PL166579B1 - Kompozycja do stabilizacji osocza krwi podczas pasteryzacji PL - Google Patents

Abstract

1 . Kompozycja do stabilizacji osocza krwi podczas pasteryzacji, znamienna tym, ze stanowi mieszanine zawierajaca 500-800 g/litr sorbitolu, 100-1000 U/litr heparyny, 3-5 mM chlorku wapniowego i 1-10 g/litr lizyny, w stosunku do osocza. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do stabilizacji osocza krwi podczas pasteryzacji w sposób pasteryzacji osocza przy użycmu Sej kompozycji. Otrzymane w Sen sposób roztwory osocza są przeznaczone szczególnie do terapii przez wymianę osocza w czynników krzepnięcia krwm V, XI W XIII.

Pełnego osocza ludzkiego lub osocza ludzkiego wolnego od krwoproteWy nadal używa swę w leczeniu osób ciężko poparzonych i tych, którzy doznali poważnych urazów lub przeszli poważne zabiegi chirurgiczne tj. we wszystkich przypadkach, w których pacjenci doznali znaczącej utraty płynów.

Do leczenia tego typu na ogół stosuje się osocze pojedynczych dawców pochodzące od zdrowych osobników, którzy przeszli uprzednio test dla wykluczenia wszelkiego ryzyka przeniesienia chorób wirusowych. Procedura ta jednakże nwe zapewnia całkowitego bezpieczeństwa W może narazić pacjenta na ryzyko zakażenia wirusami w stadium wcześniejszym nwż jest możliwe ich wykrycie metodami serologwoznymW, szczególnie różnymi wirusami zapalenia wątroby w wirusem wywołującym AIDS.

Korzystne byłoby zatem opracowanie sposobu Wnaktnaaojw wirusów, który nwe wpływałby na różne funkcje biologiczne osocza.

Wyraźnie wykazano, że wirus zapalenia wątroby typy B ulegał całkowitej ^aktywacji w wyniku ogrzewania w ciągu 10 godzin w temperaturze 60°C w obecności 0,5 M cytrynianu sodowego /Tabor w wn., Thrtmbtowo Res. 22, 1981, 233-238/. Jednakże takie traktowanie prowadzi do utraty aktywności biologicznej pewnych białek osocza /Tabor W Wn., oraz Barrowoliffi w in. Ft.J.HnemoSology 55, 1983, 37-46/.

Możliwe jest poddawanie różnych białek wartościowych leczniczo, oczyszczonych z osocza krwi konwencjonalnej pasteryzacji w temperaturze 60°C w ciągu 10 godzin w obecności różnych stabilizatorów. Zauważono jednakże, że cząsteczki stabWlWzujące jedną aktywność biologiczną, mogą być całkowicie pozbawione wpływu na inną.

Na przykład, albuminę można stabilizować aoeSnlotΓyptfryetn lub kaptnlanem /Gellis i in., J.Clin.InveoS. 27, 1948, 239-244/, podczas gdy stabilizatory te nie mają żadnego wpływu na plazmmntgen. Trombinę można stabilizować wysokimi stężeniami cukrów /Seegers, Arch.Blochem. 3, 1944, 363-367/, podczas gdy nie chronią one protrombiny. Dodanie aminokwasu i cukru daje dobre wyniki dla czynnika VIII i anty^on^Wny III / patrz opis patentowy DE 29 16 711/.

W europejskim opisie patentowym numer 0 035 204 wykazano stabilizację αntntrnpsnnn α , nntnSttmbiyn III, ptekallikteiny, ^bronek^ny W czynnika VIII w obecności po/Wo/u, którego Jedynym przykładem była sacharoza: wskazano Jednakże, że w tych samych warunkach, czynnik IX W prekallikreWna tracą całkowicie aktywność leczniczą.

166 579

Te różne dane doświadczalne potwierdzają ogólnie akceptowaną koncepcją, że inaktywacji wirusów pełnego osocza /świeżego osocza, mrożonego świeżego osocza lub supernatantu krioprecypitatu/ nie można uzyskać przez pasteryzację.

Ponieważ ciągle występuje w medycynie zapotrzebowanie na pełne osocze, usiłowano opracować kompozycję zapewniającą jednoczesną ochronę aktywności biologicznej wszystkich czynników leczniczych będących przedmiotem zainteresowania przed denaturacją podczas pasteryzacji.

Zaobserwowano, że sorbitol daje pewien stopień ochrony przed denaturacją termiczną, ale z wynikami zróżnicowanymi dla różnych próbek osocza i z niskimi wydajnościami, więc poszukiwano różnych dodatków mieszaniny, które z sorbitolem podwyższałyby jego siłę stabilizującą.

Kompozycja według wynalazku stanowi mieszaninę zawierającą 500-800 g/litr sorbitolu, 100-1000 U/litr heparyny, 3-5 mM chlorku wapnia i 1-10 g/litr lizyny w stosunku do osocza. Stężenia różnych składników doprowadza się więc do otrzymania wymaganego stężenia w osoczu, które następnie poddawane jest pasteryzacji. Stężenia te wynoszą:

- 50 do 80% sorbitolu, a korzystnie 60%,

- 0,1 do 1 U/ml heparyny, a korzystnie 0,5 U/ml

- 1 do 10 g/litr lizyny, a korzystnie 4 g/litr,

- 3 do 5 mM CaClj, a korzystnie 4 mM.

Kompozycję według wynalazku dodaje się do świeżego osocza lub zamrożonego-rozmrożonego świeżego osocza, bądź do osocza wolnego od białek krioprecypitatu, przed przeprowadzeniem pasteryzacji przez ogrzewanie w temperaturze 60°C /±1°C/ w ciągu 10 godzin.

Po pasteryzacji temperaturę obniża się stopniowo do temperatury 20°C i roztwór dializuje się w celu usunięcia sorbitolu i heparyny. Bufor dializacyjny ma wartość pH 7 i zawiera cytrynian sodowy o stężeniu pomiędzy 4 a 10 mM, 4 mM chlorku wapniowego, 0,13 M chlorku sodowego i lizynę o stężeniu 4 g/litr. Można także stosować bufory dializacyjne o różnych składach, zgodnie z wymaganiami. Roztwór zatęża się następnie w celu przywrócenia fizjologicznej ilości białek osocza. Powstały roztwór sterylizuje się przez sączenie, dzieli, a następnie zamraża lub liofilizuje.

Przedmiotem wynalazku Jest także sposób pasteryzacji osocza, który polega na dodaniu kompozycji do stabilizacji według wynalazku do osocza przed etapem ogrzewania a następnie usunięciu przez dializę pasteryzowanego osocza wobec buforu.

Sposób ten jest szczególnie korzystny, ponieważ można go stosować do dużych partii osocza otrzymanego z kilku różnych pobrań. Bardzej szczegółowo, pasteryzując partie 100 do 200 litrów lub więcej można, po przeprowadzeniu odpowiednich testów, zagwarantować, że partie mają odpowiednią jakość.

Ponadto, partie osocza pasteryzowanego z zastosowaniem sposobu według wynalazku, mogą także służyć jako produkty w leczeniu przez wymianę pacjentów posiadających niedobory czynników krzepnięcia, których nie ma w postaci oczyszczonych koncentratów, takich jak czynnik V, czynnik XI lub czynnik XIII.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się zatem pasteryzowane roztwory osocza, które są przeznaczone zwłaszcza z jednej strony do leczenia niedoborów czynników krzepnięcia czynników krzepnięcia V, XI i XIII oraz, z drugiej strony, do leczenia przez wymianę, wymagającego pełnego osocza lub supernatantu krioprecypitatu.

Następujący przykład ilustruje wynalazek.

Przykład. 0o dwóch litrów rozmrożonego osocza dodaje się heparynę /1000 U/, lizynę /8 g/ i chlorek wapniowy /220 mg/. Te dwa produkty dodaje się jako sole w postaci proszku, mieszając delikatnie osocze. Następnie wlewa się stopniowo 1200 g nierozcieńczonego sorbitolu.

Pasteryzację prowadzi się w odbieralniku o objętości 5 litrów przez ogrzewanie w temperaturze 60°C w ciągu 10 godzin, stosując łaźnię wodną lub w termostatowanym zbiorniku. Po pasteryzacji sorbitol i heparynę usuwa się przez dializę za pomocą sztucznej nerki lub układu do ultrafiltracji, takiego jak kasetowy układ Pellicon, stosując bufor cytrynianowy zawierający lizynę o stężeniu 4 g/litr, 4 mM CaC^ i 0,13 M NaCl?* Po dializie można przeprowadzić zatężanie, stosując to samo wyposażenie w celu przywrócenia ilości czynników krzepnięcia do

166 579 około 1 U/litr, Jak w przypadku leczniczego osocza dobrej jakości. Produkt dializuje się przy osmolarności równej 370 mOsmoli/ litr i pH 7. Następnie produkt poddaje się sterylizacji przez sączenie, na przykład z zastosowaniem sączka 40 Millipack /Millipore/ z porami o średnicy 0,22 pm. Produkt umieszcza się w woreczkach plastikowych do zamrażania, lub w butelkach do liofilizacji.

Stabilizacja osocza w czasie pasteryzacji i ultrafiltracji przez dodanie chlorku wapnia, heparyny i lizyny czyni możliwym otrzymanie następujących wydajności, w stosunku do /wskazanego poniżej po słowie wobec/ produktu kontrolnego zawierającego tylko lizynę i sorbitol:

czynnik VIIIc czynnik Vc czynnik VCCc czynnik ICc fibrynogen zdolny do koagulacji czynnik CCCC

87% wobec 66% 77% wobec 35% 55% wobec 52% 60% wobec 49%

81% wobec 57% 77% wobec 71%.

Nie obserwowano żadnych oznak aktywacji czynników krzeeniącia w obecności tj ilości w^^p— nia. A zatem, stosunek bydlęcego czynnika CCC/koagulacyjnego czynnika CCC wynosi 0,95 wobec 1,09 dla produktu kontrolnego. Stabilność, testowana przez monitorowanie aktywności czynnika CCCC po konserwacji produktu w ciągu 24 godzin w stanie ciekłym i w temperaturze otoczenia nie podlega ujemnemu wpływowi w porównaniu z próbką kontrolną /odzysk 100% aktywności/. Jest to zgodne ze stosunkiem PKA<2% dla produktów pasteryzowanego i kontrolnego.

Ponadto, testy na szczurach, poprzez iniekcję dożylną tak pasteryzowanego osocza wskazują na brak wpływu podwyższającego ciśnienie krwi i nie wykazują żadnych zmian rytmu serca.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1(00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Kompozycja do stabilizacji osocza krwi podczas pasteryzacji, znamienna tym, że stanowi mieszaninę zawierającą 500-800 g/lWtr sorbitolu, 100-1000 U/litr heparyny, 3-5 mM chlorku wapniowego i lii0 //ittr lżyjmy , w stounnUu oo osocza.
2. 2. Kompozycja eddłuo zssI^zz . I .znamienna tym .że zawiera 600 g/litr sorbtoouu.
3. 3. Kompozycja eddłu o astrzu . I .znamienna tym . źe zawiera 500 U/litr hepayyyu.
4. 4. Ktmopzyojα według asstrz. I, znaminnna yym, że zawirra 4 mOchlorku wapniowego.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera 4 g/litr lizyny.
6. 6. Sposób pasteryzacji osocza krwi polegający na zastosowaniu kompozycji do stabilizacji przed etapem ogrzewania a następnie usunięciu jej przez dializę, znamienny tym, że do osocza dodaje się kompozycję stanowiącą mieszaninę zawierającą 500-800 g/litr sorbitolu, 100-1000 U/litr heparyny, 3-5 mM chlorku wapniowego i 1-10 g/litr lizyny.

   * * *