina 0,1 M -NaCl 0,03 M- ácido £ aminocaproico 5θ mM -674

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Mod. 71-10000 ex. -89/07

-arginina 5θ mM θ aprotinina 100 ϋ/ml de pH 8 (l kg/ll) Porcede-se então a um aquecimento líquido de 10 horas a 60°C após ter adicionado estabilizante de proteínas, a saber 2400 g de glucose e 600 g de sorbitol a 2 litros de solução para um volume final de cerca de 4 litros (tendo em conta a diluição devida à adição dos açucares). Após pasteurização a solução é diluida 10 ve zes no citrato 5 mM - Na Cl 0,051 M - ácido aminocaproico 25 mM - arginina 17 mM pHtf. A solução obtida é depois precipitada em álcool a 10$ a uma temperatura com preendida entre -2° e - 3°C. As proteínas precipitadas são recuperadas no resíduo da centrifugação. Este é em seguida reposto em solução no citrato trissódico 1 mM -NaCl 60 niM - ácido aminocaproico 20 mM - glicina 60 mM pH 7,5.

As proteínas são em seguida concentradas até ao valor de 27 - 30 g/l para um volume final de 1,5 1.

produto é em seguida repartido em frascos após filtração estéril e depois liofilizado. A concentração em pro teínas coaguláveis pode ser controlada em função do volume de reconstituição do produto liofilizado. O produto obtido apresenta, para um valor de proteínas de 110 g/l, 77 g/l de fibrinogénio coagulável, 12 g/l de fibromectina e um valor de aprotinina de 2000 KlU/ml (solvente utilizado para a reconstituição do produto liofilizado).

Claims

15. - Processo para a pasteurização de uma mistura de proteínas contendo principalmente fibrinogénio aquecendo a mistura nas condições que assegura a pasteu-762525

31.

fl /J ~ I rização caracterizado por a referida mistura ser pasteurizada na presença de um monossacárido e de um açúcar alcoólico.

2ô, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura não possuir praticamente ião cálcio.

3- . - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a mistura não possuir praticamen te inibidor da trombina.

4». - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mistura conter factor XIII plasmático.

5-· - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por a mistura de proteínas ser obtida a partir de um crioprecipitado de plasma humano posto em solução e precipitado na presença de heparina e por o precipitado obtido posto em solução constituir a mistura a pasteurizar.

6s. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado por a pasteurização ser conduzida na presença de glucose e sorbitol,

7-. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado por a pasteurização ser realizada a 60°C durante 10 horas ou em condições de pasteurização equivalentes.

8&. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por a quantidade de monossacárido

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Mod. 71 · 10000 ex. - 89/07 utilizada estar compreendida entre 1000 e l400 g a adicionar por litro de solução e a quantidade de açúcar alcoólico estar compreendido entre 200 e 400 g a adicionar por litro de solução.

9*. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por as quantidades de glucose e de sorbitol a adicionar por litro de solução serem respectivamente 1200 g/l e 300 g/l.

10*. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado por a precipitação na presença de heparina ser efectuada a uma temperatura da ordem dos 10 a 35°C.

11*. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado por o passo de pasteurização ser conduzido para concentrações de 40 a 70 g/l de proteínas ·

12*. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado por o precipitado antes da pasteurização conter outros agentes estabilizantes e inibidores da fibrinolise.

13*. - Processo para a preparação de cola para reunir os tecidos humano ou animal possuindo dois componentes:

a) uma mistura de proteínas extraídas do plasma humano contendo principalmente fibrinogénio e o factor.

XIII e,

b) trombina cálcica misturados extemporaneamente no momento da colagem ca racterizado por a mistura de proteínas contendo princi

-962525 /

// // palmente fibrinogénio e factor XIII ser pasteurizada pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 12,