DE69839014T2

DE69839014T2 - Apolipoprotein a-i agonisten und deren verwendung zur behandlung dyslipidämischer erkrankungen

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Publication number: DE69839014T2
Application number: DE69839014T
Authority: DE
Inventors: Jean-Louis Dasseux; Renate Sekul; Klaus Buttner; Isabelle Cornut; Gunther Metz; Jean Dufourcq
Original assignee: DASSEUX JEAN LOUIS
Current assignee: DASSEUX JEAN LOUIS
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2009-01-08
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: NO20001599L; ES2331808T3; US20030203842A1; US6376464B1; EP1854471B1; PL339629A1; EP1019073A4; RU2215747C2; WO1999016459A1; US6753313B1; AU746090B2; EP1019073A1; KR100650929B1; IL135318A0; JP2001518282A; US7312190B2; HUP0002381A3; US6716816B1; CA2304805A1; EP1854471A1

Description

1. EINFÜHRUNG
Die Erfindung betrifft Apolipoprotein-A-I-(ApoA-I)-Agonist-Zusammensetzungen zum Behandeln von Erkrankungen, die mit Dyslipoproteinämie verbunden sind, die Hypercholesterinämie, kardiovaskuläre Krankheit, Atherosklerose, Restenose und andere Erkrankungen wie beispielsweise septischen Schock einschließen.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zirkulierendes Cholesterin wird durch Plasmalipoproteine – Teilchen von komplexer Lipid- und Proteinzusammensetzung, die Lipide im Blut transportieren – getragen. Lipoproteine niederer Dichte (LDL) und Lipoproteine hoher Dichte (HDL) sind die hauptsächlichen Cholesterinträger. Es wird angenommen, daß die LDL für die Zuführung von Cholesterin aus der Leber (wo es synthetisiert oder aus Nahrungsmittelausgangsstoffen erhalten wird) zu extrahepatischen Geweben im Körper verantwortlich sind. Der Begriff „reverser Cholesterintransport" beschreibt den Transport von Cholesterin aus extrahepatischem Gewebe in die Leber, wo es katabolisiert und eliminiert wird. Es wird angenommen, daß Plasma-HDL-Teilchen eine Hauptrolle in dem reversen Transportprozeß spielen, indem sie als Fänger von Gewebecholesterin wirken.
Die Beweislage, die erhöhtes Serumcholesterin mit koronarer Herzkrankheit verknüpft, ist überwältigend. Zum Beispiel ist Atherosklerose eine langsam fortschreitende Krankheit, die durch die Ansammlung von Cholesterin innerhalb der Arterienwand gekennzeichnet ist. Zwingender Beweis stützt das Konzept, daß Lipide, abgelagert in atherosklerotischen Läsionen, in erster Linie von Plasma-LDL abgeleitet sind; so sind LDLs landläufig als das „schlechte" Cholesterin bekannt geworden. Im Gegensatz dazu korrelieren HDL-Serumspiegel umgekehrt mit koronarer Herzkrankheit – in der Tat werden hohe Serumspiegel von HDL als negativer Risikofaktor angesehen. Es wird die Hypothese aufgestellt, daß hohe Spiegel von Plasma-HDL nicht nur gegen koronare Herzkrankheit schützen, sondern tatsächlich die Rückbildung von atherosklerotischen Plaquen induzieren können (z. B. siehe Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Ergänzungsband III): 86–94).
So ist HDL landläufig als das „gute" Cholesterin bekannt geworden.
2.1. CHOLESTERINTRANSPORT
Das Fett-Transportsystem kann in zwei Wege unterteilt werden: einen exogenen für Cholesterin und Triglyceride, absorbiert aus dem Darm, und einen endogenen für Cholesterin und Triglyceride, eintretend in den Blutstrom aus der Leber und anderem nichthepatischen Gewebe.
Auf dem exogenen Weg werden Nahrungsmittelfette in Lipoproteinteilchen, genannt Chylomikrone, verpackt, welche in den Blutstrom eintreten und ihre Triglyceride an Fettgewebe (zur Lagerung) und an die Muskulatur (zur Oxidation für die Zuführung von Energie) abgeben. Der Überrest des Chylomikrons, enthaltend Cholesterinester, wird aus dem Blutkreislauf durch einen spezifischen Rezeptor, gefunden nur auf Leberzellen, entfernt. Dieses Cholesterin wird dann wiederum für zellulären Metabolismus oder zur Rückführung in extrahepatische Gewebe als Plasmalipoproteine verfügbar.
Auf dem endogenen Weg sekretiert die Leber ein großes Lipoproteinteilchen sehr geringer Dichte (VLDL) in den Blutstrom. Der Kern von VLDLs besteht zum größten Teil aus Triglyceriden, synthetisiert in der Leber, mit einem kleineren Anteil von Cholesterinestern (entweder synthetisiert in der Leber oder rückgeführt aus Chylomikronen). Zwei vorherrschende Proteine werden auf der Oberfläche von VLDLs gezeigt, Apoprotein B-100 und Apoprotein E. Wenn ein VLDL die Kapillaren von Fettgewebe oder von Muskulatur erreicht, werden seine Triglyceride extrahiert, was zu einer neuen Art von Teilchen, vermindert in der Größe und angereichert an Cholesterinestern, aber festhaltend seine zwei Apoproteine, führt, das Lipoprotein intermediärer Dichte (IDL) genannt wird.
Bei Menschen wird etwa die Häfte der IDL-Teilchen schnell (innerhalb von zwei bis sechs Stunden nach ihrer Bildung) aus dem Blutkreislauf entfernt, weil sie fest an Leberzellen binden, welche ihr Cholesterin extrahieren, wobei neues VLDL und Gallensäuren hergestellt werden. Die IDL-Teilchen, welche nicht von der Leber aufgenommen werden, bleiben länger im Blutkreislauf. Mit der Zeit dissoziiert das Apoprotein E von den zirkulierenden Teilchen, wobei sie in LDL mit Apoprotein B-100 als ihrem einzigen Protein umgewandelt werden.
In erster Linie nimmt die Leber den größten Teil des Cholesterins auf und baut es zu Gallensäuren ab, welche die Endprodukte des Cholesterinstoffwechsels sind. Die Aufnahme von Cholesterin enthaltenden Teilchen wird von LDL-Rezeptoren vermittelt, welche in hohen Konzentrationen auf Hepatozyten vorhanden sind. Der LDL-Rezeptor bindet sowohl Apoprotein E als auch Apoprotein B-100 und ist für Binden und Entfernen von sowohl IDLs als auch LDLs aus dem Blutkreislauf verantwortlich. Jedoch ist die Affinität von Apoprotein E für den LDL-Rezeptor größer als die von Apoprotein B-100. Infolgedessen haben die LDL-Teilchen eine viel längere Lebensdauer im Blutkreislauf als IDL-Teilchen – LDLs zirkulieren für im Mittel zwei und einen halben Tag, bevor sie sich an die LDL-Rezeptoren in der Leber und anderen Geweben binden. Hohe Serumspiegel von LDL (das „schlechte" Cholesterin) sind positiv mit koronarer Herzkrankheit verbunden. Zum Beispiel sammelt sich bei Atherosklerose Cholesterin, abgeleitet von zirkulierenden LDLs, in den Wanden von Arterien an, was zu der Bildung von voluminösen Plaquen führt, die den Blutstrom hemmen, bis sich schließlich ein Koagulum bildet, was die Arterie verstopft, wobei eine Herzattacke oder ein Schlaganfall verursacht wird.
Letzten Endes kontrolliert die Menge von intrazellulärem Cholesterin, freigesetzt von den LDLs, den zellulären Cholesterinstoffwechsel. Die Ansammlung von zellulärem Cholesterin, abgeleitet von VLDLs und LDLs, kontrolliert drei Prozesse: erstens verringert sie zelluläre Cholesterinsynthese, indem die Synthese von HMGCoA-Reduktase – einem Schlüsselenzym in dem Cholesterin-Biosynthese-Weg – abgeschaltet wird. Zweitens fördert das hereinkommende LDL-abgeleitete Cholesterin die Lagerung von Cholesterin durch Aktivieren von ACHT – dem zellulären Enzym, welches Cholesterin in Cholesterinester umwandelt, die in Vorratströpfchen abgelagert werden. Drittens steuert die Ansammlung von Cholesterin innerhalb der Zelle einen Feedback-Mechanismusus, der die zelluläre Synthese von neuen LDL-Rezeptoren hemmt. Zellen, passen daher ihr Komplement von LDL-Rezeptoren an, so daß genug Cholesterin hereingebracht wird, um ihre Stoffwechselanforderungen zu erfüllen, ohne sie zu überlasten. (Für eine Übersicht siehe Brown & Goldstein, in The Pharmacological Basis Of Therapeutics (Die pharmakologische Basis von Therapeutika), 8. Aufl., Goodman & Gilman, Pergamon Press, NY, 1990, Kap. 36, S. 874–896).
2.2. REVERSER CHOLESTERINTRANSPORT
Insgesamt erhalten periphere (nichthepatische) Zellen ihr Cholesterin aus einer Kombination von lokaler Synthese und der Aufnahme von vorgebildetem Sterol aus VLDLs und LDLs. Im Gegensatz dazu ist reverser Cholesterintransport (RCT) der Weg, durch welchen Cholesterin peripherer Zellen zur Rückführung in extrahepatische Gewebe, oder Exkretion in den Darm in Galle, entweder in modifizierter oder in oxidierter Form als Gallensäuren, zu der Leber zurückgeführt werden kann. Der RCT-Weg stellt das einzige Mittel dar, um Cholesterin aus den meisten extrahepatischen Geweben zu eliminieren, und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Struktur und Funktion der meisten Zellen im Körper.
Der RCT besteht aus hauptsächlich aus drei Schritten: (a) Cholesterinabfluß, der anfänglichen Entfernung von Cholesterin aus verschiedenartigen Pools von peripheren Zellen; (b) Cholesterinveresterung durch die Wirkung von Lecithin:Cholesterin-Acyltransferase (LCAT), die einen Wiedereintritt von abgeflossenem Cholesterin in Zellen verhindert; und (c) Aufnahme/Zuführung von HDL-Cholesterinester an Leberzellen. Der RCT-Weg wird von HDLs vermittelt. HDL ist eine generelle Bezeichnung für Lipoproteinteilchen, welche durch ihre hohe Dichte gekennzeichnet sind. Die hauptsächlichen lipidischen Bestandteile von HDL-Komplexen sind verschiedenartige Phospholipide, Cholesterin(ester) und Triglyceride. Die prominentesten Apolipoprotein-Komponenten sind A-I und A-II, welche die funktionellen charakteristischen Eigenschaften von HDL bestimmen; weiterhin sind kleinere Mengen der Apolipoproteine C-I, C-II, C-III, D, E, J usw. beobachtet worden. HDL kann in einer breiten Vielfalt unterschiedlichen Größen und unterschiedlicher Gemische der vorstehend erwähnten Bestandteile, abhängig von dem Status der Remodellierung während der metabolischen RCT-Kaskade, existieren.
Das Schlüsselenzym, das an dem RCT-Weg beteiligt ist, ist LCAT. LCAT wird hauptsächlich in der Leber erzeugt und zirkuliert im Plasma, assoziiert mit der HDL-Fraktion. LCAT wandelt zellabgeleitetes Cholesterin in Cholesterinester um, welche in HDL, bestimmt zur Entfernung, sequestriert werden. Cholesterinester-Transferprotein (CETP) und Phospholipid-Transferprotein (PLTP) tragen zu weiterer Remodellierung der zirkulierenden HDL-Population bei. CETP kann Cholesterinester hergestellt durch LCAT, zu anderen Lipoproteinen, insbesondere ApoB enthaltenden Lipoproteinen, wie beispielsweise VLDL und LDL, bewegen. PLTP liefert Lecithin an HDL. HDL-Triglyceride können durch die extrazelluläre hepatische Triglycerid-Lipase katabolisiert werden, und Lipoprotein-Cholesterin wird durch die Leber über verschiedene Mechanismen entfernt.
Jedes HDL-Teilchen enthält mindestens eine Kopie (und gewöhnlich zwei bis vier Kopien) von ApoA-I. ApoA-I wird durch die Leber und den Dünndarm als Präproapolipoprotein synthetisiert, welches als Proprotein sekretiert wird, das schnell gespalten wird, wobei ein reifes Polypeptid mit 243 Aminosäureresten erzeugt wird. ApoA-I besteht hauptsächlich aus 6 bis 8 verschiedenen Wiederholungen mit 22 Aminosäuren, mit Zwischenraum angeordnet durch eine Verknüpfungseinheit, welche oft Prolin ist, und besteht in einigen Fällen aus einem Abschnitt, hergestellt aus verschiedenen Resten. ApoA-I bildet drei Typen von stabilen Komplexen mit Lipiden: kleine, lipidarme Komplexe, bezeichnet als pre-beta-1-HDL; abgeflachte scheibenförmige Teilchen, enthaltend polare Lipide (Phospholipid und Cholesterin), bezeichnet als pre-beta-2-HDL; und kugelförmige Teilchen, enthaltend sowohl polare als auch nichtpolare Lipide, bezeichnet als kugelförmiges oder reifes HDL (HDL₃ und HDL₂). Der größte Teil des HDL in der zirkulierenden Population enthält sowohl ApoA-I als auch ApoA-II (das zweite hauptsächliche HDL-Protein) und wird hier als die AI/AII-HDL-Fraktion von HDL bezeichnet. Jedoch scheint die Fraktion von HDL, die nur ApoA-I enthält (hier als die AI-HDL-Fraktion bezeichnet), im RCT wirksamer zu sein. Bestimmte epidemiologische Studien unterstützen die Hypothese, daß die AI-HDL-Fraktion anti-atherogen ist. (Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12: 701–707; Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27: 299–307).
Obwohl der Mechanismusus für Cholesterinüberführung von der Zelloberfläche (d. h. Cholesterinabfluß) unbekannt ist, wird angenommen, daß der lipidarme Komplex pre-beta-1-HDL der bevorzugte Akzeptor für Cholesterin überführt von peripherem Gewebe, beteiligt am RCT, ist. (Siehe Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 22975–22982; Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33: 1699–1709; Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33: 1091–1097; und Kawano et al., 1993, Biochemistry 32: 5025–5028; Kawano et al., 1997, Biochemistry 36: 9816–9825). Während dieses Vorgangs der Cholesterinrekrutierung von der Zelloberfläche wird pre-beta-1-HDL schnell in pre-beta-2-HDL umgewandelt. PLTP kann die Geschwindigkeit der Bildung der pre-beta-2-Scheibe erhöhen, aber Daten, die eine Rolle für PLTP im RCT anzeigen, fehlen. LCAT reagiert vorzugsweise mit scheibenförmigem und kugelförmigem HDL, wobei die 2-Acylgruppe von Lecithin oder anderen Phospholipiden zu dem freien Hydroxylrest von Cholesterin überführt wird, wobei Cholesterinester (zurückgehalten im HDL) und Lysolecithin erzeugt werden. Die LCAT-Reaktion erfordert ApoA-1 als Aktivator; d. h., ApoA-I ist der natürliche Cofaktor für LCAT. Die Umwandlung von Cholesterin in seinen Ester, sequestriert in dem HDL, verhindert Wiedereintritt von Cholesterin in die Zelle, wobei das Ergebnis ist, daß Cholesterinester zur Entfernung bestimmt werden. Cholesterinester in den reifen HDL-Teilchen in der AI-HDL-Fraktion (d. h. ApoA-I und kein ApoA-II enthaltend) werden durch die Leber entfernt und wirksamer zu Galle verarbeitet als diejenigen, abgeleitet von HDL, die sowohl ApoA-I als auch ApoA-II enthalten (die AI/AII-HDL-Fraktion). Dies kann teilweise auf die wirksamere Bindung von AI-HDL an die Hepatozytenmembran zurückzuführen sein. Die Existenz eines HDL-Rezeptors wurde als Hypothese aufgestellt, und kürzlich wurde ein Fänger-Rezeptor, SR-BI als HDL-Rezeptor identifiziert (Acton et al., 1996, Science 271: 518–520; Xu et al., 1997, J. Lipid Res. 38: 1289–1298). Der SR-BI wird in reichstem Maße in steroidogenen Geweben (z. B. den Nebennieren), und in der Leber (Landshulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98: 984–995; Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 33545–33549) exprimiert.
CETP scheint keine größere Rolle in RCT zu spielen und ist stattdessen an dem Metabolismus von VLDL- und LDL-abgeleiteten Lipiden beteiligt. Jedoch spielen Veränderungen in der CETP-Aktivität oder bei seinen Akzeptoren, VLDL und LDL, eine Rolle in der „Remodellierung" der HDL-Population. Zum Beispiel werden in der Abwesenheit von CETP die HDLs zu vergrößerten Teilchen, welche nicht aufgeklärt sind. (Zu Übersichten über RCT und HDLs siehe Fielding & Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36: 211–228; Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta. 1300: 73–85; Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6): 1053–1059).
2.3. GEGENWÄRTIGE BEHANDLUNGEN FÜR DYSLIPOPROTEINÄMIEN
Eine Anzahl von Behandlungen ist gegenwärtig zum Senken von Serumcholesterin und Triglyceriden verfügbar (siehe z. B. Brown & Goldstein, vorstehend). Jedoch hat jede ihre eigenen Nachteile und Begrenzungen hinsichtlich Wirksamkeit, Nebenwirkungen und Qualifizierung der Patientenpopulation.
Gallensäure bindende Harze sind eine Klasse von Arzneimitteln, die die Rückführung von Gallensäuren aus dem Darm in die Leber unterbrechen; z. B. Cholestyramin (Questran Light^®, Bristol Myers Squibb), und Colestipol-Hydrochlorid (Colestid^®, The Upjohn Company). Wenn oral eingenommen binden diese positiv geladenen Harze an die negativ geladenenGallensäuren im Darm. Weil die Harze aus dem Darm nicht absorbiert werden können, werden sie ausgeschieden, wobei sie die Gallensäuren mit sich tragen. Die Verwendung derartiger Harze senkt jedoch Serumcholesterinspiegel bestenfalls nur um etwa 20% und ist mit gastrointestinalen Nebenwirkungen verbunden, zu denen Verstopfung und bestimmte Vitaminmangelzustände gehören. Überdies müssen, da die Harze andere Arzneimittel binden, andere orale medimenkatöse Behandlungen mindestens eine Stunde vor oder vier bis sechs Stunden nach der Aufnahme des Harzes eingenommen werden; wobei so Arzneimittelregimes von Herzpatienten kompliziert werden.
Die Statine sind Cholesterin senkende Mittel, die die Cholesterinsynthese durch Hemmen von HMGCoA-Reduktase, dem an dem Cholesterin-Biosyntheseweg beteiligten Schlüsselenzym, blockieren. Die Statine, z. B. Lovastatin (Mevacor^®, Merck & Co., Inc.) und Pravastatin (Pravachol^®, Bristol-Myers Squibb Co.), werden manchmal in Kombination mit Gallensäure bindenden Harzen verwendet. Die Staune senken Serumcholesterin- und LDL-Serum-Spiegel bedeutsam und verlangsamen das Fortschreiten von koronarer Atherosklerose. Jedoch werden Serum-HDL-Cholesterinspiegel nur mäßig erhöht. Der Mechanismusus der LDL senkenden Wirkung kann sowohl Senkung der VLDL-Konzentration als auch Induktion zellulärer Expression von LDL-Rezeptor beinhalten, was zu verringerter Erzeugung und/oder erhöhtem Katabolismus von LDLs führt. Nebenwirkungen einschließlich Leber- und Nierendysfunktion sind mit der Verwendung dieser Arzneimittel verbunden (Physicians Desk Reference, Medical Economics Co., Inc., Montvale, NJ, 1997). Kürzlich hat die FDA Atorvastatin (ein HMGCoA-Reduktase-Inhibitor, entwickelt von Parke-Davis) (Warner Lambert) für den Markt genehmigt, um seltene, aber dringende Fälle von familiärer Hypercholesterinämie zu behandeln (1995, Scrip 20(19): 10).
Niacin oder Nicotinsäure ist ein wasserlöslicher Vitamin-B-Komplex, der als Nahrungsmittelzusatz und antihyperlipidämisches Mittel verwendet wird. Niacin vermindert die Erzeugung von VLDL und ist beim Senken von LDL wirksam. In einigen Fällen wird es in Kombination mit Gallensäure bindenden Harzen verwendet. Niacin kann HDL erhöhen, wenn es mit adäquaten Dosen verwendet wird, jedoch ist seine Verwendbarkeit durch ernste Nebenwirkungen begrenzt, wenn es mit derartig hohen Dosen verwendet wird.
Fibrate sind eine Klasse von Lipid senkenden Arzneimitteln, die verwendet werden, um verschiedenartige Formen von Hyperlipidämie (d. h. erhöhte Serumtriglyceride), welche auch mit Hypercholesterinämie verbunden sein kann, zu behandeln. Fibrate scheinen die VLDL-Fraktion zu verringern und HDL mäßig zu erhöhen – jedoch sind die Auswirkungen dieser Arzneimittel auf Serumcholesterin variabel. In den Vereinigten Staaten sind Fibrate zur Verwendung als antilipidämische Arzneimittel genehmigt worden, aber haben keine Genehmigung als Hypercholesterinämie-Mittel erhalten. Zum Beispiel ist Clofibrat (Atromid-S^®, Wyeth-Ayerst Laboratories) ein antilipidämisches Mittel, welches (über einen unbekannten Mechanismus) wirkt, wobei Serumtriglyceride gesenkt werden, indem die VLDL-Fraktion verringert wird. Obwohl Serumcholesterin bei bestimmten Patientensubpopulationen verringert werden kann, ist die biochemische Reaktion auf das Arzneimittel variabel, und ist nicht immer möglich vorherzusagen welche Patienten günstige Ergebnisse erhalten werden. Es ist nicht gezeigt worden, daß Atromid-S^® zur Verhinderung von koronarer Herzkrankheit wirksam ist. Das chemisch und pharmakologisch verwandte Arzneimittel Gemfibrozil (Lopid^®, Parke-Davis) ist ein Lipid regulierendes Mittel, welches Serumtriglyceride und VLDL-Cholesterin mäßig verringert und HDL-Cholesterin – die HDL₂- und HDL₃-Subfraktionen ebenso wie sowohl ApoA-I als auch A-II (d. h. die AI/AII-HDL-Fraktion) – mäßig erhöht. Jedoch ist die Lipidreaktion heterogen, speziell zwischen verschiedenen Patientenpopulationen. Überdies ist es, wenn auch Verhinderung von koronarer Herzkrankheit bei männlichen Patienten zwischen 40–55 ohne Vorgeschichte oder Symptome von existierender koronarer Herzkrankheit beobachtet wurde, nicht klar, in welchem Ausmaß diese Ergebnisse für andere Patientenpopulationen (z. B. Frauen, ältere und jüngere Männer) extrapoliert werden können. In der Tat wurde keine Wirksamkeit bei Patienten mit etablierter koronarer Herzkrankheit beobachtet. Ernste Nebenwirkungen sind mit der Verwendung von Fibraten verbunden, die Toxizität wie beispielsweise Malignität, (insbesondere gastrointestinaler Krebs), Gallenblasenerkrankung und ein erhöhtes Auftreten von nicht-koronarer Mortalität einschließen. Diese Arzneimittel sind nicht für die Behandlung von Patienten mit hohem LDL oder niedrigem HDL als ihrer einzigen Lipidanormalität angezeigt (Physician's Desk Reference, 1997, Medical Economics Co., Inc. Montvale, NJ).
Orale Östrogenersatztherapie kann für mäßige Hypercholesterinämie bei post-menopausalen Frauen in Betracht gezogen werden. Jedoch können Zunahmen bei HDL von einer Zunahme bei Triglyceriden begleitet werden. Östrogenbehandlung ist natürlich auf eine spezielle Patientenpopulation (postmenopausale Frauen) begrenzt und ist mit ernsten Nebenwirkungen verbunden, zu denen Induktion von malignen Neoplasmen, Gallenblasenkrankheit, thromboembolische Krankheit, hepatisches Adenom, erhöhter Blutdruck, Glucoseintoleranz und Hypercalcämie gehören.
So gibt es einen Bedarf, sichere Arzneimittel zu entwickeln, die beim Senken von Serumcholesterin, Erhöhen von HDL-Serumspiegeln, Verhindern von koronarer Herzkrankheit und/oder Behandeln von existierender Krankheit, insbesondere Atherosklerose, wirksam sind.
2.4. APOA-I ALS ZIEL
Keines von den gegenwärtig verfügbaren Arzneimitteln zum Senken von Cholesterin erhöht sicher die HDL-Spiegel und stimuliert den RCT – die meisten scheinen auf dem Cholesterintransportweg zu wirken, wobei Nahrungsmittelaufnahme, Rückführung, Synthese von Cholesterin und die VLDL-Population moduliert werden.
Wenn es auch wünschenswert ist, Arzneimittel zu finden, die Cholesterinabfluß und -entfernung stimulieren, existieren verschiedene potentielle Ziele in dem RCT – z. B. LCAT, HDL und seine verschiedenartigen Komponenten (ApoA-I, ApoA-II und Phospholipide), PLTP und CETP – und es ist nicht bekannt, welches Ziel beim Erreichen wünschenswerter Lipoproteinprofile und Schutzwirkungen am wirksamsten sein würde. Störung einer einzigen Komponente in dem RCT-Weg beeinflußt letzten Endes die Zusammensetzung zirkulierender Lipoproteinpopulationen und die Wirksamkeit des RCT.
Verschiedene Beweislinien, basierend auf Daten, erhalten in vivo, bringen das HDL und seine hauptsächliche Proteinkomponente, ApoA-I, mit der Verhinderung von atherosklerotischen Läsionen und möglicherweise der Rückbildung von Plaquen in Zusammenhang – was diese zu attraktiven Zielen für therapeutische Intervention macht. Erstens existiert eine inverse Korrelation zwischen Serum-ApoA-I-(HDL)-Konzentration und Atherogenese beim Menschen (Gordon & Rifkind, 1989, N. Eng. J. Med. 321: 1311–1316; Gordon et al., 1989, Circulation 79: 8–15). In der Tat sind spezielle Subpopulationen von HDL mit einem verringerten Risiko für Atherosklerose bei Menschen in Verbindung gebracht worden (Miller, 1987, Amer. Heart 113: 589–597; Cheung et al., 1991, Lipid Res. 32: 383–394); Fruchart & Ailhaud, 1992, Clin. Chem. 38: 79).
Zweitens unterstützen Studien mit Tieren die schützende Rolle von ApoA-I (HDL). Behandlung von Cholesterin-gefütterten Kaninchen mit ApoA-I oder HDL verringerte die Entwicklung und das Fortschreiten von Plaque (Fatty Streaks (Fettstreifen)) bei Cholesterin-gefütterten Kaninchen. (Koizumi et al., 1988, J. Lipid Res. 29: 1405–1415; Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60: 455–461; Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 1234–1241). Jedoch variierte die Wirksamkeit abhängig von dem Ausgangsstoff von HDL (Beitz et al., 1992, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 47: 149–152; Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113: 237–246).
Drittens wurde direkter Beweis für die Rolle von ApoA-I aus Experimenten erhalten, die transgene Lebewesen einbezogen. Die Expression des humanen Gens für ApoA-I, übertragen auf Mäuse, genetisch prädisponiert für Ernährungs-induzierte Atherosklerose, schützte gegen die Entwicklung von Aortenläsionen (Rubin et al., 1991, Nature 353: 265–267). Es wurde auch gezeigt, daß das ApoA-I-Transgen Atherosklerose bei ApoE-defizienten Mäusen und bei Apo(a)-transgenen Mäusen unterdrückt (Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 899–903; Plump et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9607–9611; Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35: 2263–2266). Ähnliche Ergebnisse wurden bei transgenen Kaninchen beobachtet, die humanes ApoA-I exprimieren (Duverger, 1996, Circulation 94: 713–717; Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16: 1424–1429), und bei transgenen Ratten, wo erhöhte Spiegel von humanem ApoA-I gegen Atherosklerose schützten und Restenose nach Ballondilatation hemmten (Burkey et al., 1992, Circulation, Ergänzungsband I, 86: I–472, Abstract Nr. 1876; Burkey et al., 1995, J. Lipid Res. 36: 1463–1473).
Das AI-HDL scheint beim RCT wirksamer zu sein als die AI/AII-HDL-Fraktion. Studien mit Mäusen, transgen für humanes ApoA-I oder Apo-I und ApoA-II (AI/AII), zeigten, daß die Proteinzusammensetzung von HDL seine Rolle signifikant beeinflußt – AI-HDL ist starker anti-atherogen als AI/AII-HDL (Schultz et al., 1993, Nature 365: 762–764). Parallele Studien, die transgene Mäuse einbezogen, die das humane LCAT-Gen exprimieren, demonstrieren, daß mäßige Zunahmen in der LCAT-Aktivität Lipoprotein-Cholesterin-Spiegel signifikant ändern und daß LCAT eine signifikante Präferenz für HDL, enthaltend ApoA-I, hat (Francone et al., 1995, J. Clinic. Invest. 96: 1440–1448; Berard et al., 1997, Nature Medicine 3(7): 744–749). Während diese Daten eine signifikante Rolle für ApoA-I beim Aktivieren von LCAT und Stimulieren von RCT unterstützen, demonstrieren zusätzliche Studien ein komplizierteres Szenario: eine hauptsächliche Komponente von HDL, die den Abfluß von Zellcholesterin moduliert, sind die Phospholipide (Fournier et al., 1996, J. Lipid Res. 37: 1704–1711).
Angesichts der potentiellen Rolle von HDL, d. h. sowohl ApoA-I als auch sein assoziiertes Phospholipid, im Schutz gegen atherosklerotische Krankheit, wurden klinische Erprobungen mit Menschen unter Benutzung von rekombinant erzeugtem ApoA-I von UCB Belgium begonnen, unterbrochen und anscheinend wieder begonnen (Pharmaprojects, 27. Okt. 1995; IMS R & D Focus, 30. Juni 1997; Drug Status Update, 1997, Atherosclerosis 2(6): 261–265); siehe auch M. Eriksson im Kongreß „The Role of HDL in Disease Prevention (Die Rolle von HDL bei der Verhinderung von Krankheit)" 7.–9. Nov. 1996, Fort Worth; Lacko & Miller, 1997, J. Lip. Res. 38: 1267–1273; und WO94/13819 ) und wurden von Bio-Tech begonnen und unterbrochen (Pharmaprojects, 7. April 1989). Erprobungen wurden auch unter Verwendung von ApoA-I versucht, um septischen Schock zu behandeln (Opal, „Reconstituted HDL as a Strategy for Sepsis (Rekonstituiertes HDL als Behandlungsstrategie für Sepsis)", IBC's 7th International Conference an Sepsis (IBC, 7. Internationale Konferenz über Sepsis), 28.–30. April, 1997, Washington, D. C.; Gouni et al., 1993, J. Lipid Res. 94: 139–146; Levine, WO96/04916 ). Jedoch gibt es viele Fallen, verbunden mit der Erzeugung und Verwendung von ApoA-I, die es als Arzneimittel weniger als ideal machen; z. B. ist ApoA-I ein großes Protein, das schwierig und kostspielig herzustellen ist; bedeutsame Probleme der Herstellung und Reproduzierbarkeit müssen im Hinblick auf Stabilität während der Lagerung, Lieferung eines aktiven Produkts und Halbwertszeit in vivo überwunden werden.
Angesichts dieser Nachteile sind Versuche gemacht worden, um Peptide herzustellen, die ApoA-I nachahmen. Da die Schlüsselaktivitäten von ApoA-I dem Vorhandensein mehrfacher Wiederholungen eines einzigartigen sekundären strukturellen Merkmals in dem Protein – einer amphipathischen α-Helix der Klasse A (Segrest, 1974, FERS Lett. 38: 247–253) – zugeschrieben worden sind, haben sich die meisten Anstrengungen zur Gestaltung von Peptiden, welche die Aktivität of ApoA-I nachahmen, auf das Gestalten von Peptiden konzentriert, welche amphipathische α-Helices vom Klasse A-Typ bilden.
Amphipathische α-Helices vom Klasse-A-Typ sind einzigartig darin, daß positiv geladene Aminosäurereste an der hydrophob-hydrophilen Grenzfläche geclustert sind und negativ geladene Aminosäurereste in der Mitte der hydrophilen Vorderseite geclustert sind. Weiterhin haben α-helikale Peptide der Klasse A einen hydrophoben Winkel von weniger als 180° (Segrest et al., 1990, Proteins: Structure, Function and Genetics 8: 103–117). Die anfänglichen de-novo-Strategien zur Gestaltung von ApoA-I-Nachahmern basierten nicht auf den primären Sequenzen von natürlich vorkommenden Apolipoproteinen, sondern vielmehr auf dem Einbringen dieser einzigartigen Klasse-A-Helix-Merkmale in die Sequenzen der Peptidanalogen, ebenso wie einiger der Eigenschaften der ApoA-I-Domänen (siehe z. B. Davidson et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13605–13610; Rogers et al., 1997, Biochemistry 36: 288–300; Lins et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta biomembranes 1151: 137–142; Ji und Jonas, 1995, J. Biol. Chem. 270: 11290–11297; Collet et al., 1997, Journal of Lipid Research, 38: 634–644; Sparrow und Gotto, 1980, Ann. N. Y. Acad. Sci. 348: 187–211; Sparrow und Gotto, 1982, CRC Crit. Rev. Biochem. 13: 87–107; Sorci-Thomas et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 21403–21409; Wang et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta 174–184; Minnich et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 16553–16560; Holvoet et al., 1995, Biochemistry 34: 13334–13342; Sorci-Thomas et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(11): 7278–7284; und Frank et al., 1997, Biochemistry 36: 1798–1806).
In einer Studie haben Fukushima et al. ein Peptid mit 22 Resten synthetisiert, das vollständig aus Glu-, Lys- und Leu-Resten besteht, die periodisch angeordnet sind, so daß sie eine amphipathische α-Helix mit gleichen hydrophilen und hydrophoben Oberseiten bilden („ELK-Peptid") (Fukushima et al., 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101(13): 3703–3704; Fukushima et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 10651–10657). Das ELK-Peptid teilt 41% Sequenzhomologie mit dem 198–219-Fragment von ApoA-I. Wie durch quantitative Ultrafiltration, Gelpermeationschromatographie und Circulardichroismus untersucht, wurde gezeigt, daß dieses ELK-Peptid wirksam mit Phospholipiden assoziiert und einige der physikalischen und chemischen Eigenschaften von ApoA-1 nachahmt (Kaiser et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1137–1140; Kaiser et al., 1984, Science 223: 249–255; Fukushima et al., 1980, vorstehend; Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087–7092). Yokoyama et al. schlußfolgerten aus derartigen Studien, daß der entscheidende Faktor für LCAT-Aktivierung einfach das Vorhandensein einer hinreichend großen amphipathischen Struktur ist (Yokoyama et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(15): 7333–7339). Es wurde später gefunden, daß ein Dimer dieses Peptids mit 22 Resten ApoA-I näher nachahmt als das Monomer; basierend auf diesen Ergebnissen wurde vermutet, daß das 44-mer, welches in der Mitte durch einen Helixbrecher (entweder Gly oder Pro) unterbrochen ist, die minimale funktionelle Domäne in ApoA-I darstellt (Nakagawa et al., 1985, vorstehend).
Eine andere Studie beinhaltete modellmäßige amphipathische Peptide, genannt „LAP-Peptide" (Pownall et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77(6): 3154–3158; Sparrow et al., 1981, in: Peptides: Synthesis-Structure-Function (Peptide: Synthese-Struktur-Funktion), Roch und Gross, Hrsg., Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 253–256). Basierend auf Studien zur Lipidbindung mit Fragmenten von nativen Apolipoproteinen wurden verschiedene LAP-Peptide, genannt LAP-16, LAP-20 und LAP-24 (enthaltend 16, 20 bzw. 24 Aminosäurereste), gestaltet. Diese modellmäßigen amphipathischen Peptide teilen keine Sequenzhomologie mit den Apolipoproteinen und wurden gestaltet, um hydrophile Oberseiten zu haben, die in einer Weise unähnlich den amphipathischen helikalen Domänen vom Klasse-A-Typ, assoziiert mit Apolipoproteinen, organisiert sind (Segrest et al., 1992, J. Lipid Res. 33: 141–166). Aus diesen Studien schlußfolgerten die Autoren, daß eine minimale Länge von 20 Resten notwendig ist, um Lipidbindungseigenschaften auf modellmäßige amphipathische Peptide zu übertragen.
Studien mit Mutanten von LAP20, die einen Prolin-Rest an verschiedenen Positionen in der Sequenz enthielten, zeigten an, daß eine direkte Beziehung zwischen Lipidbindung und LCAT-Aktivierung existiert, aber daß das helikale Potential eines Peptids allein nicht zu LCAT-Aktivierung führt (Ponsin et al., 1986 J. Biol. Chem. 261(20): 9202–9205). Überdies verringerte das Vorhandensein dieses Helixbrechers (Pro) nahe der Mitte des Peptids seine Affinität für Phospholipidoberflächen ebenso wie seine Fähigkeit, LCAT zu aktivieren. Wenn auch gezeigt wurde, daß bestimmte von den LAP-Peptiden Phospholipide binden (Sparrow et al., vorstehend), existiert eine Kontroverse, was das Ausmaß betrifft, in welchem LAP-Peptide in Gegenwart von Lipiden helikal sind (Buchko et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(6): 3039–3045; Zhong et al., 1994, Peptide Research 7(2): 99–106).
Segrest et al. haben Peptide, bestehend aus 18 bis 24 Aminosäureresten, synthetisiert, die keine Sequenzhomologie mit den Helices von ApoA-1 teilen (Kannelis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(3): 11464–11472; Segrest et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 2290–2295). Die Sequenzen wurden speziell gestaltet, um die amphipathischen helikalen Domänen von austauschbaren Apolipoproteinen der Klasse A hinsichtlich des hydrophoben Moments (Eisenberg et al., 1982, Nature 299: 371–374) und der Ladungsverteilung (Segnest et al., 1990, Proteins 8: 103–117; US-Patentschrift 4643988 ) nachzuahmen. Ein Peptid mit 18 Resten, das „18A"-Peptid, wurde gestaltet, um eine modellmäßige α-Helix der Klasse-A zu sein (Segrest et al., 1990, vorstehend). Studien mit diesen Peptiden und anderen Peptiden mit einer umgekehrten geladenen Verteilung, ähnlich dem „18R"-Peptid, haben übereinstimmend gezeigt, daß Ladungsverteilung kritisch für Aktivität ist; Peptide mit einer umgekehrten Ladungsverteilung zeigen verminderte Lipidaffinität relativ zu den 18A-Klasse-A-Nachahmern und einen niedrigeren helikalen Gehalt in Gegenwart von Lipiden (Kanellis et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 11464–11472; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 10248–10255; Chung et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 10256–10262; Epand et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 9389–9396; Anantharamaiah et al., 1991, Adv. Exp. Med. Biol. 285: 131–140).
Zu anderen synthetischen Peptiden, die keine Sequenzhomologie mit den Apolipoproteinen teilen, welche mit begrenztem Erfolg vorgeschlagen worden sind, gehören Dimere und Trimere des 18A-Peptids (Anantharamaiah et al., 1986, Proteins of Biological Fluids 34: 63–66), GALA- und EALA-Peptide (Subbarao et al., 1988, Proteins: Structure, Function and Genetics 3: 187–198) und ID-Peptide (Labeur et al., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17: 580–588) sowie das 18AM4-Peptid (Brasseur et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 1–7).
Ein „Consensus"-Peptid, enthaltend 22 Aminosäurereste, basierend auf den Sequenzen der Helices von humanem ApoA-I, wurde ebenfalls gestaltet (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95–105; Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585–596). Die Sequenz wurde konstruiert, indem der am meisten vorherrschende Rest an jeder Position der hypothetisierten Helices von humanem ApoA-I identifiziert wurde. Ähnlich den vorstehend beschriebenen Peptiden hat die Helix, gebildet durch dieses Peptid, positiv geladene Aminosäurereste, geclustert an der hydrophil-hydrophoben Grenzfläche, negativ geladene Aminosäurereste, geclustert in der Mitte der hydrophilen Oberseite, und einen hydrophoben Winkel von weniger als 180°. Wenn auch ein Dimer von diesem Peptid beim Aktivieren von LCAT etwas wirksam ist, zeigte das Monomer schlechte Lipidbindungseigenschaften (Venkatachalapathi et al., 1991, vorstehend).
Basierend in erster Linie auf in-vitro-Untersuchungen mit den vorstehend beschriebenen Peptiden, hat sich ein Satz von „Regeln" zum Gestalten von Peptiden ergeben, welche die Funktion von apoA-I nachahmen. Es ist bedeutsam, denkt man, daß eine amphipathische α-Helix mit positiv geladenen Resten, geclustert an der hydrophil-hydrophoben Grenzfläche, und negativ geladenen Aminosäureresten, geclustert in der Mitte der hydrophilen Oberseite, für Lipidaffinität und LCAT-Aktivierung erforderlich ist (Venkatachalapathi et al., 1991, vorstehend). Anantharamaiah et al. haben auch angezeigt, daß der negativ geladene Glu-Rest an Position 13 des Consensus-22-mer-Peptids, welcher innerhalb der hydrophoben Oberseite der Helix positioniert ist, eine wichtige Rolle in der LCAT-Aktivierung spielt (Anantharamaiah et al., 1991, vorstehend). Weiterhin hat Brasseur angezeigt daß ein hydrophober Winkel (pho-Winkel) von weniger als 180° für optimale Lipid-Apolipoprotein-Komplex-Stabilität erforderlich ist und auch für die Bildung von scheibenförmigen Teilchen mit den Peptiden um die Randzone der Lipiddoppelschicht herum verantwortlich ist (Brasseur, 1991, J. Biol. Chem. 66(24): 16120–16127). Rosseneu et al. haben auch betont, daß ein hydrophober Winkel von weniger als 180° für LCAT-Aktivierung erforderlich ist ( WO93/25581 ).
Jedoch hat trotz dieser „Regeln" bis heute niemand ein so aktives Peptid wie ApoA-I gestaltet oder hergestellt – wobei die besten weniger als 40% der Aktivität von ApoA-I, wie gemessen durch den hier beschriebenen LCAT-Aktivierungs-Assay, haben. Von keinem der in der Literatur beschriebenen Peptid"mimetika" ist demonstriert worden, daß es als Arzneimittel verwendbar ist.
Angesichts des vorhergehenden gibt es einen Bedarf für die Entwicklung eines stabilen ApoA-I-Agonisten, der die Aktivität von ApoA-I nachahmt und welcher relativ einfach und kosteneffektiv herzustellen ist. Jedoch sind die „Regeln" zum Gestalten von wirksamen ApoA-I-Mimetika nicht enträtselt worden, und die Prinzipien zum Gestalten von organischen Molekülen mit der Funktion von ApoA-I sind unbekannt.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ApoA-I-Agonisten, die imstande sind, amphipathische α-Helices zu bilden, die die Aktivität von ApoA-I nachahmen, mit spezifischen Aktivitäten, d. h. Einheiten von Aktivität (Aktivierung von LCAT)/Masseneinheit, die die von dem nativen Molekül annähern oder übertreffen. Im einzelnen sind die ApoA-I-Agonisten der Erfindung Peptide oder Peptidanaloge, die: amphipathische Helices bilden (in Gegenwart von Lipiden), Lipide binden, pre-β-ähnliche oder HDL-ähnliche Komplexe bilden, LCAT aktivieren, Serumspiegel von HDL-Fraktionen erhöhen und den Cholesterinabfluß fördern.
Die Erfindung basiert teilweise auf der Gestaltung und Entdeckung der Anmelder von Peptiden, die die Funktion von ApoA-I nachahmen. Die Peptide der Erfindung wurden gestaltet, basierend auf der mutmaßlichen helikalen Struktur und den amphipathischen Eigenschaften der 22-Aminosäuren-Consensus-Sequenz, welche von den helikalen Wiederholungen von ApoA-I abgeleitet wurde. Überraschenderweise haben die Peptide der Erfindung eine spezifische Aktivität weit über derjenigen, die für in der Literatur beschriebene ApoA-I-abgeleitete Peptide berichtet wurde. In der Tat nähern sich einige Ausführungsformen der Erfindung 100% der Aktivität von nativem ApoA-I an, während hier beschriebene Superagonisten die spezifische Aktivität von ApoA-I übertreffen.
Die Erfindung wird auf dem Wege von Arbeitsbeispielen veranschaulicht, die die Struktur, Herstellung und Verwendung spezieller amphipathischer Peptide beschreiben, die Helices bilden (in Gegenwart von Lipiden), Lipide binden, Komplexe bilden und LCAT-Aktivität erhöhen. Basierend auf der Struktur und Aktivität der beispielhaft veranschaulichten Ausführungsformen haben die Anmelder einen Satz von „Regeln" ausgedacht, welche zur Gestaltung von geänderten oder mutierten Formen verwendet werden können, die ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung sind.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Formulierungen, enthaltend derartige ApoA-I-Agonisten (als entweder Peptide oder Peptid-Lipid-Komplexe) als Wirkstoff, ebenso wie Verfahren zum Herstellen derartiger Formulierungen und ihre Verwendung zur Behandlung von Krankheiten, verbunden mit Dyslipoproteinämie (z. B. kardiovaskuläre Krankheiten, Atherosklerose, metabolisches Syndrom), Restenose oder Endotoxämie (z. B. septischer Schock)
3.1. ABKÜRZUNGEN

Wie hier verwendet sind die Abkürzungen für die genetisch codierten L-enantiomeren Aminosäuren herkömmlich und sind wie folgt:

Aminosäure	Ein-Buchstaben-Symbol	Gebräuchliche Abkürzung
Alanin	A	Ala
Arginin	R	Arg
Asparagin	N	Asn
Asparaginsäure	D	Asp
Cystein	C	Cys
Glutamin	Q	Gln
Glutaminsäure	E	Glu
Glycin	G	Gly
Histidin	H	His
Isoleucin	I	Ile
Leucin	L	Leu
Lysin	K	Lys
Methionin	M	Met
Phenylalanin	F	Phe
Prolin	P	Pro
Serin	S	Ser
Threonin	T	Thr
Tryptophan	W	Trp
Tyrosin	Y	Tyr
Valin	V	Val

Die Abkürzungen, verwendet für die D-Enantiomeren der genetisch codierten Aminosäuren, sind in Kleinbuchstaben Äquivalente der ein-Buchstaben-Symbole. Zum Beispiel bezeichnet „R" L-Arginin und bezeichnet „r" D-Arginin.
3.2. DEFINITIONEN
Wie hier verwendet sollen die folgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen haben:
„Alkyl": bezeichnet einen gesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest. Zu typischen Alkylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Hexyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Alkylgruppen (C₁-C₆)-Alkyl.
„Alkenyl": bezeichnet einen ungesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Der Rest kann in entweder der cis- oder der trans-Konformation über der (den) Doppelbindung(en) sein. Zu typischen Alkenylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Ethenyl, Propenyl, Isopropenyl, Butenyl, Isobutenyl, tert-Butenyl, Pentenyl, Hexenyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkenylgruppe (C₁-C₆)-Alkenyl.
„Alkenyl": bezeichnet einen ungesättigten verzweigten, geradkettigen oder cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Zu typischen Alkinylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Isobutinyl, Pentinyl, Hexinyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkinylgruppe (C₁-C₆)-Alkinyl.
„Aryl": bezeichnet einen ungesättigten cyclischen Kohlenwasserstoffrest mit einem konjugierten π-Elektronensystem. Zu typischen Arylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Penta-2,4-dien, Phenyl, Naphthyl, Anthracyl, Azulenyl, Chrysenyl, Coronenyl, Fluoranthenyl, Indacenyl, Idenyl, Ovalenyl, Perylenyl, Phenalenyl, Phenanthrenyl, Picenyl, Pleiadenyl, Pyrenyl, Pyranthrenyl, Rubicenyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Arylgruppe (C₅-C₂₀)-Aryl, wobei (C₅-C₁₀) besonders bevorzugt ist.
„Alkaryl": bezeichnet eine geradkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, bei der eines der Wasserstoffatome, gebunden an einen terminalen Kohlenstoff, mit einer Aryleinheit ersetzt ist. Zu typischen Alkarylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Benzyl, Benzyliden, Benzylidin, Benzolbenzyl, Naphthenobenzyl und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkarylgruppe (C₆-C₂₆)-Alkaryl, d. h., die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit der Alkarylgruppe ist (C₁-C₆) und die Aryleinheit ist (C₅-C₂₀). In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkarylgruppe (C₆-C₁₃)-Alkaryl, d. h., die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit der Alkarylgruppe ist (C₁-C₃) und die Aryleinheit ist (C₅-C₁₀).
„Heteroaryl": bezeichnet eine Aryleinheit, bei der ein oder mehrere Kohlenstoffatome mit einem anderen Atom, wie beispielsweise N, P, O, S, As, Se, Si, Te usw., ersetzt sind. Zu typischen Heteroarylgruppen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Acridarsin, Acridin, Arsanthridin, Arsindol, Arsindolin, Carbazol, β-Carbolin, Chromen, Cinnolin, Furan, Imidazol, Indazol, Indol, Indolizin, Isoarsindol, Isoarsinolin, Isobenzofuran, Isochromen, Isoindol, Isophosphoindol, Isophosphinolin, Isochinolin, Isothiazol, Isoxazol, Naphthyridin, Perimidin, Phenanthridin, Phenanthrolin, Phenazin, Phosphoindol, Phosphinolin, Phthalazin, Pteridin, Purin, Pyran, Pyrazin, Pyrazol, Pyridazin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrol, Pyrrolizin, Chinazolin, Chinolin, Chinolizin, Chinoxalin, Selenophen, Tellurophen, Thiophen und Xanthen. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Heteroarylgruppe ein 5–20-gliedriges Heteroaryl, wobei 5–10-gliedriges Aryl besonders bevorzugt wird.
„Alkheteroaryl": bezeichnet eine geradkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, wo eines der Wasserstoffatome, gebunden an ein terminales Kohlenstoffatom, mit einer Heteroaryleinheit ersetzt ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Alkheteroarylgruppe 6–26-gliedriges Alkheteroaryl, d. h., die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit des Alkheteroaryls ist (C₁-C₆) und das Heteroaryl ist ein 5–20-gliedriges Heteroaryl. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Alkheteroaryl 6–13-gliedriges Alkheteroaryl, d. h. die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyleinheit ist ein 5–10-gliedriges Heteroaryl.
„Substituiertes Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Alkaryl, Heteroaryl oder Alkheteroaryl": bezeichnet eine Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Alkaryl-, Heteroaryl- oder Alkheteroarylgruppe, in welcher ein oder mehrere Wasserstoffatome mit einem anderen Substituenten ersetzt sind. Zu bevorzugten Substituenten gehören -OR, -SR, -NRR, -NO₂, -CN, Halogen, -C(O)R, -C(O)OR und -C(O)NR, wo jedes R unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Alkaryl, Heteroaryl oder Alkheteroaryl ist.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A ist ein Schiffer-Edmundson-Helixrad-Diagramm einer idealisierten amphipathischen α-Helix, in welchem offene Kreise hydrophile Aminosäurereste darstellen und schattierte Kreise hydrophobe Aminosäurereste darstellen.
1B ist ein Helixnetz-Diagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A.
1C ist ein Helixzylinder-Diagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A.
2A ist ein Schiffer-Edmundson Helixrad-Diagramm des Kernpeptids von Struktur (I), veranschaulichend die Amphipathie der Helix (offene Kreise stellen hydrophile Aminosäurereste dar, schattierte Kreise stellen hydrophobe Aminosäurereste dar und teilweise schattierte Kreise stellen entweder hydrophile oder hydrophobe Aminosäurereste dar).
2B ist ein Helixnetz-Diagramm des Kernpeptids von Struktur (I), veranschaulichend die hydrophobe Oberseite der Helix.
2C ist ein Helixnetz-Diagramm des Kernpeptids von Struktur (I), veranschaulichend die hydrophile Oberseite der Helix.
3A ist ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophile Oberseite von Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO: 75).
3B ist ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophile Oberseite des beispielhaften Kernpeptids 4 (PVLELFENLLERLLDALQKKLK; SEQ ID NO: 4).
4A ist ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophobe Oberseite von Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (SEQ ID NO: 75).
4B ist ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophobe Oberseite des beispielhaften Kernpeptids 4 (SEQ ID NO: 4).
5A ist ein Schiffer-Edmundson-Helixrad-Diagramm von Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (SEQ ID NO: 75).
5B ist ein Schiffer-Edmundson-Helixrad-Diagramm des beispielhaften Kernpeptids 4 (SEQ ID NO: 4).
6A ist ein Computermodell von zwei Peptiden 4 (SEQ ID NO: 4), angeordnet in einer antiparallelen Weise, in welcher die Reste Glu-8 und Gln-19 hervorgehoben sind, um die Fähigkeit dieser zwei Peptide zu veranschaulichen, intermolekulare Wasserstoffbindungen zu bilden, wenn sie an Lipide gebunden sind.
6B ist ein Computermodell von zwei Peptiden 102 (PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK; SEQ ID NO: 102), angeordnet in einer antiparallelen Weise, in welcher die Reste Glu-8 und Gln-19 hervorgehoben sind, um die Unfähigkeit dieser zwei Peptide zu veranschaulichen, intermolekulare Wasserstoffbindungen zu bilden, wenn sie an Lipide gebunden sind.
7A veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk dritter Ordnung der Erfindung.
7B veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk vierter Ordnung der Erfindung.
7C veranschaulicht ein verzweigtes Netzwerk gemischter Ordnung der Erfindung.
7D veranschaulicht beispielhafte verzweigte „Lys-Baum"-Netzwerke der Erfindung.
8A ist eine graphische Darstellung, veranschaulichend die Unterschiede zwischen den beobachteten chemischen Verschiebungen von Hα und den in der Tabelle aufgeführten chemischen Verschiebungen von Hα des statistischen Knäuels für Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (SEQ ID NO: 75).
8B ist eine graphische Darstellung, veranschaulichend die Unterschiede zwischen den beobachteten chemischen Verschiebungen des Amidprotons und den in der Tabelle aufgeführten chemischen Verschiebungen des Amidprotons des statistischen Knäuels für Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (SEQ ID NO: 75).
8C ist eine Vorlage, veranschaulichend die periodische Beziehung zwischen den chemischen Verschiebungen des Hα-Protons von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und seiner α-helikalen Konformation.
9A–9D stellen Gelchromatogramme von isoliertem humanen HDL, inkubiert für 2 h bei 37°C in Puffer, wie gemessen durch Extinktion (-), und in Gegenwart von ¹⁴C-markiertem Peptid 4, wie gemessen durch Extinktion (---) oder ¹⁴C-radiometrische Zählung (♦), bereit. Die Chromatogramme wurden mit Peptid:HDL-Massenverhältnissen von 1:15 (9A), 1:10 (9B), 1:5 (9C) und 1:3 (9D) erhalten.
9E ist ein Kontroll-Gelfiltrationschromatogramm von freiem, ungebundenem ¹⁴C-markierten Peptid 4, wie gemessen durch Extinktion (---) oder ¹⁴C-radiometrische Zählung (♦).
9F stellt Gelfiltrations-Differenzchromatogramme bereit, veranschaulichend die Differenz zwischen jedem von den Extinktionschromatogrammen von Peptid-behandelten HDL, dargestellt in den 9A (---), 9B (-), 9C (---) und 9D (-), und dem Kontrollchromatogramm von 9E (positive Werte zeigen eine höhere Extinktion in der behandelten Probe an; negative Werte zeigen eine größere Extinktion in der Kontrollprobe an).
10 ist eine graphische Darstellung, veranschaulichend das Lipoproteinprofil von Kaninchen, injiziert mit 10 mg/kg Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) (in der Form von Peptid/DPPC-Komplexen).
11A ist eine Vorlage, darstellend die verschiedenartigen Aggregationszustände und Peptid-Lipid-Komplexe, die mit den ApoA-I-Agonisten der Erfindung erhalten werden können. Links: Multimerisierungsprozeß der Peptide, resultierend aus der Wechselwirkung verschiedener Peptid-Helices und führend zu der Bildung von Oligomeren unter definierten Bedingungen von Peptidkonzentration, pH und Ionenstärke. Mitte: Die Wechselwirkung der Peptide (in jedem dieser Zustande der Aggregation) mit lipidischen Gebilden (wie beispielsweise SUVs) führt zu Lipid-Reorganisation. Rechts: Durch Ändern des Lipid:Peptid-Molverhältnisses können verschiedene Typen von Peptid-Lipid-Komplexen erhalten werden, von Lipid-Peptid-Comicellen bei niedrigen Lipid-Peptid-Verhältnissen zu scheibenförmigen Teilchen und schließlich zu großen multilamellaren Komplexen bei zunehmend höheren Lipid:Peptid-Verhältnissen.
11B veranschaulicht das allgemein akzeptierte Modell für scheibenförmige Peptid-Lipid-Komplexe, gebildet in einem definierten Bereich von Lipid:Peptid-Verhältnissen. Jedes Peptid, umgebend die Randzone der Scheibe, ist in engem Kontakt mit seinen zwei nächsten Nachbarn.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung ahmen Funktion und Aktivität von ApoA-I nach. Sie bilden amphipathische Helices (in Gegenwart von Lipiden), binden Lipide, bilden pre-β-ähnliche oder HDL-ähnliche Komplexe, aktivieren LCAT, erhöhen Serum-HDL-Konzentration und fördern Cholesterinabfluß. Die biologische Funktion der Peptide korreliert mit ihrer helikalen Struktur oder der Umwandlung zu helikalen Strukturen in Gegenwart von Lipiden.
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können in stabilen Massen- oder Einheitsdosierungsformen hergestellt werden, z. B. lyophilisierten Produkten, die vor Gebrauch in vivo rekonstituiert oder reformuliert werden können. Die Erfindung schließt die pharmazeutischen Formulierungen und die Verwendung derartiger Zubereitungen in der Behandlung von Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie, koronarer Herzkrankheit, Atherosklerose und anderen Leiden wie beispielsweise Endotoxämie, die septischen Schock verursacht, ein.
Die Erfindung wird durch Arbeitsbeispiele veranschaulicht, welche demonstrieren, daß die ApoA-I-Agonisten der Erfindung mit der HDL-Komponente von Plasma assoziieren und die Konzentration von HDL und pre-β-Teilchen erhöhen können. Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung erhöhen den zellulären Cholesterinabfluß. Die Agonisten sind außerdem extrem effizient beim Aktivieren von LCAT und fördern so den RCT. Verwendung der ApoA-I-Agonisten der Erfindung in vivo in Tiermodellen resultiert in einer Zunahme der Serum-HDL-Konzentration.
Die Erfindung wird in größerer Ausführlichkeit in den nachstehenden Unterabschnitten dargelegt, welche beschreiben: die Zusammensetzung und Struktur der ApoA-I-Peptid-Agonisten; strukturelle und funktionelle Charakterisierung; Verfahren der Herstellung von Formulierungen in großer Menge und in Einheitsdosierung; und Verfahren der Verwendung.
5.1. PEPTIDSTRUKTUR UND FUNKTION
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung sind im allgemeinen Peptide, oder Analoge davon, welche imstande sind, in Gegenwart von Lipiden amphipathische α-Helices zu bilden, und welche die Aktivität von ApoA-I nachahmen. Die Agonisten haben als ihr Hauptmerkmal ein „Kern"-Peptid, bestehend aus 15 bis 29 Aminosäureresten, vorzugsweise 22 Aminosäureresten, oder ein Analoges davon, wobei mindestens eine Amidbindung in dem Peptid mit einem substituierten Amid, einem Isosteren von einem Amid oder einem Amidmimetikum ersetzt ist.
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung basieren teilweise auf der überraschenden Entdeckung der Anmelder, daß Verändern bestimmter Aminosäurereste in der primären Sequenz der 22-mer-Consensus-Sequenz von Venkatachalapathi et al., 1991, Mol. Conformation and Biol. Interactions, Indian Acad. Sci. B: 585–596 (PVLDEFREKLNEELEALKQKLK; SEQ ID NO: 75; nachstehend „Segrest's Consensus-22-mer" oder „Consensus 22-mer") von denen man dachte, daß sie kritisch für die Aktivität sind, synthetische Peptide ergibt, welche Aktivitäten zeigen, die die Aktivität von nativem ApoA-I annähern oder in einigen Ausführungsformen sogar übertreffen. Insbesondere haben die Anmelder entdeckt, daß Ersetzen von drei geladenen Aminosäureresten in Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (Glu-5, Lys-9 und Glu-13) mit einem hydrophoben Leu-Rest Peptide bereitstellt, die die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von ApoA-1 in einem Maße nachahmen, das in dem Fachbgebiet noch nie da gewesen ist.
Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Helix, gebildet durch die ApoA-I-Agonisten der Erfindung, die strukturellen und funktionellen Eigenschaften der amphipathischen helikalen Regionen von nativem ApoA-I, die zum Bewirken von Lipidbindung, Cholesterinabfluß und LCAT-Aktivierung wichtig sind, genauer nachahmt, als es die α-Helix, gebildet durch die in der Literatur beschriebenen ApoA-I-mimetischen Peptide, tut, und dadurch in Peptiden resultiert, die signifikant höhere ApoA-I-ähnliche Aktivität zeigen als diese anderen Peptide. In der Tat zeigen, während viele der ApoA-I-Agonisten der Erfindung die Aktivität von ApoA-I annähern, und in einigen Ausführungsformen sogar übertreffen, bis heute die besten in der Literatur beschriebenen Peptid-ApoA-I-Nachahmer – Peptid 18AM4 (EWLEAFYKKVLEKLKELF; SEQ ID NO: 246) (Corinjn et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 8–16; Labeur et al., Okt. 1994, Arteriosclerosis: Abstract Nr. 186 und 187) und N-acetyliertes, C-amidiertes Peptid 18AM4 (SEQ ID NO: 239) (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 1–7) – weniger als 4% bzw. 11% der Aktivität von ApoA-I, wie durch den hier beschriebenen LCAT-Aktivierungs-Assay gemessen wurde.
Im allgemeinen haben die Kernpeptide (oder Analoge davon), die die ApoA-I-Agonisten der Erfindung bilden, die folgende Strukturformel (1): X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂ wobei:
X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) oder D-Pro (p) ist;
X₂ eine aliphatische Aminosäure ist;
X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₄ eine saure Aminosäure ist;
X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₇ eine hydrophile Aminosäure ist;
X₈ eine saure oder eine basische Aminosäure ist;
X₉ Leu (L) oder Gly (G) ist;
X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist;
X₁₁ eine hydrophile Aminosäure ist;
X₁₂ eine hydrophile Säure ist;
X₁₃ Gly (G) oder eine aliphatische Aminosäure ist;
X₁₄ Leu (L), Trp (W), Gly (G) oder Nal ist;
X₁₅ eine hydrophile Aminosäure ist;
X₁₆ eine hydrophobe Aminosäure ist;
X₁₇ eine hydrophobe Aminosäure ist;
X₁₈ eine basische Aminosäure, Gln (Q) oder Asn (N) ist;
X₁₉ eine basische Aminosäure, Gln (Q) oder Asn (N) ist;
X₂₀ eine basische Aminosäure ist;
X₂₁ eine aliphatische Aminosäure ist; und
X₂₂ eine basische Aminosäure ist.
Die Kernpeptide von Struktur (I) sind teilweise hinsichtlich Aminosäuren der bezeichneten Klassen definiert. Die Definitionen der verschiedenartigen bezeichneten Klassen werden nachstehend in Verbindung mit der Beschreibung von mutierten oder geänderten Ausführungsformen von Struktur (I) bereitgestellt.
In den Kernpeptiden von Struktur (I) bezeichnet das Symbol „-" zwischen Aminosäureresten X_n im allgemeinen eine konstitutive Verknüpfungsfunktion des Grundgerüsts. So stellt das Symbol „-" gewöhnlich eine Peptidbindung oder Amidbindung (-C(O)NH-) dar. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung Peptidanaloge betrachtet, bei denen ein oder mehrere Amidbindungen gegebenenfalls mit einer Verknüpfung anders als Amid, vorzugsweise einem substituierten Amid oder einem Isosteren von Amid, ersetzt sind. So erkennt, wenn auch die verschiedenartigen X_n-Reste innerhalb von Struktur (I) im allgemeinen hinsichtlich Aminosäuren beschrieben sind und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft durch Peptide veranschaulicht sind, der Fachmann, daß in Ausführungsformen mit nicht-Amidbindungen der Begriff „Aminosäure" oder „Rest", wie er hier verwendet wird, andere bifunktionelle Einheiten bezeichnet, die Gruppen tragen, die in der Struktur den Seitenketten der Aminosäuren ähnlich sind.
Zu substituierten Amiden gehören im allgemeinen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Gruppen der Formel -C(O)NR-, wo R (C₁-C₆)-Alkyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, substituiertes (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, substituiertes (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5–20-gliedriges Heteroaryl, substituiertes 5–20-gliedriges Heteroaryl, 6–26-gliedriges Alkheteroaryl und substituiertes 6–26-gliedriges Alkheteroaryl ist.
Zu Isosteren von Amid gehören im allgemeinen, ohne aber darauf begrenzt zu sein, -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH- (cis und trans), -C(O)CH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-. Verbindungen mit derartigen nicht-Amidbindungen und Verfahren zum Herstellen derartiger Verbindungen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Spatola, März 1983, Vega Data Bd. 1, Ausgabe 3; Spatola, 1983, „Peptide Backbone Modifications" („Peptid-Grundgerüst-Modifizierungen"), in: Chemie and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins (Chemie und Biochemie von Aminosäuren, Peptiden und Proteinen), Weinstein, Hrsg., Marcel Dekker, New York, S. 267 (allgemeiner Überblick); Morley, 1980, Trends Pharm. Sci. 1: 463–468; Hudson et al., 1979, Int. J. Prot. Res. 14: 177–185 (-CH₂NH-, -CH₂CH₂-); Spatola et al., 1986, Life Sci. 38: 1243–1249 (-CH₂-S); Hann, 1982, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1: 307–314 (-CH=CH-, cis und trans); Almquist et al., 1980, J. Med. Chem. 23: 1392–1398 (-COCH₂-); Jennings-White et al., Tetrahedron. Lett. 23: 2533 (-COCH₂-); Europäische Patentanmeldung EP 45665 (1982) CA 97: 39405 (-CH(OH)CH₂-); Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24: 4401–4404 (-C(OH)CH₂-); und Hruby, 1982, Life Sci. 31: 189–199 (-CH₂-S-).
Zusätzlich können ein oder mehrere Amidbindungen mit peptidomimetischen oder Amid-mimetischen Einheiten ersetzt werden welche die Struktur oder Aktivität der Peptide nicht signifikant beeinträchtigen. Geeignete Amid-mimetische Einheiten sind, zum Beispiel, in Olson et al., 1993, J. Med. Chem. 36: 3039–3049 beschrieben.
Ein kritisches Merkmal der Kernpeptide von Struktur (I) ist ihre Fähigkeit, in Gegenwart von Lipiden eine amphipathische α-Helix zu bilden. Amphipathisch bedeutet, daß die α-Helix gegenüberliegende hydrophile und hydrophobe Oberseiten, orientiert entlang ihrer langen Achse, hat, d. h., eine Oberseite der Helix führt hauptsächlich hydrophile Seitenketten vor, während die gegenüberliegende Oberseite hauptsächlich hydrophobe Seitenketten vorführt. Die 1A und 1B stellen zwei veranschaulichende Ansichten der gegenüberliegenden hydrophilen und hydrophoben Oberseiten einer beispielhaften idealisierten amphipathischen α-Helix dar. 1A ist ein Schiffer-Edmundson-Helixrad-Diagramm (Schiffer und Edmundson, 1967, Biophys. J. 7: 121–135). In dem Rad ist die lange Achse der Helix senkrecht zu der Seite. Ausgehend von dem N-Terminus sind aufeinanderfolgende Aminosäurereste (dargestellt durch Kreise) mit 100°-Intervallen radial über den Umfang eines Kreises verteilt. So ist der Aminosäurerest n + 1 100° von Rest n positioniert, ist Rest n + 2 100° von Rest n + 1 positioniert und so fort. Die 100°-Plazierung ist für die 3,6 Aminosäurereste pro Drehung verantwortlich, die typischerweise in einer idealisierten α-Helix beobachtet werden. In 1A sind die gegenüberliegenden hydrophilen und hydrophoben Oberseiten der Helix klar sichtbar; hydrophile Aminosäuren sind als offene Kreise dargestellt und hydrophobe Aminosäurereste sind als schattierte Kreise dargestellt.
1B stellt ein Helixnetz-Diagramm der idealisierten amphipathischen Helix von 1A dar. (Lim, 1978, FERS Lett. 89: 10–14). In einem typischen Helixnetz-Diagramm ist die α-Helix als Zylinder dargestellt, der entlang der Mitte seiner hydrophilen Oberseite geschnitten und abgeflacht worden ist. So liegt die Mitte der hydrophoben Fläche, bestimmt durch das hydrophobe Moment der Helix (Eisenberg et al., 1982, Nature 299: 371–374), in der Mitte der Figur und ist orientiert, um aus der Ebene der Seite empor zu steigen. Eine Veranschaulichung des helikalen Zylinders, bevor er geschnitten und abgeflacht wird, ist in 1C dargestellt. Durch Schneiden des Zylinders entlang verschiedener Ebenen können verschiedene Ansichten der gleichen amphipathischen Helix beobachtet und unterschiedliche Information über die Eigenschaften der Helix erhalten werden.
Die amphipathische Natur der α-Helix, gebildet durch die Kernpeptide von Struktur (I) in Gegenwart von Lipiden, ist in 2 veranschaulicht. 2A stellt ein Schiffer-Edmundson-Helixrad-Diagramm dar, 2B stellt ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophobe Oberseite, dar und 2C stellt ein Helixnetz-Diagramm, veranschaulichend die hydrophile Oberseite, dar. In jeder von den 2A, 2B und 2C sind hydrophile Reste als offene Kreise und hydrophobe Reste als schattierte Kreise dargestellt. Wie nachstehend sorgfältiger in Verbindung mit geänderten oder mutierten Formen der Peptide von Struktur (I) diskutiert wird, können bestimmte Aminosäurereste mit anderen Aminosäureresten ersetzt werden, so daß die hydrophilen und hydrophoben Oberseiten der Helix, gebildet durch die Peptide, nicht vollständig aus hydrophilen bzw. und hydrophoben Aminosäuren bestehen mögen. So ist es selbstverständlich, daß, wenn Bezug auf die amphipathische α-Helix, gebildet durch die Kernpeptide der Erfindung genommen wird, der Ausdruck „hydrophile Oberseite" eine Oberseite der Helix mit insgesamt netto hydrophilem Charakter bezeichnet. Der Ausdruck „hydrophobe Oberseite" bezeichnet eine Oberseite der Helix mit insgesamt netto hydrophobem Charakter.
Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß bestimmte strukturelle und/oder physikalische Eigenschaften der amphipathischen Helix, gebildet durch Kernpeptide von Struktur (I), für die Aktivität wichtig sind. Zu diesen Eigenschaften gehören der Grad der Amphipathie, die Gesamthydrophobie, die mittlere Hydrophobie, hydrophobe und hydrophile Winkel, hydrophobes Moment, mittleres hydrophobes Moment und Nettoladung der α-Helix.
Während die Helixrad-Diagramme von 2A ein geeignetes Mittel zur Visualisierung der amphipathischen Natur der Kernpeptide von Struktur (I) bereitstellen, kann der Grad der Amphipathie (Grad der Asymmetrie von Hydrophobie) geeignet durch Berechnen des hydrophoben Moments (μ_H) der Helix quantifiziert werden. Verfahren zum Berechnen von μ_H für eine spezielle Peptidsequenz sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel bei Eisenberg, 1984, Ann. Rev. Biochem. 53: 595–623, beschrieben. Der tatsächliche μ_H, erhalten für ein spezielles Peptid, hängt von der Gesamtzahl von Aminosäureresten ab, die das Peptid bilden. So ist es im allgemeinen nicht informativ, direkt μ_H für Peptide von verschiedenen Längen zu vergleichen.
Die Amphipathien von Peptiden verschiedener Längen können direkt durch das mittlere hydrophobe Moment (<μ_H>) verglichen werden. Das mittlere hydrophobe Moment kann durch Teilen von μ_H durch die Anzahl von Resten in der Helix erhalten werden (d. h. <μ_H> = μ_H/N). Allgemein werden Kernpeptide, welche ein <μ_H> in dem Bereich von 0,45 bis 0,65, wie bestimmt unter Verwendung der genormten Consensus-Hydrophobie Skala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125–142), zeigen, dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein, wobei ein <μ_H> in dem Bereich von 0,50 bis 0,60 bevorzugt wird.
Die gesamte oder totale Hydrophobie (H_o) eines Peptids kann geeignet berechnet werden, indem die algebraische Summe der Hydrophobien von jedem Aminosäurerest in dem Peptid (d. h.
wo N die Anzahl von Aminosäureresten in dem Peptid ist und H_i die Hydrophobie des i. Aminosäurerests ist) genommen wird. Die mittlere Hydrophobie (<H_o>) ist die Hydrophobie, geteilt durch die Anzahl von Aminosäureresten (d. h. <H_o> = H_o/N). Allgemein werden Kernpeptide, die eine mittlere Hydrophobie in dem Bereich von –0,050 bis –0,070, wie bestimmt unter Verwendung der genormten Consensus-Hydrophobie-Skala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125–142), zeigen, dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein, wobei eine mittlere Hydrophobie in dem Bereich von –0,030 bis –0,055 bevorzugt wird.
Die totale Hydrophobie der hydrophoben Oberseite (H_o ^pho) einer amphipathischen Helix kann erhalten werden, indem die Summe der Hydrophobien der hydrophoben Aminosäurereste genommen wird, welche in den hydrophoben Winkel fallen, wie nachstehend definiert (d. h.,
wo H_i wie vorher definiert ist und N_H die Gesamtzahl von hydrophoben Aminosäuren in der hydrophoben Oberseite ist). Die mittlere Hydrophobie der hydrophoben Oberseite (<H_o ^pho>) ist H_o ^pho/N_H, wo N_H wie definiert vorstehend ist. Allgemein werden Kernpeptide, welche ein <H_o ^pho> in dem Bereich von 0,90 bis 1,20, wie bestimmt unter Verwendung der Consensus-Hydrophobie-Skala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, vorstehend; Eisenberg et al., 1982, vorstehend) zeigen, dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein, wobei ein <H_o ^pho> in dem Bereich von 0,94 bis 1,10 bevorzugt wird.
Der hydrophobe Winkel (pho-Winkel) ist im allgemeinen als der Winkel oder Bogen definiert, der durch den längsten kontinuierlichen Abschnitt von hydrophoben Aminosäureresten bedeckt ist, wenn das Peptid in der Schiffer-Edmundson-Helixrad-Darstellung angeordnet ist (d. h. die Anzahl von zusammenhängenden hydrophoben Resten auf dem Rad, multipliziert mit 20°). Der hydrophile Winkel (phi-Winkel) ist die Differenz zwischen 360° und dem pho-Winkel (d. h. 360°-pho-Winkel). Der Fachmann erkennt, daß der pho- und phi-Winkel teilweise von der Anzahl von Aminosäureresten in dem Peptid abhängen. Zum Beispiel kann, bezugnehmend auf die 5A und 5B, gesehen werden, daß nur 18 Aminosäuren um eine Drehung des Schiffer-Edmundson-Helixrades passen. Weniger Aminosäuren hinterlassen eine Lücke in dem Rad; mehr Aminosäuren verursachen, daß bestimmte Positionen des Rades durch mehr als einen Aminosäurerest besetzt werden.
In dem Fall von Peptiden, enthaltend mehr als 18 Aminosäurereste, wie beispielsweise die Kernpeptide von Struktur (I), bedeutet ein „kontinuierlicher" Abschnitt von hydrophoben Aminosäureresten, daß mindestens eine Aminosäure an Positionen entlang des Rades, enthaltend zwei oder mehrere Aminosäuren, eine hydrophobe Aminosäure ist. So ist, bezugnehmend auf 5B, der pho-Winkel der Bogen, bedeckt durch die Reste 5, 16, 9, 2, 13, 6, 17, 10, 3 und 14, trotz des Vorkommens eines hydrophilen Rests an Position 20, da der Rest an Position 2, welcher die gleiche Position auf dem Rad teilt, ein hydrophober Rest ist. Typischerweise werden Kernpeptide mit einem pho-Winkel in dem Bereich von 160° bis 220° dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der Erfindung zu sein, wobei ein pho-Winkel in dem Bereich von 180° bis 200° bevorzugt wird.
Bestimmte strukturelle und/oder physikalische charakteristische Eigenschaften der Kernpeptide von Struktur (I) sind in den 3 und 4 veranschaulicht. 3B stellt ein Helixnetz-Diagramm eines beispielhaften Kernpeptids der Erfindung, Peptid 4 (PVLDLFRELLNELLEALKQKLK; SEQ ID NO: 4), veranschaulichend die Ladungsverteilung entlang der hydrophilen Oberseite der Helix, dar. In 3B ist der helikale Zylinder entlang der Mitte der hydrophoben Oberseite geschnitten und abgeflacht worden. Die drei hydrophoben Leu-(L)-Reste, die hydrophile Reste in Segrest's Consensus-22-mer ersetzen (3A), sind schattiert. Wie in 3B gesehen werden kann, sind positiv geladene Aminosäurereste an der letzten C-terminalen Drehung der Helix geclustert (der C-Terminus ist oben auf der Seite). Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine spezielle Theorie gebunden gebunden zu sein, wird angenommen, daß der Cluster von basischen Resten an dem C-Terminus die Helix durch elektrostatische Wechselwirkungen Ladung-(NH₃ ⁺)-Helix-Dipol stabilisiert. Es wird auch gedacht, daß Stabilisierung durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Lysin-Seitenketten und dem Helix-Kern erfolgt (siehe Groebke et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 4025–4029; Esposito et al., 1997, Biopolymers 41: 27–35).
Mit der Ausnahme des positiv geladenen C-terminalen Clusters sind negative Ladungen auf dem Rest der hydrophilen Oberseite verteilt, mit mindestens einem negativ geladenen (sauren) Aminosäurerest pro Drehung, resultierend in einem kontinuierlichen Abschnitt von negativen Ladungen entlang der hydrophilen Oberseite der Helix. Eine positive Ladung befindet sich an Rest 7, welche möglicherweise durch Bilden einer Salzbrücke mit einen saurem Rest eine Drehung auf der Helix entfernt zur Helix-Stabilität beiträgt.
4B stellt ein Helixnetz-Diagramm dar, veranschaulichend die hydrophobe Oberseite der amphipathischen Helix, gebildet durch das beispielhafte Kernpeptid 4 (SEQ ID NO: 4). In 4B ist der helikale Zylinder entlang der Mitte der hydrophilen Oberseite geschnitten und abgeflacht. Die hydrophobe Oberseite des Kernpeptids besteht aus zwei hydrophoben Resten pro Drehung, ausgenommem die letzte C-terminale Drehung, wo basische Reste dominieren. NMR-Untersuchungen zeigen an, daß die Aminosäurereste 3, 6, 9 und 10 von diesem Kernpeptid einen hydrophoben Cluster nahe dem N-Terminus der Helix bilden. Phe-6 befandet sich in der Mitte in dieses Clusters, und es wird angenommen, daß es eine wichtige Rolle beim Stabilisieren des hydrophoben Clusters spielt.
Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß der hydrophobe Cluster, gebildet durch die Reste 3, 6, 9 und 10, bedeutsam beim Bewirken von Lipidbindung und LCAT-Aktivierung ist. Zum Beispiel zeigt, während das beispielhafte Kernpeptid 4 (SEQ ID NO: 4), 93% LCAT-Aktivierung in dem hier beschriebenen Assay zeigt, ein Derivat von Peptid 4, enthaltend einen Lys-(K)-Rest an Position 9 (Peptid 33; SEQ ID NO: 33), welcher den hydrophoben Cluster zerstört, nur 33% LCAT-Aktivierung in dem gleichen Assay. Es wird erwartet, daß amphipathische Peptide Phospholipide binden, indem ihre hydrophoben Oberseiten in Richtung zu den Alkylketten der Lipideinheiten zeigen. So wird angenommen, daß dieser in hohem Maße hydrophobe Cluster zu den starken Lipidaffinitäten beiträgt, die für die Kernpeptide der Erfindung beobachtet werden. Da Lipidbindung eine Vorbedingung für LCAT-Aktivierung ist, wird angenommen, daß dieser hydrophobe Cluster auch für LCAT-Aktivierung essentiell ist.
Es wird oft gefunden, daß aromatische Reste wichtig beim Verankern von Peptiden und Proteinen an Lipide sind (De Kruijff, 1990, Biosci. Rep. 10: 127–130; O'Neil und De Grado, 1990, Science 250: 645–651; Blondelle et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1202: 331–336). So wird weiter angenommen, daß Phe-6, welches in der Mitte des hydrophoben Clusters positioniert ist, auch eine Schlüsselrolle beim Verankern der Kernpeptide von Struktur (I) an Lipiden spielen kann.
Wechselwirkungen zwischen den Kernpeptiden der Erfindung und Lipiden führen zu der Bildung von Peptid-Lipid-Komplexen. Wie in 11A veranschaulicht ist, hängt der Typ von Komplex, der erhalten wird (Comicellen, Scheiben, Vesikel oder Mehrfachschichten), von dem Lipid:Peptid-Molverhältnis ab, wobei Comicellen im allgemeinen bei niedrigen Lipid:Peptid-Molverhältnissen gebildet werden und scheibenförmige und vesikuläre oder mehrschichtige Komplexe mit zunehmenden Lipid:Peptid-Molverhältnissen gebildet werden. Diese charakteristische Eigenschaft ist für amphipathische Peptide (Epand, The Amphipathic Helix (Die amphipathische Helix), 1993) und für ApoA-I (Jones, 1992, Structure and Function of Apolipoproteins (Struktur und Funktion von Apolipoproteinen), Kapitel 8, S. 217–250) beschrieben worden. Das Lipid:Peptid-Molverhältnis bestimmt auch die Größe und Zusammensetzung der Komplexe (siehe Abschnitt 5.3.1, nachstehend).
Die lange Achse der α-Helix, gebildet durch die Kernpeptide von Struktur (I), hat eine insgesamt gekrümmte Gestalt. In typischen amphipathischen Helices wurde gefunden, daß die Längen der Wasserstoffbindungen der hydrophilen und hydrophoben Oberseiten variieren, so daß die hydrophobe Seite der Helix konkav ist (Barlow und Thornton, 1988, J. Mol. Biol. 201: 601–619; Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 33: 11174–11183; Gesell et al., 1997, J. Biomol. NMR 9: 127–135). Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Gesamtkrümmung der hydrophoben Oberseite der Helix beim Binden von scheibenförmigen Komplexen wichtig sein kann – eine gekrümmte Helix gestattet dem Peptid, besser um die Randzonen von scheibenförmigen Teilchen zu „passen", wodurch die Stabilität des Peptid-Scheiben-Komplexes erhöht wird.
In dem allgemein akzeptierten strukturellen Modell von ApoA-I sind die amphipathischen α-Helices um die Randzone des scheibenförmigen HDL herum gepackt (siehe 11B). In diesem Modell wird angenommen, daß die Helices ausgerichtet sind, wobei ihre hydrophoben Oberseiten in Richtung zu den Lipid-Acyl-Ketten zeigen (Brasseur et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta 1043: 245–252). Die Helices sind in einer antiparallelen Weise angeordnet, und es wird gedacht, daß eine kooperative Wirkung zwischen den Helices zu der Stabilität des scheibenförmigen HDL-Komplexes beiträgt (Brasseur et al., vorstehend). Es wurde vorgeschlagen, daß ein Faktor, der zu der Stabilität des scheibenförmigen HDL-Komplexes beiträgt, die Existenz ionischer Wechselwirkungen zwischen sauren und basischen Resten ist, resultierend in der Bildung von intermolekularen Salzbrücken oder Wasserstoffbindungen zwischen Resten auf benachbarten antiparallellen Helices. In diesem Modell werden die Peptide nicht als einzelnes Gebilde, sondern als in Wechselwirkung mit mindestens zwei anderen benachbarten Peptidmolekülen angesehen (11B).
Es wird auch allgemein akzeptiert, daß die Bildung von intramolekularen Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zwischen sauren bzw. basischen Resten an den Positionen i und i + 3 der Helix die helikale Struktur stabilisiert (Marqusee et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(24): 8898–8902).
So sind zusätzliche Schlüsselmerkmale der Kernpeptide von Struktur (I) ihre Fähigkeit, intermolekulare Wasserstoffbindungen miteinander zu bilden, wenn sie in einer antiparallelen Weise ausgerichtet werden, wobei ihre hydrophoben Oberseiten in die gleiche Richtung zeigen, so wie es der Fall sein würde, wenn die Peptide an Lipide gebunden sind (d. h., zwischen den sauren Resten an den Positionen 4 und 8 und den basischen Resten an den Positionen 18, 20 und 22), und auch ihre Fähigkeit, intramolekulare Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken nahe den N- und C-Termini der Helix (d. h. zwischen den sauren und basischen Resten an den Positionen 4 und 7 sowie 15 und 18) zu bilden.
Die Fähigkeit der Kernpeptide von Struktur (I), intermolekulare Wasserstoffbindungen zu bilden, ist in 6A veranschaulicht. In 6A sind zwei ideale α-Helices des beispielhaften Kernpeptids 4 (SEQ ID NO: 4) in einer antiparallelen Weise ausgerichtet, wobei ihre entsprechenden hydrophoben Oberseiten in die gleiche Richtung zeigen (aus der Ebene der Seite heraus). H-Bindungs-Wechselwirkungen könnten zwischen den Resten E-8 und Q-19 vorkommen (Huyghues-Despointes et al., 1995, Biochemistry 34(41): 13267–13271).
Weiterhin sind die Helices, wenn in dieser anti-parallelen Weise angeordnet, dicht gepackt; es gibt keine sterische Hinderung, die engen Kontakt zwischen den Helices verhindert. Änderungen in der Sequenz der Kernpeptide, welche die Packung der Helices beeinflussen, beeinflussen die Aktivität der Kernpeptide negativ. Zum Beispiel aktiviert, bezugnehmend auf 6B, ein Dimer von Peptiden, bei denen Gln-19 durch Glu-19 ersetzt ist (Peptid 102; PVLDLFRELLNLXLEALKEKLK, wo X Aib ist; SEQ ID NO: 102), und welche daher keine intermolekularen Wasserstoffbindungen bilden können, LCAT nicht. Bedeutsam ist, daß, während Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) 93% LCAT-Aktivierung in dem hier beschriebenen Assay zeigte, Peptid 102 (SEQ ID NO: 102) in dem gleichen Assay nur 2% Aktivität zeigte.
So wird, wenn auch nicht durch irgendeine spezielle Theorie gebunden, angenommen, daß die Fähigkeit der Kernpeptide von Struktur (I) zu dichter Packung und ionischer Wechselwirkung, wobei intra- und/oder intermolekulare Salzbrücken und/oder Wasserstoffbindungen gebildet werden, wenn sie an Lipide in einer antiparallelen Weise gebunden werden, ein wichtiges Merkmal der Kernpeptide der Erfindung ist.
Es wird auch gedacht, daß die Fähigkeit der Kernpeptide, günstige intermolekulare Peptid-Peptid-Wechselwirkungen zu erzeugen, in Abwesenheit von Lipiden von Relevanz ist. Die Kernpeptide der Erfindung assoziieren selbst, zurückzuführen teilweise auf ihre hohen <μ_H>, <H_o> und den hydrophoben Winkel (siehe, Tabelle I, nachstehend). Das Phänomen der Selbstassoziation hängt von den Bedingungen von pH, Peptidkonzentration und Ionenstärke ab und kann in verschiedenen Assoziationszuständen von monomeren bis zu verschiedenen multimeren Formen resultieren (11A). Der hydrophobe Kern von Peptidaggregaten begünstigt hydrophobe Wechselwirkungen mit Lipiden. Die Fähigkeit der Peptide, sogar bei sehr niedrigen Konzentrationen zu aggregieren, kann ihre Bindung an Lipide begünstigen. Es wird gedacht, daß im Kern der Peptidaggregate Peptid-Peptid-Wechselwirkungen ebenfalls vorkommen und mit Lipid-Peptid-Wechselwirkungen konkurrieren können.
Es wird gedacht, daß zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Eigenschaften andere Parameter gleichfalls für Aktivität wichtig sind, die die Gesamtzahl von hydrophoben Resten, die Gesamtzahl von geladenen Resten und die Nettoladung der Peptide einschließen.

Eine Zusammenfassung der bevorzugten physikalischen und strukturellen Eigenschaften der Kernpeptide von Struktur (I) wird nachstehend in Tabelle I bereitgestellt: TABELLE I PHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN VON BEVORZUGTEN APOA-I-AGONISTEN VON STRUKTUR (I)

Eigenschaft	Bereich	bevorzugter Bereich
% hydrophobe Aminosäuren	40–70	50–60
<H_o>	–0,050 bis –0,070	–0,030 bis –0,055
<H_o ^pho>	0,90–1,2	0,94–1,1
<μ_H>	0,45–0,65	0,50–0,60
pho-Winkel	160°–220°	180°–200°
# positiv geladene Aminosäuren	3–5	4
# negativ geladene Aminosäuren	3–5	4
Nettoladung	–1 bis +1	0
hydrophober Cluster	die Positionen 3, 6, 9, 10 sind hydrophobe Aminosäuren
saurer Cluster	mindestens 1 saure Aminosäure pro Drehung, abgesehen von den letzten 5 C-terminalen Aminosäuren
basischer Cluster	mindestens 3 basische Aminosäuren in den letzten 5 C-terminalen Aminosäuren

Die Eigenschaften der amphipathischen α-Helices, gebildet durch die Kernpeptide der Erfindung, unterscheiden sich signifikant von den Eigenschaften amphipathischer α-Helices der Klasse A, insbesondere der α-Helix der Klasse A von Segrest's Consensus-22-mer. Diese Unterschiede sind bei dem beispielhaften Kernpeptid 4 (SEQ ID NO: 4) in den 3–5 veranschaulicht.
Bezugnehmend auf die 4A und 4B kann gesehen werden, daß die hydrophobe Oberseite von Peptid 4 viel größeren hydrophoben Charakter als die hydrophobe Oberseite von Segrest's Consensus-22-mer hat. Insbesondere sind Rest 5, 9 und 13 (schattierte Region von 4B) hydrophobe Leu-(L)-Reste in Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), verglichen mit geladenen Resten in dem Consensus-22-mer (SEQ ID NO: 75). Die Ersetzung dieser drei geladenen Reste in Segrest's Consensus-22-mer mit hydrophoben Leu-(L)-Resten führt zu bedeutsamen Unterschieden in der Amphipathie, Hydrophobie, dem pho-Winkel und anderen Eigenschaften der Helix.

Ein Vergleich der physikalischen und strukturellen Eigenschaften von zwei beispielhaften Kernpeptiden von Struktur (I), Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und Peptid 8 (SEQ ID NO: 8), und Segrest's Consensus-22-mer (SEQ ID NO: 75) wird nachstehend in Tabelle II bereitgestellt: TABELLE II VERGLEICH DER EIGENSCHAFTEN VON BEISPIELHAFTEN KERNPEPTIDEN MIT SEGREST'S CONSENSUS-22-MER

Eigenschaft	Consensus	Peptid 4	Peptid 8
# Aminosäuren	22	22	22
# hydrophile Aminosäuren	13	10	10
# hydrophobe Aminosäuren	9	12	12
% hydrophobe Aminosäuren	41	55	55
<H_o>	–0,293	–0,013	–0,040
<H_o ^pho>	0,960	0,990	0,940
<μ_H>	0,425	0,547	0,521
pho-Winkel	100°	200°	200°
# positiv geladene Aminosäuren	5	4	4
# negativ geladene Aminosäuren	6	4	4
Nettoladung	–1	0	0

Am bemerkenswertesten ist, daß die Kernpeptide von Struktur (I) aus einem größeren Prozentgehalt von hydrophoben Resten bestehen, eine signifikant größere <H_o> und <μ_H> haben und einen zweifach größeren pho-Winkel haben (siehe 5A und 5B). Diese Unterschiede in den Eigenschaften führen zu bedeutsamen Unterschieden in der Aktivität. Während Segrest's Consensus-22-mer (SEQ ID NO: 75) nur 10% LCAT-Aktivierung, verglichen mit nativem ApoA-I in den hier beschriebenen Assays, zeigt, zeigen die Peptide 4 (SEQ ID NO: 4) und 8 (SEQ ID NO: 8) 93% bzw. 83% LCAT-Aktivierung, verglichen mit nativem ApoA-I in den gleichen Assays. Peptid 1 (PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK; SEQ ID NO: 1) und Peptid 2 (GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK; SEQ ID NO: 2) zeigten 120% bzw. 105% LCAT-Aktivierung, verglichen mit nativem ApoA-I in den gleichen Assays.
Bestimmte Aminosäurereste in den Kernpeptiden von Struktur (I) können mit anderen Aminosäureresten ersetzt werden, ohne die Aktivität der Peptide bedeutsam schädlich zu beeinflussen, und sie in vielen Fallen sogar verstärken. So werden durch die vorliegende Erfindung auch geänderte oder mutierte Formen der Kernpeptide von Struktur (I) in Betracht gezogen, wobei mindestens ein definierter Aminosäurerest in der Struktur mit einem anderen Aminosäurerest substituiert ist. Es wird angenommen, daß eines der kritischen Merkmale, die die Aktivität der Kernpeptide der Erfindung beeinflussen, ihre Fähigkeit ist, α-Helices in Gegenwart von Lipiden zu bilden, die die amphipathischen und anderen vorstehend beschriebenen Eigenschaften zeigen, es wird erkannt, daß in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung die Aminosäuresubstitutionen konservativ sind, d. h., der ersetzende Aminosäurerest hat physikalische und chemische Eigenschaften, die denen des Aminosäurerests, der ersetzt wird, ähnlich sind.
Für Zwecke der Bestimmung von konservativen Aminosäuresubstitutionen können die Aminosäuren geeignet in zwei Hauptkategorien – hydrophil und hydrophob – klassifiziert werden, abhängig in erster Linie von den physikalisch-chemischen charakteristischen Eigenschaften der Aminosäureseitenkette. Diese zwei Hauptkategorien können weiter in Unterkategorien klassifiziert werden, die die charakteristischen Eigenschaften der Aminosäureseitenketten deutlicher definieren. Zum Beispiel kann die Klasse von hydrophilen Aminosäuren weiter in saure, basische und polare Aminosäuren unterteilt werden. Die Klasse von hydrophoben Aminosäuren kann weiter in apolare und aromatische Aminosäuren unterteilt werden. Die Definitionen der verschiedenartigen Kategorien von Aminosäuren, die Struktur (I) definieren, sind wie folgt:
„Hydrophile Aminosäure" bezeichnet eine Aminosäure, die eine Hydrophobie von weniger als null entsprechend der genormten Consensus-Hydrophobie-Skala von Eisenberg et al., 1984, J. Mol. Biol. 179: 125–142, zeigt. Zu genetisch codierten hydrophilen Aminosäuren gehören Thr (T), Ser (S), His (H), Glu (E), Asn (N), Gln (Q), Asp (D), Lys (K) und Arg (R).
„Saure Aminosäure" bezeichnet eine hydrophile Aminosäure mit einem Seitenketten-pK-Wert von weniger als 7. Saure Aminosäuren haben typischerweise bei physiologischem pH aufgrund des Verlusts eines Wasserstoffions negativ geladene Seitenketten. Zu genetisch codierten sauren Aminosäuren gehören Glu (E) und Asp (D).
„Basische Aminosäure" bezeichnet eine hydrophile Aminosäure mit einem Seitenketten-pK-Wert von größer als 7. Basische Aminosäuren haben typischerweise bei physiologischem pH aufgrund der Assoziation mit Hydroniumion positiv geladene Seitenketten. Zu genetisch codierten basischen Aminosäuren gehören His (H), Arg (R) und Lys (K).
„Polare Aminosäure" bezeichnet eine hydrophile Aminosäure mit einer Seitenkette, die bei physiologischem pH ungeladen ist, aber welche mindestens eine Bindung hat, in welcher das Paar von Elektronen, das zwei Atome gemeinsam haben, von einem der Atome enger gehalten wird. Zu genetisch codierten polaren Aminosäuren gehören Asn (N), Gln (Q), Ser (S) und Thr (T).
„Hydrophobe Aminosäure" bezeichnet eine Aminosäure, die eine Hydrophobie von größer als null entsprechend der genormten Consensus-Hydrophobie-Skala von Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125–142, zeigt. Zu genetisch codierten hydrophoben Aminosäuren gehören Pro (P), Ile (I), Phe (F), Val (V), Leu (L), Trp (W), Met (M), Ala (A), Gly (G) und Tyr (Y).
„Aromatische Aminosäure" bezeichnet eine hydrophobe Aminosäure mit einer Seitenkette mit mindestens einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring. Der aromatische oder heteroaromatische Ring kann einen oder mehrere Substituenten wie beispielsweise -OH, -SH, -CN, -F, -Cl, -Br, -I, -NO₂, -NO, -NH₂, -NHR, -NRR, -C(O)R, -C(O)OH, -C(O)OR, -C(O)NH₂, -C(O)NHR, -C(O)NRR und dergleichen enthalten, wo jedes R unabhängig (C₁-C₆)-Alkyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, substituiertes (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, substituiertes (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, substituiertes (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5–20-gliedriges Heteroaryl, substituiertes 5–20-gliedriges Heteroaryl, 6–26-gliedriges Alkheteroaryl oder substituiertes 6–26-gliedriges Alkheteroaryl ist. Zu genetisch codierten aromatischen Aminosäuren gehören Phe (F), Tyr (Y) und Trp (W).
„Nichtpolare Aminosäure" bezeichnet eine hydrophobe Aminosäure mit einer Seitenkette, die bei physiologischem pH ungeladen ist und welche Bindungen hat, in welchen das Paar von Elektronen, das zwei Atome gemeinsam haben, im allgemeinen durch jedes der zwei Atome gleich gehalten wird (d. h., die Seitenkette ist nicht polar). Zu genetisch codierten apolaren Aminosäuren gehören Leu (L), Val (V), Ile (I), Met (M), Gly (G) und Ala (A).
„Aliphatische Aminosäure" bezeichnet eine hydrophobe Aminosäure mit einer aliphatischen Kohlenwasserstoff-Seitenkette. Zu genetisch codierten aliphatischen Aminosäuren gehören Ala (A), Val (V), Leu (L) und Ile (I).
Der Aminosäurerest Cys (C) ist ungewöhnlich insofern, als er Disulfidbrücken mit anderen Cys-(C)-Resten oder anderen Sulfanyl-enthaltenden Aminosäuren bilden kann. Die Fähigkeit von Cys-(C)-Resten (und anderen Aminosäuren mit -SH enthaltenden Seitenketten), in einem Peptid in entweder der reduzierten freien -SH- oder der oxidierten Disulfid-verbrückten Form zu existieren, beeinflußt, ob Cys-(C)-Reste netto hydrophoben oder hydrophilen Charakter zu einem Peptid beitragen. Wenn auch Cys (C) eine Hydrophobie von 0,29 entsprechend der genormten Consensus-Skala von Eisenberg (Eisenberg, 1984, vorstehend) zeigt, ist es selbstverständlich, daß für Zwecke der vorliegenden Erfindung Cys (C), trotz der vorstehend definierten allgemeinen Klassifikationen, als polare hydrophile Aminosäure kategorisiert wird.
Wie vom Fachmann erkannt wird, sind die vorstehend-definierten Kategorien sich nicht gegenseitig ausschließend. So können Aminosäuren mit Seitenketten, die zwei oder mehrere physikalisch-chemische Eigenschaften zeigen, in mehrfache Kategorien eingeschlossen werden. Zum Beispiel können Aminosäureseitenketten mit aromatischen Einheiten, die weiter mit polaren Substituenten substituiert sind, wie beispielsweise Tyr (Y), sowohl aromatische hydrophobe Eigenschaften als auch polare oder hydrophile Eigenschaften zeigen, und können daher in sowohl die aromatische als auch die polare Kategorie eingeschlossen werden. Die geeignete Kategorisierung einer Aminosäure ist für den Fachmann offensichtlich, insbesondere angesichts der ausführlichen Offenbarung, die hier bereitgestellt wird.
Bestimmte Aminosäurereste, genannt „Helix-brechende" Aminosäuren, haben eine Neigung, die Struktur von α-Helices zu unterbrechen, wenn sie in internen Positionen innerhalb der Helix enthalten sind. Aminosäurereste, die derartige Helix-brechende Eigenschaften zeigen, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Chou und Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251–276) und dazu gehören Pro (P), Gly (G) und möglicherweise alle D-Aminosäuren (wenn sie in einem L-Peptid enthalten sind; umgekehrt unterbrechen L-Aminosäuren die helikale Struktur, wenn sie in einem D-Peptid enthalten sind). Wenn auch diese Helix-brechenden Aminosäurereste in die vorstehend definierten Kategorien fallen, mit der Ausnahme von Gly (G) (diskutiert nachstehend), sollten diese Reste nicht verwendet werden, um Aminosäurereste in internen Positionen innerhalb der Helix zu substituieren – sie sollten nur verwendet werden, um 1–3 Aminosäurereste an dem N-Terminus und/oder C-Terminus des Peptids zu substituieren.
Wenn auch die vorstehend definierten Kategorien hinsichtlich der genetisch codierten Aminosäuren beispielhaft dargestellt worden sind, brauchen die Aminosäuresubstitutionen nicht, und in bestimmten Ausführungsformen sind sie es vorzugsweise nicht, auf die genetisch codierten Aminosäuren beschränkt zu sein. In der Tat enthalten viele der bevorzugten Peptide von Struktur (I) genetisch nicht-codierte Aminosäuren. So können, zusätzlich zu den natürlich vorkommenden genetisch codierten Aminosäuren, Aminosäurereste in den Kernpeptiden von Struktur (I) mit natürlich vorkommenden nicht-codierten Aminosäuren und synthetischen Aminosäuren substituiert sein.
Zu bestimmten gebräuchlicherweise angetroffenen Aminosäuren, welche verwendbare Substitutionen für die Kernpeptide von Struktur (I) bereitstellen, gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, β-Alanin (β-Ala) und andere omega-Aminosäuren, wie beispielsweise 3-Aminopropionsäure, 2,3-Diaminopropionsäure (Dpr), 4-Aminobuttersäure und so fort; α-Aminoisobuttersäure (Aib); ε-Aminohexansäure (Aha); δ-Aminovaleriansäure (Ava); N-Methylglycin oder Sarcosin (MeGly); Ornithin (Orn); Citrullin (Cit); t-Butylalanin (t-BuA); t-Butylglycin (t-BuG); N-Methylisoleucin (MeIle); Phenylglycin (Phg); Cyclohexylalanin (Cha); Norleucin (Nle); Naphthylalanin (Nal); 4-Chlorphenylalanin (Phe(4-Cl)); 2-Fluorphenylalanin (Phe(2-F)); 3-Fluorphenylalanin (Phe(3-F)); 4-Fluorphenylalanin (Phe(4-F)); Penicillamin (Pen); 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic); β-2-Thienylalanin (Thi); Methioninsulfoxid (MSO); Homoarginin (hArg); N-Acetyllysin (AcLys); 2,4-Diaminobuttersäure (Dbu); 2,3-Diaminobuttersäure (Dab); p-Aminophenylalanin (Phe(pNH₂)); N-Methylvalin (MeVal); Homocystein (hCys), Homophenylalanin (hPhe) und Homoserin (hSer); Hydroxyprolin (Hyp), Homoprolin (hPro), N-methylierte Aminosäuren und Peptoide (N-substituierte Glycine).

Die Klassifikationen der genetisch codierten und gebräuchlichen nicht-codierten Aminosäuren entsprechend den vorstehend definierten Kategorien sind nachstehend in Tabelle 111 zusammengefaßt. Es ist selbstverständlich, daß Tabelle III nur für veranschaulichende Zwecke ist und nicht vorgibt, eine erschöpfende Liste von Aminosäureresten zu sein, die verwendet werden können, um die hier beschriebenen Kernpeptide zu substituieren. Andere Aminosäurereste, die hier nicht speziell erwähnt sind, können angesichts der hier bereitgestellten Definitionen basierend auf ihren beobachteten physikalischen und chemischen Eigenschaften leicht kategorisiert werden. TABELLE III KLASSIFIKATIONEN VON GEBRÄUCHLICHERWEISE ANGETROFFENEN AMINOSÄUREN

Klassifikation	genetisch codiert	nicht-genetisch codiert
Hydrophob
Aromatisch	F, Y, W	Phg, Nal, Thi, Tic, Phe(4-Cl), Phe(2-F), Phe(3-F), Phe(4-F), hPhe
Apolar	L, V, I, M, G, A, P	t-BuA, t-BuG, MeIle, Nle, MeVal, Cha, McGly, Aib
Aliphatisch	A, V, L, I	b-Ala, Dpr, Aib, Aha, MeGly, t-BuA, t-BuG, MeIle, Cha, Nle, MeVal
Hydrophil
Sauer	D, E
Basisch	H, K, R	Dpr, Orn, hArg, Phe(p-NH₂), Dbu, Dab
Polar	C, Q, N, S, T	Cit, AcLys, MSO, bAla, hSer
Helix-brechend	P, G	D-Pro und andere D-Aminosäuren (in L-Peptiden)

Wenn auch in den meisten Fällen die Aminosäuren der Kernpeptide von Struktur (I) mit L-enantiomeren Aminosäuren substituiert sein werden, sind die Substitutionen nicht auf L-enantiomere Aminosäuren begrenzt. So sind in die Definition von „mutierten" oder „geänderten" Formen auch diejenigen Situationen eingeschlossen, wo eine L-Aminosäure mit einer identischen D-Aminosäure (z. B. L-Arg → D-Arg) oder mit einer D-Aminosäure der gleichen Kategorie oder Unterkategorie (z. B. L-Arg → D-Lys) ersetzt wird, und umgekehrt. In der Tat können in bestimmten bevorzugten Ausführungsformen, die für orale Verabreichung an tierische Patienten geeignet sind, die Peptide vorteilhafterweise aus mindestens einer D-enantiomeren Aminosäure bestehen. Man denkt, daß Peptide, die derartige D-Aminosäuren enthalten, gegenüber Zersetzung in der Mundhöhle, dem Darm oder Serum stabiler sind als es Peptide sind, die ausschließlich aus L-Aminosäuren bestehen.
Wie vorstehend bemerkt neigen D-Aminosäuren dazu, die Struktur von α-Helices zu unterbrechen, wenn sie bei einem α-helikalen L-Peptid in internen Positionen enthalten sind. Weiterhin ist beobachtet worden, daß bestimmte mutierte Formen der Kernpeptide von Struktur (I), die vollständig aus D-Aminosäuren bestehen, signifikant niedrigere LCAT-Aktivierung in dem hier beschriebenen Assay zeigen als identische Peptide, die vollständig aus L-Aminosäuren bestehen. Infolgedessen sollten D-Aminosäuren nicht verwendet werden, um interne L-Aminosäuren zu substituieren; D-Aminosäure-Substitutionen sollten auf 1–3 Aminosäurereste an dem N-Terminus und/oder C-Terminus des Peptids begrenzt sein.
Wie bereits diskutiert wirkt die Aminosäure Gly (G) im allgemeinen als Helix-brechender Rest, wenn sie in internen Positionen eines Peptids enthalten ist. Ganz überraschenderweise haben die Anmelder entdeckt, daß, wenn auch die helikale Struktur der Kernpeptide der Erfindung in Abwesenheit von Lipiden unterbrochen wird, wenn interne Aminosäurereste mit Gly (G) substituiert werden, in Gegenwart von Lipiden derartige Gly (G) enthaltende Peptide signifikante helikale Struktur ebenso wie Aktivität zeigen. Zum Beispiel wurden, während Peptid 8 (SEQ ID NO: 8) nur 20% helikale Struktur in Puffer zeigt, 61–93% helikale Struktur in Gegenwart von Lipiden beobachtet und 93% Helizität wurden in Gegenwart von Trifluorethanol (TFE) beobachtet. Die helikale Struktur dieses Peptids in Gegenwart von TFE wurde mit NMR bestätigt (siehe Abschnitt 7.3.5, nachstehend). Bemerkenswerterweise zeigte dieses Peptid auch 83% LCAT-Aktivierung. Andere Kernpeptide, die interne Glycin-Reste enthielten, zeigten ebenfalls > 38% LCAT-Aktivierung (siehe z. B. Tabelle X, Abschnitt 8.3, nachstehend). So kann, obwohl Gly (G) im allgemeinen als Helix-brechender Rest angesehen wird, Gly (G) verwendet werden, um Aminosäuren an internen Positionen der Kernpeptide von Struktur (I) zu substituieren. Vorzugsweise werden nur interne Reste, positioniert innerhalb etwa ±1 helikalen Drehung der Mitte des Peptids (speziell für Peptide, bestehend aus einer geraden Anzahl von Aminosäuren) mit Gly (G) substituiert. Zusätzlich wird bevorzugt, daß nur ein interner Aminosäurerest in dem Peptid mit Gly (G) substituiert wird. Bevorzugte Ausführungsformen der ApoA-I-Agonisten der Erfindung, die interne Glycine enthalten, sind nachstehend in Abschnitt 5.1.2 beschrieben.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Aminosäurerest-Klassifikationen in Verbindung mit den Schiffer-Edmundson-Helixrad- und Helixnetzdiagramm-Darstellungen der Kernpeptide von Struktur (I) ebenso wie der hier bereitgestellten ausführlichen Beschreibung der gewünschten Eigenschaften können geänderte oder mutierte Formen der Kernpeptide von Struktur (I), die die amphipathischen und anderen Eigenschaften der Helix im wesentlichen behalten und welche daher dafür angesehen werden, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein, leicht erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden geänderte oder mutierte Formen der Kernpeptide von Struktur (I) durch Fixieren der hydrophilen oder hydrophoben Reste entsprechend Struktur (I) und Substituieren von mindestens einem nichtfixierten Rest mit einer anderen Aminosäure, vorzugsweise mit einer anderen Aminosäure der gleichen Kategorie oder Unterkategorie, erhalten. Die Reste, die die basischen und/oder hydrophoben Cluster bilden, können auch fixiert und mindestens ein nicht-fixierter Rest substituiert sein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden geänderte oder mutierte Formen der Kernpeptide von Struktur (I) durch Fixieren der hydrophilen Aminosäurereste, positioniert innerhalb der hydrophilen Oberseite der Helix entsprechend Struktur (I), und Substituieren von mindestens einem nicht-fixierten Aminosäurerest mit einer anderen Aminosäure, vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest der gleichen Kategorie oder Unterkategorie, erhalten. Bezugnehmend auf 2A kann gesehen werden, daß die Reste 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 und 22 innerhalb der hydrophilen Oberseite der amphipathischen Helix, gebildet durch die Kernpeptide von Struktur (I), positioniert sind. Von diesen Resten sind alle hydrophil, abgesehen von Rest 1, welcher entweder hydrophil oder hydrophob sein kann. So sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Reste 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19 und 22 entsprechend Struktur (I) fixiert und mindestens einer von den Resten 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 ist mit einer anderen Aminosäure der gleichen Kategorie substituiert, vorzugsweise mit einer anderen Aminosäure der gleichen Unterkategorie. Alternativ ist Rest 1 auch entsprechend Struktur (I) fixiert und mindestens einer von den Resten 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 ist wie beschrieben substituiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der C-terminale basische Cluster (Reste 18, 19, 20 und 22) auch entsprechend Struktur (I) fixiert, und nur die Reste 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 und/oder 21 sind substituiert.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist der hydrophobe Cluster auch fixiert, und nur die Reste 2, 5, 13, 14, 16, 17, 20 und/oder 21 sind substituiert.
In noch einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform sind sowohl der basische als auch hydrophobe Cluster fixiert und nur die Reste 2, 5, 13, 14, 16, 17 und/oder 21 sind substituiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden geänderte oder mutierte Formen der Kernpeptide der Erfindung durch Fixieren der hydrophoben Aminosäurereste, positioniert innerhalb der hydrophoben Oberseite der Helix, und Substituieren mindestens eines nicht-fixierten Aminosäurerests mit einem anderen Aminosäurerest, vorzugsweise mit einem anderen Rest der gleichen Kategorie oder Unterkategorie, erhalten.
Bezugnehmend auf 2A kann gesehen werden, daß die Reste 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17, 20 und 21 innerhalb der hydrophoben Oberseite positioniert sind. Von diesen sind alle hydrophob, abgesehen von Rest 20, welcher hydrophil ist. So sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Reste 2, 3, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 16, 17 und 21 entsprechend Struktur (I) fixiert und mindestens einer von den Resten 1, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 18, 19, 20 und 22 ist mit einem anderen Aminosäurerest, vorzugsweise mit einer anderen Aminosäure der gleichen Kategorie oder Unterkategorie substituiert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der C-terminale basische Cluster auch fixiert, und nur die Reste 1, 4, 7, 8, 11, 12 und/oder 15 sind substituiert.
In einer anderen Ausführungsform werden geänderte oder mutierte Formen der Peptide von Struktur (I) durch Fixieren aller der Aminosäurereste, die sich innerhalb der hydrophoben oder hydrophilen Oberseite der Helix befinden, und Substituieren, vorzugsweise konservativ, von mindestens einem Aminosäurerest, der sich in der anderen Oberseite befindet, mit einem anderen Aminosäurerest erhalten. Die Reste, umfassend den hydrophoben Cluster und/oder den basischen Cluster können auch gegebenenfalls entsprechend Struktur (I), wie vorher definiert, fixiert sein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die geänderten oder mutierten Formen von Struktur (I) durch Substituieren von mindestens einer Aminosäure mit einer nicht-konservativen Aminosäure erhalten. Der Fachmann erkennt, daß derartige Substitutionen die amphipathischen und/oder strukturellen Eigenschaften der vorstehend diskutierten Helix nicht wesentlich verändern sollten. So kann es in bestimmten Fällen wünschenswert sein, ein oder mehrere Paare von Aminosäuren zu substituieren, um die netto-Eigenschaften der Helix zu bewahren. Weitere Anleitung zum Auswählen geeigneter Aminosäuresubstitutionen wird durch die Peptid-Sequenzen, aufgeführt in Tabelle X (siehe Abschnitt 8.3, nachstehend) bereitgestellt.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die ersten ein bis vier Aminosäurereste an dem N-Terminus und/oder C-Terminus der Kernpeptide von Struktur (I) mit einem oder mehreren Aminosäureresten substituiert, oder einem oder mehreren Peptidsegmenten, von denen bekannt ist, daß sie Stabilität auf Regionen mit α-helikaler sekundärer Struktur übertragen („Endkappen"-Reste oder Segmente). Derartige Endkappen-Reste und Segmente sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Richardson und Richardson, 1988, Science 240: 1648–1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30): 7605–7609; Dasgupta und Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499–511; Seale et al., 1994, Protein Science 3: 1741–1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33: 3396–3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18: 1–7; Doig und Baldwin, 1995, Protein Science 4: 1325–1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34: 12820–12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35: 387–397; Doig et al., 1997, Protein Science 6: 147–155). Alternativ können die ersten ein bis vier N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäurereste von Struktur (I) mit peptidomimetischen Einheiten ersetzt werden, die die Struktur und/oder Eigenschaften von Endkappen-Resten oder Segmenten nachahmen. Geeignete Endkappen-Mimetika sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind zum Beispiel bei Richardson und Richardson, 1988, Science 240: 1648–1652; Harper et al., 1993, Biochemistry 32(30): 7605–7609; Dasgupta und Bell, 1993, Int. J. Peptide Protein Res. 41: 499–511; Seale et al., 1994, Protein Science 3: 1741–1745; Doig et al., 1994, Biochemistry 33: 3396–3403; Zhou et al., 1994, Proteins 18: 1–7; Doig und Baldwin, 1995, Protein Science 4: 1325–1336; Odaert et al., 1995, Biochemistry 34: 12820–12829; Petrukhov et al., 1996, Biochemistry 35: 387–397; Doig et al., 1997, Protein Science 6: 147–155) beschrieben.
Wenn auch Struktur (I) 22 spezifizierte Aminosäurerestpositionen enthält, ist es selbstverständlich daß die Kernpeptide der Erfindung weniger als 22 Aminosäurereste enthalten können. In der Tat werden verkürzte oder intern deletierte Formen von Struktur (I), die so wenige wie 18 oder sogar 15 Aminosäurereste enthalten, die die Gesamtcharakteristika und Eigenschaften der amphipathischen Helix, gebildet durch die Kernpeptide von Struktur (I), im wesentlichen behalten, dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein.
Verkürzte Formen der Peptide von Struktur (I) werden durch Deletieren einer oder mehrerer Aminosäuren von dem N- und/oder C-Terminus von Struktur (I) erhalten. Intern deletierte Formen von Struktur (I) werden durch Deletieren einer oder mehrerer Aminosäuren von internen Positionen innerhalb des Peptids von Struktur (I) erhalten. Die deletierten internen Aminosäurereste können aufeinanderfolgende Reste sein oder können es nicht sein.
Der Fachmann erkennt, daß Deletieren eines internen Aminosäurerests aus einem Kernpeptid von Struktur (I) verursachen wird, daß die Ebene der hydrophil-hydrophoben Grenzfläche der Helix sich an dem Punkt der Deletion um 100° dreht. Da derartige Drehungen die amphipathischen Eigenschaften der resultierenden Helix signifikant ändern können, werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Aminosäurereste deletiert, so daß die Ausrichtung der Ebene der hydrophil-hydrophoben Grenzfläche entlang der gesamten langen Achse der Helix im wesentlichen beibehalten wird.
Dies kann geeignet durch Deletieren einer ausreichenden Anzahl von aufeinanderfolgenden oder nicht-aufeinanderfolgenden Aminosäureresten erreicht werden, so daß eine vollständige helikale Drehung deletiert wird. Eine idealisierte α-Helix enthält 3,6 Reste pro Drehung. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform Gruppen von 3–4 aufeinanderfolgenden oder nicht aufeinanderfolgenden Aminosäureresten deletiert. Ob 3 Aminosäuren oder 4 Aminosäuren deletiert werden, wird von der Position innerhalb der Helix des ersten zu deletierenden Rests abhängen. Bestimmen der geeigneten Anzahl von aufeinanderfolgenden oder nicht aufeinanderfolgenden Aminosäureresten, die eine vollständige helikale Drehung von einem speziellen Ausgangspunkt innerhalb einer amphipathischen Helix bilden, liegt vollauf innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns.
Aufgrund der vermuteten Bedeutung des basischen Clusters an dem C-Terminus der Kernpeptide von Struktur (I) beim Stabilisieren der Helix und der Bedeutung des hydrophoben Clusters beim Bewirken von Lipidbindung und LCAT-Aktivierung werden in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Reste, die basischen und hydrophoben Cluster umfassen, nicht deletiert. So werden in bevorzugten Ausführungsformen die Reste 18, 19, 20 und 22 (basischer Cluster) und die Reste 3, 6, 9 und 10 (hydrophober Cluster) nicht deletiert.
Die Kernpeptide von Struktur (I) können auch an einem oder beiden Termini oder intern mit zusätzlichen Aminosäureresten verlängert werden, die die strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften der Peptide nicht wesentlich beeinträchtigen und in einigen Ausführungsformen sogar verbessern. In der Tat werden verlängerte Kernpeptide, enthaltend so viele wie 23, 25, 26, 29 oder sogar mehr Aminosäurereste, dafür angesehen, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung zu sein. Vorzugsweise werden derartige verlängerte Peptide die netto-Amphipathie und andere Eigenschaften der Peptide von Struktur (I) im wesentlichen beibehalten. Natürlich wird erkannt, daß Hinzufügen von Aminosäuren intern die Ebene der hydrophob-hydrophilen Grenzfläche an dem Punkt der Insertion in einer Weise ähnlich der vorstehend für interne Deletionen beschriebenen drehen wird. So werden die vorstehend diskutierten Überlegungen in Verbindung mit internen Deletionen gleichfalls auf interne Additionen angewendet.
In einer Ausführungsform werden die Kernpeptide an dem N- und/oder C-Terminus um mindestens eine helikale Drehung verlängert. Vorzugsweise stabilisieren derartige Extensionen die helikale sekundäre Struktur in Gegenwart von Lipiden, wie beispielsweise die bereits beschriebenen Endkappen-Aminosäuren und Segmente.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Kernpeptid von Struktur (I) an dem C-Terminus durch einen einzelnen basischen Aminosäurerest, vorzugsweise Lys (K), verlängert. Wenn so verlängert, ist X₁ vorzugsweise D-Pro (p) oder Gly (G); ist X₂ vorzugsweise Val (V); ist X₃ vorzugsweise Leu (L); ist X₄ vorzugsweise Asp (D); ist X₅ vorzugsweise Leu (L); ist X₆ vorzugsweise Phe (F); ist X₇ vorzugsweise Arg (R); ist X₈ vorzugsweise Glu (E); ist X₉ vorzugsweise Leu (L); ist X₁₀ vorzugsweise Leu (L); ist X₁₁ vorzugsweise Asn (N); ist X₁₂ vorzugsweise Glu (E); ist X₁₃ vorzugsweise Leu (L); ist X₁₄ vorzugsweise Leu (L); ist X₁₅ vorzugsweise Glu (E); ist X₁₆ vorzugsweise Ala (A); ist X₁₇ vorzugsweise Leu (L); ist X₁₈ vorzugsweise Lys (K); ist X₁₉ vorzugsweise Gln (Q); ist X₂₀ vorzugsweise Lys (K); ist X₂₁ vorzugsweise Lys (K); und/oder ist X₂₂ vorzugsweise Lys (K).
Ebenfalls eingeschlossen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung sind „blockierte" Formen des ApoA-I-Agonisten, d. h. Formen der ApoA-I-Agonisten, in welchen der N- und/oder C-Terminus mit einer Einheit blockiert ist, die imstande ist, mit dem N-terminalen -NH₂ oder C-terminalen -C(O)OH zu reagieren. Es ist entdeckt worden, daß Entfernen der N- und/oder C-terminalen Ladungen der ApoA-I-Agonisten der Erfindung, enthaltend 18 oder weniger Aminosäurereste, (durch Synthetisieren von N-acylierten Peptidamiden/-estern/-hydraziden/-alkoholen und Substitutionen davon) in Agonisten resultiert, welche die Aktivität der unblockierten Form des Agonisten annähern und in einigen Ausführungsformen sogar übertreffen. In einigen Ausführungsformen, die 22 oder mehr Aminosäuren enthalten, resultiert Blockieren des N- oder C-Terminus in ApoA-I-Agonisten, welche niedrigere Aktivität als die unblockierten Formen zeigen. Jedoch wird erwartet, daß Blockieren sowohl des N- als auch des C-Terminus von ApoA-I-Agonisten, bestehend aus 22 oder mehr Aminosäuren, die Aktivität wiederherstellt. So sind in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entweder der N- und/oder der C-Terminus (vorzugsweise beide Termini) von Kernpeptiden, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren, blockiert, wohingegen der N- und C-Terminus von Peptiden, enthaltend 22 oder mehr Aminosäuren, entweder beide blockiert oder beide unblockiert sind. Zu typischen N-terminalen blockierenden Gruppen gehören RC(O)-, wo R -H, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5–20-gliedriges Heteroaryl oder 6–26-gliedriges Alkheteroaryl ist. Zu bevorzugten N-terminalen blockierenden Gruppen gehören Acetyl, Formyl und Dansyl. Zu typischen C-terminalen blockierenden Gruppen gehören -C(O)NRR und -C(O)OR, wo jedes R unabhängig wie vorstehend definiert ist. Zu bevorzugten C-terminalen blockierenden Gruppen gehören diejenigen, wo jedes R unabhängig Methyl ist. Wenn auch nicht beabsichtigt ist, durch irgendeine spezielle Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß derartige terminale blockierende Gruppen die α-Helix in Gegenwart von Lipiden stabilisieren (siehe z. B. Venkatachelapathi et al., 1993, Proteins: Structure, Function and Genetics (Proteine: Struktur, Funktion und Genetik) 15: 349–359).
Die native Struktur von ApoA-I enthält acht helikale Einheiten, von denen man denkt, daß sie gemeinsam wirken, um Lipide zu binden (Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087–7092; Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 10248–10262; Vanloo et al., 1991, J. Lipid Res. 32: 1253– 1264; Mendez et al., 1994, J. Clin. Invest. 94: 1698–1705; Palgunari et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16: 328–338; Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74–84). So sind in der vorliegenden Erfindung auch ApoA-I-Agonisten eingeschlossen, die aus Dimeren, Trimeren, Tetrameren und Polymeren noch höherer Ordnung („Multimeren") der hier beschriebenen Kernpeptide bestehen. Derartige Multimere können in der Form von Tandemwiederholungen, verzweigten Netzwerken oder Kombinationen davon sein. Die Kernpeptide können direkt aneinander gebunden oder durch ein oder mehrere Verbindungsglieder getrennt sein.
Die Kernpeptide, die die Multimere umfassen, können die Peptide von Struktur (I), Analoge von Struktur (I), mutierte Formen von Struktur (I), verkürzte oder intern deletierte Formen von Struktur (I), verlängerte Formen von Struktur (I) und/oder Kombinationen davon sein. Die Kernpeptide können in einer Kopf-zu-Schwanz-Weise (d. h., N-Terminus zu C-Terminus), einer Kopf-zu-Kopf-Weise, (d. h. N-Terminus zu N-Terminus), einer Schwanz-zu-Schwanz-Weise (d. h. C-Terminus zu C-Terminus) oder Kombinationen davon verbunden sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Multimere Tandemwiederholungen von zwei, drei, vier und bis zu etwa zehn Kernpeptiden. Vorzugsweise sind die Multimere Tandemwiederholungen von 2 bis 8 Kernpeptiden. So umfassen in einer Ausführungsform die ApoA-I-Agonisten der Erfindung Multimere mit der folgenden Strukturformel: HH-[LL_m-HH]-_nLL_m-HH (II)wobei:
jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1, vorzugsweise 1, ist;
n eine ganze Zahl von 0 bis 10, vorzugsweise 0 bis 8, ist;
jedes „HH" unabhängig ein Kernpeptid oder Peptidanaloges von Struktur (I) oder eine wie hier beschriebene mutierte, verkürzte, intern deletierte oder verlängerte Form davon darstellt;
jedes „LL" unabhängig ein Verbindungsglied darstellt; und
jedes „-„ unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
In Struktur (II) kann das Verbindungsglied LL ein beliebiges bifunktionelles Molekül sein, das imstande ist, zwei Peptide kovalent miteinander zu verbinden. So sind geeignete Verbindungsglieder bifunktionelle Moleküle, in welchen die funktionellen Gruppen imstande sind, kovalent an den N- und/oder C-Terminus eines Peptids gebunden zu werden. Funktionelle Gruppen, die zur Bindung an den N- oder C-Terminus von Peptiden geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie es geeignete chemische Zusammensetzungen zum Bewirken der Bildung von derartiger kovalenter Bindung sind.
Das Verbindungsglied kann flexibel, starr oder halbstarr sein, abhängig von den gewünschten Eigenschaften des Multimers. Zu geeigneten Verbindungsgliedern gehören zum Beispiel Aminosäurereste wie Pro oder Gly oder Peptidsegmente, enthaltend von etwa 2 bis etwa 5, 10, 15 oder 20 oder sogar mehr Aminosäuren, bifunktionelle organische Verbindungen wie beispielsweise H₂N(CH₂)_nCOOH, wo n eine ganze Zahl von 1 bis 12 ist, und dergleichen. Beispiele derartiger Verbindungsglieder, ebenso wie Verfahren zum Herstellen derartiger Verbindungsglieder und Peptide, die derartige Verbindungsglieder einschließen, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Hünig et al., 1974, Chem. Ber. 100: 3039–3044; Basak et al., 1994, Bioconjug. Chem. 5(4): 301–305).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Tandemwiederholungen intern durch einen einzelnen Prolinrest unterbrochen. Zu diesem Zweck ist in denjenigen Fällen, wo die Kernpeptide an ihrem N- oder C-Terminus mit Prolin terminiert sind, wie z. B., wo X₁ in Struktur (I) Pro (P) oder D-Pro (p) ist, m in Struktur (II) vorzugsweise 0. In denjenigen Fällen, wo die Kernpeptide kein N- oder C-terminales Prolin enthalten, ist LL vorzugsweise Pro (P) oder D-Pro (p) und m ist vorzugsweise 1.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, spaltbare Verbindungsglieder anzuwenden, die die Freisetzung von einem oder mehreren helikalen Segmenten (HH) unter bestimmten Bedingungen gestatten. Zu geeigneten spaltbaren Verbindungsgliedern gehören Peptide mit Aminosäuresequenzen, die von Proteasen erkannt werden, Oligonucleotide, die von Endonucleasen gespalten werden, und organische Verbindungen, die über chemische Mittel, wie beispielsweise unter sauren, basischen oder anderen Bedingungen, gespalten werden können. Vorzugsweise werden die Spaltungsbedingungen relativ mild sein, um die helikalen Segmente und/oder nicht-gespaltenen Verbindungsglieder, die die multimeren ApoA-I-Agonisten bilden, nicht zu denaturieren oder anderweitig zu abzubauen.
Peptide und Oligonucleotid-Verbindungsglieder, die selektiv gespalten werden können, ebenso wie Mittel zum Spalten der Verbindungsglieder sind bekannt und sind für den Fachmann leicht offensichtlich. Verbindungsglieder in Form einer geeigneten organischen Verbindung, die selektiv gespalten werden können, werden für den Fachmann offensichtlich sein und schließen diejenigen ein, die zum Beispiel in WO 94/08051 ebenso wie den darin angeführten Referenzen beschrieben sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die angewendeten Verbindungsglieder Peptide, die Substrate für endogene zirkulierende Enzyme sind, wodurch den multimeren ApoA-I-Agonisten gestattet wird, selektiv in vivo gespalten zu werden. Zu endogenen Enzymen, die zum Spalten der Verbindungsglieder geeignet sind, gehört zum Beispiel Proapolipoprotein-A-I-Propeptidase. Geeignete Enzyme ebenso wie Peptidsegmente, die als Substrate für derartige Enzyme wirken, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Edelstein et al., 1983, J. Biol. Chem. 258: 11430–11433; Zanis, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2574–2578).
Wie vorstehend diskutiert ist ein Schlüsselmerkmal der Kernpeptide der Erfindung ihre Fähigkeit, intermolekulare Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zu bilden, wenn sie in einer antiparallelen Weise angeordnet werden. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Verbindungsglieder mit ausreichender Länge und Flexibilität verwendet, um den helikalen Segmenten (HH) von Struktur (II) zu gestatten, sich in einer antiparallelen Weise auszurichten und in Gegenwart von Lipiden intermolekulare Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zu bilden.
Zu Verbindungsgliedern von ausreichender Länge und Flexibilität gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Pro (P), Gly (G), Cys-Cys, H₂N-(CH₂)_n-COOH, wo n 1 bis 12, vorzugsweise 4 bis 6, ist; H₂N-Aryl-COOH und Kohlenhydrate.
Alternativ können, da die nativen Apolipoproteine kooperative Bindung zwischen antiparallelen helikalen Segmenten gestatten, Peptid-Verbindungsglieder, welche in primärer Sequenz den Peptid-Segmenten entsprechen, die benachbarte Helices der nativen Apolipoproteine, einschließlich zum Beispiel ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE und ApoJ, verbinden, geeignet verwendet werden, um die Kernpeptide zu verbinden. Diese Sequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Rosseneu et al. „Analysis of the Primary and of the Secondary Structure of the Apolipoproteins" („Analyse der primären und der sekundären Struktur der Apolipoproteine") in: Structure and Function of Lipoproteins (Struktur und Funktion von Lipoproteinen), Ch. 6, 159–183, CRC Press, Inc., 1992).
Andere Verbindungsglieder, welche die Bildung von intermolekularen Wasserstoffbindungen oder Salzbrücken zwischen Tandemwiederholungen von antiparallelen helikalen Segmenten gestatten, schließen reverse Drehungen des Peptids, wie beispielsweise β-Drehungen und γ-Drehungen, ebenso wie organische Moleküle, die die Strukturen von Peptid-β-Drehungen und/oder -γ-Drehungen nachahmen, ein. Allgemein sind reverse Drehungen Segmente von Peptid, die die Richtung der Polypeptidkette umkehren, um einer einzelnen Polypeptidkette zu erlauben, Regionen von antiparalleler β-Blatt- oder antiparalleler α-Helix-Struktur zu übernehmen. β-Drehungen bestehen im allgemeinen aus vier Aminosäureresten und γ-Drehungen bestehen im allgemeinen aus drei Aminosäureresten.
Die Konformationen und Sequenzen von vielen Peptid-β-Drehungen sind auf dem Fachgebiet beschrieben worden und schließen, als Beispiel und nicht als Begrenzung, Typ-I, Typ-I', Typ-II, Typ-II', Typ-III, Typ-III', Typ-IV, Typ-V, Typ-V', Typ-VIa, Typ-VIb, Typ-VII und Typ-VIII ein (siehe Richardson, 1981, Adv. Protein Chem. 34: 167–339; Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1–109; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221–232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206: 759–777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382–394).
Die speziellen Konformationen von kurzen Peptid-Drehungen, wie beispielsweise β-Drehungen, hängen in erster Linie von den Positionen bestimmter Aminosäurereste in der Drehung ab (gewöhnlich Gly, Asn oder Pro). Allgemein ist die Typ-I-β-Drehung kompatibel mit einem beliebigen Aminosäurerest an den Positionen 1 bis 4 der Drehung, außer daß Pro nicht an Position 3 vorkommen kann. Gly überwiegt an Position 4 und Pro überwiegt an Position 2 von sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Drehungen. Asp-, Asn-, Ser- und Cys-Reste kommen häufig an Position 1 vor, wo ihre Seitenketten oft zu dem NH von Rest 3 eine Wasserstoffbindung bilden.
In Typ-II-Drehungen kommen Gly und Asn am häufigsten an Position 3 vor, da sie die erforderlichen Winkel des Grundgerüsts am leichtesten übernehmen. Idealerweise haben Typ-I'-Drehungen Gly an den Positionen 2 und 3, und Typ-II'-Drehungen haben Gly an Position 2. Typ-III-Drehungen können im allgemeinen die meisten Aminosäurereste haben, aber Typ-III'-Drehungen erfordern gewöhnlich Gly an den Positionen 2 und 3. Typ-VIa- und -VIb-Drehungen haben im allgemeinen eine cis-Peptid-Bindung und Pro als internen Rest. Für eine Übersicht über die verschiedenen Typen und Sequenzen von β-Drehungen in Proteinen und Peptiden wird der Leser auf Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221–232, hingewiesen.
Die Konformation und die Sequenzen von vielen Peptid-γ-Drehungen sind ebenfalls auf dem Fachgebiet beschrieben worden (siehe z. B. Rose et al., 1985, Adv. Protein Chem. 37: 1–109; Wilmer-White et al., 1987, Trends Biochem. Sci. 12: 189–192; Wilmot et al., 1988, J. Mol. Biol. 203: 221–232; Sibanda et al., 1989, J. Mol. Biol. 206: 759–777; Tramontano et al., 1989, Proteins: Struct. Funct. Genet. 6: 382–394). Alle von diesen Typen von β-Drehungen und γ-Drehungs-Strukturen und ihre entsprechenden Sequenzen, ebenso wie später entdeckte Peptid-β-Drehungen und γ-Drehungs-Strukturen und Sequenzen, werden durch die Erfindung speziell in Betracht gezogen.
Alternativ kann das Verbindungsglied (LL) ein organisches Molekül oder eine Einheit umfassen, die die Struktur einer Peptid-β-Drehung oder γ-Drehung nachahmt. Derartige mimetische β-Drehungs- und/oder γ-Drehungs-Einheiten, ebenso wie Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden, die derartige Einheiten enthalten, sind auf dem Fachgebiet bekannt, und dazu gehören, unter anderen, diejenigen, die bei Giannis und Kolter, 1993, Angew. Chem. Intl. Ed. Eng. 32: 1244–1267; Kahn et al., 1988, J. Molecular Recognition 1: 75–79; und Kahn et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28: 1623–1626 beschrieben sind.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Multimere in der Form von verzweigten Netzwerken (siehe z. B. 7). Derartige Netzwerke werden geeigneterweise durch die Verwendung von Multifunktions-Verknüpfungseinheiten erhalten, die gestatten, daß mehr als zwei helikale Einheiten an eine einfache Verknüpfungseinheit gebunden werden. So wenden verzweigte Netzwerke Moleküle mit drei, vier oder sogar mehr funktionellen Gruppen an, die imstande sind, kovalent an den N- und/oder C-Terminus eines Peptids zu binden. Zu geeigneten Verknüpfungseinheiten gehören zum Beispiel Aminosäurereste mit Seitenketten, tragend Hydroxyl-, Sulfanyl-, Amino-, Carboxyl-, Amid- und/oder Esterfunktionalitäten, wie zum Beispiel Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q), Lys (K), Arg (R), Orn, Asp (D) und Glu (E); oder andere organische Moleküle, die derartige funktionelle Gruppen enthalten.
Die helikalen Segmente, die an eine einzelne Verknüpfungseinheit gebunden sind, brauchen nicht über ähnliche Termini gebunden zu sein. In der Tat sind in einigen Ausführungsformen die helikalen Segmente an eine einzelne Verknüpfungseinheit gebunden, um in einer antiparallelen Weise angeordnet zu werden, d. h., einige der Helices sind über ihre N-Termini, andere über ihre C-Termini gebunden.
Die helikalen Segmente können direkt an die Verknüpfungseinheit gebunden sein oder können durch ein oder mehrere bifunktionelle Verbindungsglieder (LL), wie vorher beschrieben, mit Abstand von der Verknüpfungseinheit angeordnet werden.
Bezugnehmend auf 7A und 7B kann gesehen werden, daß ein verzweigtes Netzwerk hinsichtlich der Anzahl von „Knoten", umfassend das Netzwerk, beschrieben werden kann, wo jede multifunktionelle Verknüpfungseinheit einen Knoten bildet. In den 7A und 7B sind helikale Segmente (d. h. Kernpeptide der Erfindung) als Zylinder veranschaulicht und multifunktionelle Verknüpfungseinheiten (oder Knoten) als Kreise (•), wo die Anzahl von Linien, ausgehend von dem Kreis, die „Ordnung" (oder die Anzahl von funktionellen Gruppen) der multifunktionellen Verknüpfungseinheit anzeigt.
Die Anzahl von Knoten in dem Netzwerk wird im allgemeinen von der gewünschten Gesamtzahl von helikalen Segmenten abhängen und wird typischerweise von etwa 1 bis 2 betragen. Natürlich wird erkannt, daß für eine gegebene Anzahl von gewünschten helikalen Segmenten Netzwerke mit Verknüpfungseinheiten höherer Ordnung weniger Knoten haben werden. Zum Beispiel hat, bezugnehmend auf die 7A und 7B, ein Netzwerk dritter Ordnung (d. h. ein Netzwerk mit trifunktionellen Verknüpfungseinheiten) von sieben helikalen Einheiten drei Knoten (7A), wohingegen ein Netzwerk vierter Ordnung (d. h. ein Netzwerk mit tetrafunktionellen Verknüpfungseinheiten) von sieben helikalen Einheiten nur zwei Knoten hat (7B).
Die Netzwerke können von gleichmäßiger Ordnung sein, d. h. Netzwerke, in welchen alle Knoten, zum Beispiel, trifunktionelle oder tetrafunktionelle Verknüpfungseinheiten sind, oder können von gemischter Ordnung sein, z. B. Netzwerke, in welchen die Knoten Gemische von, zum Beispiel, trifunktionellen und tetrafunktionellen Verknüpfungseinheiten sind. Natürlich ist es selbstverständlich, daß sogar in Netzwerken gleichmäßiger Ordnung die Verknüpfungseinheiten nicht identisch zu sein brauchen. Ein Netzwerk dritter Ordnung kann, zum Beispiel, zwei, drei, vier oder sogar mehr verschiedene trifunktionelle Verknüpfungseinheiten anwenden.
Ähnliche den linearen Multimeren können die helikalen Segmente, umfassend das verzweigte Netzwerk, identisch sein, aber brauchen es nicht zu sein.
Ein Beispiel eines derartigen verzweigten Netzwerks gemischter Ordnung ist in 7C veranschaulicht. In 7C sind helikale Segmente (d. h. Kernpeptide der Erfindung) als Zylinder veranschaulicht und multifunktionelle Verknüpfungseinheiten als Kreise (•), wo die Anzahl von Linien, ausgehend von dem Kreis, die „Ordnung" (oder Anzahl von funktionellen Gruppen) der multifunktionellen Verknüpfungseinheit anzeigt. Linien, die helikale Segmente verbinden, stellen bifunktionelle Verbindungsglieder LL, wie vorher beschrieben, dar. Helikale Segmente, welche die verzweigten Netzwerke umfassen, können Tandemwiederholungen von Kernpeptiden, wie vorher beschrieben, sein.
In einer veranschaulichenden Ausführungsform sind die verzweigten Netzwerke der Erfindung durch die Formel: X-N_ya-X_(ya-1)-[N_yb-X_(yb-1)]_p (III)beschrieben, wobei:
jedes X unabhängig HH-[LL_m-HH]-_nLL_m-HH ist;
jedes HH unabhängig ein Kernpeptid von Struktur (I) oder ein Analoges oder eine mutierte, verkürzte, intern deletierte oder verlängerte Form davon, wie hier beschrieben, ist;
jedes LL unabhängig ein bifunktionelles Verbindungsglied ist;
jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis l ist;
jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist;
N_ya und N_yb jeweils unabhängig eine multifunktionelle Verknüpfungseinheit sind, wo y_a und y_b die Anzahl von funktionellen Gruppen auf N_ya bzw. N_yb darstellen;
jedes y_a oder y_b unabhängig eine ganze Zahl von 3 bis 8 ist;
p eine ganze Zahl von 0 bis 7 ist; und
jedes „-" unabhängig ein kovalente Bindung bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das verzweigte Netzwerk einen „Lys-Baum", d. h. ein Netzwerk, wobei die multifunktionelle Verknüpfungseinheit aus einem oder mehreren Lys-(K)-Resten besteht (siehe z. B. 7D).
In einer veranschaulichenden Ausführungsform sind die verzweigten Netzwerke des „Lys Baums" der Erfindung durch die Formeln:
beschrieben, wobei:
jedes X unabhängig HH-[LL_m-HH]-_nLL_m-HH ist;
jedes HH unabhängig ein Kernpeptid oder Peptidanaloges von Struktur (1) oder eine mutierte, verkürzte, intern deletierte oder verlängerte Form davon, wie hier beschrieben, ist;
jedes LL unabhängig ein bifunktionelles Verbindungsglied ist;
jedes n unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 8 ist;
jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist;
R₁ -OR oder -NRR ist; und
jedes R unabhängig -H, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5–20-gliedriges Heteroaryl, oder 6–26-gliedriges Alkheteroaryl ist.
5.1.1. ANALYSE VON STRUKTUR UND FUNKTION
Die Struktur und Funktion der Kernpeptide oder Peptidanalogen der Erfindung, ebenso wie der ApoA-I-Agonisten, bestehend aus derartigen Kernpeptiden, einschließlich der vorstehend beschriebenen multimeren Formen, können einem Assay unterzogen werden, um aktive Agonisten oder Mimetika von ApoA-I auszuwählen. Zum Beispiel können die Kernpeptide oder Peptidanalogen einem Assay für ihre Fähigkeit unterzogen werden, α-Helices in Gegenwart von Lipiden zu bilden, Lipide zu binden, Komplexe mit Lipiden zu bilden, LCAT zu aktivieren, Cholesterinabfluß zu fördern usw.
Verfahren und Assays zum Analysieren der Struktur und/oder Funktion der Peptide sind auf dem Fachgebiet bekannt. Bevorzugte Verfahren werden nachstehend in den Arbeitsbeispielen bereitgestellt. Zum Beispiel können die Assays mit Circulardichroismus (CD) und kernmagnetischer Resonanz (NMR), beschrieben nachstehend in Abschnitt 7, verwendet werden, um die Struktur der Peptide oder Peptidanalogen – insbesondere den Helizitätsgrad in Gegenwart von Lipiden – zu analysieren. Die Fähigkeit, Lipide zu binden, kann unter Verwendung des Fluoreszenzspektroskopie-Assays, beschrieben nachstehend in Abschnitt 7, bestimmt werden. Die Fähigkeit der Peptide und/oder Peptidanalogen, LCAT zu aktivieren, kann unter Verwendung der LCAT-Aktivierung, beschrieben nachstehend in Abschnitt 8, leicht bestimmt werden. Die in-vitro- und in-vivo-Assays, beschrieben nachstehend in Abschnitt 9, 10 und 11, können verwendet werden, um die Halbwertszeit, Verteilung, den Cholesterinabfluß und die Auswirkungen auf den RCT zu bewerten.

Im allgemeinen werden Kernpeptide und/oder Peptidanaloge gemäß der Erfindung, welche die Eigenschaften, aufgeführt nachstehend in Tabelle IV, zeigen, dafür angesehen, aktiv zu sein. TABELLE IV EIGENSCHAFTEN VON AKTIVEN PEPTIDEN

	Bereich	Bevorzugter Bereich
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (unblockierte Peptide mit 22 Aminosäureresten)	≥ 60%	≥ 80%
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (unblockierte Peptide mit 18 Aminosäureresten)	≥ 40%	≥ 60%
% Helizität in Gegenwart von Lipiden (Ri = 30) (blockierte Peptide mit 18 Aminosäureresten und kürzere Peptide)	≥ 60%	≥ 80%
Lipidbindung (in Gegenwart von SUVs)	0,5–10 μM Peptid R_i = 1–50
LCAT-Aktivierung	≥ 38%	≥ 80%

R_i: ist Lipid:Peptid-Molverhältnis

Wie in den Arbeitsbeispielen nachstehend veranschaulicht ist, besitzen Kernpeptide, welche einen hohen Grad von LCAT-Aktivierung (≥ 38%) zeigen, im allgemeinen signifikante α-helikale Struktur in Gegenwart von lipidischen kleinen unilamellaren Vesikeln (SUVs) (≥ 60% helikale Struktur in dem Fall von unblockierten Peptiden, enthaltend 22 oder mehr Aminosäurereste, und blockierten Peptiden, enthaltend 18 oder weniger Aminosäurereste; ≥ 40% helikale Struktur in dem Fall von unblockierten Peptiden, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren), und diejenigen Peptide, welche wenig oder keine LCAT-Aktivierung zeigen, besitzen wenig α-helikale Struktur. Jedoch bewirken in bestimmten Fällen Peptide, welche signifikante helikale Struktur in Gegenwart von Lipiden zeigen, keine signifikante LCAT.
Ähnlich bewirken, während Kernpeptide, die signifikante LCAT-Aktivierung zeigen, typischerweise Lipide binden, in bestimmten Fällen Peptide, welche Lipidbindung zeigen, keine signifikante LCAT-Aktivierung.
Folglich wird vom Fachmann erkannt, daß, während die Fähigkeit der hier beschriebenen Kernpeptide, α-Helices zu bilden (in Gegenwart von Lipiden) und Lipide zu binden, kritisch für Aktivität ist, in vielen Fällen diese Eigenschaften nicht ausreichend sein können. So werden in einer bevorzugten Ausführungsform Kernpeptide der Erfindung einer Serie von Screens unterworfen, um Kernpeptide auszuwählen, die signifikante pharmakologische Aktivität zeigen.
In einem ersten Schritt wird ein Kernpeptid für seine Fähigkeit gescreent, in Gegenwart von Lipiden eine α-Helix zu bilden, wobei der CD-Assay verwendet wird, der nachstehend in Abschnitt 7 beschrieben ist. Diejenigen Peptide, welche zu mindestens 40% helikal (unblockierte Peptide, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren) oder 60% helikal (blockierte Peptide, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren; unblockierte Peptide, enthaltend 22 oder mehr Aminosäuren) in Gegenwart von Lipiden (bei einer Konz. von etwa 5 μM und einem Lipid:Peptid-Molverhältnis von etwa 30) sind, werden dann für ihre Fähigkeit gescreent, Lipide zu binden, wobei der Fluoreszenzassay, beschrieben nachstehend in Abschnitt 7, verwendet wird. Natürlich werden nur diejenigen Kernpeptide, welche einen fluoreszierenden Trp-(W)- oder Nal-Rest enthalten, über Fluoreszenz für Lipidbindung gescreent. Jedoch ist für Peptide, welche keine fluoreszierenden Reste enthalten, Bindung an Lipide offensichtlich, wenn die Helizität in Gegenwart von Lipiden zunimmt.
Kernpeptide, welche Lipidbindung in Gegenwart von SUVs zeigen (0,5–10 μM Peptid; Lipid:Peptid-Molverhältnis in dem Bereich von 1 bis 50) werden dann für pharmakologische Aktivität gescreent. Natürlich hängt die pharmakologische Aktivität, für die gescreent wird, von der gewünschten Verwendung der ApoA-I-Agonisten ab. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kernpeptide für ihre Fähigkeit gescreent, LCAT zu aktivieren, da Peptide, welche LCAT aktivieren, in den hier beschriebenen Verfahren besonders brauchbar sind. Kernpeptide, welche mindestens etwa 38% LCAT-Aktivierung zeigen, wenn mit nativem humanen ApoA-1 (wie bestimmt unter Verwendung des LCAT-Aktivierungs-Assays, beschrieben nachstehend in Abschnitt 8) verglichen, werden bevorzugt, wobei Kernpeptide, die 50%, 60%, 70%, 80% oder sogar 90% oder mehr zeigen, besonders bevorzugt werden.
5.1.2. BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können weiter durch bevorzugte Ausführungsformen definiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₇ eine basische Aminosäure, Asn (N) oder Glu (E) ist; X₈ eine saure Aminosäure oder Arg (R) ist, X₁₂ eine saure Aminosäure oder Asn (N) ist; und/oder X₁₅ eine saure Aminosäure, Gln (Q) oder Lys (K) ist; und X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀ und X₂₁ wie vorher für Struktur (I) definiert sind.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (1) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen:
X₁ Pro (P), Gly (G), Ala (A), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) oder D-Pro (p) ist;
X₂ Ala (A), Val (V) oder Leu (L) ist;
X₄ Asp (D) oder Glu (E) ist;
X₇ Lys (K), Arg (R), Orn, Asn (N) oder Glu (E) ist;
X₈ Asp (D), Arg (R) oder Glu (E) ist;
X₁₁ Asn (N), Gln (Q), Glu (E) oder Arg (R) ist;
X₁₂ Asp (D), Glu (E) oder Asn (N) ist;
X₁₃ Leu (L), Gly (G) oder Aib ist;
X₁₅ Asp (D), Glu (E), Gln (Q) oder Lys (K) ist;
X₁₆ Ala (A), Trp (W), Gly (G), Leu (L), Phe (F) oder Nal ist;
X₁₇ Leu (L), Gly (G) oder Nal ist;
X₁₈ Lys (K), Orn, Gln (Q) oder Asn (N) ist;
X₁₉ Lys (K), Orn, Gln (Q) oder Asn (N) ist;
X₂₀ Lys (K) oder Orn ist;
X₂₁ Lys (K) ist und/oder
X₂₂ Lys (K) oder Orn ist und X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀ und X₁₄ wie vorher für Struktur (I) definiert sind.
Eine noch stärker bevorzugte Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind diejenigen Peptide, in welchen:
X₂ Val (V) ist;
X₃ Leu (L) ist;
X₅ Leu (L) ist;
X₆ Phe (F) ist;
X₇ Arg (R) oder Lys (K) ist;
X₈ Glu (E) ist;
X₉ Leu (L) ist;
X₁₀ Leu (L) ist;
X₁₁ Asn (N) oder Glu (Q) ist;
X₁₂ Glu (E) ist; und/oder
X₁₅ Glu (E) ist;
und X₁, X₄, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁ und X₂₂ wie vorher für Struktur (I) definiert sind oder wie in dem vorhergehenden Absatz definiert sind.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen nur eines von X₁₈ oder X₁₉ eine basische Aminosäure ist und das andere von X₁₈ oder X₁₉ Gln (Q) oder Asn (N) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen eines von X₁₈ oder X₁₉ Lys (K) oder Orn ist und das andere von X₁₈ oder X₁₉ Gln (Q) oder Asn (N) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen eines von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₆ oder X₁₇ Gly (G) ist und die anderen anders als Gly (G) sind.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₁₃ Gly (G) ist und jedes von X₉, X₁₀, X₁₄, X₁₆ oder X₁₇ anders als Gly (G) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen:
X₁ Pro (P), Gly (G) oder D-Pro (p) ist;
X₂ Val (V) ist;
X₃ Leu (L) ist;
X₄ Asp (D) oder Glu (E) ist;
X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₆ Phe (F) ist;
X₇ Arg (R) ist;
X₈ Glu (E) ist:
X₉ Leu (L) ist;
X₁₀ Leu (L) oder Trp (W) ist;
X₁₁ Asn (N) ist;
X₁₂ Glu (E) ist;
X₁₃ Gly (G) ist;
X₁₄ Leu (L) ist;
X₁₅ Glu (E) ist:
X₁₆ Ala (A) oder Trp (W) ist;
X₁₇ Leu (L) oder Nal ist;
X₁₈ Lys (K) oder Orn ist;
X₁₉ Gln (Q) ist;
X₂₀ Lys (K) oder Orn ist;
X₂₁ Leu (L) ist; und
X₂₂ Lys (K) oder Orn ist.
Besonders bevorzugte ApoA-I-Agonisten gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind aus der Gruppe, bestehend aus:
und den C-terminalen amidierten oder veresterten und/oder N-terminalen acylierten Formen davon ausgewählt.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₉ Gly (G) ist und jedes von X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₆ und X₁₇ anders als Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugter ApoA-I-Agonist gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 20: PVLDLFREGLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 20).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₁₀ Gly (G) ist und jedes von X₉, X₁₃, X₁₄, X₁₆ und X₁₇ anders als Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugter ApoA-I-Agonist gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 9: PVLDLFRELGNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 9).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₁₄ Gly (G) ist und jedes von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₆ und X₁₇ anders als Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugter ApoA-I-Agonist gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 126: PVLDLFRELLNELGEALKQKLK (SEQ ID NO: 126).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₁₆ Gly (G) ist und jedes von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄ und X₁₇ anders als Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugter ApoA-I-Agonist gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 22: PVLDLFRELLNELLEGLKQKLK (SEQ ID NO: 22).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen X₁₇ Gly (G) ist und jedes von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄ und X₁₆ anders als Gly (G) ist. Ein besonders bevorzugter ApoA-I-Agonist gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist Peptid 12: PVLDLFRELLNELLEAGKQKLK (SEQ ID NO: 12).
Ausführungsformen, die interne Glycin-Reste enthalten, können leicht in hoher Ausbeute durch Segmentkondensation synthetisiert werden, wodurch bedeutsame Vorteile für die Produktion in großem Maßstab bereitgestellt werden. Segmentkondensation, d. h. die Zusammenfügung von Peptidketten mit kleinen Bestandteilen, um eine größere Peptidkette zu erzeugen, ist verwendet worden, um viele biologisch aktive Peptide, einschließlich Nachahmern von ApoA-I mit 44 Aminosäureresten (siehe z. B. Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087–7083; Nokihara et al., 1989, Peptides 1988: 166–168; Kneib-Cordonnier et al., 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35: 527–538), herzustellen, und wird dafür angesehen, das kosteneffektivste Verfahren für Synthese der Kernpeptide der Erfindung in großer Menge mit hoher Ausbeute zu sein.
Zu Vorteilen der Synthese über Segmentkondensation gehört die Fähigkeit, vorgebildete Segmente in der Lösungsphase zu kondensieren, und die Leichtigkeit der Reinigung des Endprodukts. Zu Nachteilen des Verfahrens gehören niedrige Kupplungseffizienz und Ausbeute im Kondensationsschritt und niedrige Löslichkeit von bestimmten Peptidsequenzen.
Die Kupplungseffizienz des Kondensationsschritts kann durch Erhöhen der Kupplungszeit bedeutsam erhöht werden. Typischerweise resultiert Erhöhen der Kupplungszeit in erhöhter Racemisierung des Produkts (Sieber et al., 1970, Helv. Chim. Acta 53: 2135–2150). Jedoch unterliegt Glycin, da ihm ein chirales Zentrum fehlt, keiner Racemisierung (Prolin-Reste unterliegen, aufgrund sterischer Hinderung, bei langen Kupplungszeiten auch wenig oder keiner Racemisierung). So können Ausführungsformen, die interne Glycin-Reste enthalten, in großer Menge in hoher Ausbeute über Segmentkondensation synthetisiert werden, indem Segmentbestandteile synthetisiert werden, welche die Tatsache ausnutzen, daß Glycin-Reste keiner Racemisierung unterliegen. So stellen Ausführungsformen, die interne Glycin-Reste enthalten, bedeutsame synthetische Vorteile für die Herstellung in großer Menge in großem Maßstab bereit.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen jedes von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₆ und X₁₇ anders als Gly (G) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten Peptide mit 22 Aminosäureresten entsprechend Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen:
X₁ Pro (P), Gly (G), Ala (A) oder D-Pro (p) ist;
X₂ Val (V) oder Leu (L) ist;
X₃ Leu (L) ist;
X₄ Asp (D) oder Glu (E) ist;
X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist;
X₇ Arg (R) oder Lys (K) ist;
X₈ Glu (E) ist;
X₉ Leu (L) ist;
X₁₀ Leu (L) oder Trp (W) ist;
X₁₁ Asn (N) oder Gln (Q) ist;
X₁₂ Glu (E) ist;
X₁₃ Leu (L) oder Aib ist;
X₁₄ Leu (L), Trp (W) oder Nal ist;
X₁₅ Glu (E) ist;
X₁₆ Ala (A), Leu (L), Trp (W) oder Nal ist;
X₁₇ Leu (L) oder Nal ist;
eines von X₁₈ oder X₁₉ Gln (Q) ist und das andere Lys (K) oder Orn ist;
X₂₀ Lys (K) oder Orn ist;
X₂₁ Leu (L) ist; und
X₂₂ Lys (K) oder Orn ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist X₂ Val (V); ist X₄ Asp (D); ist X₅ Leu (L); ist X₆ Phe (F), ist X₇ Arg (R); ist X₁₀ Leu (L); ist X₁₁ Asn (N); ist X₁₃ Leu (L); ist X₁₄ Leu (L); ist X₁₆ Ala (A); ist X₁₇ Leu (L); ist X₁₈ Lys (K); ist X₁₉ Gln (Q); ist X₂₀ Lys (K) und/oder ist X₂₂ Lys (K).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten geänderte oder mutierte Formen der Peptide von Struktur (I) oder die N-terminal acylierten und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, in welchen:
X₁ anders als Aib, Val (V) oder Leu (L) ist;
X₂ anders als D-Val (v) ist;
X₅ anders als Lys (K), Glu (E), Trp (W) oder Nal ist;
X₆ anders als Trp (W) ist;
X₇ anders als Trp (W) oder Leu (L) ist;
X₈ anders als Trp (W) ist;
X₉ anders als Lys (K) oder Trp (W) ist;
X₁₁ anders als Trp (W) ist;
X₁₂ anders als Trp (W) oder Leu (L) ist;
X₁₃ anders als Glu (E) oder Trp (W) ist;
X₁₅ anders als Trp (W) ist; und/oder
X₂₁ anders als Lys (K) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten der Erfindung aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt, die nachstehend dargestellt sind:
und den N-terminal acylierten (insbesondere acetylierten oder dansylierten) und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, wobei X Aib ist; Z Nal ist; und O Orn ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten der Erfindung aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt, die nachstehend dargestellt sind:
und den N-terminal acylierten (insbesondere acetylierten oder dansylierten) und/oder C-terminal amidierten oder veresterten Formen davon, wobei X Aib ist; Z Nal ist; und O Orn ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten multimere Formen entsprechend den Strukturen II, III und/oder IV, in welchen HH ein Peptid entsprechend Struktur (I) oder eine N-terminal acylierte und/oder C-terminal amidierte oder veresterte Form davon oder eines der hier beschriebenen bevorzugten Peptid entsprechend Struktur (I) ist.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die KernPeptid, die die ApoA-I-Agonisten bilden, nicht eines der folgenden Peptid:
In einer finalen bevorzugten Ausführungsform sind die ApoA-I-Agonisten nicht eines der Peptid, aufgeführt in Tabelle X (Abschnitt 8.3, nachstehend), die eine LCAT-Aktivierungsaktivität von weniger als 38%, verglichen mit nativem humanen ApoA-1, zeigen.
5.2 SYNTHESE UND REINIGUNG DER APOA-I-PEPTID-AGONISTEN
Die KernPeptid der Erfindung können unter Verwendung praktisch jeder auf dem Fachgebiet bekannten Technik für die Herstellung von Peptiden hergestellt werden. Zum Beispiel können die Peptid unter Verwendung herkömmlicher schrittweiser Lösungs- oder Festphasen-Peptidsynthesen oder rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden.
5.2.1 CHEMISCHE SYNTHESE
KernPeptid können unter Verwendung herkömmlicher schrittweiser Lösungs- oder Festphasen-Synthese hergestellt werden (siehe z. B. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptids and Proteins (Chemische Herangehensweisen für die Synthese von Peptiden und Proteinen), Williams et al., Hrsg., 1997, CRC Press, Boca Raton Florida, und darin angeführte Referenzen; Solid Phase Peptid Synthesis: A Practical Approach (Festphasen-Peptidsynthese: Eine praktische Herangehensweise), Atherton & Sheppard, Hrsg., 1989, IRL Press, Oxford, England, und darin angeführte Referenzen).
Alternativ können die Peptid der Erfindung durch Segmentkondensation hergestellt werden, wie beschrieben, zum Beispiel, bei Liu et al., 1996, Tetrahedron Lett. 37(7): 933–936; Baca et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117: 1881–1887; Tam et al., 1995, Int. J. Peptid Protein Res. 45: 209–216; Schnölzer und Kent, 1992, Science 256: 221–225; Liu und Tam, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(10): 4149–4153; Liu und Tam, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6584–6588; Yamashiro und Li, 1988, Int. J. Peptid Protein Res. 31: 322–334). Dies ist besonders bei Glycin enthaltenden Peptiden der Fall. Andere Verfahren, die zum Synthetisieren der Peptid der Erfindung verwendbar sind, sind bei Nakagawa et al., 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 7087–7092, beschrieben.
ApoA-I-Agonisten, enthaltend N- und/oder C-terminale blockierende Gruppen, können unter Verwendung von Standardtechniken der organischen Chemie hergestellt werden. Zum Beispiel sind Verfahren zum Acylieren des N-Terminus eines Peptids oder Amidieren oder Verestern des C-Terminus einer Peptid auf dem Fachgebiet bekannt. Erscheinungsformen des Tragens anderer Modifizierungen an dem N- und/oder C-Terminus werden für den Fachmann offensichtlich sein, wie es Erscheinungsformen zum Schützen aller Seitenketten-Funktionalitäten sind, wie sie notwendig sein können, um terminale blockierende Gruppen zu binden.
Pharmazeutisch verträgliche Salze (Gegenionen) können geeignet durch Ionenaustauschchromatographie oder andere Verfahren hergestellt werden, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Verbindungen der Erfindung, welche in der Form von Tandem-Multimeren sind, können geeignet durch Hinzufügen des (der) Verbindungsglieds(er) zu der Peptidkette in dem geeigneten Schritt in der Synthese synthetisiert werden. Alternativ können die helikalen Segmente synthetisiert und jedes Segment mit dem Verbindungsglied umgesetzt werden. Natürlich hängt das tatsächliche Verfahren der Synthese von der Zusammensetzung des Verbindungsglieds ab. Geeignete schützende Anordnungen und chemische Zusammensetzungen sind bekannt und werden für den Fachmann offensichtlich sein.
Verbindungen der Erfindung, welche in der Form von verzweigten Netzwerken sind, können geeignet unter Verwendung der trimeren und tetrameren Harze und chemischen Zusammensetzungen synthetisiert werden, die bei Tam, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409–5413 und Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74–84 beschrieben sind. Modifizieren der synthetischen Harze und Strategien zum Synthetisieren verzweigter Netzwerke von höherer oder niedrigerer Ordnung, oder welche Kombinationen von helikalen Segmenten verschiedener KernPeptid enthalten, ist vollauf innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns von Peptidchemie und/oder organischer Chemie.
Erzeugung von Disulfidverknüpfungen wird, wenn sie gewünscht wird, im allgemeinen in Gegenwart von milden Oxidationsmitteln durchgeführt. Chemische Oxidationsmittel können verwendet werden, oder die Verbindungen können einfach atmosphärischem Sauerstoff ausgesetzt werden, um diese Verknüpfungen zu bewirken. Verschiedenartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich derjenigen, beschrieben, zum Beispiel, von Tam et al., 1979, Synthesis 955–957; Stewart et al., 1984, Solid Phase Peptid Synthesis (Festphasenpeptidsynthese), 2. Aufl., Pierce Chemical Company Rockford, IL; Ahmed et al., 1975, J. Biol. Chem. 250: 8477–8482; und Pennington et al., 1991 Peptids 1990 164–166, Giralt und Andreu, Hrsg., ESCOM Leiden, Niederlande. Eine zusätzliche Alternative ist von Kamber et al., 1980, Helv. Chim. Acta 63: 899–915 beschrieben. Ein Verfahren, durchgeführt auf festen Trägern, ist von Albericio, 1985, Int. J. Peptid Protein Res. 26: 92–97, beschrieben. Jedes von diesen Verfahren kann verwendet werden, um Disulfidverknüpfungen in dem Peptid der Erfindung zu erzeugen.
5.2.2 REKOMBINANTE SYNTHESE
Wenn das Peptid vollständig aus Gen-codierten Aminosäuren zusammengesetzt ist, oder ein Teil von ihm so zusammengesetzt ist, kann das Peptid oder der relevante Anteil auch unter Verwendung herkömmlicher Techniken rekombinanter Gentechnologie synthetisiert werden.
Für rekombinante Erzeugung wird eine Polynucleotidsequenz, codierend das Peptid, in ein geeignetes Expressionsvehikel insertiert, d. h. einen Vektor, welcher die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten codierenden Sequenz, oder in dem Fall eines viralen RNA-Vektors die notwendigen Elemente für Replikation und Translation, enthält. Das Expressionsvehikel wird dann in eine geeignete Zielzelle transfiziert, welche das Peptid exprimiert. Abhängig von dem verwendeten Expressionssystem wird das exprimierte Peptid dann durch Verfahrensweisen isoliert, die auf dem Fachgebiet etabliert sind. Verfahren für rekombinante Protein- und Peptidrzeugung sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch) Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y.; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie), Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., jedes von diesen ist hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme eingeschlossen.).
Um die Effizienz der Produktion zu erhöhen, kann das Polynucleotid gestaltet werden, mehrfache Einheiten des Peptids, getrennt durch enzymatische Spaltungsstellen, zu codieren – entweder Homopolymere (sich wiederholende Peptidinheiten) oder Heteropolymere (verschiedene Peptid aneinandergereiht) können gentechnisch auf diesem Wege hergestellt werden. Das resultierende Polypeptid kann gespalten werden (z. B. durch Behandlung mit dem geeigneten Enzym), um die Peptidinheiten zu gewinnen. Dies kann die Ausbeute von Peptiden, angetrieben durch einen einzelnen Promotor, erhöhen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein polycistronisches Polynucleotid so gestaltet werden, daß eine einzelne mRNA transkribiert wird, welche mehrfache Peptid (d. h. Homopolymere oder Heteropolymere) codiert, wobei jede codierende Region operativ mit einer Kappen-unabhängigen Translations-Kontrollsequenz verknüpft ist; z. B. einer internen Ribosom-Eintrittsstelle (IRES). Wenn in geeigneten viralen Expressionssystemen verwendet, wird die Translation jedes Peptids, codiert durch die mRNA, intern in dem Transkript gerichtet; z. B. durch die IRES. So richtet das polycistronische Konstrukt die Transkription einer einzelnen, großen polycistronischen mRNA, welche dann wieder die Translation von mehrfachen, individuellen Peptiden richtet. Diese Herangehensweise eliminiert die Erzeugung und enzymatische Verarbeitung von Polyproteinen und kann die Ausbeute von Peptid, angetrieben durch einen einzelnen Promotor, bedeutsam erhöhen.
Eine Vielfalt von Wirt-Expressionsvektor-Systemen kann benutzt werden, um die hier beschriebenen Peptid zu exprimieren. Zu diesen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien, transformiert mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA, oder Plasmid-DNA-Expressionsvektoren, enthaltend eine geeignete codierende Sequenz; Hefe oder Fadenpilze, transformiert mit rekombinanten Hefe- oder Pilz-Expressionsvektoren, enthaltend eine geeignete codierende Sequenz; Insekten-Zellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Baculovirus), enthaltend eine geeignete codierende Sequenz; Pflanzen-Zellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z. B. Blumenkohl-Mosaikvirus oder Tabak-Mosaikvirus) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), enthaltend eine geeignete codierende Sequenz; oder Tier-Zellsysteme.
Die Expressionselemente der Expressionssysteme variieren in ihrer Stärke und ihren Spezifitäten. Abhängig von dem benutzten Wirt/Vektor-System kann eines von einer Anzahl von geeigneten Transkription- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Promotoren, in dem Expressionsvektor verwendet werden. Zum Beispiel können, wenn in bakteriellen Systemen kloniert wird, induzierbare Promotoren wie beispielsweise pL von Bakteriophage λ, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac-Hybrid-Promotor) und dergleichen verwendet werden; wenn in Insekten-Zellsystemen kloniert wird, können Promotoren wie beispielsweise der Baculovirus-Polyhedrin-Promotor verwendet werden; wenn in Pflanzen-Zellsystemen kloniert wird, können Promotoren, abgeleitet von dem Genom von Pflanzenzellen (z. B. Hitzeschock-Promotoren; der Promotor für die kleine Untereinheit von RUBISCO; der Promotor für das Chlorophyll-a/b-Bindungsprotein) oder von Pflanzenviren (z. B. der 35S-RNA-Promotor von CaMV; der Hüllprotein-Promotor von TMV) verwendet werden; wenn in Säuger-Zellsystemen kloniert wird, können Promotoren, abgeleitet von dem Genom von Säugerzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugerviren (z. B. der späte Promotor des Adenovirus; der Vacciniavirus-7,5-K-Promotor) verwendet werden; wenn Zell-Linien erzeugt werden, die mehrfache Kopien von Expressionsprodukt enthalten, können SV40-, BPV- und EBV-basierte Vektoren mit einem geeigneten auswählbaren Marker verwendet werden.
In Fällen, wo Pflanzen-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression von Sequenzen, codierend die Peptid der Erfindung, durch einen von einer Anzahl von Promotoren angetrieben werden. Zum Beispiel können virale Promotoren wie beispielsweise die 35S-RNA- und 19S-RNA-Promotoren von CaMV (Brisson et al., 1984, Nature 310: 511–514) oder der Hüllprotein-Promotor von TMV (Takamatsu et al., 1987, EMBO J. 6: 307–311) verwendet werden; alternativ können Pflanzen-Promotoren wie beispielsweise die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3: 1671–1680; Broglie et al., 1984, Science 224: 838–843) oder Hitzeschock-Promotoren, z. B. hspl7.5-E oder hspl7.3-B von der Sojabohne (Gurley et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 559–565) verwendet werden. Diese Konstrukte können in Pflanzenzellen unter Verwendung von Ti-Plasmiden, Ri-Plasmiden, Pflanzenvirus-Vektoren, direkter DNA-Transformation, Mikroinjektion, Elektroporation usw. eingeführt werden. Für Übersichten über derartige Techniken siehe z. B. Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology (Verfahren für Pflanzenmolekularbiologie), Academic Press, NY, Abschnitt VIII, S. 421–463; und Grierson & Corey, 1988, Plant Molecular Biology (Pflanzenmolekularbiologie) 2. Ausg., Blackie, London, Kap. 7–9.
In einem Insekten-Expressionssystem, das verwendet werden kann, um die Peptid der Erfindung zu erzeugen, wird Autographs-californica-Nuclear-Polyhedrosis-Virus (AcNPV) als Vektor verwendet, um die fremden Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera-frugiperda-Zellen. Eine codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen (zum Beispiel das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter Kontrolle eines AcNPV-Promotors (zum Beispiel der Polyhedrin-Promotor) gesetzt werden. Erfolgreiche Insertion einer codierenden Sequenz resultiert in Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und Erzeugung von nicht-eingeschlossenem rekombinanten Virus (d. h. Virus, dem die proteinartige Hülle, codiert durch das Polyhedrin-Gen, fehlt). Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera-frugiperda-Zellen zu infizieren, in welchen das insertierte Gen exprimiert wird (z. B. siehe Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, US-Patentschrift 4215051 ). Weitere Beispiele dieses Expressionssystems können in Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Ausubel et al., Hrsg., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience gefunden werden.
In Säuger-Wirtszellen kann eine Anzahl von viral basierten Expressionssystemen benutzt werden. In Fallen, wo ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann eine codierende Sequenz mit einem Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. dem späten Promotor und dreiteiliger Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch Rekombination in vitro oder in vivo insertiert werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) resultiert in einem rekombinanten Virus, das lebensfähig und imstande ist, Peptid in infizierten Wirten zu exprimieren. (z. B. siehe Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 3655–3659). Alternativ kann der Vaccinia-7,5-K-Promotor verwendet werden (siehe z. B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415–7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857–864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 4927–4931).
Andere Expressionssysteme zum Erzeugen der Peptid der Erfindung werden dem Fachmann offensichtlich sein.
5.2.3 REINIGUNG VON PEPTIDEN
Die Peptid der Erfindung können durch auf dem Fachgebiet bekannte Techniken wie beispielsweise Umkehrphasenchromatographie, Hochleistungs-Flüssigchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelelektrophorese, Affinitätschromatographie und dergleichen gereinigt werden. Die tatsächlichen Bedingungen, die verwendet werden, um ein spezielles Peptid zu reinigen, hängen teilweise von der Synthesestrategie und von Faktoren wie beispielsweise Nettoladung, Hydrophobie, Hydrophilie usw. ab und werden dem Fachmann offensichtlich sein. Multimere verzweigte Peptid können z. B. durch Ionenaustausch oder Größenausschlußchromatographie gereinigt werden.
Für Affinitätschromatographie-Reinigung kann ein beliebiger Antikörper verwendet werden, welcher das Peptid speziell bindet. Für die Erzeugung von Antikörpern können verschiedenartige Wirtstiere, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw., durch Injektion mit einem Peptid immunisiert werden. Das Peptid kann an einen geeigneten Träger, wie beispielsweise BSA, mittels einer funktionellen Gruppe der Seitenkette oder mittels Verbindungsgliedern, gebunden an eine funktionelle Gruppe der Seitenkette, gebunden werden. Verschiedenartige Hilfsstoffe können verwendet werden, um die immunologische Reaktion, abhängig von der Wirtsspezies, zu erhöhen, die, ohne aber darauf begrenzt zu sein, das Freund'sche Adjuvans (komplett und inkomplett), Mineralgele wie beispielsweise Aluminiumhydroxid, grenzflächenaktive Substanzen wie beispielsweise Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptid, Ölemulsionen, Schlitzschnecken-Hämocyanin, Dinitrophenol und möglicherweise verwendbare humane Zusatzstoffe, wie beispielsweise BCG (Bazilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum, einschließen.
Monoklonale Antikörper für ein Peptid können unter Verwendung einer beliebigen Technik hergestellt werden, welche für die Erzeugung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zell-Linien in Kultur sorgt. Zu diesen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, die Hybridoma-Technik, ursprünglich beschrieben von Kohler und Milstein, 1975, Nature 256: 495–497, oder Kaprowski, US-Patentschrift 4376110 , welche hier durch Bezugnahme einbezogen ist; die Hybridoma-Technik mit humanen B-Zellen (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 2026–2030); und die EBV-Hybridoma-Technik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Monoklonale Antikörper und Krebstherapie), Alan R. Liss, Inc., S. 77–96 (1985)). Außerdem können Techniken, entwickelt für die Erzeugung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454, Boss, US-Patentschrift 4816397 ; Cabilly, US-Patentschrift 4816567 ; welche hier durch Bezugnahme einbezogen werden) durch Spleißen der Gene am einem Mäuse-Antikörper-Molekül mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörper-Molekül mit geeigneter biologischer Aktivität verwendet werden. Oder „humanisierte" Antikörper können hergestellt werden (siehe z. B. Queen, US-Patentschrift 5585089 , welche hier durch Bezugnahme einbezogen ist). Alternativ können Techniken, beschrieben für die Erzeugung von Antikörpern mit einzelner Kette ( US-Patentschrift 4946778 ) angepaßt werden, um Peptid-spezifische Antikörper mit einzelner Kette zu erzeugen.
Antikörper-Fragmente, welche Deletionen von speziellen Bindungsstellen enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel gehören zu derartigen Fragmenten, ohne aber darauf begrenzt zu sein, F(ab')₂-Fragmente, welche durch Pepsindigestion von dem Antikörper-Molekül und Fab-Fragmenten erzeugt werden können, welche durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab-Expressionsbanken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281), um schnelle und leichte Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für das interessierende Peptid zu erlauben.
Der Antikörper oder das Antikörperfragment, spezifisch für das gewünschte Peptid, können zum Beispiel an Agarose gebunden werden, und der Antikörper-Agarose-Komplex wird in der Immunchromatographie verwendet, um Peptid der Erfindung zu reinigen. Siehe Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice (Proteinreinigung: Prinzipien und Praxis), Springer-Verlag New York, Inc., NY, Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins (Verfahren in der Enzymologie: Immunoaffinitätschromatographie von Proteinen) 34: 723731.
5.3 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN UND VERFAHREN DER BEHANDLUNG
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können verwendet werden, um eine Krankheit bei Lebewesen, insbesondere Säugern einschließlich Menschen, zu behandeln, für welche Erhöhen der Serum-HDL-Konzentration, Aktivieren von LCAT und Fördern von Cholesterinabfluß und RCT vorteilhaft ist. Zu derartigen Leiden gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Hyperlipidämie und insbesondere Hypercholesterinämie und kardiovaskuläre Krankheit wie beispielsweise Atherosklerose (einschließlich Behandlung und Verhinderung von Atherosklerose); Restenose (z. B. Verhindern oder Behandeln atherosklerotischer Plaquen, welche sich infolge medizinischer Prozeduren wie beispielsweise Ballondilatation entwickeln); und andere Erkrankungen, wie beispielsweise Endotoxämie, welche oftmals in septischem Schock resultiert.
Die ApoA-I-Agonisten können allein verwendet werden oder in Kombinationstherapie mit anderen Arzneimitteln, die verwendet werden, um die vorhergehenden Leiden zu behandeln. Zu derartigen Therapien gehört, ohne aber darauf begrenzt zu sein, gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Verabreichung der beteiligten Arzneimittel.
Zum Beispiel können bei der Behandlung von Hypercholesterinämie oder Atherosklerose die ApoA-I-Agonist-Formulierungen mit einer beliebigen oder mehreren der Cholesterin senkenden Therapien verabreicht werden, die gegenwärtig in Gebrauch sind; z. B. Gallensäure-Harze, Niacin und/oder Statine. Ein derartiges kombiniertes Regime kann besonders vorteilhafte therapeutische Auswirkungen erzeugen, da jedes Arzneimittel auf ein unterschiedliches Ziel in Cholesterinsynthese und -transport wirkt; d. h. Gallensäure-Harze beeinflussen die Cholesterin-Rückführung, die Chylomikron- und LDL-Population; Niacin beeinflußt in erster Linie die VLDL- und LDL-Population; die Statine hemmen die Cholesterin-Synthese, wobei sie die LDL-Population vermindern (und vielleicht die LDL-Rezeptor-Expression erhöhen); wohingegen die ApoA-I-Agonisten RCT beeinflussen, HDL erhöhen, die LCAT-Aktivität erhöhen und den Cholesterinabfluß fördern.
In einer anderen Ausführungsform können die ApoA-I-Agonisten in Verbindung mit Fibraten verwendet werden, um Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie und/oder kardiovaskuläre Krankheit wie beispielsweise Atherosklerose zu behandeln.
In noch einer anderen Ausführungsform können die ApoA-I-Agonisten der Erfindung in Kombination mit den antimikrobiellen Mitteln und entzündungshemmenden Mitteln verwendet werden, die gegenwärtig verwendet werden, um septischen Schock, induziert durch Endotoxin, zu behandeln.
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können als Peptid oder als Peptid-Lipid-Komplexe formuliert werden, welche an Patienten auf einer Vielfalt von Wegen verabreicht werden können, um den ApoA-I-Agonisten an die Zirkulation zu tiefem. Beispielhafte Formulierungen und Behandlungsregimes sind nachstehend beschrieben.
5.3.1 APOA-I-AGONISTEN UND PEPTID/LIPID-KOMPLEX ALS WIRKSTOFF
Die ApoA-I-Agonist-Peptid können unter Verwendung einer beliebigen Technik synthetisiert oder hergestellt werden, die in Abschnitt 5.2 und seinen Unterabschnitten beschrieben ist. Stabile Zubereitungen, welche eine lange Lagerbeständigkeit haben, können durch Lyophilisieren der Peptid hergestellt werden – entweder, um Masse für Reformulierung herzustellen oder um individuelle Aliquots oder Dosierungseinheiten herzustellen, welche vor der Verabreichung an einen Patienten durch Rehydration mit sterilem Wasser oder einer geeigneten sterilen gepufferten Lösung rekonstituiert werden können.
In bestimmten Ausführungsformen kann es bevorzugt werden, den ApoA-I-Agonist in einem Peptid-Lipid-Komplex zu formulieren und zu verabreichen. Diese Herangehensweise hat verschiedene Vorteile, da der Komplex eine erhöhte Halbwertszeit im Blutkreislauf haben sollte, insbesondere wenn der Komplex eine ähnliche Größe und Dichte wie HDL, und insbesondere die pre-β-1- oder pre-β-2-HDL-Populationen, hat. Die Peptid-Lipid-Komplexe können geeignet durch eines von einer Anzahl von nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Stabile Zubereitungen mit einer langen Lagerbeständigkeit können durch Lyophilisierung hergestellt werden – wobei die nachstehend beschriebene Verfahrensweise der Colyophilisierung die bevorzugte Herangehensweise ist. Die lyophilisierten Peptid-Lipid-Komplexe können verwendet werden, um Masse für pharmazeutische Reformulierung herzustellen oder um individuelle Aliquots oder Dosierungseinheiten herzustellen, welche durch Rehydration mit sterilem Wasser oder einer geeigneten gepufferten Lösung vor der Verabreichung an einen Patienten rekonstituiert werden können.
Eine Vielfalt von dem Fachmann bekannten Verfahren kann verwendet werden, um die Peptid-Lipid-Vesikel oder Komplexe herzustellen. Zu diesem Zweck kann eine Anzahl von zum Herstellen von Liposomen oder Proteoliposomen verfügbaren Techniken verwendet werden. Zum Beispiel kann das Peptid zusammen mit geeigneten Lipiden (unter Verwendung einer Bad- oder Sonden-Beschallungsvorrichtung) einer Ultraschallbehandlung unterzogen werden, um Komplexe zu bilden. Alternativ kann das Peptid mit vorgebildeten Lipid-Vesikeln vereinigt werden, was in der spontanen Bildung von Peptid-Lipid-Komplexen resultiert. In noch einer anderen Alternative können die Peptid-Lipid-Komplexe durch ein Detergens-Dialyse-Verfahren gebildet werden; z. B. wird ein Gemisch von dem Peptid, Lipid und Detergens dialysiert, um das Detergens zu entfernen und Peptid-Lipid-Komplexe zu rekonstituieren oder zu bilden (z. B. siehe Jonas et al., 1986, Methods in Enzymol. 128: 553–582).
Wenn auch die vorhergehenden Herangehensweisen machbar sind, stellt jedes Verfahren seine eigenen besonderen Probleme der Erzeugung hinsichtlich Kosten, Ausbeute, Reproduzierbarkeit und Sicherheit dar. Die Anmelder haben ein einfaches Verfahren zum Herstellen von Peptid- oder Protein-Phospholipid-Komplexen entwickelt, welche charakteristische Eigenschaften ähnlich HDL haben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die ApoA-I-Peptid-Lipid-Komplexe herzustellen, und hat die folgenden Vorteile: (1) Der größte Teil oder alle von den eingeschlossenen Bestandteilen werden verwendet, um die vorgesehenen Komplexe zu bilden, wobei so Abfall von Ausgangsmaterial vermieden wird, welcher für die anderen Verfahren allgemein verbreitet ist. (2) Lyophilisierte Verbindungen werden gebildet, welche während der Lagerung sehr stabil sind. Die resultierenden Komplexe können unmittelbar vor Gebrauch rekonstituiert werden. (3) Die resultierenden Komplexe brauchen gewöhnlich nach der Bildung und vor Gebrauch nicht weiter gereinigt zu werden. (4) Toxische Verbindungen, einschließlich Detergentien wie beispielsweise Cholat, werden vermieden. Überdies kann das Verfahren der Erzeugung leicht im Maßstab vergrößert werden und ist für GMP-Herstellung (d. h. in einer Endotoxin-freien Umgebung) geeignet.
Entsprechend dem bevorzugten Verfahren werden das Peptid und Lipid in einem Lösungsmittelsystem vereinigt, welches jeden Bestandteil cosolubilisiert und durch Lyophilisierung vollständig entfernt werden kann. Zu diesem Zweck müssen Lösungsmittelpaare sorgfältig ausgewählt werden, um die Colöslichkeit von sowohl dem amphipathischen Peptid als auch dem Lipid sicherzustellen. In einer Ausführungsform können das (die) Protein(e) oder Peptid(e), die in die Teilchen eingebracht werden sollen, in einem wässerigen oder organischen Lösungsmittel oder Gemisch von Lösungsmitteln (Lösungsmittel 1) gelöst werden. Die (Phospho)lipidkomponente wird in einem wässerigen oder organischen Lösungsmittel oder Gemisch von Lösungsmitteln (Lösungsmittel 2), welches mit Lösungsmittel 1 mischbar ist, gelöst und die zwei Lösungen werden gemischt. Alternativ können das Peptid und Lipid in ein Colösungsmittelsystem; d. h. ein Gemisch der mischbaren Lösungsmittel, eingebracht werden. Ein geeignetes Verhältnis von Peptid (Protein) zu Lipiden wird zuerst empirisch bestimmt, so daß die resultierenden Komplexe die geeigneten physikalischen und chemischen Eigenschaften besitzen; d. h., gewöhnlich (aber nicht notwendigerweise) in der Größe dem HDL ähnlich sind. Das resultierende Gemisch wird gefroren und zur Trockene lyophilisiert. Manchmal muß ein zusätzliches Lösungsmittel zu dem Gemisch hinzugegeben werden, um die Lyophilisierung zu erleichtern. Dieses lyophilisierte Produkt kann für lange Zeiträume aufbewahrt werden und bleibt stabil.
In den nachstehend beschriebenen Arbeitsbeispielen wurden Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und Phospholipide gesondert in Methanol gelöst, vereinigt, dann vor der Lyophilisierung mit Xylol gemischt. Das Peptid und Lipid können beide zu einem Gemisch der zwei Lösungsmittel gegeben werden. Alternativ kann eine Lösung des Peptids, gelöst in Methanol, mit einer Lösung von Lipid, gelöst in Xylol, gemischt werden. Sorge sollte getragen werden, Salz aus dem Lösungsmittelsystem zu eliminieren um Aussalzen des Peptids zu vermeiden. Die resultierende Lösung, enthaltend das Peptid und Lipid, cosolubilisiert in Methanol/Xylol, wird lyophilisiert, wobei ein Pulver erzeugt wird.
Das lyophilisierte Produkt kann rekonstituiert werden, um eine Lösung oder Suspension des Peptid-Lipid-Komplexes zu erhalten. Zu diesem Zweck wird das lyophilisierte Pulver mit einer wässerigen Lösung zu einem geeigneten Volumen rehydratisiert (oftmals 5 mg Peptid/ml, was für intravenöse Injektion geeignet ist).
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das lyophilisierte Pulver mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder einer physiologischen Kochsalzlösung rehydratisiert. Es kann sein, daß das Gemisch gerührt oder verwirbelt werden muß, um die Rehydration zu erleichtern, und in den meisten Fällen sollte der Rekonstitutionsschritt bei einer Temperatur, gleich der oder größer als die Phasenübergangstemperatur der Lipidkomponente der Komplexe, durchgeführt werden. Innerhalb von Minuten resultiert eine klare Zubereitung von rekonstituierten Lipid-Protein-Komplexen.
Ein Aliquot der resultierenden rekonstituierten Zubereitung kann charakterisiert werden, um zu bestätigen, daß die Komplexe in der Zubereitung die gewünschte Größenverteilung; z. B. die Größenverteilung von HDL, haben. Gelfiltrationschromatographie kann zu diesem Zweck verwendet werden. In den nachstehend beschriebenen Arbeitsbeispielen wurde ein Pharmacia-Superose-6-FPLC-Gelfiltrationschromatographiesystem verwendet. Der verwendete Puffer enthält 150 mM NaCl in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. Ein typisches Probevolumen beträgt 20 bis 200 Mikroliter von Komplexen, enthaltend 5 mg Peptid/ml. Die Säulendurchflußgeschwindigkeit beträgt 0,5 ml/min. Eine Serie von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht und Stokes-Durchmesser ebenso wie humanes HDL werden als Standards verwendet, um die Säule zu kalibrieren. Die Proteine und Lipoprotein-Komplexe werden durch Extinktion oder Streuung von Licht der Wellenlänge 254 oder 280 nm überwacht.
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können mit einer Vielfalt von Lipiden, die gesättigte, ungesättigte, natürliche und synthetische Lipide und/oder Phospholipide einschließen, komplex gebunden werden. Zu geeigneten Lipiden gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Phospholipide mit kleiner Alkylkette, Ei-Phosphatidylcholin, Sojabohnen-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Distearoylphosphatidylcholin 1-Myristoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2myristoylphosphatidylcholin, 1-Palmitoyl-2-stearoylphosphatidylcholin, 1-Stearoyl-2-palmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylcholin Dioleophosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylglycerolphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Sphingomyelin, Sphingolipide, Phosphatidylglycerol, Diphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidylglycerol, Dipalmitoylphosphatidylglycerol, Distearoylphosphatidylglycerol, Dioleoylphosphatidylglycerol, Dimyristoylphosphatidinsäure, Dipalmitoylphosphatidinsäure, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin, Gehirn-Phosphatidylserin, Gehirn-Sphingomyelin, Dipalmitoylsphingomyelin, Distearoylsphingomyelin, Phosphatidinsäure, Galactocerebrosid, Ganglioside, Cerebroside, Dilaurylphosphatidylcholin, (1,3)-D-Mannosyl-(1,3)-diglycerid, Aminophenylglycosid, 3-Cholesteryl-6'-(glycosylthio)hexyl etherglycolipid sowie Cholesterin und seine Derivate.
Die Anmelder haben entdeckt, daß, wenn die ApoA-I-Agonisten der Erfindung komplex mit Sphingomyelin gebunden sind, das gesamte HDL der pre-β-ähnlichen Teilchen entfernt wird. Dementsprechend werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die ApoA-I-Agonisten als Komplex mit Sphingomyelin verabreicht.
5.3.2 VERFAHREN DER BEHANDLUNG
Die ApoA-I-Peptid-Agonisten oder Peptid-Lipid-Komplexe der Erfindung können auf einem beliebigen geeigneten Wege verabreicht werden, der die biologische Verfügbarkeit im Blutkreislauf sicherstellt. Dies kann am besten durch parenterale Wege der Verabreichung, einschließlich intravenöser (IV), intramuskulärer (IM), intradermaler, subcutaner (SC) und intraperitonealer (IP) Injektionen, erreicht werden. Jedoch können andere Wege der Verabreichung verwendet werden. Zum Beispiel kann Absorption durch den Gastrointestinaltrakt durch orale Wege der Verabreichung bewerkstelligt werden (einschließlich, aber nicht begrenzt auf die Einnahme, bukkale und sublinguale Wege), mit der Maßgabe, daß geeignete Formulierungen (z. B. enterische Beschichtungen) verwendet werden, um Zersetzung des Wirkstoffs, z. B. in der harschen Umgebung der Mundhöhle, des Magens und/oder des Dünndarms, zu vermeiden oder minimieren. Alternativ kann Verabreichung über Schleimhautgewebe, wie beispielsweise vaginale und rektale Arten der Verabreichung, benutzt werden, um Zersetzung in dem Gastrointestinaltrakt zu vermeiden oder minimieren. In noch einer anderen Alternative können die Formulierungen der Erfindung transcutan (z. B. transdermal) oder durch Inhalation verabreicht werden. Es wird erkannt, daß der bevorzugte Weg mit dem Leiden, dem Alter und der Willfährigkeit des Empfängers variieren kann.
Die tatsächliche Dosis von ApoA-I-Agonisten oder Peptid-Lipid-Komplex, die verwendet wird, variiert mit dem Weg der Verabreichung und sollte angepaßt werden, um zirkulierende Plasmakonzentrationen von 100 mg/l bis 2 g/l zu erreichen. Werte, erhalten in hier beschriebenen Tiermodellsystemen, zeigen, daß die ApoA-I-Agonisten der Erfindung mit der HDL-Komponente assoziieren und eine Sollhalbwertszeit bei Menschen von etwa fünf Tagen haben. So können in einer Ausführungsform die ApoA-I-Agonisten durch Injektion mit einer Dosis zwischen 0,5 mg/kg bis 100 mg/kg einmal in der Woche verabreicht werden. In einer anderen Ausführungsform können wünschenswerte Serumspiegel durch kontinuierliche Infusion oder durch intermittierende Infusion aufrecht erhalten werden, die etwa 0,5 mg/kg/h bis 100 mg/kg/h bereitstellen.
Toxizität und therapeutische Wirksamkeit der verschiedenartigen ApoA-I-Agonisten können unter Verwendung von standardmäßigen pharmazeutischen Verfahrensweisen in Zellkultur oder Versuchstieren zum Bestimmen der LD₅₀ (die Dosis, die für 50% der Population letal ist) und der ED₅₀ (die Dosis, die bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist) bestimmt werden. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Auswirkungen ist der therapeutische Index, und er kann als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden. ApoA-I-Peptid-Agonisten, welche große therapeutische Indices zeigen, werden bevorzugt.
5.3.3 PHARMAZEUTISCHE FORMULIERUNGEN
Die pharmazeutischen Formulierungen der Erfindung enthalten den ApoA-I-Peptid-Agonisten oder den Peptid-Lipid-Komplex als Wirkstoff in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, geeignet für Verabreichung und Zuführung in vivo. Da die Peptid saure und/oder basische Termini und/oder Seitenketten enthalten können, können die Peptid in die Formulierungen in entweder der Form von freien Säuren oder Basen oder in der Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen eingeschlossen werden.
Zu injizierbaren Zubereitungen gehören sterile Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen des Wirkstoffs in wässerigen oder öligen Vehikeln. Die Zusammensetzungen können auch Formulierungsmittel, wie beispielsweise suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel enthalten. Die Formulierungen zur Injektion können in Einheitsdosierungsform, z. B. in Ampullen oder in Behältern mit mehrfachen Dosen, dargeboten werden und können hinzugefügte Konservierungsstoffe enthalten.
Alternativ kann die injizierbare Formulierung in Pulverform zur Rekonstitution mit einem geeigneten Vehikel, einschließend, ohne aber darauf begrenzt zu sein, steriles pyrogenfreies Wasser, Puffer, Dextroselösung usw., vor Gebrauch bereitgestellt werden. Zu diesem Zweck kann der ApoA-I-Agonist lyophilisiert werden oder kann der colyophilisierte Peptid-Lipid-Komplex hergestellt werden. Die aufbewahrten Zubereitungen können in Einheitsdosierungsformen geliefert und vor Gebrauch in vivo rekonstituiert werden.
Für lang anhaltende Zuführung kann der Wirkstoff als Depotzubereitung, zur Verabreichung durch Implantation; z. B. subcutane, intradermale oder intramuskuläre Injektion, formuliert werden. So kann zum Beispiel der Wirkstoff mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauschharzen oder als schwerlösliche Derivate; z. B. als schwerlösliche Salzform des ApoA-I-Agonisten, formuliert werden.
Alternativ können transdermale Zuführungssysteme, hergestellt als klebende Scheibe oder Pflaster, welche langsam den Wirkstoff für percutane Absorption freisetzen, verwendet werden. Zu diesem Zweck können Permeationsverbesserer verwendet werden, um die transdermale Penetration des Wirkstoffs zu erleichtern. Ein spezieller Vorteil kann durch Einbringen der ApoA-I-Agonisten der Erfindung oder des Peptid-Lipid-Komplexes in ein Nitroglycerinpflaster zur Verwendung bei Patienten mit ischämischer Herzkrankheit und Hypercholesterinämie erreicht werden.
Für orale Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Form von zum Beispiel Tabletten oder Kapseln annehmen, die durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Excipienten, wie beispielsweise Bindemittel (z. B. prägelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffe (z. B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat); Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk oder Siliciumdioxid); Zerfallmittel (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat); oder Benetzungsmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), hergestellt werden. Die Tabletten können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Zubereitungen für orale Verabreichung können die Form von zum Beispiel Lösungen, Sirupen oder Suspensionen annehmen, oder sie können als trockenes Produkt zur Konstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch dargeboten werden. Derartige flüssige Zubereitungen können durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen, wie beispielsweise suspendierende Mittel (z. B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder hydrierte Speisefette); emulgierende Mittel (z. B. Lecithin oder Akaziengummi); nicht-wässerige Vehikel (z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte pflanzliche Öle); und Konservierungsstoffe (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure) hergestellt werden. Die Zubereitungen können auch Puffersalze, aromatisierende, färbende und süßende Mittel wie geeignet enthalten. Zubereitungen für orale Verabreichung können geeignet formuliert werden, um kontrollierte Freisetzung der aktiven Verbindung zu ergeben.
Für bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die in herkömmlicher Weise formuliert werden. Für rektale und vaginale Wege der Verabreichung kann der Wirkstoff als Lösungen (für Retentionseinläufe), Suppositorien oder Salben formuliert werden.
Für Verabreichung durch Inhalation kann der Wirkstoff geeignet in der Form einer Aerosolspraydarbietung aus Druckpackungen oder einem Zerstäuber mit der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas, zugeführt werden. In dem Fall eines Druckaerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellen eines Ventils bestimmt werden, um ehre abgemessene Menge zuzuführen. Kapseln und Hülsen aus z. B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die ein Pulvergemisch der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis wie beispielsweise Lactose oder Stärke enthalten.
Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Packung oder Dispenservorrichtung dargeboten werden, welche ein oder mehrere Einheitsdosierungsformen, enthaltend den Wirkstoff, enthalten kann. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Plastikfolie umfassen, wie beispielsweise eine Blisterpackung. Die Packung oder Dispenservorrichtung kann von Instruktionen zur Verabreichung begleitet werden.
5.4 ANDERE VERWENDUNGEN
Die ApoA-I-Agonisten der Erfindung können in Assays in vitro verwendet werden, um Serum-HDL, z. B. für diagnostische Zwecke, zu messen. Weil die ApoA-I-Agonisten mit der HDL-Komponente des Serums assoziieren, können die Agonisten als „Marker" für die HDL-Population verwendet werden. Überdies können die Agonisten als Marker für die Subpopulation von HDL verwendet werden, die im RCT wirksam ist. Zu diesem Zweck kann der Agonist zu einer Probe von Patientenserum hinzugegeben werden oder mit ihr gemischt werden; nach einer geeigneten Inkubationszeit kann die HDL-Komponente einem Assay unterzogen werden, indem der eingebrachte ApoA-I-Agonist nachgewiesen wird. Dies kann unter Verwendung von markiertem Agonist (z. B. Radiomarkierungen, Fluoreszenzmarkierung, Enzymmarkierungen, Farbstoffe usw.) oder durch Immunoassays unter Verwendung von für den Agonisten spezifischen Antikörpern (oder Antikörperfrgmenten) bewerkstelligt werden.
Alternativ kann markierter Agonist in bilderzeugenden Verfahrensweisen (z. B. CAT-Scans, MRI-Scans) verwendet werden, um das Kreislaufsystem zu visualisieren oder um den RCT zu überwachen oder um die Ansammlung von HDL an Fettstreifen, atherosklerotischen Läsionen usw. (wo das HDL aktiv im Cholesterinabfluß sein sollte) zu visualisieren.
6. BEISPIEL: SYNTHESE VON PEPTID-AGONISTEN VON APOA-I
Die Peptid, beschrieben in Tabelle X (Abschnitt 8.3, nachstehend), wurden synthetisiert und charakterisiert, wie nachstehend in den Unterabschnitten beschrieben ist. Die Peptid wurden außerdem strukturell und funktionell analysiert, wie nachstehend in den Abschnitten 7 und 8 beschrieben ist.
6.1 SYNTHESE VON KERNPEPTIDEN

Peptid wurden auf fester Phase entsprechend der Merrifield-Technik (Merrifield, 1969, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149–2154) unter Verwendung von 0,25 mmol p-Alkoxybenzylalkohol-Harz (HMP-Harz) (Wang, 1973, J. Am. Chem. Soc. 95: 1328–1333) und Fmoc-Chemie synthetisiert. Alle Synthesen wurden auf einem automatischen Peptidsynthetisierer Applied BioSystems ABI Modell 430A (Perlon-Elmer, Foster City, CA) ausgeführt. Die Solvations- und Aktivierungszeiten, die für jeden Kupplungszyklus verwendet wurden, sind nachstehend in Tabelle V angegeben: TABELLE V EINZELNE KUPPLUNGAKTIVATORZYKLEN

Zyklus-Name	bezeichnete minosäuren	lösendes Lösungsmittel	Zeit	Aktivierungs-zeit	Transfer-Zeiten*
afmc 31	Asn (trt), His (trt), Lys (Boc), Trp	–0,4 ml DCM –1,2 ml NMP –1,0 ml HOBt/NMP	–7 min.	–51 min.	1 = 50 sec. 2 = 36 sec.
afmc 32	Arg (Pmc), Gln (trt), Aib	–0,8 ml DCM –1,2 ml NMP –1,0 ml HOBt/NMP	–32 min.	–51 min.	1 = 60 sec. 2 = 40 sec.
afmc 33	Ala, Asp (OtBu), Glu (OtBu), Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro	–0,4 ml DCM –0,8 ml NMP –0,1 ml HOBt/NMP	–4 min.	–36,5 min.	1 = 38 sec. 2 = 27 sec.
afmc 34	Val	–0,4 ml DCM –0,8 ml NMP –0,1 ml HOBt/NMP	–4 min.	–61,5 min.	1 = 38 sec. 2 = 27 sec.

* 1 = Transfer von der Hülse zum Aktivator
2 = Transfer vom Aktivator zu der Hülse
DCC ist Dicyclohexylcarbodiimid
HOBt ist 1-Hydroxybenzotriazol
NMP ist N-Methylpyrrolidon
trt ist Trityl
BOC ist t-Butyloxycarbonyl
Pmc ist Pentamethylchroman-6-sulfonyl
OtBu ist t-Butylester

Die Harze wurden zwischen jedem Kupplungsschritt mit NMP gewaschen. Das Protokoll für einen Synthesezyklus ist nachstehend in Tabelle VI angegeben: TABELLE VI KUPPLUNGSPROTOKOLL FÜR EINEN SYNTHESEZYKLUS

Arbeitsgang	Zeit (mm)
1. Entschützung (10% Piperidin in NMP)	20
2. Waschen (NMP)	5
3. Kuppeln (4 Äquiv. Fmoc-Aminosäure-HOBT-Ester in NMP, präaktiviert 50 min)	61
4. Waschen	3
5. Harzprobe (optional)	3
insgesamt	92

Alle Aminosäuren außer Fmoc-β-(1-Naphthyl)alanin wurden in dieser Weise gekuppelt. Fmoc-β-(1-Naphthyl)alanin wurde manuell gekuppelt. Für manuelle Kupplung wurden 1 mmol Fmoc-β-(1-Naphthyl)alanin und 1 mmol 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TBTU) in 5 ml NMP gelöst und mit dem Peptid-Harz gemischt.
Danach wurden 2 mmol N-Ethyldiisopropylamin hinzugegeben, das Gemisch für 2 Stunden geschüttelt und das Peptid-Harz 6 Mal mit 10 ml NMP gewaschen. Die Kupplungseffizienz wurde unter Verwendung des Kaiser-Tests (Kaiser, 1970, Anal. Biochem. 34: 59577) überwacht und die Kupplung wenn notwendig wiederholt. Nach Kupplung von Naphthylalanin wurde der Rest der Synthese automatisch wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
6.2 SYNTHESE VON PEPTID-AMIDEN
Wo in Tabelle X (Abschnitt 8.3, nachstehend) angezeigt, wurden Peptid-Amide unter Verwendung eines Rink-Amid-Harzes, enthaltend den Fmoc-Rink-Amid-Anker 4-(2',4'-Dimethylphenyl)-Fmoc- phenoxymethyl (Rink, 1987, Tetrahedron Lett. 28: 3787–3790), synthetisiert und die Syntheseprotokolle vorstehend in Abschnitt 6.1 beschrieben.
6.3 SYNTHESE VON N-TERMINAL ACYLIERTEN PEPTIDEN
Wo in Tabelle X (Abschnitt 8.3, nachstehend) angezeigt wurden N-terminal acylierte Formen der Peptid hergestellt, indem das Harz-gebundene Peptid, hergestellt wie vorstehend in Abschnitt 6.1 oder 6.2 beschrieben, einem geeigneten Acylierungsmittel ausgesetzt wurde.
Für N-terminal acetylierte Peptid wurden 15 ml Acetanhydrid-Lösung (10% Vol./Vol. in NMP) zu jeweils 1 g Harz-gebundenem Peptid gegeben, das Gemisch wurde für 5 min geschüttelt und das Harz durch Filtration gewonnen. Das gewonnene Harz wurde drei Mal mit NMP (15 ml) und drei Mal mit Ethanol (15 ml) gewaschen.
6.4 SPALTUNG UND ENTSCHÜTZUNG
Im Anschluß an die Synthese wurden die Peptid, beschrieben vorstehend in den Abschnitten 6.1, 6.2 und 6.3, von dem Harz abgespalten und mit einer Spaltungslösung, enthaltend 92,5% Trifluressigsäure (TFA)/3,75% Anisol/3,75% Dodecanthiol (Vol./Vol./Vol.) entschützt. Um Spaltung zu bewirken, wurden 10 ml Spaltungslösung zu 0,25 mmol Peptid-Harz hinzugegeben und für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und das abgespaltene/entschützte Peptid mit Diethylether ausgefällt, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Der Spaltungscocktail für Peptid, enthaltend Trp (W), ebenso wie für Peptidamide bestand aus 86,5% TFA, 4,5% H₂O, 4,5% 1,2-Ethandithiol, 4,5% Anisol und 3% Phenol.
6.5 REINIGUNG
Die rohen, abgespaltenen Peptid von Abschnitt 6.4 wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Reinheit jedes Peptids wurde durch verschiedene analytische Techniken (analytische HPLC, Kapillarelektrophorese) bestätigt. Kapillarelektrophoresen wurden auf Quarzglas-Kapillaren von 70 cm Länge und einem inneren Durchmesser von 75 μm (Thermo Separation Products) ausgeführt. Die Trennungen wurden bei 25°C, 15 kV, Durchlaufzeit 35 min, in zwei verschiedenen Puffersystemen durchgeführt: Puffer 1 (20 mM Na₂B₄O₇, pH 9,2) und Puffer 2 (10 mM Na₂HPO₄, pH 2,5). HPLC-Trennungen wurden auf Nucleosil 7C18 oder Nucleosil 7C4-Säulen (Macherey und Nagel, Deutschland), 250 × 21 mm, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 8 ml/min ausgeführt. Die Gradientenelution wurde unter Verwendung eines Gemisches von 0,1% TFA in Wasser (Lösungsmittel A) und 0,1% TFA in Acetonitril (Lösungsmittel B) durchgeführt. Die verwendeten Gradienten wurden angepaßt, um die Anforderungen jedes Peptids zu erfüllen.
6.6 CHARAKTERISIERUNG
Die Massen- und Aminosäureanalyse der gereinigten Peptid, beschrieben in Abschnitt 6.5, wurde durch Massenspektrometrie bzw. Aminosäureanalyse, wie nachstehend beschrieben, bestätigt. Edman-Abbau wurde zum Sequenzieren verwendet.
6.6.1 LC-MS
Ein standardmäßiges im Handel erhältliches Dreistufen-Quadrupol-Massenspektrometer (Modell TSQ 700; Finnigan MAT, San Jose CA, USA) wurde zur Massenbestimmung verwendet. Eine pneumatisch unterstützte Elektrospray-(ESI)-Grenzfläche wurde zur Einführung der Probe in die Ionisationsquelle bei atmosphärischem Druck des Massenspektrometers verwendet. Der Grenzflächensprayer wurde mit einem positiven Potential von 4,5 kV betrieben. Die Temperatur der Stahlkapillare wurde bei 200°C gehalten, wohingegen der Verteiler bei 70°C war. Positive Ionen, die durch diesen Ionenverdampfungsprozeß erzeugt wurden, traten in den Analysator des Massenspektrometers ein. Der Multiplier wurde auf 1000 V eingestellt. Die Analysatorkammer des Massenspektrometers war bei 4E-6. Alle Erfassungen wurden bei der Auflösung < 1u durchgeführt.
Peptid wurden durch direkte Infusion der gereinigten Peptid analysiert, wobei ein ABI (Applied BioSystems) Mikropacksystem, bestehend aus einer Spritzenpumpe (Modell 140B), einem UV-Detektor (Modell 785A) und einem Ofen/Injektor (Modell 112A), verwendet wurde. Das Lösungsmittelsystem bestand aus Wasser (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B), die jeweils 0,1% TFA enthielten. Peptid wurden infundiert, wobei entweder ein Gradient oder isokratische Bedingungen verwendet wurden, und von einer Aquapore-C18-Säule eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug typischerweise 300 μl/min. Die Konzentration jedes Peptids betrug etwa 0,03 mg/ml, 20 μl von diesem wurden injiziert (z. B. 30 pmol).
Full-scan-MS-Experimente wurden durch Scannen von Quadrupol 1 von m/z 500–1500 in 4 s erhalten. Die Werte wurden unter Verwendung einer Alpha DEC Station erfaßt und wurden unter Verwendung des von Finnigan MAT (BIOWORKS) bereitgestellten Software-Pakets verarbeitet.
6.6.2 AMINOSÄUREANALYSE
Aminosäureanalyse wurde auf einem ABI (Applied BioSystems) 420 Amino Acid Analyzer (Aminosäureanalysator) durchgeführt. Dieses System besteht aus drei Modulen: einem Instrument für Hydrolyse und Derivatisierung, einer Umkehrphasen-HPLC und einem Datensystem. Die Peptid-Probe wurde (3 Mal in dreifacher Ausführung) auf poröse Glasobjekträger aufgebracht und nachfolgend unter Gasphasenbedingungen (155°C, 90 min) hydrolysiert. Nach Entfernung der HCl wurden die resultierenden Aminosäuren unter Verwendung von PITC (Phenylisothiocyanat) in PTC-AA (Phenylthiocarbamoyl-Aminosäuren) umgewandelt. Nach Überführung auf die HPC-Probenschleife wurden die resultierenden Gemische auf einer Aquapore-C18-Säule fraktioniert, wobei der Gradientenmodus (Lösungsmittel A: 50 mmol Ammoniumacetat (NH₄Ac), pH 5,4, in Wasser; Lösungsmittel B: 32 mmol von Natriumacetat (NaOAc) in wässerigem Acetonitril) unter Bedingungen der Temperaturkontrolle verwendet wurde. Die HPLC-Werte wurden durch das Softwarepaket, bereitgestellt von Applied BioSystems, verarbeitet. Quantifizierung wurde relativ zu einem Peptidstandard, geliefert von Applied BioSystems, durchgeführt.
6.7 SYNTHESE VON VERZWEIGTEN NETZWERKEN
Peptidyl-Harz mit tetramerem Kern und Peptidyl-Harz mit trimerem Kern werden synthetisiert, wie bei Demoor et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239: 74–84, beschrieben ist. Die Matrix mit tetramerem und trimerem Kern, noch verknüpft mit dem 4-Methylbenzhydrylamin-Harz, wird dann als anfängliches Peptidyl-Harz für automatische Synthese von KernPeptiden wie vorher beschrieben verwendet.
Verzweigte Netzwerke, enthaltend helikale Segmente von verschiedenen Aminosäurezusammensetzungen, können unter Verwendung orthogonaler Synthese und schützender Strategien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, synthetisiert werden.
7. BEISPIEL: STRUKTURELLE UND LIPIDBINDUNGSANALYSE VON APOA-I-PEPTIDEN
Die charakteristischen strukturellen und Lipidbindung-Eigenschaften der gereinigten Peptid, synthetisiert wie vorstehend in Abschnitt 6 beschrieben, wurden durch Circulardichroismus (CD), Fluoreszenzspektroskopie und kernmagnetische Resonanz (NMR) bestimmt.
7.1 CIRCULARDICHROISMUS
Dieses Beispiel beschreibt ein bevorzugtes Verfahren zum Bestimmen des Grades von Helizität der KernPeptid der Erfindung sowohl frei in Puffer als auch in Gegenwart von Lipiden.
7.1.1 EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Circulardichroismus-Spektren im fernen UV wurden zwischen 190 und 260 nm (in Inkrementen von 0,5 nm oder 0,2 nm) mit einem AVIV62DS-Spektrometer (AVIV Associates, Lakewood, NJ, USA), ausgestattet mit einer thermoelektrischen Küvettenhalter und Probenwechsler, aufgezeichnet. Das Instrument wurde mit (+)-10-Camphersäure kalibriert. Zwischen einem und drei Scans wurden für jede Probe unter Verwendung von Quarz-Suprasil-Zellen mit 10 cm, 5 cm, 1 cm bzw. 0,1 cm Weglänge für Peptidkonzentrationen von 10^–7 M bis 10^–4 M gesammelt. Die Bandbreite wurde bei 1,5 nm und die Scangeschwindigkeit auf 1 s pro Wellenlängeschritt fixiert. Die berichteten Daten sind der Mittelwert von mindestens 2 oder 3 unabhängigen Messungen.
Nach Subtraktion des Hintergrunds wurden Spektren in molare Elliptizität (θ) pro Rest in Grad·cm^–2·dmol^–1 umgewandelt. Die Peptidkonzentration wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt, und außerdem durch Absorptionspektrometrie auf einem UV/Vis-Spektrophotometer Perkin Elmer Lambda 17, wenn das Peptid einem Chromophor (Tryptophan, Dansyl, Naphthylalanin) enthielt.
CD-Spektren wurden mit freiem, ungebundenem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7,4); mit Peptid-SUV-Komplexen (20:1 EPC:Chol., Ri = 30 und Ri = 50); mit Peptid-Mizell-Komplexen (1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin, Ri = 100); und mit freiem, ungebundenem Peptid in Gegenwart von 2,2,2-Trifluorethanol (TFE) (5 μM Peptid, 90% Vol. TFE) erhalten.
Die SUVs wurden durch Dispergieren der Lipide (10 mM, 20:1 EPC:Chol., Avanti Polar Lipids, AL) in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) mit Hindurchperlen von N₂ für 5 min und nachfolgender Ultraschallbehandlung (1,5 h) in einem Ultraschallbad erhalten. Die Homogenität der Herstellung wurde durch FPLC überprüft.
Die Mizellen wurden durch Dispergieren des Lipids (6 mM 1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphatidylcholin, Avanti Polar Lipids, AL) in Phosphatpuffer (5 mM, pH 7,4) mit Hindurchperlen von N₂ für 5 min und nachfolgendes Verwirbeln erhalten.
Um die Peptid-SUV-Komplexe zu erhalten, wurden SUVs zu dem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) bei einem Phospholipid-Peptid-Molverhältnis (Ri) von 30 oder 50 hinzugegeben.
Um die Peptid-Mizell-Komplexe zu erhalten, wurden Mizellen zu dem Peptid (5 μM in 5 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) bei einem Ri von 100 hinzugegeben.
Alle Spektren wurden bei 37°C aufgezeichnet. Die Stabilität von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) als Funktion der Temperatur (sowohl frei in Puffer als auch in Mizellen) wurde durch Aufzeichnen der Spektren in einer Serie von verschiedenen Temperaturen bestimmt.
Der Grad der Helizität von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) als Funktion der Konzentration wurde ebenfalls bestimmt.
7.1.2 BESTIMMUNG DER HELLZITÄT
Der Grad von Helizität der Peptid unter der verschiedenartigen Bedingungen wurde aus der mittleren Restelliptizität bei 222 nm (Chen et al., 1974, Biochemistry 13: 3350–3359) oder durch Vergleichen der erhaltenen CD-Spektren mit auf Datenbanken verfügbaren Referenzspektren bestimmt (16 helikale Referenzspektren von Provencher & Glockner, 1981, Biochemistry 20: 33–37; Referenzspektren von denaturiertem Protein von Venyaminov et al., 1993, Anal. Biochem. 214: 17–24) unter Verwendung des Pakets CONTIN Kurvenanpassungs-Algorithmus Version 2DP, CD-1 (Aug. 1982) (Provencher, 1982, Comput. Phys. Commun. 27: 213–227, 229–242). Akzeptable Anpassung wurde unter Verwendung der Methodik der statistischen Analyse, bereitgestellt durch den CONTIN-Algorithmus, bestimmt. Der Fehler aller Verfahren war ±5% Helizität.
7.1.3 ERGEBNISSE
Der Grad von Helizität (%) der freien, ungebundenen Peptid (frei), der Peptid-SUV-Komplexe (SUVs), der Peptid-Mizell-Komplexe (mics) und der Peptid-TFE-Lösung (TFE) sind in Tabelle X, Abschnitt 8.3, nachstehend berichtet. Der Grad von Helizität von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) als Funktion der Konzentration (frei und gebunden an Lipide) wird in Tabelle VII bereitgestellt. TABELLE VII % HELIZITÄT VON PEPTID 4 (SEQ ID NO: 4) ALS FUNKTION DER KONZENTRATION

Konzentration (μM) Frei % Helizität gebunden (Mizellen) TFE

0,15 42 65 -

0,40 58 68 -

2,0 63 - -

5,0 80 95 -

50,0 - - 94
Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) enthält signifikante α-helikale Struktur (80% Helizität) in Puffer bei einer Konzentration von 5 μM. Wenn auch der Grad von Helizität mit abnehmender Peptidkonzentration abnimmt, wird signifikante Helizität (42%) sogar bei Konzentrationen so niedrig wie 0,15 μM aufrecht erhalten. Überdies ist die α-helikale Struktur über einen Temperaturbereich von 5–45°C vollständig stabil (Werte nicht angegeben).
Die Helizität von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) erhöht sich in Gegenwart von sowohl SUVs (97% Helizität) als auch Mizellen (95% Helizität) und auch in Gegenwart von TFE (94% Helizität), welches ein Lösungsmittel ist, das, aufgrund dessen, eine signifikant niedrigere Dielektrizitätskonstante (ε = 26,7) als Wasser (ε = 78,4) zu haben, α-Helices und Intrapeptid-Wasserstoffbindungen bei Konzentrationen zwischen 5–90% (Vol./Vol.) stabilisiert.
Bezugnehmend auf Tabelle X, Abschnitt 8.3, nachstehend, kann gesehen werden, daß diejenigen Peptid, welche einen hohen Grad von LCAT-Aktivierung (≥ 38%) zeigen, im allgemeinen signifikante α-helikale Struktur in Gegenwart von Lipiden besitzen (≥ 60% helikale Struktur in dem Fall von unblockierten Peptiden, enthaltend 22 oder mehr Aminosäuren, oder blockierten Peptiden, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren; ≥ 40% helikale Struktur in dem Fall von unblockierten Peptiden, enthaltend 18 oder weniger Aminosäuren), wohingegen Peptid, welche wenig oder keine LCAT-Aktivierung zeigen, wenig α-helikale Struktur besitzen. Jedoch zeigen in einigen Fällen Peptid, welche signifikante α-helikale Struktur enthalten, in Gegenwart von Lipiden keine signifikante LCAT-Aktivierung. Folglich wird die Fähigkeit der KernPeptid der Erfindung, eine α-helikale Struktur in Gegenwart von Lipiden anzunehmen, als kritisches Merkmal der KernPeptid der Erfindung angesehen, da die Fähigkeit, eine α-Helix in Gegenwart von Lipiden zu bilden, eine Vorbedingung für LCAT-Aktivierung zu sein scheint.
7.2 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Die Lipidbindungseigenschaften der Peptid, synthetisiert vorstehend in Abschnitt 6, wurden durch Fluoreszenzmessungen mit markierten Peptiden, in dem vorliegenden Fall Tryptophan (Trp oder W) oder Naphthylalanin (Nal), getestet. Die Fluoreszenzspektren wurden auf einem Fluoromax von Spex (Jobin-Yvon), ausgestattet mit einer Xenon-Lampe von 150 W, zwei Monochromatoren (Anregung und Emission), einem Photomultiplier R-928 für den Nachweis, empfindlich in Rot bis zu 850 nm, und einem thermoelektrischen magnetischen gerührten Küvettenhalter, aufgezeichnet. Quarz-Suprasil-Küvetten wurden für Messungen in dem mikromolaren Konzentrationsbereich verwendet. Eine Vorrichtung mit variablen Spalten (von 0,4 bis 5 nm) erlaubt Modulation der einfallenden und emittierten Intensitäten entsprechend der verwendeten Konzentration von Peptid. Die berichteten Werte sind in allgemeinen der Mittelwert von zwischen 2 bis 4 Spektren. Die Peptidkonzentration wird durch Absorptionsspektrometrie auf einem Philips PU 8800 unter Verwendung der Absorptionsbande des Trp (ε_280nm = 5550 M^–1cm^–1 in Tris-Puffer) oder des Nal (ε_224nn = 92770 M^–1cm^–1 in Methanol) bestimmt.
Fluoreszenzspektren der Peptid wurden zwischen 290 nm und 450 nm in Tris-HCl Puffer (20 μM, pH = 7,5) in Gegenwart und Abwesenheit von lipidischen Vesikeln aufgezeichnet. Die kleinen unilamellaren Vesikel wurden nach Rehydration in Puffer der lyophilisierten Phospholipide, Dispergierung und Spitzen-Ultraschallbehandlung unter einem N₂-Strom erzeugt. Die verwendeten Lipide waren entweder Ei-PC/Chol. (20:1) oder POPC/Chol. (20:1). Die Spektren wurden bei einer Peptidkonzentration von 2 μM und bei einer Temperatur von 37°C aufgezeichnet. Der Fluoreszenz-Referenzstandard in dem Fall von Trp war N-Acetyltryptophanylamid (NATA).
Lipidbindungs-Untersuchungen wurden durch progressive Zugabe von lipidischem Vesikel zu dem Peptid in Lösung bei 2 μM (Spalte: 5 nm in der Anregung und 1,5 nm in der Emission) ausgeführt. Verdünnungsauswirkungen wurden für die Bestimmung der Fluoreszenzintensität berücksichtigt. Die Lipidkonzentrationen wurden von 10 bis 600 μM variiert und das Molverhältnis von Lipid zu Peptid (Ri) wurde von 5 bis 300 variiert. Die Wellenlänge der Anregung wurde für sowohl Trp als auch Nal auf 280 nm eingestellt.
7.2.1 FLUORESZENZSPEKTRALANALYSE
Die Werte wurden direkt aufgezeichnet und mit einem IBM-PC, verknüpft mit dem Spektrofluorimeter durch die DM3000F-Software von Spex, behandelt. Die Spektren wurden durch Subtraktion des Lösungsmittelbeitrages und durch Anwendung eines durch den Hersteller angegebenen Koeffizienten, der die Veränderung der Photomultiplierreaktion im Verhältnis zu der Wellenlänge berücksichtigt, korrigiert.
Die Fluoreszenzspektren der Peptid wurden durch die Wellenlänge an ihrem Maximum der Fluoreszenzemission und durch ihre quantenmäßige Ausbeute, verglichen mit NATA, in dem Fall von Peptiden, markiert mit einem Tryptophan, gekennzeichnet. Der Vorgang der Bindung an Lipide wurde durch Berechnen der Verschiebung der Wellenlänge an dem Maximum der Fluoreszenzemission (λ_max) und die Veränderung der relativen Fluoreszenzintensität der Emission im Verhältnis zu der Lipidkonzentration analysiert. Die relative Fluoreszenzintensität ist als das folgende Verhältnis: (I – I₀)_λmax/I_0λmax definiert. I und I₀ werden beide bei der (λ_max) entsprechend dem anfänglichen freien Zustand des Peptids, d. h. ohne Lipide, gemessen. I ist die Intensität bei einem definierten Lipid-zu-Peptid-Verhältnis und I₀ ist der gleiche Parameter, gemessen in Abwesenheit von Lipiden. Die Abwesenheit dieser Veränderungen ist relevant für die Abwesenheit von Wechselwirkungen der Peptid mit den Lipiden.
7.2.2 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Die Lipidbindungseigenschaften von Peptid 15 (SEQ ID NO: 15) (welches Peptid 4 ist, das einen Trp-Rest an Position 10 enthält) sind in Tabelle VIII dargestellt. TABELLE VIII BINDUNGSEIGENSCHAFTEN VON PEPTID 15 (SEQ ID NO: 15) ZU LIPIDISCHEN VESIKELN, WIE DURCH FLUORESZENZ GEMESSEN

Lipid:Peptid-Molverhältnis (Ri) I/I₀ λ_max (nm)

0 0 332

5 10,8 323

10 13,2 323,5

30 17,5 323

100 26,4 323

200 43,5 323
Das Maximum der Tryptophan-Emission (λ_max) bei 332 nm zeigt an, daß in dem Puffer bei einer Konzentration von 2 μM das Peptid etwas selbstassoziiert ist. Das Peptid bindet an die lipischen Vesikel (EPC/Chol 5%) mit einer sehr hohen Affinität, wie durch das Verbergen des Trp (die Wellenlänge des Maximums der Trp-Emission verschiebt sich von 332 nm herab zu 323 nm) und die hohe Exaltation der Fluoreszenzintensität (siehe Tabelle VIII) demonstriert wird. Das maximale Verbergen des Tryptophanrests wird für ein sehr niedriges Lipid-zu-Peptid-Molverhältnis, niedriger als 5, erhalten.
Andere Peptid, welche einen hohen Grad von Helizität in Gegenwart von Lipiden zeigten (≥ 60% für unblockierte Peptid mit ≥ 22 Aminosäuren oder blockierte Peptid mit ≥ 18 Aminosäuren; ≥ 40% für unblockierte Peptid mit ≤ 18 Aminosäuren), wie durch Circulardichroismus, wie vorstehend in Abschnitt 7.1 offenbart, gemessen, demonstrierten ebenfalls gute Lipidbindung. Natürlich wurden unter all den Peptiden, ausgewählt durch das Circulardichroismus-Screening, nur diejenigen, die durch Fluoreszenz verfolgt werden konnten, für ihre Lipidbindungseigenschaften getestet.
7.3 KERNMAGNETISCHE RESONANZ (NMR)
Dieses Beispiel beschreibt ein NMR-Verfahren zum Analysieren der Struktur der KernPeptid der Erfindung.
7.3.1 NMR-PROBENHERSTELLUNG
Proben wurden durch Lösen von 5 mg Peptid in 90% H₂O/10% D₂O, enthaltend Spurenmengen von 2,2-Dimethyl-2-sila-5-pentansulfonat (DSS) als innere Referenz der chemischen Verschiebung, hergestellt. Einige der Proben enthielten Trifluorethanol (TFE) (ausgedrückt als % Vol.). Das Gesamtprobenvolumen betrug 500 μl und die Konzentration von Peptid betrug ungefähr 5 mM.
7.3.2 NMR-SPEKTROSKOPIE
¹H-NMR-Spektren wurden bei 500 MHz unter Verwendung eines Spektrometers Bruker DRX500, ausgestattet mit einer B-VT2000-Temperaturkontrolleinheit, erfaßt. Ein- und zweidimensionale Experimente wurden unter Verwendung von Standardpulssequenzen aufgezeichnet. (Two Dimensional NMR Spectroscopy (Zweidimensionale NMR-Spektroskopie), Hrsg. W. R. Croasmun und RMK Carlson, 1994, VCH Publishers, New York, USA). Wasserunterdrückung wurde mit Vorsättigung bei niedriger Energie für 2 s erreicht. Zweidimensionale Experimente wurden in dem phasenempfindlichen Modus unter Verwendung von zeitproportionaler Phaseninkrementierung (TPPI) und einer Spektralbreite von 6000 Hz in beiden Dimensionen ausgeführt. Typischerweise wurden 40 Scans für 400-t_i-Inkremente mit 2048 Datenpunkten zusammengefügt. Die Daten wurden unter Verwendung von FELIX95-Software (Molekulare Simulationen) auf einem INDIGO2-Arbeitsplatz (Silicon Graphics) verarbeitet. Die Daten wurden mit Nullen aufgefüllt, um eine 2K × 2K Datenmatrix zu ergeben, und durch eine 45° verschobene quadratische Sinusglockenfunktion apodisiert.
7.3.3 NMR-ZUORDNUNG
Vollständige Protonenresonanz-Zuordnungen wurden durch Anwenden der Technik der aufeinanderfolgenden Zuordnung unter Verwendung von DQFCOSY-, TOCSY- und NOESY-Spektren wie in der Literatur beschrieben erhalten (Wüthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids (NMR von Proteinen und Nucleinsäuren), 1986, John Wiley & Sons, New York, USA). Sekundäre chemische Verschiebungen wurden für HN- und Hα-Protonen durch Subtrahieren der tabellarisch zusammengestellten chemischen Verschiebungen des statistischen Knäuels (Wishart und Sykes, 1994, Method. Enz. 239: 363–392) von den entsprechenden experimentellen Werten berechnet.
7.3.4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Allgemeine Betrachtung. Amphipathische helikale Peptid neigen dazu, in wässerigen Lösungen bei den für NMR-Spektroskopie notwendigen hohen Konzentrationen zu aggregieren, was es schwierig macht, Spektren mit hoher Auflösung zu erhalten. Zum Beispiel zeigen NMR-Spektren des beispielhaften Kernpeptids 4 (SEQ ID NO: 4) in Wasser sehr breite Linien. So können die Resonanzen von jedem Aminosäurerest nicht aufgelöst werden. Zugabe von TFE zu der Probe verbessert die Auflösung der Spektren. Von TFE ist bekannt, daß es Peptid solubilisiert, und außerdem stabilisiert es helikale Konformationen von Peptiden mit helikaler Neigung. Die Ergebnisse aus der NMR-Spektroskopie werden für Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) als repräsentatives Beispiel demonstriert. Das Consensus-22-mer von Segrest (SEQ ID NO: 75) wurde zum Vergleich untersucht.
Sekundäre chemische Verschiebungen. Chemische Verschiebungen der Protonen von Aminosäuren hängen sowohl von dem Typ des Rests als auch von der lokalen sekundären Struktur innerhalb eines Peptids oder Proteins ab (Szlagyi, 1995, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 27: 325–443). Daher ist Identifizierung von regulärer sekundärer Struktur durch Vergleichen experimenteller Verschiebungen mit tabellarisch zusammengestellten Werten für die Konformation des statistischen Knäuels möglich.
Die Bildung einer α-Helix resultiert typischerweise in einer stromaufwärts-(negativen)-Verschiebung für die Hα-Resonanz. Die Beobachtung einer stromaufwärts-Hα-Verschiebung für verschiedene aufeinanderfolgende Reste wird allgemein als Beweis einer helikalen Struktur genommen. Die sekundären Hα-Verschiebungen für Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) in 25% TFE bei 295 K zeigen eine signifikante negative Verschiebung für die Reste 4 bis 19 (9A), die eine in hohem Maße helikale Konformation demonstrieren. Kleine Unterschiede werden in den chemischen Verschiebungen von Hα des Consensus-22-mer (SEQ ID NO: 75), verglichen mit Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), beobachtet.
Die chemischen Verschiebungen der Amidwasserstoffe von Aminosäureresten, die sich in Regionen der α-Helix befinden, sind im Hinblick auf die für das statistische Knäuel beobachteten chemischen Verschiebungen ebenfalls stromaufwärts verschoben. Außerdem kann eine Periodizität der HN-Verschiebungen beobachtet werden, und sie reflektiert die Periode der helikalen Drehungen. Die Amplitude der Veränderung der Verschiebung entlang der Sequenz steht in Zusammenhang mit der Amphipathie eines helikalen Peptids. Ein höheres hydrophobes Moment führt zu einer starker ausgeprägten Oszillation (Zhou et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4320–4326). Die sekundären Verschiebungen von HN für Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) in 25% TFE bei 295 K zeigen ein oszillatorisches Verhalten in Übereinstimmung mit der amphipathischen Natur der Helix (9B). Das Muster der chemischen Verschiebung von Amid des Consensus-22-mer-Peptids (SEQ ID NO: 75) unterscheidet sich signifikant von dem von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4). Insbesondere resultiert die Ersetzung der Reste 5, 9 und 13 mit Leu (L) in chemischen Verschiebungen mit einer stärker ausgeprägten Periodizität in dem Fall von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4). Die Wirkung erstreckt sich sogar auf Rest 17 und in einem geringeren Ausmaß auf Rest 21. Aus den NMR-Daten kann die Existenz von 5–6 Drehungen in der Sequenz wahrgenommen werden. So beeinflußt die Ersetzung von drei Aminosäuren die Faltung des Peptids entlang der gesamten Sequenz. Das NMR-Muster reflektiert klar die starker amphipathische Natur von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), verglichen mit dem Consensus-22-mer-Peptid von Segrest (SEQ ID NO: 75).
Die sekundäre Verschiebung eines Amidprotons wird durch die Länge der Wasserstoffbindung zu dem Carbonylsauerstoff eine Drehung entfernt von der Helix beeinflußt. Daher reflektiert die Periodizität von beobachteten Werten der chemischen Verschiebung verschiedene Längen der Wasserstoffbindung. Diese Differenz ist mit einer insgesamt gekrümmten helikalen Gestalt des Helix-Grundgerüsts verbunden. Die hydrophoben Reste befinden sich auf der konkaven Seite. Die sekundären Verschiebungen von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) zeigen eine gekrümmte α-helikale Konformation an.
7.3.5 PEPTID, DIE INTERNE GLYCINE ENTHALTEN, SIND IN GEGENWART VON TFE HELIKAL
Die dreidimensionale Struktur von Peptid 8 (SEQ ID NO: 8) wurde in Gegenwart von TFE unter Verwendung der aus den Nuclear Qverhauser Effects (Kern-Qverhauser-Effekte) (NOEs) abgeleiteten Zwänge des Proton-Proton-Abstands bestimmt. Insbesondere ist das Vorhandensein von NOE's des mittleren Bereichs (dαN₃, dαβ₃, daN₄) entlang der gesamten Sequenz mit einer insgesamt α-helikalen Struktur vereinbar. Eine Familie von Konformeren wurde aus dem NMR-Datensatz erzeugt und die Strukturen überlagern sich von Rest 4 bis 19 gut mit einer RMSD des Grundgerüsts < 0,8 Å. Eine Stereo-Banddarstellung der durchschnittlichen Struktur zusammen mit der Spur des Grundgerüsts der 15 Konformere mit der niedrigsten Energie bestätigen eine gekrümmte helikale Gesalt. In einer ungefähren Abschätzung resultiert die Biegung in einem 20°-Winkel zwischen der N-terminalen und der C-terminalen Hälfte des Peptids. Die hydrophoben Reste werden hauptsächlich auf der konkaven Seite gefunden, mit der Ausnahme von Leu-5. Ein gut definierter hydrophober Cluster befindet sich in der Mitte um Phe-6 einschließlich Leu-3, Leu-9 und Leu-10 herum. Wenn auch die helikalen Drehungen um Rest 3 an dem N- Terminus beginnen, zeigt die Existenz vieler NOE's bis zum Rest 22 an, daß sich die Helix in Richtung zu dem Ende des C-Terminus erweitert.
8. BEISPIEL: LCAT-AKTIVIERUNGS-ASSAY
Die Peptid, synthetisiert wie vorstehend in Abschnitt 6 beschrieben, wurden in vitro für ihre Fähigkeit analysiert, LCAT zu aktivieren. In dem LCAT-Assay werden Substrat-Vesikel (kleine unilamellare Vesikel oder „SUVs"), bestehend aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) oder 1-Palmitoyl-2-oleyl-phosphatidylcholin (POPC) und radiomarkiertem Cholesterin, mit äquivalenten Massen entweder von Peptid oder von ApoA-I (isoliert aus humanem Plasma) vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von LCAT (gereinigt aus humanem Plasma) initiiert. Natives ApoA-I, welches als positive Kontrolle verwendet wurde, stellt 100% Aktivierungsaktivität dar. „Spezifische Aktivität" (d. h. Einheiten von Aktivität (LCAT-Aktivierung)/Einheit der Masse) der Peptid kann als die Konzentration von Peptid berechnet werden, die maximale LCAT-Aktivierung erreicht. Zum Beispiel kann eine Serie von Konzentrationen des Peptids (z. B. eine begrenzende Verdünnung) einem Assay unterzogen werden, um die „spezifische Aktivität" für das Peptid zu bestimmen – die Konzentration, welche maximale LCAT-Aktivierung (d. h. den Prozentgehalt der Umwandlung von Cholesterin zu Cholesterinester) zu einem speziellen Zeitpunkt in dem Assay (z. B. 1 h) erreicht. Wenn der Prozentgehalt der Umwandlung von Cholesterin zu z. B. 1 h gegen die Konzentration von verwendetem Peptid aufgetragen wird, kann die „spezifische Aktivität" als die Konzentration von Peptid identifiziert werden, die ein Plateau auf der aufgetragenen Kurve erreicht.
8.1 HERSTELLUNG VON SUBSTRAT-VESIKELN
Die Vesikel, die in dem LCAT-Assay verwendet werden, sind SUVs, bestehend aus Ei-Phosphatidylcholin (EPC) oder 1-Palmitoyl-2-oleylphosphatidylcholin (POPC) und Cholesterin mit einem Molverhältnis von 20:1. Um eine Vesikelvorratslösung, ausreichend für 40 Assays, herzustellen, werden 7,7 mg EPC (oder 7,6 mg POPC; 10 μmol), 78 μg (0,2 μmol) 4-¹⁴C-Cholesterin, 116 μg Cholesterin (0,3 μmol) in 5 ml Xylol gelöst und lyophilisiert. Danach werden 4 ml Assay-Puffer zu dem trockenen Pulver hinzugegeben und unter Stickstoffatmosphäre bei 4°C ultraschallbehandelt. Ultraschallbehandlungsbedingungen: Beschallungsvorrichtung Branson 250, 10 mm Spitze, 6 × 5 Minuten; Assay-Puffer: 10 mM Tris, 0,14 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4). Das ultraschallbehandelte Gemisch wird 6 Mal für 5 Minuten, jedes Mal bei 14000 U/min (16000 × g), zentrifugiert, um Titanteilchen zu entfernen. Die resultierende klare Lösung wird für den Enzymassay verwendet.
8.2 REINIGUNG VON LCAT
Für die LCAT-Reinigung wird Dextransulfat/Mg²⁺-Behandlung von humanem Plasma verwendet, um Lipoprotein-defizientes Serum (LPDS) zu erhalten, welches aufeinanderfolgend auf Phenylsepharose, Affigel-Blue, Concanavalin-A-Sepharose und anti-ApoA-I-Affinitätschromatographie chromatographiert wird, wie für eine repräsentative Reinigung nachstehend in Tabelle IX zusammengefaßt ist:
8.2.1 HERSTELLUNG VON LPDS
Um LPDS herzustellen, werden 500 ml Plasma zu 50 ml Lösung von Dextransulfat (MW = 500000) gegeben. Man rühre 20 Minuten. Man zentrifugiere für 30 Minuten bei 3000 U/min (16000 × g) bei 4°C. Man verwende den Überstand (LPDS) für weitere Reinigung (ca. 500 ml).
8.2.2 PHENYLSEPHAROSE-CHROMATOGRAPHIE
Die folgenden Materialien und Bedingungen wurden für die Phenylsepharose-Chromatographie verwendet.
Feste Phase: Phenylsepharose fast flow, hohe Subst. Handelsklasse, Pharmacia
Säule: XK26/40, Gelbetthöhe: 33 cm, Vol. = ca. 175 ml
Durchflußgeschwindigkeiten: 200 ml/h (Probe)
Waschen: 200 ml/h (Puffer)
Elution: 80 ml/h (destilliertes Wasser)
Puffer: 10 mM Tris, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 7,4, 0,01% Natriumazid.
Man äquilibriere die Säule in Tris-Puffer, gebe 29 g NaCl zu 500 ml LPDS und bringe auf die Säule auf. Man wasche mit verschiedenen Volumina von Tris-Puffer, bis die Absorption bei 280 nm Wellenlänge ungefähr an der Basislinie ist, dann starte man die Elution mit destilliertem Wasser. Die Fraktionen, die Protein enthalten, werden zusammengefaßt (Pool-Größe: 180 ml) und für Affigel-Blue-Chromatographie verwendet.
8.2.3 AFFIGEL-BLUE-CHROMATOGRAPHIE
Der Phenylsepharose-Pool wird über Nacht bei 4°C gegen 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,01% Natriumazid dialysiert. Das Pool-Volumen wird durch Ultrafiltration (Amicon YM30) auf 50–60 ml verringert und auf eine Affigel-Blue-Säule aufgegeben.
Feste Phase: Affigel-Blue, Biorad, 153-7301-Säule, XK26/20, Gelbetthöhe: ca. 13 cm; Säulenvolumen: ungefähr 70 ml.
Durchflußgeschwindigkeiten: Beladung: 15 ml/h
Waschen: 50 ml/h
Man äquilibriere die Säule in Tris-Puffer. Man bringe den Phenylsepharose-Pool auf die Säule auf. Man starte parallel das Sammeln der Fraktionen.
Man wasche mit Tris-Puffer. Die zusammengefaßten Fraktionen (170 ml) wurden für ConA-Chromatographie verwendet.
8.2.4 CONA-CHROMATOGRAPHIE
Der Affigel-Blue-Pool wurde über Amicon (YM30) auf 30–40 ml verringert und gegen ConA-Ausgangspuffer (1 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM MgCl₂, 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl₂, 0,01% Natriumazid) über Nacht bei 4°C dialysiert.
Feste Phase: ConA-Sepharose (Pharmacia)
Säule: XK26/20, Gelbetthöhe: 14 cm (75 ml)
Durchflußgeschwindigkeiten: Beladung 40 ml/h
Waschen (mit Ausgangspuffer): 90 ml/h
Elution: 50 ml/h, 0,2 M Methyl-α-D-mannosid
in 1 mM Tris, pH 7,4.
Die Protein-Fraktionen der Mannosid-Elutionen wurden gesammelt (110 ml), und das Volumen wurde durch Ultrafiltration (YM30) auf 44 ml verringert. Der ConA-Pool wurde in 2-ml-Aliquots geteilt, welche bei –20°C aufbewahrt werden.
8.2.5 ANTI-APOA-I-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE
Anti-ApoA-I-Affinitätschromatographie wurde auf Affigel-Hz-Material (Biorad) durchgeführt, auf welches die anti-ApoA-I-Abs kovalent gekuppelt wurden.
Säule: XK16/20, Vol. = 16 ml. Die Säule wurde mit PBS pH 7,4 äquilibriert. Zwei ml von dem ConA-Pool wurden für 2 Stunden gegen PBS dialysiert, bevor sie auf die Säule aufgegeben wurden.
Durchflußgeschwindigkeiten: Beladung: 15 ml/Stunde, Waschen (PBS) 40 ml/Stunde.
Die zusammengefaßten Proteinfraktionen (Vol. = 14 ml) werden für LCAT-Assays verwendet.
Die Säule wird mit 0,1 M Citrat-Puffer (pH 4,5) regeneriert, um gebundenes A-I (100 ml) zu eluieren, und unmittelbar nach dieser Prozedur mit PBS reäquilibriert.
8.3 ERGEBNISSE
Die Ergebnisse des LCAT-Aktivierungs-Assays sind nachstehend in Tabelle X dargestellt. TABELLE X

^1/ Segrest's Consensus-22-mer-Peptid (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95–105).
^2/ [A¹³]-Consensus-22-mer-Peptid (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95–105).
^3/ [R¹³]-Consensus-22-mer-Peptid (Anantharamaiah et al., 1990, Arteriosclerosis 10(1): 95–105).
^4/ ID-3-Peptid (Labeur et al., 1997, Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 17(3): 580–588).
^5/ Ac-18AMOD-C(O)NH₂-Peptid (Epand et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(19): 9389–9396).
^6/ Ac-18AM4-C(O)NH₂-Peptid (Brasseur, 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 1–7).
^7/ 18L-Peptid (Segrest et al., 1990, Proteins: Structure, Function and Genetics 8: 103–117).
^8/ 18A-Peptid (Anantharamaiah et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(18): 10248–10255).
^9/ 18AM4-Peptid (Rosseneu et al., WO93/25581 ; Corijn et al., 1993, Biochim. Biophys. Acta 1170: 8–16).
^10/ [Glu^1,8; Leu^5,11,17]18A-Peptid (Epand et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(19): 9389–9396).
^11/ Ac-18AM3-C(O)NH₂ (Rosseneu et al., WO93/25581 ).
^12/ Ac-18AM2-C(O)NH₂ (Rosseneu et al., WO93/25581 ).
^13/ Ac-18AM1-C(O)NH₂ (Rosseneu et al., WO93/25581 ).

In Tabelle X zeigt * Peptid an, die N-terminal acetyliert und C-terminal amidiert sind; zeigt ' Peptid an, die N-terminal dansyliert sind; zeigt sp Peptid an, die unter den experimentellen Bedingungen Löslichkeitsprobleme zeigten; ist X Aib; ist Z Nal; ist O Orn; bezeichnet He (%) Prozent Helizität; bezeichnet mics Mizellen; und zeigt - deletierte Aminosäuren an.
9. BEISPIEL: PHARMAKOKINETIK DER APOA-I-AGONISTEN
Die folgenden Experimente demonstrieren, daß die ApoA-I-Agonisten im Blutkreislauf stabil sind und mit der HDL-Komponente vom Plasma assoziieren.
Insbesondere assoziierte das radioaktiv markierte Peptid 4, injiziert intraperitoneal in Mäuse, mit der HDL-Komponente und blieb für mindestens 6 Stunden stabil. Wenn zu humanem Plasma (ex vivo) hinzugegeben, assoziierte Peptid 4 ebenfalls mit der HDL-Komponente.
9.1. SYNTHESE VON RADIOMARKIERTEN PEPTIDEN
Die radiomarkierten Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) und 8 (SEQ ID NO: 8) wurden durch Kuppeln von ¹⁴C-markiertem Fmoc-Pro als der N-terminalen Aminosäure synthetisiert.
L-[U-¹⁴C]-Prolin, spezifische Aktivität 9,25 GBq/mmol, wurde für die Synthese von markiertem Fmoc-L-Prolin verwendet. Die Synthese wurde entsprechend Lapatsanis, Synthesis, 1983, 671–173 ausgeführt. Kurz gesagt wurden 250 μM (29,6 mg) von unmarkiertem L-Prolin in 225 μl einer 9%igen Na₂CO₃-Lösung gelöst und zu einer Lösung (9% Na₂CO₃) von mit 9,25 MBq (250 μM) ¹⁴C-markiertem L-Prolin hinzugegeben. Die Flüssigkeit wurde auf 0°C abgekühlt, mit 600 μM (202 mg) 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonat (Fmoc-OSu) in 0,75 ml DMF gemischt und bei Raumtemperatur für 4 h geschüttelt. Danach wurde das Gemisch mit Diethylether (2 × 5 ml) und Chloroform (1 × 5 ml) extrahiert, die verbliebene wässerige Phase wurde mit 30%iger HCl angesäuert und mit Chloroform (5 × 8 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, abfiltriert und das Volumen wurde unter Stickstoffstrom auf 5 ml verringert. Die Reinheit wurde durch TLC (CHCl₃:MeOH:Hac, 9:1:0,1 Vol./Vol./Vol., stationäre Phase HPTLC Silicagel 60, Merck, Deutschland) abgeschätzt und zeigte einen einzelnen Peak (UV-Nachweis, radiochemische Reinheit: Linear Analyzer, Berthold, Deutschland); Reaktionsausbeute: 90% (bestimmt durch LSC).
Die Chloroform-Lösung, enthaltend ¹⁴C-Fmoc-Prolin, wurde direkt für Peptidsynthese verwendet. Ein Peptidharz, enthaltend die Aminosäuren 2–22, synthetisiert automatisch wie in Abschnitt 6 beschrieben, wurde für die Synthese verwendet. Die Sequenz des Peptids wurde durch Edman-Abbau bestimmt. Die Kupplung wurde wie in Abschnitt 6.1 beschrieben (manuelle Kupplung von Fmoc-Nal) durchgeführt, außer daß HATU (O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat) anstatt TBTU verwendet wurde. Eine zweite Kupplung mit unmarkiertem Fmoc-L-Pro wurde manuell wie in Abschnitt 6.1 beschrieben ausgeführt. Peptidspaltung und -entschützung waren wie in Abschnitt 6.4 beschrieben. Die spezifischen Aktivitäten der markierten Peptid waren wie folgt:
Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) = 3,9 × 10⁵ dpm/mg
Peptid 8 (SEQ ID NO: 8) = 1,0 × 10⁵ dpm/mg
9.2. PHARMAKOKINETIK IN MÄUSEN

In jedem Experiment wurden 2,5 mg/kg radiomarkiertes Peptid intraperitoneal in Mäuse injiziert, welche mit normalem Mäusefutter oder der atherogenen Thomas-Harcroft-modifizierten Kost (resultierend in in starkem Maße erhöhtem VLDL- und IDL-Cholesterin) gefüttert wurden. Blutproben wurden in mehrfachen Zeitintervallen zur Bewertung der Radioaktivität im Plasma genommen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle XI zusammengefaßt. TABELLE XI Halbwertszeit von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) in Mäusen

Spezies	Zubereitung	Halbwertszeit (Stunden)
C57BL/6 (normale Kost)	Peptid 4/PBS	5,72¹
C57B1/6 (Kost mit hohem Fettgehalt)	Peptid 4/PBS	5,98²
	Peptid 4/POPC-Komplex³	6,39⁴
ApoE^–6	Peptid 4/PBS	14,2⁵

¹ Die maximale Serumkonzentration, die erreicht wurde, betrug 25,7% injizierte cpm 1,9 Stunden nach der Injektion. r² = 0,960.
² Die maximale Serumkonzentration, die erreicht wurde, betrug 20,3% injizierte cpm 2,98 Stunden nach der Injektion. r² = 0,973.
³ Komplexe, bestehend aus Phospholipid (POPC) und Peptid 4, wurden unter Verwendung des Cholat-Dialyse-Verfahrens hergestellt.
⁴ Die maximale Serumkonzentration, die erreicht wurde, betrug 39,4% injizierte cpm 4,2 Stunden nach der Injektion. r² = 0,893.
⁵ Die maximale Serumkonzentration, die erreicht wurde, betrug 17,4% injizierte cpm 1,46 Stunden nach der Injektion. r² = 0,973.
⁶ ApoE Knockout.

9.3 STABILITÄT IN HUMANEM SERUM
9.3.1 EXPERIMENTELLE VERFAHREN
100 μg von ¹⁴C-markiertem Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), hergestellt wie vorstehend in Abschnitt 9.1 beschrieben, wurden mit 2 ml frischem humanen Plasma (bei 37°C) gemischt und entweder unmittelbar (Kontrollprobe) oder nach 8 Tagen der Inkubation bei 37°C (Testprobe) delipidiert. Die Delipidierung wurde durch Extrahieren der Lipide mit einem gleichen Volumen von 2:1 (Vol./Vol.) Chloroform:Methanol ausgeführt.
Die Proben wurden auf eine Umkehrphasen-C₁₈-HPLC-Säule aufgegeben und mit einem linearen Gradienten (25–58% über 33 min) von Acetonitril (enthaltend 0,1% TFA) eluiert. Die Elutionsprofile wurden durch Extinktion (220 nm) und Radioaktivität verfolgt.
9.3.2 ERGEBNISSE
Die Kontrollprobe eluierte als einzelner Peak mit einer Retentionszeit von ungefähr 30 min. Die gesamte Radioaktivität eluierte in diesem Peak.
Die Testprobe eluierte als zwei Peaks: einer mit einer Retentionszeit von etwa 3 min, der andere mit einer Retentionszeit von etwa 30 min. Der 3-min-Peak (abgebautes Peptid) war für ungefähr 15% der gesamten auf die Säule aufgegebenen Radioaktivität verantwortlich. Der Rest der Radioaktivität eluierte mit dem 30-min-Peak (intaktes Peptid), was anzeigte, daß Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) extrem stabil gegenüber humanem Serum ist – mehr als 80% des Peptids 4 blieben intakt, sogar nach einer 8-Tage-Inkubation in humanem Serum.
9.4. ERZEUGUNG VON PRE-B-ÄHNLICHEN TEILCHEN
9.4.1 EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Humanes HDL wurde durch KBr-Dichte-Ultrazentrifugation mit der Dichte d = 1,21 g/ml, um die obere Fraktion zu erhalten, und nachfolgende Superose-6-Gelfiltrationschromatographie, um HDL von anderen Lipoproteinen zu trennen, isoliert. Isoliertes HDL wurde mit physiologischer Kochsalzlösung, basierend auf dem Proteingehalt, bestimmt durch Bradford-Protein-Assay, auf eine finale Konzentration von 1,0 mg/ml eingestellt. Ein Aliquot von 300 μl wurde aus der isolierten HDL-Zubereitung entnommen und mit 100 μl ¹⁴C-markiertem Peptid 4 (0,2–1,0 μg/μl) für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Fünf gesonderte Inkubationen wurden analysiert, die eine Blindprobe, enthaltend 100 μl physiologische Kochsalzlösung, und vier Verdünnungen von ¹⁴C-markiertem Peptid 4: (i) 0,20 μg/μl Peptid:HDL Verhältnis = 1:15; (ii) 0,30 μg/μl Peptid:HDL Verhältnis = 1:10; (iii) 0,60 μg/μl Peptid:HDL Verhältnis = 1:5; und (iv) 1,00 μg/μl Peptid:HDL Verhältnis = 1:3 einschlossen. Im Anschluß an die zwei Stunden Inkubation wurde ein 200-μl-Aliquot der Probe (Gesamtvolumen = 400 μl) auf eine Superose-6-Gelfiltrationssäule für Lipoproteintrennung und -analyse aufgegeben, und 100 μl wurden verwendet, um die aufgegebene Gesamtradioaktivität zu bestimmen. Die Bedingungen für alle FPLC-Chromatographien waren wie nachstehend in Abschnitt 9.4 beschrieben.
9.4.2 ERGEBNISSE
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle XII und den 9A–9F dargestellt.
Aus den in Tabelle XII dargestellten Daten ist offensichtlich, daß nach der Trennung der Lipoproteinteilchen mehr als 90% der Radioaktivität aus der Säule wiedergewonnen wurden. Bei niedriger Konzentration von Peptid (d. h. Peptid-HDL-Massenverhältnis von 1:15) wurde der HDL-Peak in zwei separate Peaks aufgespalten (9A), was darauf hinweist, daß eine Wechselwirkung zwischen dem Peptid und HDL erfolgt ist, welche in gewisser Remodellierung des Lipoproteinteilchens resultierte, aber da kein verdrängter Peak bemerkt wurde, war die Wechselwirkung nicht ausreichend, um natives ApoAI zu verdrängen. Wenn die Konzentration von Peptid erhöht wurde, wurde eine Verdrängung von ApoAI beobachtet, welche mit zunehmender Konzentration von Peptid zunahm (9B–9D). Außerdem zeigten alle chromatographischen Durchlaufe einen dritten Peak, nachgewiesen durch radiometrische Zählung (ausgenommen der eine mit einem Massenverhältnis von 1:10, für den Ergebnisse nicht angegeben sind); der im Einklang mit dem Elutionsvolumen von freiem Peptid ist (9E).
Um die Auswirkung der Peptidkonzentration auf die Wechselwirkung von ¹⁴C-markiertem Peptid 4 und HDL weiter zu analysieren, wurde eine Differenzdarstellung aus den vier chromatographischen Durchlaufen erzeugt (9A–9D) und wird in 9F gezeigt. Die Differenzdarstellung demonstriert die Verschiebung in dem HDL-Peak ebenso wie die erhöhte Verdrängung von ApoAI mit zunehmender Peptidkonzentration. Die Verdrängung von ApoAI resultiert in der Erzeugung von pre-β-ähnlichen Teilchen.
9.5 Assoziation von Peptid 4 mit humanen Lipoproteinen
9.5.1 Experimentelle Verfahren
Die Assoziation von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) mit humanen Lipoprotein-Fraktionen wurde durch Inkubieren von ¹⁴C-markiertem Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) mit jeder Lipoprotein-Klasse (HDL, LDL und VLDL) und einem Gemisch der verschiedenen Lipoprotein-Klassen bestimmt.

HDL, LDL und VLDL wurden durch KBr-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation bei d = 1,21 g/ml isoliert und durch FPLC auf einer Größenausschlußsäule Superose-6B-Säule gereinigt (die Chromatographie wurde mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,7 ml/min und einem durchlaufenden Puffer von 10 mM Tris (pH 8), 115 mM NaCl, 2 mM EDTA und 0,01% NaN₃ ausgeführt). ¹⁴C-markiertes Peptid 4 wurde mit HDL, LDL und VLDL mit einem Peptid:Phospholipid-Verhältnis von 1:5 (Massenverhältnis) für 2 h bei 37°C inkubiert. Die erforderliche Menge von Lipoprotein (die Volumina basierten auf der Menge, die benötigt wurde, um 1000 μg zu ergeben) wurde mit 0,2 ml Peptidvorratslösung (1 mg/ml) gemischt und die Lösung wurde unter Verwendung von 0,9%igem NaCl entsprechend Tabelle XIII bis auf 2,2 ml gebracht. TABELLE XIII HERSTELLUNG VON PEPTID-LIPOPROTEIN-PROBEN

	HDL (ml)	LDL (ml)	VLDL (ml)	0,9% NaCl (ml)	¹⁴C-markiertes Peptid 4 (ml)	insgesamt (ml)
Kontrolle				2,0	0,2	2,2
LP/Peptid	0,4	0,3	0,9	0,4	0,2	2,2
HDL/Peptid	0,4			1,6	0,2	2,2
LDL/Peptid		0,3		1,7	0,2	2,2
VLDL/Peptid			0,9	1,1	0,2	2,2

Nach dem Inkubieren für 2 h bei 37°C wurde ein Aliquot (0,1 ml) für Flüssigkeitsszintillationszählung entnommen, um die Gesamtradioaktivität zu bestimmen, die Dichte des verbliebenen Inkubationsgemisches wurde mit KBr auf 1,21 g/ml eingestellt, und die Proben wurden mit 100000 U/min (300000 g) für 24 Stunden bei 4°C in einem Rotor TLA 100.3 unter Verwendung einer Beckman-Tischultrazentrifuge zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde fraktioniert, indem 0,3-ml-Aliquots vom oberen Teil jeder Probe für insgesamt 5 Fraktionen entnommen wurden, und 0,05 ml von jeder Fraktion wurden für Flüssigkeitsszintillationszählung verwendet. Die oberen zwei Fraktionen enthalten die schwimmenden Lipoproteine, die anderen Fraktionen (3–5) entsprechen Proteinen/Peptiden in Lösung.
9.5.2. ERGEBNISSE

Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle XIV dargestellt. Die Inkubation von ¹⁴C-markiertem Peptid 4 mit den isolierten Lipoprotein-Fraktionen enthüllte eine starke Assoziation mit HDL (88% der gesamten Radioaktivität in den Fraktionen 1 und 2) ebenso wie mit VLDL (85%) und eine wesentlich schwächere Affinität zu LDL (66%). Das Inkubationsgemisch, bestehend aus allen Lipoprotein-Fraktionen und ¹⁴C-markiertem Peptid 4 (LP/Peptid), zeigte, daß 88% des markierten Peptids mit der Lipoprotein-Fraktion assoziiert waren. FPLC-Analyse des LP/Peptid-Inkubationsgemisches demonstrierte, daß nahezu alles von dem ¹⁴C-markierten Peptid 4 mit der HDL-Fraktion assoziiert war, was eine hohe Selektivität für diese Lipoproteinklasse anzeigte. TABELLE XIV ASSOZIATION VON PEPTID 4 (SEQ ID NO: 4) MIT VERSCHIEDENARTIGEN LIPIDEN

Fraktion	Kontrolle	LP/Peptid	HDL/Peptid	LDL/Peptid	VLDL/Peptid
1	650	60250	61510	43740	42920
2	1000	12990	17620	15140	19280
3	6590	3810	2260	11880	3930
4	36550	1510	3130	10860	2600
5	34380	5090	5450	7710	4550
Insgesamt	79170	83650	89970	89330	73280
Insgesamt*	88550	96646	98494	100452	97306
Rückgewinnung (%)	89	87	91	89	75

* vor der Zentrifugation

9.6 PEPTID 4 (SEQ ID NO: 4) BINDET SELEKTIV HDL-LIPIDE IN HUMANEM PLASMA
9.6.1 EXPERIMENTELLES VERFAHREN
Humanes Plasma (2 ml) wurde mit 20, 40, 60, 80 und 100 μg von ¹⁴C-markiertem Peptid Peptid 4 für 2 h bei 37°C inkubiert. Die Lipoproteine wurden durch Einstellen der Dichte auf 1,21 g/ml und Zentrifugation in einem Rotor TLA 100.3 mit 100000 U/min (300000 g) für 36 h bei 4°C getrennt. Die oberen 900 μl (in 300-μl-Fraktionen) wurden für die Analyse genommen. 50 μl von jeder 300-μl-Fraktion wurden für Radioaktivität gezählt und 200 μl von jeder Fraktion wurden durch FPLC (Kombinationssäule Superose 6/Superose 12) analysiert.
9.6.2 ERGEBNISSE

Die Menge von Radioaktivität, die für jede Fraktion wiedergewonnen wird, ist nachstehend in Tabelle XV dargestellt. Der größte Teil der Radioaktivität wurde in den oberen drei Fraktionen wiedergewonnen. Alle Lipoproteinabtrennungsprofile der Plasmaprobe, inkubiert mit ¹⁴C-markiertem Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) (nicht angegeben), zeigen an, daß in jedem Fall fast die gesamte Radioaktivität in der HDL-Fraktion vorhanden ist. So zeigt, obwohl andere Lipoproteine in dem humanen Serum vorhanden sind, Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) in hohem Maße selektive Bindung an HDL. TABELLE XV RADIOAKTIVITÄT, WIEDERGEWONNEN AUS DER INKUBATION VON ¹⁴C-MARKIERTEM PEPTID 4 MIT HUMANEM SERUM

Peptid	Fraktion	Radioaktivität (cpm*)		Rückgewinnung**
(μg)	Nr.	in 50 μl	in 300 μl	(%)
20	1	1407	8442	71,6
	2	405	2430	20,6
	3	152	912	7,7
40	1	2538	15228	70,4
	2	721	4326	20
	3	347	2082	9,6
60	1	4492	26952	75,5
	2	1107	6642	18,6
	3	354	2124	5,9
80	1	4715	28290	60
	2	2251	13506	28,6
	3	851	5346	11,3
100	1	5424	32544	67,5
	2	1708	10248	21,2
	3	907	5442	11,3

* Der Wert für 300 μl wurde durch Multiplizieren des 50-μl-Wertes mit 6 erhalten.
** Basierend auf den anfänglichen Gesamtzählungen, verwendet zum Mischen mit Plasma.

10. BEISPIEL: DIE APOA-I-AGONISTEN FÖRDERN CHOLESTERIN-ABFLUSS
HepG2-Hepatomzellen wurden in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen plattiert und zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Trocknen des Cholesterins, dann Hinzufügen von 1% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), Ultraschallbehandeln der Lösung und Hinzufügen von 0,2 ml Markierungslösung und 1,8 ml Wachstumsmedium zu den Zellen mit ³H-Cholesterin markiert, so daß jede Vertiefung 2 μCi Radioaktivität enthielt. Die Zellen wurden für 24 h mit dem Markierungsmedium inkubiert.
Peptid (oder Protein):DMPC-Komplexe wurden mit einem 1:2-Peptid (oder Protein):DMPC-Verhältnis (Gew.:Gew.) hergestellt. Um die Komplexe herzustellen, wurde Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) oder natives humanes ApoA-I-Protein zu einer DMPC-Lösung in PBS gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert, bis zu welcher Zeit sich die Lösung geklärt hat. Die Peptid- oder Protein-Konzentration in der finalen Lösung betrug etwa 1 mg/ml.
Das Markierungsmedium wurde von den Zellen entfernt und die Zellen wurden vor der Zugabe von Komplexen mit PBS gewaschen. 1,6 ml Wachstumsmedium wurden in jede Vertiefung gegeben, nachfolgend Peptid (oder Protein):DMPC-Komplex und ausreichend PBS, um das finale Volumen auf 2 ml pro Vertiefung zu bringen. Die finalen Peptid- oder ApoA-I-Konzentrationen waren 1, 2,5, 5, 7,5 und 25 μg/ml Medium. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit 2 ml von 1% BSA/PBS gewaschen, nachfolgend mit 2 ml jeweils von PBS gewaschen. Die Menge von ³H-Cholesterin, die in das Medium abgeflossen war, wurde durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt.
Die Ergebnisse demonstrieren, daß Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) beim Cholesterinabfluß wirksamer war als ApoA-I.
11. BEISPIEL: VERWENDUNG DER APOA-I-AGONISTEN IN TIERMODELLSYSTEMEN
Die Wirksamkeit der ApoA-I-Agonisten der Erfindung wurde bei Kaninchen demonstriert. Die Ergebnisse zeigen, daß Verabreichung der ApoA-I-Agonisten die Serumkonzentration von HDL-ähnlichen Teilchen erhöht.
11.1 HERSTELLUNG DER PHOSPHOLIPID/PEPTID-KOMPLEXE
Kleine scheibenförmige Teilchen, bestehend aus Phospholipid (DPPC) und Peptid, wurden hergestellt, indem dem Cholat-Dialyse-Verfahren gefolgt wurde. Das Phospholipid wurde in Chloroform gelöst und unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Das Peptid wurde in Puffer (Kochsalzlösung) mit einer Konzentration von 1–2 mg/ml gelöst. Der Lipidfilm wurde in Cholat enthaltendem Puffer (43°C) wieder gelöst und die Peptid-Lösung wurde mit einem 3:1-Phospholipid/Peptid-Gewichtsverhältnis hinzugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 43°C inkubiert und dann bei 43°C (24 h), Raumtemperatur (24 h) und 4°C (24 h) mit drei Wechseln des Puffers (große Volumina) am Temperaturpunkt dialysiert. Die Komplexe wurden für Injektion und Lagerung bei 4°C filtersterilisiert (0,22 μm).
11.2. ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PEPTID/PHOSPHOLIPID-TEILCHEN
Die Teilchen wurden auf einer Gelfiltrationssäule (Superose 6HR) getrennt. Die Position des Peaks, enthaltend die Teilchen, wurde durch Messen der Phospholipidkonzentration in jeder Fraktion identifiziert. Aus dem Elutionsvolumen wurde der Stokes-Radius bestimmt. Die Konzentration von Peptid in dem Komplex wurde durch Messen des Phenylalaningehalts (durch HPLC) im Anschluß an eine 16-h-Säurehydrolyse bestimmt.
11.3 INJEKTION IM KANINCHEN
Männliche Kaninchen New Zealand White (2,5–3 kg) wurden intravenös mit einer Dosis von Phospholipid/Peptid-Komplex (5 oder 10 mg/kg Körpergewicht oder 10 mg/kg Körpergewicht ApoA-I, ausgedrückt als Peptid) in einer einzelnen Bolus-Injektion injiziert, die 10–15 ml nicht überschritt. Die Tiere wurden vor den Manipulationen leicht sediert. Blutproben (gesammelt auf EDTA) wurden vor und 5, 15, 30, 60, 240 und 1440 Minuten nach der Injektion genommen. Der Hämatokrit (Hct) wurde für jede Probe bestimmt. Die Proben wurden aliquotiert und vor der Analyse bei –20°C aufbewahrt.
11.4 ANALYSE DER KANINCHENSEREN
PLASMA-LIPIDE.
Das gesamte Plasmacholesterin, die Plasmatriglyceride und Plasmaphospholipide wurden enzymatisch unter Verwendung von im Handel erhältlichen Assays entsprechend den Protokollen der Hersteller (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland und Biomérieux, 69280, Marcy-L'étoile, Frankreich) bestimmt.
LIPOPROTEINPROFILE.
Die Plasmalipoproteinprofile der Fraktionen, erhalten nach der Trennung des Plasmas in seine Lipoproteinfraktionen, wurden durch schnelles Rotieren in einem Saccharose-Dichtegradienten bestimmt. Die Fraktionen wurden gesammelt und in jeder individuellen Fraktion wurde der Phospholipid- und Cholesteringehalt enzymatisch gemessen
11.5 ERGEBNISSE
Das Lipoproteinprofil von Kaninchen, injiziert mit 10 mg/kg Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) (in der Form von Peptid/DPPC-Komplexen), als Funktion der Zeit wird in 10 gezeigt. Eine wesentliche Zunahme im Cholesterin der HDL-Cholesterin-Fraktionen (Fraktionen > 1,06 mg/ml) ist 5 min nach der Injektion offensichtlich und dauert für ungefähr 1 h an.
Das Cholesterin der vereinigten HDL-Fraktionen, erhalten durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, ist nachstehend in Tabelle XI dargestellt. Die höchste Zunahme von HDL-Cholesterin (31,3%) erfolgte 15 min nach der Verabreichung.
Diese Werte zeigen an, daß Verabreichung von Peptid 4/DPPC-Komplexen (10 mg/kg) schnelle und wirksame Mobilisierung von peripherem Cholesterin induziert. TABELLE XVI HDL-CHOLESTERIN IN KANINCHEN IM ANSCHLUß AN DIE VERABREICHUNG VON 10 MG/KG PEPTID 4 (SEQ ID NO: 4)

Zeit (min) HDL-Cholesterin Zunahme in HDL-Cholesterin (%)

0 325

408 25,2

15 428 31,3

60 387 18,9

240 291 –10,7

1440 347 6,6

Die Dosisabhängigkeit der Peptid 4/DPPC-Komplexe wird nachstehend in Tabelle XVII gezeigt. Basierend auf diesen zwei Zeitpunkten wurde eine ungefähr lineare Dosisabhängigkeit beobachtet. TABELLE XVII DOSISABHÄNGIGKEIT VON HDL-CHOLESTERIN-SPIEGELN IM ANSCHLUß AN DIE VERABREICHUNG VON PEPTID 4/DPPC-KOMPLEXEN

Dosis	HDL-Cholesterin (5 min)	HDL-Cholesterin (15 min)	HDL-Cholesterin (60 min)
5 mg/kg	33,7	28	60
5 mg/kg	49	40	20
Mittlere Zunahme (%)	41,4	35,0	40,0
10 mg/kg	60,7	75	121,3
10 mg/kg	35	42,5	35,6
Mittlere Zunahme (%)	47,9	58,8	78,5

Die Prozent Zunahme in HDL-Cholesterin im Anschluß an die Injektion von 5 mg/kg Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) (in der Form von Peptid/DPPC-Komplexen) oder 10 mg/kg Peptid 3 (SEQ ID NO: 3) (in der Form von Peptid/DPPC-Komplexen) wird nachstehend in Tabelle XVIII gezeigt. TABELLE XVIII

Zeit (min) Zunahme (%) (Peptid 1, 5 mg/kg) Zunahme (%) (Peptid 3, 10 mg/kg)

15 24,3 84

30 95 71

60 40,7 60

240 29 14,5
Diese Experimente demonstrieren die Fähigkeit der ApoA-I-Agonisten der Erfindung, HDL-Cholesterin zu erhöhen. Eine wesentliche Zunahme in HDL-Cholesterin wird sogar 4 h nach der Verabreichung für Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) und Peptid 3 (SEQ ID NO: 3) beobachtet.
12. BEISPIEL: HERSTELLUNG VON PEPTID-LIPID-KOMPLEX DURCH EINE HERANGEHENSWEISE MIT COLYOPHILISIERUNG
Das folgende Protokoll wurde benutzt, um Peptid-Lipid Komplexe herzustellen.
Ein mg Peptid in Form von Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) wurde in 250 μl Methanol von HPLC-Qualität (Perkin Elmer) in einem ein-ml-Klarglasfläschchen mit Kappe (Waters #WAT025054) gelöst. Das Lösen des Peptids wurde durch gelegentliches Verwirbeln über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur unterstützt. Zu diesem Gemisch wurde ein Aliquot, enthaltend entweder 1, 2, 3, 4, 5, 7,5, 10 oder 15 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC; Avanti Polar Lipids, 99% Reinheit, Produkt #850355), von einer 100-mg/ml-Vorratslösung in Methanol hinzugegeben. Das Volumen des Gemisches wurde durch Zugabe von Methanol auf 400 μl gebracht, und das Gemisch wurde intermittierend für einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur weiter verwirbelt. In jedes Röhrchen wurden 200 μl Xylol (Sigma Aldrich 99% rein, HPLC-Qualität) gegeben, und die Röhrchen wurden für jeweils 10 Sekunden verwirbelt. Zwei kleine Löcher wurden mit einer 20-Gauge-Spritzennadel in die Oberteile von jedem Röhrchen gestanzt, die Röhrchen wurden für jeweils 15 Sekunden in flüssigem Stickstoff eingefroren, und die Röhrchen wurden über Nacht unter Vakuum lyophilisiert. In jedes Röhrchen wurden 200 ml 0,9%ige NaCl-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden für jeweils 20 Sekunden verwirbelt. Zu dieser Zeit waren die Lösungen in den Röhrchen milchig im Aussehen. Die Röhrchen wurden dann in einem Wasserbad für 30 Minuten bei 41°C inkubiert. Die Lösungen in allen Röhrchen wurden klar (d. h. im Aussehen Wasser ähnlich) ausgenommen das Röhrchen, das 15 mg DPPC enthielt, welches trübe blieb.
Das folgende Protokoll wurde verwendet, um eine größere Menge von Peptid-Lipid-Komplexen für in-vivo-Experimente herzustellen.
Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) (22,4 mg) wurde in Methanol mit einer Konzentration von 3,5 mg/ml durch Inkubation für mehrere Minuten und Mischen durch intermittierenden Wirbel gelöst. Zu dieser Lösung wurde Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) in Methanol (100 mg/ml Vorratslösung) gegeben, derart, daß das finale Verhältnis DPPC/Peptid 2,5:1 (Gewicht/Gewicht) betrug. Diese Lösung wurde durch Verwirbeln gemischt. Xylol wurde zu dieser Lösung zu einer finalen Konzentration von 36% hinzugegeben. Aliquots der resultierenden Lösung wurden für spätere Analyse durch Gelfiltrationschromatographie entnommen. Die Lösungen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und durch Vakuum zur Trockene lyophilisiert. Ein Aliquot, enthaltend 20 mg Peptid und 50 mg DPPC, wurde in steriler Kochsalzlösung (0,9% NaCl) rehydratisiert, gemischt und für mehrere Minuten auf 41°C erhitzt, bis eine klare Lösung von rekonstituierten Peptid-Phospholipid-Komplexen resultierte.
12.1 CHARAKTERISIERUNG VON KOMPLEXEN DURCH SUPERÖSE-6-GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE
Peptid-Phospholipid-Komplexe, enthaltend ¹⁴C-markiertes Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) (spezifische Radioaktivität 159000 DPM/mg Peptid, bezogen auf das Gewicht, unter der Annahme von 50% Peptidgehalt) wurden durch Colyophilisierung wie im Text beschrieben hergestellt. Die Zubereitung enthielt 1 mg Peptid und 4 mg DPPC, bezogen auf das Gewicht. Nach dem Rekonstituieren der Komplexe in 200 μl 0,9%igem NaCl wurden 20 μl (100 μg) der Komplexe auf eine Pharmacia-Superose-6-Säule aufgebracht, wobei 0,9%iges NaCl als flüssige Phase mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute verwendet wurde. Nach einer 5-ml-Verzögerung (Säulenhohlraumvolumen = 7,7 ml) wurden 1-ml-Fraktionen gesammelt. Aliquots, enthaltend 20 μl der Fraktionen, wurden einem Assay für den Phospholipidgehalt unterzogen, indem der Kit BioMerieux Phospholipides Enzymatique PAP 150 (#61491) entsprechend den vom Hersteller gelieferten Instruktionen verwendet wurde. Die Überreste jeder Fraktion wurden für 3 Minuten in einem Flüssigkeitsszintillationszähler Wallach 1410 (Pharmacia) unter Verwendung des Easy-Count-Programms gezählt. Die gewaltige Mehrheit von sowohl Phospholipid als auch Peptid wurde gemeinsam in einigen Fraktionen mit Peaks bei ungefähr 16 ml gewonnen. Das UV-Extinktionsprofil für diese Probe (nicht gezeigt) zeigt an, daß die Komplexe aus der Säule mit einem Volumen von 14,7 ml eluieren. Die Diskrepanz zwischen dem Elutionsvolumenen, wie gemessen durch Radioaktivität/Phospholipid-Assay und UV-Extinktion, ist auf das 1,3-ml-Totvolumen der Rohrleitung zwischen der UV-Extinktions-Fließzelle und dem Auslaß des Fraktionssammlers zurückzuführen. Dieses Elutionsvolumen entspricht einem Stokes-Durchmesser von 114 Angström. Elutionsvolumina von etwa 15–19 ml entsprechen Teilchen mit Stokes-Durchmessern von 50–120 Angström, welches der Größenbereich von humanem HDL ist.
12.2 SUPEROSE-6-GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE VON HUMANEM HDL
Humanes HDL₂ wurde wie folgt hergestellt: 300 ml gefrorenes humanes Plasma (Mannheim Blutspendezentrale #1185190) wurden aufgetaut, mit festem Kaliumbromid auf Dichte 1,25 eingestellt und für 45 Stunden mit 40000 U/min unter Verwendung eines Ti45-Rotors (Beckman) bei 20°C zentrifugiert. Die schwimmende Schicht wurde gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert, mit festem Kaliumbromid auf Dichte 1,07 eingestellt und wie vorstehend beschrieben für 70 Stunden zentrifugiert. Die Bodenschicht (mit einem Niveau von einem cm über dem Röhrchenboden) wurde gesammelt, mit 0,01% Natriumazid versetzt und bei 4°C für 4 Tage bis zur Chromatographie aufbewahrt. 20 μl von dem HDL₂ wurden auf ein Pharmacia-Superose-6-FPLC-Gelfiltrationschromatographiesystem aufgegeben, wobei 0,9%iges NaCl als Säuleneluat verwendet wurde. Die Durchflußgeschwindigkeit der Säule betrug 0,5 ml/min. Das Säuleneluat wurde durch Extinktion oder Streuung von Licht der Wellenlänge 254 nm überwacht. Eine Serie von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht und Stokes-Durchmesser wurde als Standards verwendet, um die Säule für die Berechnung von Stokes-Durchmessern der Teilchen zu kalibrieren (Pharmacia Gel Filtration Calibration Kit Instruction Manual (Handbuch zur Instruktion für den Pharmacia-Kit zur Gelfiltrations-Kalibrierung), Pharmacia Laboratory Separation, Piscataway, NJ, überarbeitet April 1985). Das HDL₂ eluierte mit einem Retentionsvolumen von 14,8 ml, entsprechend einem Stokes-Durchmesser von 108 nm.
13. BEISPIEL: HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN
Die Peptid 4 oder 8 wurden mit Schlitzschnecken-Hämocyanin (KLH; 1 mg Peptid mit 10 mg KLH) konjugiert. Das KLH-Konjugat (LMG) wurde in komplettem Freund'schen Adjuvans suspendiert und zu der Zeit 0 in Kaninchen injiziert und mit 0,25 mg KLH-Konjugat nach 4 Wochen und wiederum nach 5 Wochen verstärkt. Blutproben davor und Blutproben sechs Wochen danach wurden für Antikörpertiter gegen authentisches Antigen durch ELISA getestet.
Die Blutproben der Herstellung wurden von jeweils 2 Kaninchen zusammengefaßt. Antikörper, gerichtet ausschließlich gegen die Peptidantigene, wurden wie folgt isoliert:

1. Freies Peptid wurde an Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) entsprechend dem Protokoll des Herstellers gebunden.
2. Die Antiseren wurden auf einer Säule von irrelevanten Peptiden und auf Säulen von irrelevanten humanen und Mäuse-Serum-Proteinen vorabsorbiert.
3. Die vorabsorbierten Antiseren wurden durch die entsprechende Peptid-Säule hindurchgeführt (siehe Punkt 1).
4. Die Säulen wurden mit 0,1 M Borat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 8,2) gewaschen, und die gebundenen Antikörper wurden unter Verwendung eines Gradienten-Schrittes bei niedrigem pH von pH 4,0 auf pH 3,0 auf pH 2,0 (0,1 M Glycin-Puffer) und schließlich mit 0,1 M HCl eluiert.
5. Die eluierte Material wurde mit überschüssiger Borat-Kochsalzlösung neutralisiert, durch Ultrafiltration (Amicon, YM30) eingeengt und gegen Borat-Kochsalzlösung dialysiert.
6. Die Proteinkonzentration wurde durch Extinktion bei 280 nm bestimmt.

Die resultierenden Antikörper wurden für Spezifität der Spezies getestet, wobei gereinigtes humanes ApoA-I oder gereinigtes Mäuse-ApoA-I in einem direkten ELISA-Bindungsassay verwendet wurde. Die humanen und murinen Antikörper waren spezifisch für humanes ApoA-I und demonstrierten minimale Kreuzaktivität.
SEQUENCE LISTING

Claims

ApoA-I-Agonist, umfassend: (i) ein Peptid oder Peptidanaloges mit 15 bis 29 Resten, welches in Anwesenheit von Lipiden eine amphipathische α-Helix bildet und welches die Strukturformel (I) umfasst: Z₁-X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-X₁₉-X₂₀-X₂₁-X₂₂-X₂₃-Z₂ oder ein pharmazeutisch vertragliches Salz davon, wobei: X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Gln (Q), Asn (N), Asp (D) oder D-Pro (p) ist; X₂ ein aliphatischer Rest ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₄ ein saurer Rest ist; X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₇ ein hydrophiler Rest ist; X₈ ein saurer oder ein basischer Rest ist; X₉ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₁ ein hydrophiler Rest ist; X₁₂ ein hydrophiler Rest ist; X₁₃ Gly (G) oder ein aliphatischer Rest ist; X₁₄ Leu (L), Trp (W), Gly (G) oder Nal ist; X₁₅ ein hydrophiler Rest ist; X₁₆ ein hydrophober Rest ist; X₁₇ ein hydrophober Rest ist; X₁₈ Gln (Q), Asn (N) oder ein basischer Rest ist; X₁₉ Gln (Q), Asn (N) oder ein basischer Rest ist; X₂₀ ein basischer Rest ist; X₂₁ ein aliphatischer Rest ist; X₂₂ ein basischer Rest ist; X₂₃ abwesend oder ein basischer Rest ist; Z₁ H₂N- oder RC(O)NH- ist; Z₂ -C(O)NRR, -C(O)OR oder -C(O)OH oder ein Salz davon ist; jedes R unabhängig -H, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkenyl, (C₁-C₆)-Alkinyl, (C₅-C₂₀)-Aryl, (C₆-C₂₆)-Alkaryl, 5–20-gliedriges Heteroaryl, 6–26-gliedriges Alkheteroaryl oder ein Peptid oder Peptidanaloges mit 1 bis 7 Resten ist; jedes "-" zwischen Resten X_n unabhängig eine Amidbindung, eine substituierte Amidbindung, ein Isosteres eines Amids oder eines Amidmimetikums bezeichnet; oder (ii) eine deletierte Form von Strukturformel (I), in welcher mindestens einer und bis zu acht von den Resten X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁ und X₂₂ deletiert sind; oder (iii) eine geänderte Form von Strukturformel (I), in welcher mindestens einer von den Resten X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃, X₁₄, X₁₅, X₁₆, X₁₇, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₁, X₂₂ oder X₂₃ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher mindestens etwa 38% LCAT-Aktivierungsenergie im Vergleich zu menschlichem ApoA-I zeigt.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher die geänderte Form von Strukturformel (I) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 3, in welchem die hydrophoben Reste gemäß Strukturformel (I) fixiert sind und mindestens ein nicht-fixierter Rest konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 4, in welchem: X₁ Pro (P), D-Pro (p), Gly (G) oder Ala (A) ist; X₂ Ala (A), Leu (L) oder Val (V) ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₉ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₃ Leu (L), Gly (G) oder Aib ist; X₁₄ Leu (L), Nal, Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₆ Ala (A), Nal, Trp (W), Gly (G), Leu (L) oder Phe (F) ist; X₁₇ Leu (L), Gly (G) oder Nal ist; X₂₁ Leu (L) ist; und mindestens einer von X₄, X₇, X₈, X₁₁, X₁₂, X₁₅, X₁₈, X₁₉, X₂₀, X₂₂ und X₂₃ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 3, in welchem die hydrophilen Reste gemäß Strukturformel (I) fixiert sind und mindestens ein nicht-fixierter Rest konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 6, in welchem: X₄ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₇ Lys (K), Arg (R) oder Orn ist; X₉ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₁₁ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₂ Glu (E) oder Asp (D) ist; X₁₅ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₁₈ Gln (Q), Asn (N), Lys (K) oder Orn ist; X₁₉ Gln (Q), Asn (N), Lys (K) oder Orn ist; X₂₀ Lys (K) oder Orn ist; X₂₂ Lys (K) oder Orn ist; X₂₃ abwesend oder Lys (K) ist; und mindestens einer von X₁, X₂, X₃, X₅, X₆, X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇ und X₂₁ konservativ mit einem anderen Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 7, in welchem X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist, X₆ Phe (F) ist, X₉ Leu (L) oder Gly (G) ist, X₁₀ Leu (L) oder Trp (W) oder Gly (G) ist und mindestens einer von X₁, X₂, X₅, X₁₃, X₁₄, X₁₆, X₁₇ und X₂₁ konservativ mit einem andern Rest substituiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 5 oder 7, in welchem der substituierende Rest innerhalb der gleichen Unterkategorie wie der substituierte Rest klassifiziert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher die deletierte Form von Strukturformel (I) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 10, in welchem eine helikale Drehung des Peptids oder Peptidanalogen deletiert ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher ein Peptid oder Peptidanaloges mit 22–23 Resten mit Strukturformel (I) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 12, in welchem das "-" zwischen Resten -C(O)NH- bezeichnet; Z₁ H₂N- ist; und Z₂ -C(O)OH oder ein Salz davon ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 13, in welchem: X₁ Pro (P), Ala (A), Gly (G), Asn (N), Gln (Q), Asp (D) oder D-Pro (p) ist; X₂ Ala (A), Val (V) oder Leu (L) ist; X₃ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₄ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₅ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₆ Leu (L) oder Phe (F) ist; X₇ Lys (K), Arg (R) oder Orn ist; X₈ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₉ Leu (L) oder Gly (G) ist; X₁₀ Leu (L), Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₁ Asn (N) oder Gln (Q) ist; X₁₂ Glu (E) oder Asp (D) ist; X₁₃ Gly (G), Leu (L) oder Aib ist; X₁₄ Leu (L), Nal, Trp (W) oder Gly (G) ist; X₁₅ Asp (D) oder Glu (E) ist; X₁₆ Ala (A), Nal, Trp (W), Leu (L), Phe (F) oder Gly (G) ist; X₁₇ Gly (G), Leu (L) oder Nal ist; X₁₈ Gln (Q), Asn (N), Lys (K) oder Orn ist; X₁₉ Gln (Q), Asn (N), Lys (K) oder Orn ist; X₂₀ Lys (K) oder Orn ist; X₂₁ Leu (L) ist; X₂₂ Lys (K) oder Orn ist; und X₂₃ abwesend oder Lys (K) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 14, in welchem X₂₃ abwesend ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 13 oder 14, in welchem einer von X₁₈ oder X₁₉ Gln (Q) oder Asn (N) ist und der andere von X₁₈ oder X₁₉ Lys (K) oder Orn ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 14, in welchem jeder von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₅ und X₁₇ anders als Gly (G) ist.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 14, in welchem einer von X₉, X₁₀, X₁₃, X₁₄, X₁₅ und X₁₇ Gly (G) ist und die anderen anders als Gly (G) sind.
ApoA-I-Agonist nach Anspruch 1, welcher aus der Gruppe, bestehend aus:

und den N-terminalen acylierten und/oder C-terminalen amidierten oder veresterten Formen davon, wobei X Aib ist; Z Nal ist und O Orn ist, ausgewählt ist.
Peptid PVLDLFRELLNELLEZLKQKLK (SEQ ID NO: 1), wobei Z Nal ist.
Peptid GVLDLFRELLNELLEALKQKLKK (SEQ ID NO: 2).
Peptid PVLDLFRELLNELLEWLKQKLK (SEQ ID NO: 3).
Peptid PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (SEQ ID NO: 4).
Peptid PVLDLFRELLNEGLEALKQKLK (SEQ ID NO: 8).
Multimerer ApoA-I-Agonist, welcher mindestens etwa 38% LCAT-Aktivierungsenergie im Vergleich zu humanem ApoA-I zeigt und welcher die Strukturformel (11) hat: HH[LL_m-HH]-_nLL_m-HH (II)oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, wobei: jedes m unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist; jedes "HH" unabhängig ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 ist; jedes "LL" unabhängig ein bifunktionelles Verbindungsglied ist; und jedes "-" unabhängig eine kovalente Bindung bezeichnet.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem das bifunktionelle Verbindungsglied spaltbar ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem n 0 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 27, in welchem m 0 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 13 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 14 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 19 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 20 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 21 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 22 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 23 ist.
Multimerer ApoA-I-Agonist nach Anspruch 25, in welchem jedes HH unabhängig ein Peptid gemäß Anspruch 24 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex, umfassend einen ApoA-I-Agonisten und ein Lipid, wobei der ApoA-I-Agonist ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 oder ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 25 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 12 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 13 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 14 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 19 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 20 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 21 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 22 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 23 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 24 ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, in welchem das Lipid Sphingomyelin ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 37, welcher in der Form eines lyophilisierten Pulvers ist.
ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex nach Anspruch 38, welcher in der Form einer Lösung ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen ApoA-I-Agonisten und einen pharmazeutisch vertraglichen Träger, Excipienten oder ein Verdünnungsmittel, wobei der ApoA-I-Agonist ein Peptid oder Peptidanaloges gemäß Anspruch 1 oder ein multimerer ApoA-I-Agonist gemäß Anspruch 20 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 12 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 13 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 14 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 19 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 20 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 21 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 22 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 23 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 50, in welcher der ApoA-I-Agonist ein Peptid gemäß Anspruch 24 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 50–59, in welcher der ApoA-I-Agonist in der Form eines ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplexes ist, wobei der Komplex den ApoA-I-Agonisten und ein Lipid umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 60, in welcher der ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplex in der Form eines lyophilisierten Pulvers ist.
Verwendung eines ApoA-I-Agonisten nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Patienten, leidend an einer mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher das Medikament in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist, wobei die Zusammensetzung den ApoA-I-Agonisten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, Excipienten oder ein Verdünnungsmittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher der ApoA-I-Agonist in der Form eines ApoA-I-Agonist-Lipid-Komplexes ist, wobei der Komplex den ApoA-I-Agonisten und ein Lipid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung Hypercholesterolämie ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung eine kardiovaskuläre Krankheit ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung Atherosklerose ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung Restenose ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung HDL- oder ApoA-I-Defizienz ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung Hypertriglyceridämie ist.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die mit Dyslipidämie verbundene Erkrankung das metabolische Syndrom ist.
Verwendung eines ApoA-Agonisten nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines Patienten, leidend an septischem Schock.
Verwendung nach Anspruch 62 oder 72, bei welcher der Patient ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 62 oder 72, bei welcher etwa 0,5 mg/kg bis etwa 100 mg/kg ApoA-Agonist an den Patienten verabreicht werden.