JPS60184019A - Ａｈｆ調製における熱的な脱フイブリノーゲン法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は実質上フィブリノーゲンの無い抗鹿友病因子Ｃ
ＡＭＦ、第■成分、以下［ＡＨＦＪと称す＞ｍ細物の製
造方法に関する。ＡＨＦは血友病を持った患者への治療
的投与ζこ有用な血漿蛋白質である。

〈従来の技術〉 止血；血液凝固の生化学は、それに依って正常な全血及
び体組織が破れた血管からの過剰の血液の流出を防止す
る極めて複雑なそして未だ完全には理解されるに至って
いない現象である。血液凝固の全体的機構は三つの基本
生理系、即ち血管外組織例えば皮下組織、筋肉組織、及
び皮膚；血管壁：及び血漿蛋白質、血漿因子、及び血小
板を含めた血管白成分、に含有される生化学的物質の協
奏相互作用の影響を受けている。遥かに最も大切ではめ
るが、最も未だ解明されていないのが血管内皿液成分に
伴う凝固に影響を与える生化学的機構である。

人間の殆んどの血液凝固関連疾病は、通常一種又は二種
以上の血漿因子の欠陥あるいは不活性化に起因して、血
管内面液系で起るので、血液凝固の生化学的機構におけ
る血漿因子が果す役割を解明する企図で科学的研究によ
ってこの方向で大きな努力が傾注されて来た。近年、血
液凝固の複雑性を理解するために多くの進歩がめったが
、人類が最終的に、血液凝固関連の疾患を効果的に改善
するための元号な知識を得る迄には、さらに多年の骨の
折れる努力が必要でろろう。それまでの量線、殆んどの
血液凝固関連疾患の治療憂こ関する技術の形態は、これ
らの疾患の有害な影響を免かれさすためでの治療用製薬
学的及び生化学的物質の投与が続けられるであろう。

血液凝固関連疾患に関する沢山の医学的研究は、それ以
外は正常である全血の凝固能喪失を特徴とする遺伝的に
誘発される疾患、血友病の許容し得る治療法の発見に向
けられていた。血友病の正確な原因は未だ知られていな
いが、最も普遍的な学説の一つは、全血からＡＨＦが欠
けているか、めるいはそれ以外は正常な血漿中のＡｌ１
ＦＬ７）活性な形態が大巾に阻害され１任在しているこ
とが原因であると示唆している。現在、血友病は全治出
来ないが、しばしばＡＨＦが欠乏した個体へのＡＩＩＦ
の投与ζこ依って治療上は処置出来る。

正常及び健康な供血渚から１４）られた血液から誘導さ
れるＡＩＩＦは全血わるいは血漿の輪注により、るるい
は血漿あるいは正常な人の全血から抽出されたＡＩＩＦ
血漿蛋白質濃縮物の注入によって投与される。然し、こ
れらの方法は下文で明かとなる様に、しばしば治療上不
満足で多ることが判明した。

血友病の経本１１のために全血あるいは血漿輸注を行う
時は、ＡＩＩＦの生理的活性は正常条件下での保存では
極めて不安定なので、かなり新鮮な血液あるいは血漿を
選び出すのに深い注意を払わねばならぬ。実験室的方法
例えば凍結乾燥及び凍結保存でも、長時ｆＵＪｔこわた
るＡＨＦの生理的活性の実質的減少を防止出来ないでめ
ろう。全血あるいは血漿の輸注の第二の主要欠点は、そ
れが好ましからさる蛋白ηの及び非蛋白質の物質を受皿
者の血流に２Ｊ）大して、しばしば敏感な患者にアレル
ギー反応、ウィルス感染例えば肝炎、あるいは凝固を起
させるための多量のＡ　Ｉｉ　Ｆを必要とする渚に血液
増加症反応を起させることである。

第三の治療方法、即ちＡ　ＩＩ　Ｆ血漿＠絹物の静脈（
ｉ、ｖ、）投与が現在床机に使用されている。これらの
濃縮物は全血又は血漿輸注によって惹起される面述の面
倒な及びしばしば危険な副作用を主として回避するため
に開発されている。

本質上、ＡＨＦ血漿濃縮物は、それからいくつかの血漿
蛋白質、例えばガンマー−グロブリン、最大のその他の
血漿因子、及び無機化学薬品が取り除かれているＡＨＦ
に冨む血漿抽出物として特徴付けられる。然し、現在入
手可能なＡＨＦｌこ冨む血筑儂細物でも不純物を含む可
能性があり、人知に投与すると有害な作用を起すことか
める、従ってよりｉ４Ｉ粋な、より治療上許容し得るＡ
ＨＦ１％絹物への要求がなおも存在する。

より治療上ｆｒ容し得るＡＨＦ生成物の開発で特Ｉこ重
要な点はＡＨＦ血漿濃縮物からフィブリノーゲンの除去
に向けられたイυ究である。Ａ　ＩＩ　Ｆ生成物に含有
されるフィブリノーゲンは、患者の血？に’沖への必須
の凝血因子を放出する血小板の（職能を妨害するその傾
向から特別に許容出来ない不純物である。正確な機構は
未だ包括的に決定されていないが、フィブリノーゲンが
血小板の細胞膜を被榎して、凝血因子の血小板からその
膜を通過して血漿中への通過を妨げると現在考えられて
いる。

Ａ　Ｉｉ　Ｆ’血漿濃縮物中のフィブリノーゲン不純物
の存在によって起る第二の欠点は反覆して及び長期にわ
たるフィブリノーゲンに富むＡＨＦ血漿濃縮物の注入を
受けている多くの患者に強い抗原拒否応答を発現させる
フィブリノーゲンの傾向でるる、ＡＨＦ血漿濃縮物に含
有されたフィブリノーゲンの反覆した多量の投与量は抗
原応答をひき起して、ＡＨＦか分離されて投与されてい
る時には普通起る’ｉ’ｉＪ能件の無い、ＡＨＦ血漿濃
縮物中の他の蛋白質例えばＡｌ１Ｆ自身に対して患者が
過敏性ζこなる。一度、抗−ＡＨＦ抗原が患者の身体に
形成されると、ＡＨＦの更なる治療的投与はききめが少
くなる。

ＡＨＦ及びフィブリノーゲンの類似した物理的及び化学
的特性のために標準的な蛋白質分離操作法、例えば電気
泳動、クロマトグラフィー、及び溶解度微分Ｃ５ｏｌｕ
ｂｉｌｉ−１ｙ　ｄｉｆｆｇｒｍｎｔｉａｌｓ）は二つ
の蛋白質を鋭く分割して治療上許容し得るフィブリノー
ゲンの無いＡＨＦ生成物を製造するのに役立たない。従
って、それに依ってフイプリノーゲンの無い高い生物学
的活性のＡＨＦｍ漿濃血漿を高′Ｍ度のフィブリノーゲ
ン’ｉ：Ｍ有する生物的試料から訪導出来る方法に対す
る要望が存在する。

本ゆ４ＩｗＢ￥ｉｌ中で使用する用語＠寒冷型沈殿物（
Ｃｒｙｏｐｒ−ｅｃｉｐｉｔａｔｔｔ）″は凍結したヒ
トの血漿を０℃±１℃で融解し且つ液相を除いた結果と
して得られるヒトの漉漿の固相フラクションを指すもの
とする。この固体フラクションはその一次成分として、
ＡＨＦ、　フィブリノーゲン、及び様々の寒冷不溶性グ
ロブリン蛋白質類を含有する。

く本発明の特徴〉 不発明は、ＡＨＦの生物学的活性を目立って損うこと無
く、寒冷型沈殿物のフィブリノーゲン及び寒冷不溶性成
分からＡＨＦを実質上抽出出来る方法を見出したことに
基づく。

より特には、本発明は、寒冷型沈殿物中のフィブリノー
ゲン成分を急速加熱及び冷却工程によって変性し、且つ
寒冷沈殿物中のＡＨＦ成分から抽出する方法でのる。沈
殿ｌこよって、寒冷型沈殿物中の変性フィブリノーゲン
成分を除去すると、得られる上澄み液は治療用の品質の
、実質上フィブリノーゲンの無い、高いＡＨＦ生物学的
活性のＡＩＩＦの上及び下限の温度範囲内でだけその生
物学的活性あるいは機能する能力を保持しているという
事実に基づいている。

蛋白質の温度がその上の温度限界を越えると、その−次
、二次及び三次の立体化学的配置が変化し始める。変化
が恒久的となり、すべての生物学的活性が失なわれた時
、蛋白質は変性されたと言われる。

本発明は、 ａ）融解した寒冷型沈殿物を低モル濃度の緩衝溶液に懸
濁させ； ｂ）肩淘散の説匣を５０乃至５５℃に急上昇させ；ｃ）
　Ｍ濁液の温度を１．５±０．５分間その温度に保持し
て二相懸濁液とし； ｄ）二相懸濁液の温度を約１０−１５℃の温度に急冷し
；ｅ）約１０−１５℃４Ｃ於て二相懸濁液を遠心分離し
、且つ ｆ）ＡＩＩＦを含有する上澄み液を回収するＭｆ工程よ
り成る、その−次成分としてＡＨＦ及びフィブリノーゲ
ンを含むガ冷型沈殿物からの実質上フィブリノーゲンの
無いＡ　Ｉｆ　Ｆ生成物の製造方法に関する。

Ａ　ＩＩ　Ｆζこ富む上澄み液は次に凍結し、更に濃縮
、あるいは凍結乾燥し１も良い。

〈発明の６）玉ｉ１：ｌｌｌな記載〉 殆んどの血漿蛋白質は狭い温度範囲で質性される。その
−次成分として二種の球状蛋白質ＡＨＦ及びフィブリノ
ーゲンを含有する寒冷型沈殿物を、特定された時間の間
、特定の温度サイクル下に置くと、フィブリノーゲンが
ＡＩＩＦよりもより急速な速度で際立って変性される事
が見出された。従って、選択的変性及び寒冷型沈殿物か
らの固体フィブリノーゲンの除去に依りてその当初の生
物学的活性を殆んどそのま＼有するＡＨＦに冨む生成物
を得ることが出来る。

本発明の原料物質Ｕ凍結した寒冷型沈殿物でめり、次に
これを融解して低モル濃度の緩衝液中をこ懸濁させ、そ
して溶液のｐＨを６．４と７．５の間に関節する。融解
した寒冷型沈殿物は低モル濃度の緩衝液中に懸濁させて
、極めて不安定なＡＨＦ及びフィブリノーゲンの過剰の
失活を防止する。

か＼る緩衝溶液は低モルの生理的緩衝液例えばイミダゾ
ール、燐酸ナトリウム、ヘペス［ｈａｐａ８１Ｎ−２−
ヒドロキジエチルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスル
ホン酸の略称３重炭酸アンモニウム、Ｅ　Ａ　ＣＡ、グ
リシンあるいはトリス（ｔｒｉｓ＋　）リス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタンの略称〕より成る、しかし様り
のその他の同様な作用をする生理的緩衝剤が有効で少る
ことが明かとなっている。緩衝溶液の付加成分は低モル
の生理的塩例えば蛋白質の凝集反応を防止するためのＮ
ａＣ７１、低モルの生理的抗凝固因子例えば過剰のナト
リウム・イオンを吸収し従ってフィブリノ−ゲンの凝固
を妨げ、そして水素の無い水を稀釈剤として作用させる
クエン酸ナトリウムより成るでろろう。

変性工程に入る前に、必須ではないが、色々の精製工程
で寒冷型沈殿物中に含まれた痕跡の蛋白質の多くを除去
するのがしばしば好ましい。か＼る方法の一つは血液の
第■、■及びＸ因子及びトロンボプラスチンの水酸化ア
ルミニウム・ゲル上への吸着である。緩衝化合物が厚生
当局の認可されたものでめり、イオン強度が許容出来る
ものであれば再懸濁緩衝液の実用特性は臨界的では無い
。

はｙ室温のｌｌＷ！濁させた寒冷型沈殿物を適当な容器
に入れて、５０℃の最低温度以上に保たれている温度調
節器制御の加熱装置、例えば水浴に浸す。懸濁させた寒
冷型沈殿物の温度は一瞬だっと５５℃を越えさせるべき
では無い。何故なら懸濁させた寒冷型沈殿物に含有され
たＡｌ１Ｆは５５℃を越える温度で急速にその生物学的
活性を失うからである。ＡＨＦ及びフィブリノーゲンの
物理的特性が本発明の加熱サイクルの温度及び時間因子
を決定する。懸濁した寒冷を沈殿物の温度が５０℃より
下であれば、ＡＨＦ及びフィブリノーゲンは短時間にそ
の生物学的活性を失９ことは無い。懸濁した寒冷型沈殿
物の温度が５０℃を越えて増加するのにつれて、フィブ
リノーゲン及びＡＨＦはいずれも次第により速い速度で
その生物学的活性を失い始め；フィブリノーゲンの失活
速度はＡＨＦよりも逼かに大きい。

５５℃より高い温ｒｘではＡＩＩＦとフィブリノーゲン
の両方が急激ｔこ失活する。

加熱時に容器をゆり動かし且つ内容物を撹拌することに
依って寒冷型沈殿物の内でより均一な温度勾配を維持す
ること力市」能である。寒冷型沈殿物懸濁液の温度範囲
を５０℃と５５℃との間に１．５±０．５分間維持した
時には、寒冷型沈殿物に含まれる実質上すべてのフィブ
リノーゲンを失活させながら、寒冷型沈殿物ζこざまれ
るＡＨＦの実質量の生物学的活性を保持し続けることが
出来ることが見出された。

サイクルの加熱損の児了時をこ懸濁ＷＬは二相）１靜濁
敵となる：即ち固相及び液相。固相は変性されたフィブ
リノーゲン、苅十の変性されたＡｌ１Ｆ及び他の変性蛋
白質を営む。液相は生物学曲に活性なＡＨＦ、少量の未
変性フィブリノーゲン、及び多種の寒冷不活性球状蛋白
質類を含む。この二相寒冷型沈殿物懸濁液を即刻、温度
調節器で制御されている冷却装置、例えば氷浴に浸して
迅速に、好ましくは１分以内ｌこ、４０℃に冷す６懸濁
液の冷却はその温度が１０℃乃至１５℃となる迄続行す
る。１０から１５℃の温度範囲に到達する時間は、好ま
しくは１０分以下でめるべきでろる。

サイクルの冷却相では液相から殊冷不溶性蛋白質の集合
（凝集）及び沈殿が認められ、それに依って更に液相中
のＡＨＦの比活性を増加させる。集合（凝集）と沈殿は
！／ｉｔｌ液のゆるやかな撹拌によって促進出来る。

二相の寒冷型沈殿物懸濁液は次に約１２，０ＯＯＧ（但
しＧは重力加速度である）　（１ｏ、ｏｏｏｒｐｍ）で
約２０分間遠心分離して、固及び液相をはっきりと分離
させる。同相は今や、主として変性されたフィブリノー
ゲン及び寒冷不溶性球状蛋白質より成る。液体の上澄み
は主としてＡＨＦ及び痕跡量のフィブリノーゲンより成
る。ＡＨＦに冨む上澄み液をこの時点で凍結乾燥して治
療用の品質の生成物を製造することが出来る。

凍結乾燥に先立って、ＡＩＩＦに富む上澄み液を多くの
標準的な実験室的方法により更に処理して、より純粋な
製品を製造しても良い。か＼る方法の一つ、限外濾過濃
縮が特に有効であることが判明している。限外濾過は当
業界で認められている方法を使用して達成出来る。例え
ば限外濾過は、アミコン（Ａｒｎ、１ｃｏｎ）モデル５
２ｔ＋を拌セルを用いＸＭ３００あるいはＰＨ１０膜を
通して室温で５−１θポンドの窒素（圧）下で、上澄み
液をＦ遇することに依って達成出来る。限外濾過の次に
、限外濾過した生成物を一７０℃で１２時間ニュー・ブ
ルンスウイック（Ｎｅｗ　Ｂｒｒｂｎｓｗｉ−ｃｋ）凍
結乾燥器で凍結乾燥しても良い。

本発明の方法を更に例示するためにプロセスの作業系統
図を次に示す。

作業系統 ０．０５Ｍグリシン に寒冷型沈殿物を再懸濁 連続的に、激しく撹拌しつつ急速加熱、−試料を５０℃
以上に１．５±０．５分加温 試料を１０℃をこ急冷して３０分おき、熱により除去用
清澄化、減菌濾過、びん詰め ↓ ｉ東結乾燥−当初容積の％−％に再構成最終生成物：　
３Ｏ−５０Ｕ／ｄ　ＡＨＦ活性０−１０３１１４固可能
蛋白質 比活性　ＩＵ／〜 次の実施例で更に本発明を例示する。

実施例り 融解した低温型沈殿物を０．０１モルのグリシン緩衝液
を用いて緩衝し、ＡＩ（ＯＨ）ｓを用いて清澄化し一７
０℃で１２時間凍結乾燥した。水素の無い水で再構成し
、１０ｍ１！の試料を２６０分間、その温度が５７．３
℃に保たれている水浴中で加熱した。最高試料温度は５
５℃でめった。試料を５０℃以上に２．０分保った。試
料を即刻５℃に保たれた水浴中で冷却した。

変性されたフィブリノーゲン及び寒冷不溶性蛋白質類を
１２．０００　Ｇで２０分間遠心分離した。デカンテー
ション後、上澄み液をモデル５２の撹拌セルを用℃・て
ＸＭ３００膜で限外濾過した。限外濾過生成物を一７０
℃で５時間ニュ・ブルンスウイツク凍結乾燥器で凍結乾
燥した。

実施例２ 融解した寒冷型沈殿物を０．０１モルのグリシン緩衝液
を用いて緩衝し、ＡＪ（Ｏｆｆ）、を用いて清澄化し、
そして−７０℃で１２時間凍結乾燥した。水素の無い水
で再措成し、１０＋＋＋／の試料をその温度が５７℃の
水浴中で２．０分間加熱した。試料は５０℃以上憂こ０
．５８分間保持された。次に試料を１０℃に保たれた水
浴中で３０分間冷却した。

変性されたフィブリノーゲン及び寒冷不溶性蛋白質類を
１２．０００Ｇで２０分間の遠心分離によって分離した
。デカンテーションして後、上澄み液をモデル５２の撹
拌セルを用いて、ＹＭ３００膜で限外濾過した。限外濾
過生成物をニュー・プルンスウィック保結乾燥器で一７
０℃て１５時間凍結乾燥した。

実施例ａ ｌＯ−の寒冷型沈殿物試料を０．０１モルのグリシン緩
衝液中に懸濁させて、一定の５６℃に保たれている水浴
中に浸した。寒冷型沈殿物の温度は５０℃から５５℃の
間に１．５分間保った。試料の平均温度は５４．６℃で
あった。試料を１０℃の水浴中で２０分間冷却した。変
性させたフィブリノーゲン及び寒冷不溶性蛋白質類を１
２，０ＯＯＧで２０分間の遠心分離を用いて分離した。

デカンテーションして後、上澄み液をモデル５２の撹拌
セルを用いてＸＭ３００膜で限外濾過した。限外濾過生
成物をニュー・プルンスウイツク凍結乾燥器で一７０℃
で１５時間凍結乾燥した。

本発明によって、これら及びその他の試料によって調製
された生成物社以下の検定方法によって試験された。

ＡＨＦ固有活性の測定は、正常血漿対照中に含有される
トロンビンの凝固時間とＡＨＦに富む生成物を添加した
同−血漿試料中のトロンビンの相対凝固時間の検定に基
づいテイル。この試験方法はブロクターＣＰｒｏｃｔｏ
ｒ）によってザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・ケミ
カル・バトロジ−（ｔｈｅ　Ａｒｎｇｒｉｃａｎ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｅｒｎｉｃａｌ　Ｐα−ｔｈｏ
ｌｏｇｙ　）第３６巻第２１２−２１９頁（１９６１年
）に詳記されている。Ａ　Ｉｉ　Ｆ生成物中のフィブリ
ノーゲン含量はＤＡＤＥ　ＤＡ’ｌ’Ａ−Ｆｌ　フィブ
リノーゲン測定キットを用いてトロンビン凝固時間によ
つ１測定する。この実験は、正常なフィブリノーゲン含
有血漿試料と本発明の生成物を添加した同一の血漿試料
の相対フィブリノーゲン凝固時間を測定する。この試験
方法はクララム（Ｃ１ａｕｓｓ）によってアクタ・ヘマ
トロギア（ＡＣ７’Ａ　ｆｌａｇ咽ｔｏＬｏｇｉα）第
１７巻第２３７頁（１９５７年）に記載されている。

Ａ　Ｉｉ　Ｆ力価回収の代衣的な結果を衣１に示す。

底　１ １　５８．０　８．７５　５６．０　４２２　５７．３
　３．０５　５６．０　９５３　５７．０　０．５８　
５３．０　１００４　５７．５　１．６０　５４．８　
７８５　５６．５　１．３０　５４．０　８０６　５６
．８　１．４２　５４．２　８３７　５６．５　１．３
０　５３．５　８４８　５６．０　１．３８　５３．４
　１００９　５７．０　１．４３　５４．３　８４１０
　５５．５　０．５５　５１．ＯＺｏ。

１１　５５．８　１．７０　５２．０　１００１２　５
６．５　２．１０　５５．０　１００試料の固有活ａ（
７１１Ｆ活性の単位／蛋白質ｍｙ）は約１．ＯＵ／ｒｒ
ｔｙでめり、一方最終生成物中のフィブリノーゲンで１
イｉり隻はＯ−０゜３　ｍ９　／　ｍｅあるいは原料物
質のフィブリノーゲン濃度のｏ−ｘｏｙ６であった。

出願　人　アーマ−ファーマシューテｌ）　Ａ／手続補
正書（方式） ％式％ １事件の表示 昭和６０年特許願第２２１２７号 事件との関係　特許出願人 名称　アーマ−ファーマシューテイカル　カンパニー４
代理人 赤坂大成ピル（電話５８２’−７１６１）願書に添付の
手書き明細書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｌα、融解した寒冷型沈殿物を低モル濃度の緩衝溶液に
   懸濁し； ｂ、懸濁液の温度を５０乃至５５℃に急上昇させ；Ｃ，
   Ｗｔ、濁液の温度を１．５±０．５分間その温度に保持
   して二相懸濁液とし； ｄ、二相懸濁液の温度を約１０−１５℃の温度に急冷し
   ；ｅ、約１０−１５℃ｌこ於て二相懸濁液を遠心分離し
   、且つ ／、ＡＨＦを含有する上澄み液を回収する諸工程より成
   る、その−次成分としてＡＨＦ及びフィブリノーゲンを
   含ｒｅ亦冷ＩＢ庁肘物吊）らの寥質トフィブリノーゲン
   の無いＡＨＦ生成物の製造方法。 ２　低モル濃度緩衝液中の１ＩＩｌ解した寒冷型沈殿物
   のｐＨを６．４−７．５に調節する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ａ　該低モル濃度緩衝液がグリシン溶液るるいはトリス
   溶液でるる特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
   。 屯　該低モル濃度緩衝液が更に塩化す）　ＩＪウムを含
   む特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の
   方法。 ５　該低モル濃度緩衝液が更にクエン酸ナトリウムを含
   む特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の
   方法。 Ｇ　低モル濃度緩衝液中の寒冷型沈殿物の懸濁液を、ｂ
   及びＣの加熱工程の間、かきまぜる特許請求の範囲第１
   項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 Ｌ　工程Ｃの二相懸濁液を１分以内に４０℃に冷却し且
   つ更に、１０−１５℃への冷却を１０分以内で達成する
   特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の方
   法。 ＆　二相懸濁液の該遠心分離を約１２．０００Ｇ（重力
   加速度）で約２０分間実施する特許請求の範囲第１項乃
   至第７項のいずれかに記載の方法。 ａ　ＡＨＦを廿む上澄み液を凍結乾燥、上澄み液を限外
   濾過、あるいは限外濾過した上澄み液を凍結乾燥する付
   加工程を含む特許請求の範囲第１項乃至第８項のいずれ
   かに記載の方法。 Ｉｎ６．凍結した寒冷型沈殿物を融解し、且つそれをイ
   ミダゾール、燐酸ナトリウム、ヘペス、重炭酸アンモニ
   ウム、グリシン、あるいはトリスから選ばれた低モル濃
   度緩衝溶液中に懸濁し： ｂ、該寒冷型沈殿物含有緩衝溶液のｐＨを６．４−７・
   ５に調節し： Ｃ０該懸濁液の温度を５０乃至５５℃に急上昇させ：ｄ
   、１．５±０．５分間懸濁液をその温度に保持して二相
   懸濁液とし； 一０二相懸濁液％１０−１５℃に急冷し；ｆ、二相懸濁
   液を１０−１５℃に於て約１２，０ＯＯＧ（重力加速度
   ）で遠心分離してフィブリノーゲンを含む沈殿を分離し
   ； Ｑ、ＡＨＦを含む上澄み液をデカンテーションし；ｈ、
   該上澄み液を１Ｍ３００膜で限外濾過し：ｉ、且つ限外
   濾過した上澄み液を一７０℃で１５時間凍結乾燥する諸
   工程から成る、その−次成分としてＡＨＦ及びフィブリ
   ノーゲンを含む寒冷型沈殿物からの実質上フィブリノー
   ゲンの無いＡＨＦ生成物の製造方法。