JPH07507554A - 新規ペプチドおよびタンパク質，それらの調製方法，ならびにコレステロール受容体としてのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 新規ペプチドおよびタンパク質、それらの調製方法、ならびにコレステロール受 容体としてのそれらの使用 本発明は、新規ペプチドおよび新規タンパク質、それらの調製方法、ならびにコ レステロール受容体としてのそれらの使用に関する。

特に、アテローム性動脈硬化症、および冠動脈性心臓病のようなその付随する併 発症は、今日、最も普遍的で、危急の健康問題になっている。

多数の危険因子が、“未熟な”アテローム性動脈硬化症の進行に関与しており、 最も重要なこれらの一つは、血漿コレステロールの上昇である。

コレステロールが、心臓病の発症に働いていると思える重大な役割の故に、人体 におけるその代謝の研究に多くの注目が、払われてきた。

アポリポタンパク質の主要な機能は、血漿中のコレステロール、リン脂質および トリグリセリドを含む脂質を担持し、これらの脂質を種々の細胞に送達すること である（Ｐｏｗｎａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７；　Ｋｏｖａｎｅｎ　ｅｔ 　ａｌ、。

１９９０）。これらの脂質−アポリポタンパク質複合体は、様々な種類の血漿リ ポタンパク質を構成する。比較的小さい水溶性アポリポタンパク質の多くは、高 いα−へソックス含量を有し、高度の相同性をもつ数個の両親媒性セグメントを 含む（Ｄｅ　Ｌｏｏｆ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７：　Ｂｒａｓｓｅｕｒ　ｅｔ 　ａｌ、。

１９９０）。低密度リポタンパク質は、抹梢細胞にコレステロールを送達するこ とに関与しくＢｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６：　Ｇｉａｎｔｕｒｃｏ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）、一方、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、抹梢 組織から過剰のコレステロールを肝臓に輸送する“逆コレステロール輸送”のた めに必要である。ＨＤＬを肝臓へ向かわせることを説明するために、いくつかの メヵニズムが提出されてきた。これらのメカニズムは、アポＥに富んだＨＤＬｌ の取り込み、ＨＤＬ３への肝臓リパーゼの酵素作用後のＨＤＬ２の直接取り込み 、ならびにコレステリルエステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）の作用下でリポタ ンパク質を含むアポＢへのＨＤＬ２からのコレステリルエステルの転移を包含す る。レシチンコレステロールアシル・トランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）およびリ ポタンパク質リパーゼ（Ｌ　Ｐ　Ｌ）は、形成過程の円盤状ＨＤＬの、ならびに 抹梢細胞由来のコレステロールの受容体として働く小ＨＤＬ３粒子の、より大き いＨＤＬ２への変換において主要な役割を演じる酵素である（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７）。

これらは、さらに異化をうけて、その結果、肝臓へのコレステロールの流量を管 理する。ＨＤＬの主要なアポタンパク質成分を表すアポＡｌは、これらの過程に 関わる主要なアポタンパク質であることが、今では証明されティる（Ｄｅｌａｍ ａｔｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）。

主として長さ１８−２２残基の合成ペプチドが、アポリポリン脂質−タンパク質 複合体におけるヘリックス−脂質相互作用の研究のためのモデルとして使用され てきた（Ｓｐａｒｒｏｗ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｏ、　１９８１）。これらの両親媒 性ペプチドの配列は、アポＡ１．ＡＩＩもしくはＥのへリソクスのペプチドに匹 敵するか（Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）　、またはアポＡ ｌにおいて同定される種々のらせん反復に対する共通の配列を表す（Ｐｏｗｎａ ｌｌｅｔ　ａｌ、、　１９８０；＾ｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ、　１９８６） 　ｏこれらのペプチドおよび脂質−ペプチド複合体の性質は、広（研究され、天 然のアポリポタンパク質の性質と比較された（Ｓｅｇｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８３：　Ｓｅｇｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０）。

合成の１８残基ペプチドの脂質結合およびＬＣＡＴ活性化の性質と、天然のアポ リポタンパク質のそれらとの間に観察される差異は、脂質−ペプチド複合体にお ける単一ペプチド間の協同性の欠如によりものとされた（Ｆｕｋｕｓｈｉｌｌａ 　ｅｔ　ａｌ、、１９８０）。

次の配列： Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−＾１　ａ−Ｐｈｅ−Ｔｙ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｕ− ＬｙｓＪａ　１−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ凾刀|Ｇ　ｌ　ｕ −Ｌｅｕ−Ｐｈｅ は、Ｓｅｇｒｅｓｔのグループによって記された１８Ａペプチドから得られた（ ＾ｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ、　１９８６：　Ｓｅｇｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ、 、１９９０　）。

このペプチドは、両親媒性の脂質と会合するペプチドであるけれども、脂質を蓄 積した細胞からのコレステロールの流出を促進する能力に関しては、上記論文に おいて何も示されていない。Ｅｐａｎｄら（１９８９）は、式：％式％ をもつペプチドのＬＣＡＴ活性化および小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）溶解活性を記載 した。

本発明の目的は、新規のペプチドおよびタンパク質、ならびに過剰のコレステロ ールに対する受容体およびキャリアーとして働くそれらのリン脂質複合体、を提 供することである。

また、本発明の目的は、新規のペプチドおよびタンパク質、ならびにコレステロ ールの最大蓄積能およびレシチンコレステリルアシルトランスフェラーゼ（ＬＣ ＡＴ）酵素の最適基質能力を合わせ持ち、それによって抹梢細胞からのコレステ ロール流出を最大限肝臓に向けさせるそれらのリン脂質複合体を提供することで ある。

また、本発明の目的は、心臓血管障害の治療のために使用し、そしてより具体的 には、アテローム性動脈硬化病巣からコレステロールを除去するために役立つ薬 剤を提供することである。さらに、そのようなペプチドおよびタンパク質、なら びにそれらのリン脂質複合体は、ＨＤＬＩこツイテ既ニ報告されたようニ（Ｌｅ ｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９２）　、Ｌ　Ｐ　Ｓを結合することによって 、内毒素ショックの治療において使用することができる。

本発明は、ペプチド１８Ａの１個ないし数個のアミノ酸の置換、および／または ペプチド１８Ａの１個ないし数個のアミノ酸の欠失、および／またはペプチド１ ８Ａの１個ないし数個のアミノ酸の付加によって、ペプチド１８Ａから得られる ペプチドを含んでなるか、またはそのペプチドによって構成されるペプチドもし くはタンノ々り質に関するものであって、該ペプチドは、ペプチド１８Ａとは異 なるものであり、次の特徴を有する −それは、各ターン３６アミノ酸残基をもつ２〜８、好ましく（ま５ターン（ｔ ｕｒｎ）をもつαヘリックスの形でコイルをなし、−該ヘリックスの直１は、約 １３人〜約１６人、好ましくは約１５人であり、 一該ヘリノクスの二つの連続するターンを分ける距離は、約４人〜約６人、好ま しくは約５人であり、 −へリソクスの長さは、約１０人〜約３０人、好ましくは約２４人〜や２６人、 より好ましくは約２５人であり、−それは、両親媒性てあり、 一疎水性ｐｈｏ角の値は、約１２０°〜約１８０’、好ましく（よ約１４０’〜 約１８０°てあり、 一親水性ｐｈｉ角の値は、約１８０°〜杓２４０°、好ましく１ま約１８０°〜 約２２０°であり、 一該ペプチドは、 ＊位置４のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡｓｐであるか、＊および／または位置６ のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡｓｐであるか、 ＊および／または位置８のアミノ酸がＬｙｓもしくはＡｒｇであるか、 ＊および／または位置１１のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡｓｐであるか、 のいずれかである。

上記のすべてのパラメーター、すなわち、ターン数、アミノ酸残基数、ヘリック スの直径、二つの連続するターン間の距離およびヘリックスの長さは、Ｂｒａｓ ｓｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）により記載された理論的計算方法によっ て決定することができる。

ヘリックスの長さは、形成されるターンの数に依存する。ヘリックスが５ターン を含む場合には、その長さは普通は２４人と２６人の間である。

疎水性ｐｈｏ角は、次のように決定される：ヘリックスのエドマンドソン（Ｅｄ ｍｕｎｄｓｏｎ）の車輪投影において、多くの疎水性残基は、ヘリックスの疎水 的な側を決定する一つの領域に位置している。ヘリックスの軸に沿った分子の疎 水力の計算は、Ｂｒａｓｓｅｕｒ　ｅｔ　ａｌｏ（１９９１）によって提案され たようになされ、ヘリックスの軸に対して垂直な面上へのその投影は、角ｐｈｏ の計算を可能とする。この角は、ヘリックスの疎水域を表す。親水性角ｐｈｉは 、ｐｈｏ角の余角　３６０°−ｐｈｏである。

表現“両親媒性”は、ヘリックスの反対の面において疎７ｔ１および親水域の分 離があることを意味する。両親媒性らせんモーメント（μＨ）は、アイゼンバー ブの方法によって決定することができる（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ。

１９８４；　Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４）。

本発明のペプチドにおいて、ペプチド末端の少なくとも一つは、ブロックされる のが好都合である。ペプチドの両末端は、保護基によって都合よくブロックされ る。

表現“ペプチドの両末端がブロックされる”は、αヘリックスの安定化に有利で あることが示されたαヘリックスペプチド末端のいかなる改変、より具体的には ５ｃｈｏｌｔｚ　＆　Ｂａｌｄｗｉｎ　（１９９２）によって例示されたような ペプチドのＮ−もしくはＣ−末端における電荷の存在を排除するαヘワックスベ ブチドの改変も意味する。本発明のペプチド中に導入されるそのような改変方法 の例は、実施例の項に示される。

好適な態様によれば、本発明の上記タンパク質およびペプチドは、位置１および １６におけるアミノ酸が、ＡｓｐおよびＧｌｕとは異なり、および／または位置 ９および１３におけるアミノ酸が、ＬｙｓおよびＡｒｇとは異なるようなもので ある。

例を挙げれば、 一位Ｎ１におけるアミノ酸は、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＡ　Ｉ　ａであってもよく、−位置９ におけるアミノ酸は、Ａｓｎ５Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＡｓｐもしくはＧｌｕてあってもよく、−位置１３に おけるアミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ＡｓｐもしくはＧｌｕてあってもよく、−位置１６に おけるアミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＬｙｓもしくはＡｌａであってもよい。

好適な態様によれば、本発明のペプチドもしくはタンパク質は、先に定義したよ うなペプチドを含んでなるか、そのペプチドによって構成されるものであって、 該ペプチドは、先に定義された特徴を有する他のペプチドとともに円盤状の複合 体を形成するために、リン脂質と、またはリン脂質およびコレステロールと、結 合もしくは会合することができ、該ペプチドは、前記の該リン脂質−タンパク質 複合体において、次のようなペプチドである、すなわち 一各々のペプチドは、３６アミノ酸残基を含んでなる各該ターンをもつ２〜８、 好ましくは５ターンを含んでなるαヘリックスの形において存在し、 一前記へリックスは、約１３人〜約１６人、好ましくは約１５人の直径を有し、 一該ヘリックスの二つの連続するターンを分ける距離は、約４人〜約６人、好ま しくは約５人であり、 一ヘリックスの長さは、約１０人〜約３０人、好ましくは約２４人〜約２６人、 より好ましくは約２５人であり、−それは、両親媒性であり、 一疎水性ｐ　ｈ　ｏ角の値は、約１２０°〜約１８０°、好ましくは約１４０° 〜約１８０°の範囲であり、 −親水性ｐｈｉ角の値は、約１８０°〜約２２０°、好ましくは約１８０°〜約 ２２００の範囲であり、 −各ペプチドは、その隣接ペプチドの一つによって構成される連続する逆平行へ リノクスの反対側のアミノ酸とのイオン結合において、相互作用しやすい少なく とも一つのアミノ酸を含有し、このイオン結合に関与する対立アミノ酸間の距離 は、約１０人未満、好ましくは約６人〜約８人、より好ましくは５人未満てあり 、−上記アミノ酸間の相互作用のエネルギーは、少な（とも＋５ｋｃａｌ／ｍｏ 　ｌ　ｅ、好ましくは−１０〜−１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅである。

円盤状の複合体における各ペプチドは、２個の隣接ペプチドとのイオン結合を通 して連結されるということに注目すべきである。

表現“先に定義された特徴”は、ターン数、ヘリックスの直径、二つの連続する ターン間の距離、ヘリックスの長さ、疎水性ｐｈｏ角の値、親水性ｐｈｉ角の値 、ならびに両親媒性に対応する。

本発明のペプチドおよびタンパク質は、先に定義されたペプチドが、内部にリン 脂質が見いだされる円盤を形成するように、相互関連して配置されるようなもの であり、かくしてそのペプチドおよびリン脂質は、円盤状の複合体を形成する： 該複合体において、リン脂質は、疎水的相互作用を通してペプチドと会合し、そ してペプチドは、相互作用の静電エネルギーを特徴とする疎水的および親水的相 互作用を通じて、特に、一つのペプチドの荷電されたアミノ酸と隣接ペプチドの 反対に荷電されたアミノ酸との間に生じるイオン結合を通じて、互いに連結され る。ブロフクされたアミノ−およびカルボキシ末端は、この相互作用の静電エネ ルギーには寄与しない。

一つのペプチドおよびその対応する隣接ペプチドのアミノ酸は、ペアーをなして 会合され、ペアーの数は、少な（とも１、好ましくは２てあり、そして二つの隣 接するペプチドは、好ましくは、それらが互いに逆平行に配置されるようなもの である。

対立ペアー間の距離は、エネルギー最小化技術によってペプチドペアーの分子模 型作製を通して評価てきる（Ｂｒａｓｓｅｕｒ、　１９９１）。二つの前記ペプ チド間の相互作用エネルギーは、疎水的、ファンデルワールス的およびイオン的 相互作用エネルギーの総計として、標準的算式に従って計算てきる（Ｂｒａｓｓ ｅｕｒ、　１９９１）。

好適な態様によれは、本発明のペプチドもしくはタンパク質は、先に定義された ペプチドによって構成され、そのペプチドは、好ましくは該ペプチドと同一であ る本発明の他のペプチドとともに、リン脂質−タンパク質複合体の部分であって 、該複合体は、約１５〜２５、好ましくは２０ペプチドを含み、そして該複合体 は、厚さ約３８人〜約４２人、好ましくは約４０人、直径約８０人〜約１５０人 、好ましくは約８０人〜１２０人を示す。その直径は、非変性勾配ポリアクリル アミドゲル電気泳動によって評価される。

用語“リン脂質−タンパク質複合体”において、タンパク質は、あるタンパク質 を表すが、好ましくは、あるペプチドを表すものと解釈されるべきである。

リン脂質−タンパク質複合体におけるペプチドの数は、リン脂質とペプチドの濃 度を測定することによって決定できる。勾配ゲル電気泳動によって決定された複 合体の直径と、分子模型作製がら得たペプチドの直径とともに、複合体当たりの ペプチド数が計算できる。

好適な態様によれば、本発明のペプチドおよびタンパク質は、形態上、そのペプ チドが二量体であるようなものである。該二量体は、各ペプチドのそれぞれのへ リノクスが、好ましくはβ鎖構造によって連結されるものであって、該構造は、 好ましくは５アミノ酸を含有し、それらの一つは、好ましくはＮもしくはＣ末端 部分からの位置３においてプロリンであり、この二量体は、Ｘがバリン、アラニ ン、グリシン、より好ましくはグリシンであるＸ−Ｘ−Ｃｙ　ｓ−Ｃｙ　ｓ　− Ｘ−Ｘのような好ましくはＣ−もしくはＮ−末端に１かれた配列によって可能な 限り閉鎖される。

その他の態様によれば、本発明のペプチドもしくはタンパク質は、先に定義され た円盤状複合体において次のようなものである：ペプチドが、リン脂質、および さらに加えて可能な限りコレステロールと会合される場合には、それは、天然の 血漿アポＡＩ−リン脂質複合体を用いて調製された複合体によるＬＣＡＴ活性化 の約１０％より少なくない量、好ましくは約２０％〜４０％の量において、ＬＣ ＡＴを活性化することができるが、この活性化は、例えばコール酸塩の透析によ って調製されたモル比１０／１／１におけるＰＬＰＣ／コレステロール／ペプチ ドの複合体からなる基質標品を用いて測定され、ＬＣＡＴ活性は、コレステリル エステルｎｍｏ　Ｉ　ｅ／ｈ／ＬＣＡＴ酵素ｍ１において表示される。コレステ リルエステルは例えばリノール酸コレステリルであり、ＨＰＬＣによって測定さ れる（Ｖｅｒｃａｅｍｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ｇ９）。

リン脂質は、ＰＬＰＣ（後記）が好都合である。

天然血漿アポＡｌは、ヒト血漿から精製される。該精製は、調製用超遠心、脱脂 およびｍｏｎｏＱ　ＦＰＬＣカラムによる分画、を含んでなる標準操作により行 うことができる。

その他の基質調製は、アポＡｌもしくはアポＡＩＶ　（アポＡＴと同様な技術に よりヒト血漿から調製された天然アポＡＩＶ）のいずれかを含んでなるコレステ ロール濃度Ｏ〜１０％（リン脂質の重量％）をもつリン脂質としてＤＰＰＣ（ｉ ＆記）もしくはＰＯＰＣ（後記）を包含することができる。

本発明のポリペプチドもしくはタンパク質は、前述のペプチドが次の特徴を示す ようなものが好都合であるニーそれが、リン脂質、およびさらに加えて可能な限 りコレステロールとの複合体に会合される場合には、それは、２９５ｎｍでの励 起後、Ｔｒｐ蛍光放射により測定すると、４ＭのＧｄｍＣｌ、好ましくは２Ｍ〜 ４ＭのＧｄｍＣ１の範囲において、ＧｄｍＣ１変性に対して安定であり、−それ は、約３モルのリン脂質／ペプチドモル〜約９モルのリン脂質／ペプチドモル、 好ましくは約５モルのリン脂質／ペプチドモルにおいてリン脂質に対する結合能 を有し、 −それは、遊離ペプチドとリン脂質複合体のペプチドとの間の差異が、赤外分光 もしくは円偏光二色性により測定して少なくとも１５％であるようなαヘリック ス含量の増加をもつ。

ＧｄｍＣＩは塩化グアニジンを意味する。

赤外は、またＩＲで示され、円偏光二色性は、ＣＤにより示されるであろう。

本発明のタンパク質およびポリペプチドにおいて、遊離ペプチド（本発明の複合 体に含まれない）中のαヘリックス構造のパーセンテージは、約２０％〜約３０ ％であり、リン脂質−タンパク質複合体中では、ペプチドのαヘリックスのパー センテージは、ＩＲおよび円偏光二色性測定によって約４０％〜約６５％である 。

αヘリックス構造の増加は、脂質による両親媒性ヘリックスの安定化に対応する 。本発明のタンパク質およびペプチドは、好ましくは両末端をブロックして使用 される。

本発明のタンパク質もしくはポリペプチドは、それが、リン脂質と会合される場 合には、前述のペプチドは、次の特徴を示す：それは、複合体でのペプチド濃度 約１００μｇ／ｍｌにおいて、遊離コレステロールの形で、コレステロール蓄積 細胞から細胞中に含まれる総コレステロールの約３０％〜５０％（重量％）、好 ましくは約４０％の最大コレステロール流出を引き起こす。これは、複合体１０ ０μｇ／ｍｌが、脂質蓄積細胞に与えられる場合、培地中に放出される遊離コレ ステロールの５〜２５μｇ、好ましくは２５μｇ量に相当する。

細胞中に残っているコレステロールは、遊離もしくはエステル体のいずれも、Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃ定量法によって測定される。

コレステロール流出（培地中に放出されるコレステロール）は、酵素的に測定さ れる。

細胞は、異なる起源のものであってもよい。

マウスマクロファージに代わるものに、ヒトマクロファージ細胞系（ＴＨＰ−１ ）、マウス腹腔マクロファージ、抹梢血液から分離されたヒトマクロファージ、 内皮細胞、脂肪細胞、またはマウスもしくはヒトのいずれかの起源由来の平滑筋 細胞がある。

細胞から遊離された遊離コレステロールは、細胞の培養液培地中にあるリン脂質 −タンパク質複合体中に取り込まれる。ＬＣＡＴｔｍ品が、培養培地中にペプチ ド−リン脂質複合体とともに添加される場合、遊離コレステロールとして細胞か ら取り上げられたコレステロールは、添加されたＬ　ＣＡ　Ｔの作用により複合 体中で直ちにエステル化される。

本発明の好都合なタンパク質は、次の式の少な（ともいずれか一つのペプチドを 含有するか、あるいは該ペプチドのいずれか一つによって構成される。

ＭＩ　Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−ｆｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈ ｅ　（配列番号１）Ｍ２　Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ− Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｚｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ− Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（配列番号２）Ｍ３　Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ−／１ｄａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＧｌｕＧｌｕ−Ｌｙ ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（配列番号３）好適な態様によ れば、本発明のリン脂質−タンパク質複合体は、先に定義されたタンパク質もし くはペプチドの少なくとも一つ、リン脂質および可能な限りコレステロールを含 有するものであって、リン脂質の量は、好ましくは前記ペプチドのモル当たり約 ３モル〜約９モルであり、好都合なことには、リン脂質のモル比において、前記 ペプチドに関して、２／１〜４／１まで変わり、そしてコレステロールの量は、 リン脂質の量（Ｗ／Ｗ）に関して０〜１０％（重量％）である。

好適な態様によれば、本発明のリン脂質−タンノ（り質複合体は、タンパク質が 多重ラメラＤＭＰＣリポソームと混合され、その混合液が１５〜２５°Ｃに加熱 される場合、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）に関して、３４ ０ｎｍにおいて約０７〜約０．０５の濁度低下を示す。

本発明のリン脂質−タンパク質複合体は、それが互いに都合よく積み重ねられる ものである。

これは、電子顕微鏡像においてリンタングステン酸でのネガティブ染色濃に認め られるが、その像では、円盤が種々の長さの典型的な巻物状に互いに積み重ねら れているのが見られる。一つの考えでは、積み重ねられた円盤は、約１５〜約７ ０である。

本発明のリン脂質−タンパク質複合体において、リン脂質は、次の中から選ばれ る： ＤＭＰＣ：（シミリストイルホスファチジルコリン）ＤＰＰＣ：　（ジパルミト イルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ：　（パルミトイルオレオリルホスファチ ジルコリン）ＰＬＰＣ：　（パルミトイルリルイルホスファチンルコリン）、ま たは卵ＰＣ（卵ホスファチンルコリン）、そしてより好ましくはＤＰＰＣである 。

本発明のリン脂質−タンパク質複合体の調製方法は、次の段階を包含する： すなわち、リン脂質−タンパク質複合体を得るために、コール酸ナトリウムのよ うな界面活性剤の存在下で、好ましくはリン脂質／ペプチド３／１　（Ｗ／Ｗ） 比、およびコレステロール／リン脂質（ｗ／ｗ）０〜１０％において、リン脂質 および可能な限りコレステロールとともに前記タンパク質のいずれか一つをイン キュベート味読いて界面活性剤を透析し、そして遊離タンパク質、遊離リン脂質 および可能な限り遊離コレステロールを除去するために、該複合体を例えばゲル 濾過もしくは密度勾配超遠心によって分画する。

合成は、均質溶液中もしくは固相において実施することができる。

例えば、使用される均質溶液中での合成技術は、“有機化学の方法（Ｍｅｔｈｏ ｄｅ　ｄｅｒ　ｏｒにａｎｉｓｃｈｅｎ）−（Ｅ、　Ｗｕｎｓｃｈｍ、ｖｏｌ、 　１５４．　Ｈ，ＴＩＩＴＥＭＥ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９７４）にＨｏｕ ｂｅｎｗｅｙｌによって記載されたものがある。

本発明のポリペプチドは、また“固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　 ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏ ｒｄ、　１９８９）内でＡｔｈｅｒｔｏｎ　ａｎｄ　５ｈｅｐａｒｄによって記 載された方法により、固相において調製することもできる。

本発明のタンパク質およびペプチドは、合成高密度リポタンパク質の形成におけ る使用のために意図される。

本発明のリン脂質−タンパク質複合体は、血漿における高密度リポタンパク質代 替物として使用されてもよく、少なくとも心臓血管病に対して天然のＨＤＬと同 様な予防効果を与える。それらは、また、内毒素ショックの治療においても使用 され得る。

したがって、本発明は、また、生理学的に適切な薬物担体との組み合わせにおい て、本発明のリン脂質−タンパク質複合体のいずれか一つを、活性物質として含 んでなる医薬組成物に関する。

リン脂質−タンパク質複合体の投与法は、好ましくは非経口的、すなわち静脈内 、腹腔内、筋肉内もしくは皮下であり、静脈内投与が最適である。合成複合体は 、担体なしで単独投与されてもよい：しかしながら、それらは、また、薬学的に 許容できる無毒な担体とともに投与されてもよく、それらの割合は、特定の担体 の適合性および化学的性質によって決定される。静脈内もしくは筋肉的投与に対 しては、それらは、他の溶質、例えば、等強性溶液を作製するために十分な生理 食塩水もしくはグルコースを含んでなる無菌溶液の形で使用される。

本発明のタンパク質は、また、投与の方法を単純化すべく連続潅流装置の使用に よって投与できることが立証できる。

好都合には、本発明の医薬組成物は、体重ｋｇ当たりリン脂質的１０ｍｇ−約１ ００ｍｇ、特に、約５０ｍｇを含有する。

これは、体重ｋｇ当たり本発明のリン脂質−タンパク質複合体約１０ｍｇ〜約１ ２５ｍｇ、特に、約６５ｍｇに対応する。

本発明のリン脂質−タンパク質複合体は、アテローム性動脈硬化病斑の進行を低 減し、退行を誘導することによって、冠動脈の重篤な狭窄症および抹梢血管疾患 のような心臓血管病の治療に当てられる薬剤の調製のために有用である。その調 製品は、また内毒素シヨツクの治療（こも使用され得る。

以下に示される実施例は、例示を目的とするものであり、本発明は、これらの実 施例に限定されるものではない。

［図および表の説明］ 図１は、温度（℃）、（Ｘ軸）の関数として、ＤＭＰＣ小胞との複合体の形成に ついて、３２５ｎｍにおける濁度の減少（ｙ軸上、Ｅ／Ｅ。

とじて表示、Ｅは、種々の温度で測定された濁度であり、Ｅｏは、１５０Ｃで測 定された濁度である）を表し、そして図において６＊゛→−”の曲線は、Ｍ２に 対応する、＊“口”の曲線は、Ｍｌに対応する、 ＊′△“の曲線は、Ｍ４に対応する、 ＊゛◇”の曲線は、Ｍ３に対応する、 ＊“・”の曲線は、アポＡｌに対応する、＊″ム”の曲線は、１８Ａに対応する 。

図２ａ−図２ｆは、種々の塩化ナトリウム濃度において、温度（Ｘ軸」二）の関 数として、Ｉ）　Ｍ　Ｐ　Ｃ小胞との複合体の形成について、３２５ｎｍにおけ る濁度の減少（ｙ軸上、Ｅ／ＥＯとして表示、Ｅは、種々の温度で測定された濁 度であり、Ｅｏは、１５°Ｃで測定された濁度である）を表す。

口”の曲線は、０．１５ＭのＮａＣ１濃度に対応する。

”＋”の曲線は、０．５ＭのＮａＣｌ濃度に対応する。

“Ｏ”の曲線は、０，８ＭのＮａＣＩａ度に対応する。

＊図２ａは、アポＡｌに対応する、 ＊図２ｂは、１８Ａに対応する、 ＊図２ｃは、Ｍｌに対応する、 ＊図２ｄは、Ｍ２に対応する、 ＊図２ｅは、Ｍ３に対応する、 ＊図２ｆは、Ｍ４に対応する。

図３８および図３ｂは、Ｔｒｐ極大値を測定することによる、ＧｄｍＣ１ｆｉ度 増加の関数として、ペプチドおよびリン脂質−ペプチド複合体の変性を表す。

＊“口”の曲線は、Ｍｌに対応する、 ＊“＋”の曲線は、Ｍ２に対応する、 ＊”◇”の曲線は、Ｍ３に対応する、 ＊″△”の曲線は、Ｍ４に対応する、 ＊“・”の曲線は、アポＡｌに対応する、＊“マ”の曲線は、１８Ａに対応する 。

ＧｄｍＣ］の濃度（Ｍ）は、Ｘ軸上に、そして極大波長（ｎｍ）は、ｙ軸上にプ ロットする。

＊図３８は、遊離ペプチドに対応する、＊図３ｂは、リン脂質−ペプチド（ＤＭ ＰＣ）複合体に対応する。

図４ａ〜図４ｆは、リン脂質−ペプチド複合体のゲルクロマトグラフィープロフ ィルを表す。Ｔｒｐ蛍光強度は、溶出容量（ｍｌで表示）の関数として測定され る。

これらの図において、 ＊図４ａは、アポＡｌに対応する、 ＊図４ｂは、１８Ａに対応する、 ＊図４０は、Ｍｌに対応する、 ＊図４ｄは、Ｍ２に対応する、 本図４ｅは、Ｍ３に対応する、 ＊図４ｆは、Ｍ４に対応する。

図５ａおよび図５ｂは、０〜２４ｈ（図５ａ）およびＯ〜６ｈ（図５ｂ）の間に おける、ＰＬＰＣ−コレステロールと種々のペプチドもしくはアポＡｌとの間で 生成された円盤状複合体によるＬＣＡＴ反応の活性化を表す。

時間（ｈ）はＸ軸上に表され、エステル化の％はｙ軸上に表される（両図）。

＊”＋゛の曲線は、Ｍｌに対応する、 ＊”◇”の曲線は、Ｍ２に対応する、 ＊”△”の曲線は、Ｍ３に対応する、 ＊“Ｏ”の曲線は、Ｍ４に対応する、 ＊“口”の曲線は、１８Ａに対応する。

図６は、ＬＣＡＴと種々の複合体との反応について基質濃度の逆数の関数（μＭ で表された１／コレステロ一ル濃度）（Ｘ軸上）として、初速度の逆数（１／Ｖ ｏ）、（ｙ軸上、ｎｍｏｌｃＥ／ｈで表示）を与えるラインライ−バー・パーク プロットを表す。

＊“＋”の曲線は、Ｍｌに対応する、 ＊“◇”の曲線は、Ｍ２に対応する、 ＊“△”の曲線は、Ｍ３に対応する、 ＊“○”の曲線は、Ｍ４に対応する、 ＊“口”の曲線は、１８Ａに対応する。

図７は、本発明のペプチド−リン脂質複合体（Ｘ軸上、タンパク質μｇ／ｍｌと して表された複合体）の種々の濃度による脂質蓄積マクロファージ（Ｊ７７４細 胞）のインキュベーション後の細胞培養培地中で測定されたコレステロール（μ ｇ）量（ｙ軸上）を表す。同条件においてアポＡｌ−リン脂質とアポＥ−リン脂 質複合体との比較がされる。

図７において、 ＊“＋゛の曲線は、アポＡｌに対応する、＊“△”の曲線は、１８Ａに対応する 、＊“Ｏ″の曲線は、Ｍｌに対応する、 ＊“”の曲線は、Ｍ２に対応する、 ＊“ム”の曲線は、Ｍ３に対応する、 ＊“・”の曲線は、Ｍ４に対応する、 ＊゛・・＋・・”の曲線は、アポＥに対応する。

図８は、本発明の両親媒性ペプチドの逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ分析を表す。

＊パネルＡは、ペプチドＭ１に対応する、＊パネルＢは、ペプチドＭ２に対応す る、＊パネルＣは、ペプチドＭ３に対応する、＊パネルＤは、ペプチドＭ４に対 応する、＊パネルＥは、ペプチド１８Ａに対応する。

勾配の詳細は、次の通りである： Ｑｎｍ　〜ｌｎｍ：バッフ７−Ｂの３０％＋バッファーＡの７０％、ｌｎｍ　〜 ３５ｎｍ：バッフ７−Ｂの３０％〜７０％（＋バッファーＡの７０％〜３０％） 、 ３５　ｎｍ　〜４０　ｎｍ　：バッフ７−Ｂの８０％＋バッファーＡの２０％。

バッファーＡ　：Ｈ２０中トリフルオロ酢酸０．１％、バッファーＢニアセトニ トリル中トリフルオロ酢酸０．１％。

流速は１ｍｌ／ｍｎ、検出は波長２３０ｎｍにおいて実施され、カラムはＣ２／ Ｃ＋５Ｐｅｐ／Ｓ逆相（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。

以下に言及される１８Ａペプチドは、Ｅｐａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９） により記載されたちのてあり、次の式を有する。

Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ　１ａ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｇ　１　ｕ −ＬｙｓＪａ　１−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌ凾刀|Ｇ　ｌｕ− た遊離ペプチド、およびリン脂質−ペプチド（ＤＭＰＣ）複合体におけるαヘリ ックス構造のパーセンテージに対応する。

表１ ペプチド　ＤＭＰＣ／ペプチド ＩＲＣＤ　ＩＲＣＤ アポＡｌ　３９　２９　４９　４７ １８Ａ　２８　４５　４７　６６ Ｍ１　２９　２０　５０　４６ Ｍ２　３６　３０　５０　４６ Ｍ３　４３　−零　６１　一本 Ｍ４　３５　５０　５８　６５ ＊＝測定せず 表２は、アポＡｌ複合体と比較されたリン脂質−ペプチド複合体のＬＣＡＴ活性 化の性質に対応する。見掛けの反応速度定数は、Ｖｍａｘ。

ＫｍおよびＶｍａｘ／Ｋｍとして与えられる。

Ｍｌ　２．４１　１４．５７　０．１７　１５．４Ｍ２　０．３３　９，４０　 ０．０４　３．３Ｍ３　０，３３　２，８９　０．１１　１０．７Ｍ４　１．５ ３　３，８３　０．４０　３７．３１８Ａ　２．３２　２１．０７　０．１１　 １０．３アポＡＩ’　５，８９　５，４９　１．０７　１００．００アポＡＩお よびペプチドのＶｍａｘ／Ｋｍ値は、両方が、コレステロール濃度（μＭ）とし て表されるので比較可能である。

ＣＥ／ｈ＝コレステロールエステル／時ＦＣ＝遊離コレステロール 表３は、アポＡ１合体の流出能力と比較されたリン脂質−ペプチド複合体のコレ ステロール流出促進特性に対応する。見掛けの反応速度定数は、Ｖｍａｘ、Ｋｍ およびＶｍａｘ／Ｋｍとして与えられる。

Ｖ＋＋＋ａｘ＊　Ｋｍ＊＊　Ｖｍａｘ／Ｋｍ　ｒ零零本Ｍｌ　１１１　３２　３ ．５　０．９９Ｍ２　４８　７　６．５　０．９８ Ｍ３　７７　６０　１．３　０．９７ Ｍ４　５０　１０　５．２　０．９９ １８Ａ　２６　１２　２．１　０．９７アポＡＩ’　５２　０，９　５６．８３ 　０．９５＊Ｖｍａｘは、μｇ細細胞７襠４ テロールμｇとして表される。

＊＊Ｋｍは、複合体のタンパク質濃度μｍｏｌ／Ｌとして表される。

＊＊＊回帰線の相関係数。

０ペプチドとアポＡｌを比較するために、アポＡｌのＭＷがペプチドのそれより 約１０倍以上であることを考慮すべきである。Ｖｍａｘ／Ｋｍを比較するために 、アポＡｌについての値は、十分の−しなければならない。

！４，は、リン脂質−タンパク質複合体の組成および電子顕微鏡像から得たサイ ズ測定値に対応する。

アポＡｌ　２／１　１２８±２２ １８Ａ　２／１　１５５±２７ Ｍ１　３／１　２０９±３３ Ｍ２　２／１　１７３±４５ Ｍ３　４／１　１７５±５５ Ｍ４　３／１　１５０±２５ ［実施例］ １、ペプチド合成 ペプチドは、Ｔｅｎｔａｇｅｌ　５−ＲＡＭ樹脂（Ｒａｐｐ　Ｐｏｌｙｍｅｒｅ 。

Ｔｔｌｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上へのカップリングによる固相ペプチド 合成によって合成されるが、樹脂は、カルボキン末端アミドを得るために、酸に 不安定なリンカ−　４−　（（１−Ｆｍｏｃ−アミノ−２’　、４’　−ジメト キンベンジル）フェノキン酢酸が導入されている。ｔｅｒｔ−ブチルに基づく側 鎖保護およびαーＦｍｏｃーアミノ保護が使用された。多くの場合において、カ ップリングは、予め作成されたアミノ酸Ｏーペンタフルオロフェニルエステルを 用いて実施された。ある場合には、トリプトファンが、ＴＢＴＵ　（０−ＩＨ− ベンゾトリアゾール−１−イル）　−Ｎ．　Ｎ。

Ｎ’　、　Ｎ’　−テトラメチルウロニウム　テトラフルオロホウ酸エステル） 活性化を用いて結合された。この活性化操作が用いられる場合には、トリプトフ ァンの側鎖インドール基は、ｔ　−　Ｂ　ｏ　ｃ　（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ． 　Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ．　ＬＩＫ）によって保護された。完成したペプチド鎖 のアミノ末端は、無水酢酸を用いてアセチル化された。全ての合成は、連続流れ 操作を用いるＭｉｌｌｉｇｅｎ９０５０　ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにより 実施された。続いて捕捉剤の存在下でトリフルオロ酢酸による脱離およびｔ−ブ チルメチルエーテルでの抽出の後、全てのペプチドは、Ｃ１８逆相クロマトグラ フィーによって分析された。

２　ベブチドデザイン この研究は、Ｓｅｇｒｅｓｔ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８３）により記された１８ Ａペプチドを使用して開始されたが、その構造および機能的性質は、広（報告さ れていた（Ｋａｎｅｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ．、　１９８０：　Ｅｐａｎｄ　ｅｔ 　ａｌ．、　１９８９）　ｏ　リン脂質とともに再集合する場合、このペプチド は、アポリポタンパク質−脂質複合体と類似した構造をもつ円盤状複合体を生じ る（Ａｎａｎｔｈａｒａｍａｉａｈ．　１９８６）。そのような複合体では、ペ プチド鎖は、互いに隣接し、リン脂質のアノル鎖に平行した向きをとる（Ｂｒａ ｓｓｅｕｒ．　１９９１）。この立体配置において、塩橋が、隣接ペプチド鎖の 端に配置された荷電残基の間に形成される。この効果は、既に、アポＥのＮ−末 端セグメントのらせん状の捩れ（ｂｕｎｄ　Ｉ　ｅ）について示され．その場合 、塩橋は、らせん状ペプチドの端に沿って生じる荷電残基の間に生じる（ｊｉｌ ｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、　１９９１）。

角ｐ　ｈ　ｏおよびｐｎｌとともに、対応する配列の周囲の疎水的および親水的 分子電位は、記述の方法を用いて計算された（Ｂｒａｓｓｅｕｒ、１９９１）。

複合体単離および特性 複合体は、ＤＭＰＣ／ペプチド、ｗ　／　ｗ比３／１において、２５°ｃ１６時 間、ペプチドとノミリストイルホスファチノルコリン（ＤＭＰＣｌＳｉｇｍａ． 　Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ．　ＭＯ）小胞とのインキュベーションによって得られた。

ンパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ）との複合体は、コール 酸塩の透析操作によって生成された（Ｖａｎｌｏｏ　ｅｔ　ａｌ．、　１９９１ ）。全ての複合体は、０．ＯＩＭＩ−リフ、−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．　０ ，　０。

１５ＭＮａＣｌ，１ｍＭＮａＮ３，０．１ｇ／Ｌ　ＥＤＴＡでの５ｕｐｅｒｏｓ ｅＰＧカラムにおけるゲルクロマトグラフィー（図４）によって単離された。カ ラムは、脂質−ペプチド複合体の解離を防ぐために、最初に、リン脂質によって 飽和された。複合体は、２８０ｎｍにおける光学濃度の連続追跡によって、そし てＪ　ａｓｃｏｓＰ５００分光蛍光計による画分のＴｒｐ放射の測定によって検 出された。複合体の組成およびサイズは、複合体の溶出ピークの極大ＵＶ吸収を もっ２画分において測定された。その組成は、酵素的アッセイ（Ｂｉｏｍｅｒｉ ｅｕｘ．　Ｆｒａｎｃｅ）を用いるリン脂質の定量および加水分解後、Ｃ１８逆 相カラムでのＨＰＬＣフェニルアラニンアッセイ（Ｖａｎｌｏｏ　ｅｔ　ａｌ． 、　１９９１）によるペプチドの定量によって決定された。

蛍光測定 ペプチドおよび複合体におけるＴｒｐ蛍光放射の測定は、複合体形成を追跡する ために使用された。蛍光測定は、蛍光偏光測定のための特殊なアダプター（Ａｍ ｉｎｃｏ−Ｊ４−９５０１）を備えたＡｍ１ｎｃ。

５ＰＦ−５００分光蛍光計により行われた。ジフェニルヘキサトリエン（ＤＰＨ ）（モル比５００　１　脂質　ＤＰＨ）で樟識された脂質−ペプチド複合体の蛍 光偏光は、脂質−ペプチド会合によるリン脂質アシル鎮の流動度における変化を 検出するので、温度の関数として測定された。

励起波長は、３６５ｎｍに設定され、放射は、４２７ｎｍにおいて検出された。

１５〜４０℃の間の温度スキャンが、０．６℃／分の割合で循環ウォーターバス （Ｊｕｌａｂｏ）を用いて実施された。

脂質−ペプチド複合体の電子顕微鏡観察タンパク質濃度１５０μｇ／ｍｌにおけ るリン脂質−ペプチド複合体が、リンタングステン酸カリウムの２０ｇ／ｌ溶液 （ｐＨ７，４）を用いてネガティブ染色された。そのサンプル７μＩが、Ｆｏｒ ｍｖａｒ炭素被覆グリッドに適用され、ＺｅｉｓｓＥＭ　ＩＯＣ透過型電子顕微 鏡を６０ｋＶで操作して検査された。粒子サイズは、各サンプルについて１２０ の別個の粒子を測定することによって決定された。複合体の平均直径およびサイ ズ分布が計算された。

赤外分光性測定（表１） 全反射減衰（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｔｏｔａｌ　Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）（Ａ ＴＲ）赤外分光法が、アポリポタンパク質のαヘリックスセグメント、ならびに アポＡｌおよびアポＡ＋−リン脂質複合体について、およびＬ　Ｄ　Ｌについて 前述された（Ｖａｎｌｏｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１）リン脂質アンル鎖の相 対的方向を決定するために使用された。これらの測定のために、Ｏ００５Ｍトリ ス−ＨＣｌバッファーｐＨ８，４中単離された複合体２０μｇの溶液７０μｍが 、ＡＴＲゲルマニウム結晶板上に塗布された。ランダムおよびαヘリックス構造 に関する吸収バンドのオーバーランプを避けるために、サンプルの重水素化が、 密封された万能Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒサンプルホルダー中で、室温３時間、 Ｄ２０飽和のＮ２をフランノングさせて実施された。

スペクトルは、垂直（９０’）および水平（０°）方向の偏光入射光を用いて、 Ｐｅｒｋｉｎ−ＥＩｍｅｒ１７２０Ｘ赤外分光光度計において記録された。二色 スペクトルは、０°の偏光を用いて記録されたスペクトルを９０’のそれから減 じることによって得られた。二色スペクトルにおける正の偏差は、その面に対す る垂線に正確に選択的に向けられた双極子を示し、一方、０°におけるより大き い吸収は、Ｇｅ結晶面に正確に向けられた双極子を示している。Ｇｅ結晶に対す る垂線と双極子との間の角は、９０および０°での偏光により記録されるスペク トルにおける吸収の比を表す二色比Ｒ，，，＝Ａ　（９０°）　／Ａ　（０°） の計算から得られる。各実験について、１５スキヤンまでが蓄積され、平均され ｔこ。

円偏光二色性測定（表１） ペプチドおよびその脂質との複合体の円偏光二色性スペクトルは、Ｊａｓｃｏ６ ００分光偏光計により２３℃で測定された（Ｂｒａｓｓｅｕｒ　ｅｔ　ａｌ、　 。

１９９１）。測定は、０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７，４中タン パク質濃度０．１ｍｇ／ｍｌで実施された。９スペクトルが収集され、各サンプ ルについて平均された。二次構造は、Ｃｏｏ＋ｐｔｏｎ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏ ｎのｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｉｎｖｅｒｓｅｍｅｔｈｏｄにしたがって評価さ れた（Ｃｏｍｐｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６）。

変性実験 ＤＭＰＣ−ペプチド複合体の安定性が、ＧｄｍＣ１の増加量に曝された後、Ｔｒ ｐ残基の極大放射波長を追求することによって比較された。

この実験について、８ＭＧｄｍＣ１溶液の一部分が、前記トリス−ＨＣ１ハンフ ァー中の複合体に添加された（図３参？、）。

複合体のＬ　ＣＡ　Ｔ活性化の性質（図５および６、表２参照）基質として種々 のペプチド−脂質複合体を用いるＬＣＡＴ酵素活性は、酵素反応によって生じる コレステロールエステルの量を、ＨＰＬＣによって測定することにより決定され た（Ｖｅｒｃａｅｍｓｔ　ｅｔ　ａＬ、、　１９８９）。

アッセイ混合液は、反応容量０２ｍｌ中コレステロール濃度５〜１００μＭにお ける種々の量の複合体、脱脂されたウノ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）５ｍｇ、 ６ｍＭβ−メルカプトエタノールからなった。３７°Ｃで２０分のブレインキュ ベーション後、酵素反応は、半精製ＬＣＡＴ酵素３〜６μｍを添加して開始され た。その反応は、３７℃で続けられ、ヘキサン−イソプロパツール３：２．ｖ／ ｖによるインキュベーション混合液の抽出によって停止された。溶媒混合液は、 それぞれコレステリルエステルおよび非エステル化コレステロール定量の内部標 準としてヘプタデカン酸コレステリル（Ｓｉｇｍａ）もしくはβ−ソトステロー ル（Ｓｉｇｍａ）のいずれかを含有した。

非エステル化コレステロールおよびコレステリルエステルは、アセトニトリル− イソプロパツールを用いて、非エステル化コレステロールに対しては９０・ＩＯ Ｖ／Ｖ比て、そしてコレステリルエステルに対しては５０　：　５０ｖ／ｖ比て 溶出される逆相ｚｏｒｂａｘＯＤｓカラムでの無勾配ＨＰ　Ｌ　Ｃによって、同 定され、定量される。検出は、２０５〜２］、　Ｑ　ｎ　ｍにおけるＵＶ吸収を 測定して実施された。５０°Ｃのカラム温度において、１．２ｍｌ／ｍｉｎの流 速で、分離は、２５分内に終了する（Ｖｅｒｃａｅｍｓｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８９）　ｏこのＨＰＬＣ技術の感度は、ポリ不飽和レノチン基質についての通 常の放射能アッセイのそれと同様であり（５０ｎｇ）、飽和レノチンについての 低さは約２倍である（８０ｎｇ）。

Ｐ　Ｌ　Ｐ　Ｃ、コレステロールおよび合成ペプチドからなる円盤状基質を用い るり、ＣＡＴ酵素によるコレステロールエステル化の時間経過は、０〜２４時間 継続された（Ｊｏｎａｓ、　１９８７）。反応速度パラメーターの決定に関して は、初速度は、曲線の直線部分、すなわち０〜３０％のコレステロールエステル の生成の間において決定された。サンプル濃度は、コレステロールエステル化の 直線的生成が３７℃で１０分以内に測定されるように、一定の酵素容量５μｍを もつ５ｘｌＯ−７〜５ｘｌＯ−’Ｍの範囲であった。

アポタンパク質もしくはペプチド濃度（Ｃ）の関数として初速度（■。）は、１ ／Ｃに対する１／■、のラインライ−バー・パークプロットを用いて解析された 。直線回帰解析により、各アポタンパク質もしくはペプチド−脂質複合体につい ての明確な速度パラメーター：Ｖｍａｘ、ＫｍおよびＶｍａｘ／Ｋｍを得た。全 ての反応速度実験は、少な（とも３回行われ、ＶｍａｘおよびＫｍは、回帰線の 切片および傾斜に基づき平均値上誤差として表された。

細胞コレステロールの流出（図７１表３）Ｊ７４４マウスマクロファージは、５ ％ＣＯ２ガス中で、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）添加のＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃ ｏ）において成長される。細胞は、３５ｍｍのディソンユ中に、２ｘｌＯ６／デ イツシユの濃度で移植され、ＤＭＥＭ−１０％ＦＣ３２ｍｌ中で１８時間成長さ れ、コンフルエント単層として使用される。１８時間後、その細胞が、Ｄ　Ｍ　 Ｅ　Ｌｉで２回洗浄され、Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍおよび１０％のりボタンバク質欠乏血 清（ＬＰＤＳ）からなる培地において、アポＢａ度１００μｇ／ｍｌにおいてア セデル化Ｌ　Ｄ　Ｌとともに２４時間インキュベートされる。ＬＰＤＳは、ラン 胎児面／ｉ　（Ｇｉｂｃｏ）から超遠心で全てのりボタンバク質を除くことによ って調製される。コレステリルエステルによる積層の後、細胞モルアーは、ＤＭ ＥＭによって洗浄される。

コレステリルエステルを積層された細胞は、ウシ血清アルブミン１ｇ／ｌを補足 され、そして細胞コレステロールの再エステル化を防ぐために、アンルーＣｏＡ ・コレステロール　アシルトランスフェラーゼ酵素（ＡＣＡＴ）の阻害剤として ５ａｎｄｏｚ５８−０３５化合物を濃度１μｇ／ｍｌ含んでなる、ＤＭＥＭ２ｍ ｌ中でインキュベートされる（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０）。コレ ステロール受容体、すなわち円盤状のペプチド−レノチン複合体は、ペプチド濃 度を１０〜２００μｇ／ｍｌに変えて培地中に添加され、細胞は、２４時間イン キュベートされた。

インキュベーション後、細胞は、ＢＳＡ２ｇ／］含有リン酸バッファーｐＨ７， ４，０，１５ＮＮａＣＩ　（ＰＢＳ）で１回、ＰＢＳのみで２回洗浄される。脂 質抽出物は、ヘキサン／イソプロピルアルコール（３２）５ｍｌを細胞ペレット に添加して調製される（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７）。濃度５００μｇ／ｍｌにおけるクロロホルム中ヘプタデカン酸コレ ステリル溶液５０μｍが、コレステリルエステルのＨＰ　Ｌ　Ｃ定量用内部標準 として添加される。３分間ポルテックス混合し、１５分間３０００ｒｐｍでの遠 心の後、有機相上澄液は、乾燥され、沈殿物は、クロロホルム１ｍｌに溶解され 、３回洗浄される。乾燥残渣は、最後に、クロロホルム　アセトニトリル　イソ プロピルアルコール（１：１・１）の混合液５０μｌ中に溶解され、その２０μ Ｉが、ＨＰ　Ｌ　Ｃシステム中に注射される。

同様の抽出操作が、培地１ｍｌに適用される。エステル化されてないコレステロ ール画分の定量のために、技術的に既知の方法により、β−ノｉ−ステロールが 内部標準として使用される。

脱脂の後、細胞タンパク質は、０．１ＭＮａＯＨに溶解され、タンパク質は、ロ ーリ−の方法（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９５１）によるが、またはＰｉ ｅ　ｃ　ｅ　（Ｐｉｅｃｅ　Ｅｕｒｏｐｅ、　ｏｕｄ−Ｂｅｉｊｅｒｌａｎｄ、 　Ｆｌｏｌｌａｎｄ）製のタンパク質アッセイ用キットを用いるビシンコニン酸 （ＢＣＡ）試薬を用いてアッセイされた。両場合において、ウシ血清アルブミン が、標準として使用された。

実施例において言及された１８Ａは、Ｅｐａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９） によって記されたような１８Ａ由来のペプチドであり、その式は、既に先に述べ られていることに、注意すべきである。

逆相カラムにおける３種のペプチドのＨＰＬＣ精製パターンが、図８に示される 。上記１８Ａ由来のペプチドは、Ｍ１ペプチドにおけるに８−Ｅ置換および特に Ｍ２におけるＦ６−Ｅ置換の両方が、ペプチドの疎水性を増大させるので、最も 疎水的である。主要ピークは、合成された物質の９０％に対応する。

本発明のペプチドの性質は、Ｅｐａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）により記 されたように１８Ａ由来ペプチドによって構成される先行技術の性質と比較され る。後者のペプチドは、実施例において、“１８Ａ”として図および表において 言及される。

ペプチドとリン脂質との再会合 ＤＭＰＣ小胞およびペプチド間の小円盤粒子の形成が、３２５ｎｍにおける濁度 の減少を温度の関数として測定することによって追跡された。

図１は、ＤＭＰＣの遷移温度を通してのスキャンが、ペプチドによって調製され た混合液の濁度を減少させることを示している。ペプチド−脂質会合によって開 始される濁度の減少は、既にＤＭＰＣ遷移温度以下の１７℃において始まり、２ ３°Ｃ付近では安定化した。濁度の減少は、本発明のペプチドへの脂質の結合親 和力を決定させることができる。Ｍｌが、強い脂質結合能を有するのに対し、１ ８ＡおよびＭ４は、全く同じ脂質結合親和力を有する。Ｍ３の脂質結合は、他の ペプチドに比較して低い。

複合体形成は、さらにＴｒｐ蛍光放射スペクトルを測定して追跡された（図２参 照）。ＭｌおよびＭ２ペプチドについての極大放射波長は、それぞれ３４］およ び３５３ｎｍにある（図３）。Ｍ２ペプチドの３５３ｎｍての極大放射波長は、 溶媒に曝されたＴｒｐのコンホメーションを示している。３３５および３４２ｎ ｍへのブルーシフトは、Ｍｌおよびへ１２ペプチドのリン脂質結合において観察 されが、それは複合体中でのＴｒｐが一層疎水的な環境になるためである（図３ ）。アポＡｌにおいては、Ｔｒｐ放射波長は、３３３から３２９ｎｍのみにシフ トされ、それは、Ｔｒｐ残基が、合成のモデルペプチド（＾ｎａｎｔｈａｒａｍ ａｉａｈ、　１９８６）においてよりも天然タンパク質において、より疎水的環 境にあることを示唆する。

複合体形成が、Ｄ　Ｐ　Ｈによる標識後、蛍光偏光の程度を測定することによっ て追跡された。リン脂質アノル鎖の移動度減少を示す蛍光偏光の減少は、Ｉ）　 ｒ）　Ｉ）　Ｃア／ル饋の結晶一液晶遷移に対応する２５〜５５°Ｃにおいて観 察された。全てのリン脂質−ベブチド混合物において、ＤＰＰＣの遷移温度は、 純粋なリン脂質のそれと比較して高い温度の方向にンフＩ・された。

ＤＰＰＣ−ペプチド複合体の分離および特性アポＡ［、合成ペプチドおよびＤＰ ＰＣの間において、３／１、脂質／タンパク質、Ｗ／Ｗ比で生じる脂質−タンパ ク質複合体は、５ｕｐｅｒｏｓｅＰＧカラムにより分画された（図４）。複合体 が、コール酸透析操作を用いてＤＰＰＣとともに調製された場合、その混合物は 、より均質てあった（図４）。それらは、ＤＰＰＣ−アポＡｔ複合体に匹敵する 溶出容量において、対称的ピークとして溶離した。Ｍ３複合体については、その 複合体サイズは一層太き（、そして遊離ペプチドのピークが観察される。

クロマトグラフィーの溶出パターン（図６）において、複合体の溶出ピークの最 大値に対応する複合体の組成が、表４に総括される。電子顕微鏡法によって得ら れた複合体の直径が、この表に加えられた。粒子の直径および分布は、電子顕微 鏡の測定によって決定された。

一般に、ＤＰＰＣ−ペプチド複合体は、約１５０人〜２００人の範囲の直径をも つが、Ｍ４は最小の直径を示す。１８ＡおよびＭ４複合体は、同サイズをもつの に対して、Ｍｌ、Ｍ３およびＭ２複合体は、より大きい。全てのペプチド−リン 脂質複合体の直径は、ＤＰＰＣ−アポＡｌ複合体について観察される直径よりも 太きい。

複合体の安定性 アポＡ＋および３種のペプチドが、位置２にＴｒｐ残基を含むので、Ｔｒｐの発 光を追跡する変性実験は、それらを用いて行われた。ＧｄｍＣ１ｆｉ度を増加し つつ滴定によって実施されるこれらの実験は、アポＡＩおよびペプチドにおける Ｔｒｐ残基の露出が、ＧｄｍＣｌ！度とともに増加することを示している（図３ ）。図３に示されたように、Ｔｒｐの極大波長がアポＡｌにおける３３８ｎｍと 比較して３５３にあるので、Ｔｒｐは、他のペプチドおよびアポＡｌにおけるよ りも、Ｍ２においてその溶媒にさらに露出される。

遷移の中間点は、アポＡｌについての１．３Ｍと比較して、Ｍｌについては０． ３Ｍ付近、１８Ａについては０２５Ｍに存在する。遷移は、Ｍ２に対するＧｄｍ Ｃｌの添加直後に起きる。Ｍ３およびＭ４ペプチドについては、これが、０．１ Ｍ付近の濃度において起きる（図３）。Ｍ４について、このことは、水性溶媒に より曝され、変性のためにより近づきやすい位置２におけるＴｒｐによって説明 し得る。

Ｔｒｐ放射が、複合体においてより低い波長方向ヘシフトし、そして変性の中間 点が、Ｍｌ、　Ｍ２．およびＭ４リン脂脂質台体については、それぞれ４．３お よび２．５Ｍまで増加し、アポＡｌリン脂質複合体については２．５まで増加す るので、脂質との会合（図３のより低い部分）は、タンパク質構造を安定化し、 変性に対してそれを保護する。Ｍ３リン脂實−ペプチド複合体については、変性 は直ちに生じる。

複合体におけるヘリックス含量およびヘリックスの方向の決定ペプチドおよびペ プチド−脂質複合体の二次構造が、ＣＤ測定によって得られた（表３）。アポＡ ｌについて従来観察されていたように（Ｂｒａｓｓｅｕｒ、　＋９９１；　Ｖａ ｎｌｏｏ　ｅｔ　ａｔ、、　１９９１）　、リン脂質への結合は、ペプチドのα ヘリックス含量を２０％増加したのに対して、ランダムコイル含量を低下した。

αヘリックス構造のパーセンテージは、さらにＡＴＲ赤外分光法によって決定さ れ、二つの技術からの結果が、表４において比較される。ＩＲ測測定比較して、 ＣＤデータは、ペプチド−脂質複合体のαヘリックスの寄与を低く評価し、アポ Ａｌ−ＤＭＰＣ複合体およびＬＤＬについて観察されたようにランダム構造およ びβターン（表４）のパーセンテージを高く評価しがちである（Ｇｏｏｒｍａｇ ｈｔｉｇｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９；　Ｂｒａｓｓｅｕｒ、１９９１）。こ れは、二つの技術において使用される解析の方法およびカーブフィッティング操 作における差異によるのであろう（Ｇｏｏｒｍａｇｈｔｉｇｈ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８９）。

ＤＭＰＣ二分子層に関するαヘリックスの方向を決定するために、ＤＭＰＣおよ び単離されたペプチド−ＤＭＰＣ複合体のＡＴＲ赤外スペクトルが、入射光の二 つの直交する直線偏光において記録された。ペプチド−ＤＭＰＣ複合体において 、アシル鏑の二色比は、炭化水素鎖が、Ｇｅ面に対して直角な軸から２４°の角 で傾斜していることを示唆する。

この値は、アポＡｌ−ＤＭＰＣ複合体（Ｖａｎｌｏｏ　ｅｔ　ａｔ、、　１９９ １）にツいて測定された値に近く、純粋なりＭＰＣについての値よりも高い。Ｍ ｌ。

Ｍ２．Ｍ３およびＭ４については、ペプチドとＧｅ面に対する直交軸の間の対応 する角は、それぞれ、２５°、２５°、３４°および３１°である。それ故、こ れらのデータから、らせん状のペプチドとリン脂質アシル鎮は、互いに平行方向 とることが推測できる。

種々の基質を用いるＬＣＡＴ活性化の速度論基質として、ペプチド、ＰＬＰＧお よびコレステロール間で生じる円盤状複合体を用いる半精製ＬＣＡＴ酵素反応の 速度が、０〜２４時間追求され、アポＡｌ／ＰＬＰＣ／コレステロール複合体の それと比較された。用語”半精製”は、血漿の濃度に比較して係数５１００であ る濃度に相当し、その主要混入物はアルブミンである。初めの基質と比べられた エステル化コレステロールのパーセンテージとして表される反応の時間的経過は 、図５ａ、５ｂおよび６、ならびに表２に示される。これらの数字は、基質とし て円盤状複合体を用いての最高速度は、アポＡｌを含む基質に関して観察される ことを示している（データは図においてではなく、表において示される）。Ｍｌ 、Ｍ４および１８Ａリン脂質−ペプチド複合体は、最高速度を与えるが、一方Ｍ ２もしくはＭ３ペプチドと形成される複合体については、低速度のコレステロー ルのエステル化が、反応の初めの１時間の間観察された。全ての基質について、 プラトーとして観察される飽和速度は、アポＡＴを含む基質については２〜４時 間内で到達しくデータは示されず）、より効率の低い基質では２４時間まてに到 達した。２４時間後は、全ての基質において存在する初期コレステロール量の９ ０％以上が、コレステロールエステルに変換された（図５８）。１／Ｃペプチド の関数として１　／　Ｖ　ｏをプロットすることによって得られるラインライ− バー・パークプロットが、図６および表２に示され、Ｖｍａｘ値は、＋１．Ｍ４ および１８Ａリン脂實−ペプチド複合体については同程度であるけれども、それ らは、アポＡｌ−リン脂質複合体についての値よりも約２〜３倍低いことを示し ている（表２）。

ＭｌおよびＭ３−リン脂質複合体は、かなり低いＶｍａｘ値を与える（表２）。

研究された全てのリン脂質−ペプチド複合体に関して、Ｍ４−リン脂質複合体は 、最高の活性（最高Ｖｍ／Ｋｍ値）を示し、それは、アポＡｌ−リン脂質活性化 能の約３７％に達する。

ペプチド−脂質複合体による細胞コレステロール流出の誘起（図７）“実験操作 ”において記されたように、Ｊ７７４マクロファージが、アセチル化ＬＤＬを蓄 積させられた。蓄積されなかったＪ７７４細胞は、エステル化されてないコレス テロール約１７μｇを含み、コレステリルエステルは検出されない。アセチル化 ＬＤＬ１００μｇとともに２４時間のインキュベーション後に、コレステリルエ ステルは、総細胞コレステロール含量の５０％を示し、それは、１７から８０〜 ９０μｇ／細胞タンパク質ｍｇに増加した。

ペプチド＝ＤＰＰＣ複合体１００μｇとの２４時間のインキュベーションの間、 細胞内コレステリルエステルの約４５％が加水分解され、総細胞コレステロール 含量の４０％とともに培地中に分泌された。コレステリルエステルとしては起こ らず遊離コレステロールとしてのみ起きる培地中へのコレステロール流出は、培 地においてＨＰＬＣによって検出された。細胞の遊離およびエステル化コレステ ロール含量の相反的減少が、付随して観察された。ペプチド−リン脂質複合体が 、精製ＬＣＡＴ標品とともにインキュベートされた場合に、コレステリルエステ ルが、培地中において（すなわち、複合体において）検出することができる。こ の酵素の添加は、複合体においてコレステロールの７０％をエステル化させる。

２４時間インキュベーション後、培地中に放出されるコレステロール量は、受容 体濃度の関数として増加した。培地中の複合体のタンパク質濃度１００μｇ／ｍ ｌにおいて、同濃度でインキュベートされたアポＡｌリン脂質複合体により示さ れるコレステロール流出の±８μｇであるのと比較して、Ｍ４および１８Ａペプ チドは、培地中に、遊離コレステロール２０μｇの流出を誘起した。他の複合体 は、アポＡｌ複合体の遊離コレステロールの流出に比較して同量の流出を誘起し た。

引用文献 ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　１ｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１０４３：　２４５−２５２゜Ｂｒａｓｓｅｕｒ　Ｒ（ １９９１）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆｌｉｐｉｄ−ａｓｓｏｃｉａ ｔｉｎｇ　ｈｅｌｉｃｅｓ　ｂｙ　浮唐■@ｏｆｔｈｒｅｅ− ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｙ　 ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ、　Ｊ　Ｂ奄盾戟@Ｃｈｅｍ　 ２６６ ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｕｐｕｋｅ　ｏｆ　ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ＜ｈａｒ ｇｅｄ　ＬＤＬ　ｂｙ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ、　Ｊ　Ｓ浮垂窒≠高盾戟@５ ｔｒｕｃ＋ １３：　６７６７− ８１Ｂｒｏ　ＭＳ、　Ｇｏｌｄｓ＋ｅｉｎ　ＪＬ　（＋９８６）　Ａ　ｒｅｃｅ ｐｔｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｐａｔｈｗａｙ　ｆｏｒ　ｃ■盾撃■唐狽■窒盾 ■ ｈｏｍｅｏｓｕｓｉｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：　３４ＡＩＣｏｍｐ＋ｏｎ 　ＬＡ、ｈ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＷＣ（＋９８６）Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏ奄唐■ ｓｐｅｃｔｒａ　ｆｏｒ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｕ−ｕｃｔｕｒｅ　ｕｓｉｎ ｇ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍａｔｒｉｘ　ｍｕｌｔｉｐｌｉｃ≠狽奄盾氏A　Ａｎ ａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ１５５：　１５５−ｌ５５ 一１６７Ｄｅｌａ　Ｊ、　Ｗｏｌｆｂａｕｅｒ　Ｇ、Ｐｈｉ出ｐｓ　ＭＣ，Ｒｏ 由ｂｌａ＋　ＧＨ（１９８６）　Ｒｏｌｅ　ｏｆａｐｏｌｉｐｏｐｒｏ＋ｅｉｎ 　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｅｆｆｌｕｘ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　８７５F　４１９−４２８ Ｄｅ　Ｌｏａｆ　Ｈ，Ｒｏｓｓｈｎｅｕ　Ｍ、　Ｂｒａｓｓｅｕｒ　ＲｌＲｕｙ ｓｓｃｈａｅｎ　ＪＭ　（＋９８７）　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａ■ ｄｉｆｆｅｒｅｎＩｉａ＋ｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｐｈＪｐｈｉｌｉｃ　ｈｅｌｉｃ ｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏτｅｉｎｓ　ｂ凵@ｈｙｄｒｏｐｈ ｏｂｉｃ ｍｏｍｅｎｔｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔ ａ　９１１：　４５−５２Ｅｐａｎｄ　ＲＭ、　Ｓｕｒｅｗｉｃｚ　Ｗ）Ｃ，Ｈ ｕｇｈｅｓ　ＤＷ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ 　ｌｉ垂奄■ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｗｉ山ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ　ｈｅｌｉｘ−ｆｏｎＴｕ ｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃ１＋ｅｍ　２U４：　４６２８− ４６３５ Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ　Ｄ　（＋９８４）Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　 ｓ＋ｒｕｃｎ＋ｒｅ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　５浮窒■≠モ■ ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＡｎｎＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ５３：５９５−６２３Ｇｉａｎ ｔｕｒｃｏ　ＳＨ，Ｂｒａｄｌｅｙ　ＷＡ　（１９８７）　Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅ ｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｉｎ：　Ｇｏｔｔｏ　`Ｍ。

Ｐｌａｓｍａ　１ｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ：　１８３−２２０Ｇｌ８３−２２０Ｇｏｏｒ　Ｅ、　Ｄｅ　Ｍｅｕｉ ｅｒ　Ｄ、　Ｖａｎｌｏｏ　Ｂ、　Ｂｒａｓｓｅｕｒ　Ｒ，Ｒｏｓｓｅｎｅｕ　 Ｍ。

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（Ａ）名称：　Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｎｖ。

（Ｂ）通り：　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｐａｒｋ　Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ　７．　ｂ ｏｘ　４（Ｃ）市　：　Ｇｅｎｔ （Ｅ）国　：　Ｂｅｌｇｉｕｍ （Ｆ）郵便番号・Ｂ−９０５２ （Ｇ）電話　３２９１４１０７１１ （Ｈ）テレファックス＋　３２９１４１０７９９（１１、発明の名称　新規タン パク質、それらの調製方法、ならびにコレステロール受容体としてのそれらの使 用（ｉｉｉ）配列の数　４ （ｉｖ）コンピューター読取り可能な形式（Ａ）媒体の種類・フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター　ＩＢＭ　ＰＣコンバーチプル（Ｃ）操作系　ＰＣ−Ｄ Ｏ３／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア−Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　 ＃ｌ、　Ｑ、　Ｖｅｒｓｉｏｎ　Ｒ１，２５（ＥＰＯ） （Ｖ）現在のアプリケーションデータ：アプリケーション番号：　ＥＰ　９２４ ０１６２１．５（２）　配列番号・　１ （ｉ）配列の特＠： （Ａ）鎖長：１８　アミノ酸 （Ｂ）種類：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　一本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｆ）分子の形：ペプチド （迅）ハイポセティカル配列：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号Ｉ Ｇｌｕ　Ｔｒｐシｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａ ｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ Ｉ＋ｅｕ　Ｐｈｅ （２）　配列番号＝　２ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長：１８　アミノ酸 （Ｂ）種類；　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数二　一本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｆ）分子の形、ペプチド （ｉｌｌ）ハイボセティカル配列：　ＹＥＳ（ｘｉ）配列：配列番号２ Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　ｆｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖ ａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｐｂｅ （２）　配列番号＝　３ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長：１８　アミノ酸 （Ｂ）種類：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数二　一本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉｔ）分子の形：ペプチド （伍）ハイポセティヵル配列：ＹＥＳ （ｘｉ）配列：配列番号３ Ｌｅｕ　Ｐｈｅ （２）　配列番号：　４ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）鎖長：１８　アミノ酸 （Ｂ）種類：　アミノ酸 （Ｃ）鎮の数・　一本鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｉ）分子の形、ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル配列・ＹＥＳ（ｘＪ）配列・配列番号４ Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＡｌａＰｈｅ丁ｙｒＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｆｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ し：ｕ　ｐｈｅ Ｆｉｇｕｒｅ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　２ａ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｄ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｅ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｆ Ｆｉｇｕｒｅ　３ａ Ｆｉｇｕｒｅ　３ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　４ａ Ｆｉｇｕｒｅ　４ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　４ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　４ｄ Ｆｉｇｕｒｅ　４ｅ Ｆｉｇｕｒｅ　４ｆ Ｆｉｇｕｒｅ　５ｂ ′”°“°°　０ Ｆｉｇｕｒｅ　８ １１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１１目１１１１１１１１１１ １１１１時間（分） 時間（分） 時間（分） 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／７７５　 ８３１８−４Ｈ（７２）発明者　デリーズ、ロバート ベルギー国ビー−１８５０グリムベルゲン・ディーペンカンテン２０ Ｉ （７２）発明者　ラブール、クリステイーヌベルギー国ビー−８２００ブルツゲ ・ベルトストラード６５

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ペプチド１８Ａの１個ないし数個のアミノ酸の置換、および／またはペプチ ド１８Ａの１個ないし数個のアミノ酸の欠失、および／またはペプチド１８Ａの １個ないし数個のアミノ酸の付加によって、ペプチド１８Ａから得られるペプチ ドを含んでなるか、またはそのペプチドによって構成されるペプチドもしくはタ ンパク質であって、該ペプチドは、ペプチド１８Ａとは異なるものであって、− それは、各ターンが３．６アミノ酸残基をもつ２〜８、好ましくは５ターンをも つαヘリックスの形でコイルをなし、 −該ヘリックスの直径は、約１３Å〜約１６Å、好ましくは約１５Åであり、− 該ヘリックスの二つの連続するターンを分ける距離は、約４Å〜約６Å、好まし くは約５Åであり、−ヘリックスの長さは、約１０Å〜約３０Å、好ましくは約 ２４Å〜や２６Å、より好ましくは約２５Åであり、−それは、両親媒性であり 、 −疎水性ｐｈｏ角の値は、約１２０°〜約１８０°、好ましくは約１４０°〜約 １８０°であり、 −親水性ｐｈｉ角の値は、約１８０°〜約２４０°、好ましくは約１８０°〜約 ２２０°であり、 −該ペプチドは、 ＊位置４のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡｓｐであるか、＊および／または位置６ のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡＳｐであるか、 ＊および／または位置８のアミノ酸がＬｙｓもしくはＡｒｇであるか、 ＊および／または位置１１のアミノ酸がＧｌｕもしくはＡｓｐであるか、のいず れかであり、 そのペプチドのカルボキシ末端およびアミノ末端は、好ましくは保護基によって ブロックされている、 の特徴を有する。
2. ２．請求の範囲１に定義されたようなペプチドを含むか、またはそのペプチドに よって構成される、該ペプチドが、請求の範囲１記載の他のペプチドとともに円 盤状の複合体を形成するために、リン脂質と、またはリン脂質およびコレステロ ールと、結合もしくは会合することができ、該ペプチドが、前記の該リン脂質− タンパク質複合体において、−各々のペプチドは、３．６アミノ酸残基を含んで なる各該ターンをもつ２〜８、好ましくは５ターンを含んでなるαヘリックスの 形において存在し、 −前記ヘリックスが、約１３Å〜約１６Å、好ましくは約１５Åの直径を有し、 −該ヘリックスの二つの連続するターンを分ける距離は、約４Å〜約６Å、好ま しくは約５Åであり、 −ヘリックスの長さが、約１０Å〜約３０Å、好ましくは約２４Å〜約２６Å、 より好ましくは約２５Åであり、−疎水性ｐｈｏ角の値が、約１２０°〜約１８ ０°、好ましくは約１４０°〜約１８０°の範囲であり、 −親水性ｐｈｉ角の値が、約１８０°〜約２４０°、好ましくは約１８０°〜約 ２２０°の範囲であり、 −各ペプチドが、その隣接ペプチドの一つによって構成される連続する逆平行ヘ リックスの反対側のアミノ酸とのイオン結合において、相互作用しやすい少なく とも一つのアミノ酸を含有し、このイオン結合に関与する対立アミノ酸間の距離 は、約１０Å以下、好ましくは約６Å〜約８Å、より好ましくは５Å以下であり 、−上記アミノ酸間の相互作用のエネルギーが、少なくとも＋５ｋｃａ１／ｍｏ ｌｅ、好ましくは−１０〜−１ｋｃａｌ／ｍｏｌｅである、請求の範囲１のペプ チドもしくはタンパク質。
3. ３．ペプチドが、請求の範囲２の他のペプチド、好ましくは該ペプチドと同一で あるペプチドとともに、リン脂質−ペプチド複合体を形成する、請求の範囲２に 定義されたペプチドによって構成される、該複合体が、約１５〜２５、好ましく は２０ペプチドを含み、そして該複合体が、厚さ約３８Å〜約４２Å、好ましく は約４０Å、その直径が、非変性勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって 評価される場合に直径約８０Å〜約１５０Å、好ましくは約８０Å〜１２０Åを 示す、請求の範囲２記載のペプチドもしくはタンパク質。
4. ４．ペプチドが、形態上、二量体、すなわち各ペプチドのそれそれのヘリックス が、好ましくはβ鎖構造によって連結されており、該構造が、好ましくは５アミ ノ酸を含有し、それらの一つが、好ましくはＮもしくはＣ末端部分からの位置３ においてプロリンであり、この二量体は、Ｘがバリン、アラニン、グリシン、よ り好ましくはグリシンであるＸ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘのような好ましく は場合によってＣ−もしくはＮ−末端に位置する配列によって閉鎖されている請 求の範囲１〜３のいずれかに記載のペプチドもしくはタンパク質。
5. ５．ペプチドが、リン脂質、およびさらに場合によりコレステロールと会合され ているときには、それは、天然の血漿アポＡＩ（ヒト血漿から精製）一リン脂質 複合体を用いて調製された複合体によるレシチンコレステロールアシル・トラン スフェラーゼ（ＬＣＡＴ）活性化の約１０％以上の量、好ましくは約２０％〜４ ０％の量で、ＬＣＡＴを活性化することができ、この活性化が、例えばコール酸 塩の透析によって調製されたモル比１０／１／１におけるＰＬＰＣ（パルミトイ ルリノレイルホスファチジルコリン）／コレステロール／ペプチドの複合体から なる基質調製物を用いて測定されるものであり、ＬＣＡＴが、コレステリルェス テルｎｍｏｌｅ／ｈ／ＬＣＡＴｍｌにおいて表示されるものであり、コレステリ ルエステルが例えばリノール酸コレステリルであって、ＨＰＬＣによって測定さ れる（Ｖｅｒｃａｅｍｓｔ　ｅｔ　ａｌ，１９８９）ものである請求の範囲１〜 ４のいずれかに記載のペプチドもしくはタンパク質。
6. ６．−ペプチドもしくはタンパク質が、リン脂質、およびさらに場合によってコ レステロールとの複合体に会合されるときには、それが、２９５ｎｍでの励起後 、Ｔｒｐ蛍光発光により測定すると、４ＭのＧｄｍＣ１まで、好ましくは２Ｍ〜 ４ＭのＧｄｍＣｌの範囲において、ＧｄｍＣ１変性に対して安定であり、 −それが、約３モルのリン脂質／ペプチドモル〜約９モルのリン脂質／ペプチド モル、好ましくは約５モルのリン脂質／ペプチドモルにおいてリン脂質に対する 結合能を有し、 −それが、遊離ペプチドとリン脂質複合体のペプチドとの間の差異が、赤外分光 法もしくは円偏光二色性法により測定して少なくとも１５％であるように増大す るαヘリックス含量をもつ、請求の範囲１〜５のいずれかに記載のペプチドもし くはタンパク質。
7. ７．該ペプチドが、リン脂質と会合される場合に、それは、複合体でのペプチド 濃度約１００μｇ／ｍｌにおいて、コレステロール蓄積細胞から遊離コレステロ ールの形で、遊離コレステロールの約２０〜２５μｇ、好ましくは約２５μｇの 最大コレステロール流出を引き起こす請求の範囲１〜６のいずれかに記載のペプ チドもしくはタンパク質。
8. ８．次の式 Ｍ１【配列があります】（配列番号１）Ｍ２【配列があります】（配列番号２） Ｍ３【配列があります】（配列番号３）Ｍ４【配列があります】（配列番号４） のペプチドの少なくともいずれか一つを含有してなるか、または該ペプチドのい ずれか一つによって構成される、請求の範囲１記載のペプチドもしくはタンパク 質。
9. ９．請求の範囲１〜７に定義されたタンパク質もしくはペプチドのいずれかの少 なくとも一種、リン脂質および場合によってコレステロールを含んでなり、該リ ン脂質の量が、好ましくは前記ペプチドのモル当たり約３モル〜約９モルであり 、好適には、ペプチドに関してリン脂質のモル比において２／１〜４／１の範囲 であり、そしてコレステロールの量が、リン脂質の量に関して０〜１０％（ｗ／ ｗ）であるリン脂質−タンパク質複合体。
10. １０．該複合体が、タンパク質を多重ラメラＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファ チジルコリン）リボソームと混合し、その混合液が１５〜２５℃に加熱される場 合には、ＤＭＰＣに関して、３４０ｎｍにおいて約０．７〜約０．０５の濁度低 下を与える請求の範囲９記載のリン脂質−タンパク質複合体。
11. １１．相互に積み重ねられている、請求の範囲９もしくは１０のいずれかに記載 のリン脂質−タンパク質複合体。
12. １２．リン脂質が、 ＤＭＰＣ：（ジミリストイルホスファチジルコリン）ＤＰＰＣ：（ジパルミトイ ルホスファチジルコリン）ＰＯＰＣ：（パルミトイルオレオリルホスファチジル コリン）ＰＬＰＣ：（パルミトイルリノレイルホスファチジルコリン）、または 卵ＰＣ（卵ホスファチジルコリン）、そしてより好ましくはＤＰＰＣの中から選 ばれる、請求の範囲９もしくは１０のいずれかに記載のリン脂質−タンパク質複 合体。
13. １３．コール酸ナトリウムのような界面活性剤の存在下で、好ましくはリン脂質 ／ペプチド３／１（ｗ／ｗ）比、およびコレステロール／リン脂質（ｗ／ｗ）０ 〜１０％において、リン脂質および場合によってコレステロールと請求の範囲１ 〜８記載のタンパク質のいずれか一種とをインキユベートして、リン脂質−タン パク質複合体を得、続いて界面活性剤を透析し、そして遊離タンパク質、遊離リ ン脂質および場合によって遊離コレステロールを除去するために、該複合体を例 えばゲル瀘過もしくは密度勾配超遠心によって分画する段階を含んでなる請求の 範囲９〜１１のいずれかに記載のリン脂質−タンパク質複合体の調製方法。
14. １４．心臓血管病もしくは内毒素ショックの治療のための、請求の範囲１〜８の いずれかに記載のペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲９〜１２記載 のリン脂質−タンパク質複合体。
15. １５．生理学的に適切な医薬担体との組み合わせにおいて、活性物質として請求 の範囲８〜１０記載のリン脂質−タンパク質複合体のいずれか一種を含んでなる 医薬組成物。
16. １６．体重１ｋｇ当たりリン脂質−タンパク質複合体約１０〜約１２５ｍｇ、特 に約６５ｍｇを含んでなる請求の範囲１５記載の医薬組成物。
17. １７．本発明のリン脂質−タンパク質複合体は、アテローム性動脈硬化病斑の進 行の低減および退行を誘導することによる冠動脈の重露な狭窄症および抹梢血管 疾患のような心臓血管病の治療、また内毒素ショックの治療に当てられる薬剤の 調製のための、請求の範囲８〜１０のいずれかに記載のペプチドの使用。