KR101631363B1 - 테트라넥틴 아포지방단백질 a-i, 이를 함유하는 지질 입자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명에서 아포지방단백질, 포스파티딜콜린 및 지질, 예를 들어 인지질, 지방산 또는 스테로이드 지질을 포함하는 지질 입자를 보고한다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 단지 하나의 아포지방단백질을 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 하나의 아포지방단백질, 인지질, 지질 및 세제로 이루어진다. 하나의 실시태양에서 상기 지질은 제 2 포스파티딜콜린이며, 이때 상기 제 1 포스파티딜콜린과 상기 제 2 포스파티딜콜린은 상기 포스파티딜콜린의 글리세롤 주쇄에 에스터화된 하나 또는 2 개의 지방산 잔기 또는 지방산 잔기 유도체가 상이하다. 하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 서열번호 1, 2, 6, 66 및 67 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖거나 상기 선택된 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체인 아포지방단백질 중에서 선택된다.

Description

테트라넥틴 아포지방단백질 A-I, 이를 함유하는 지질 입자 및 이의 용도{TETRANECTIN-APOLIPOPROTEIN A-I, LIPID PARTICLES CONTAINING IT AND ITS USE}

본 발명은 지방단백질 및 지질 입자의 분야에 있다. 본 발명에서 아포지방단백질, 포스파티딜콜린 및 지질을 포함하는 지질 입자뿐만 아니라 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 및 이의 용도를 보고한다.

혈장 지방단백질은 혈중 지질 수송 및 대사를 수행하는 가용성 단백질-지질 복합체이다. 지방단백질의 여러 주요 부류들이 이들의 밀도, 크기, 화학 조성, 및 작용을 근거로 구분된다. 이들 중에서 고밀도 지방단백질(HDL) 입자(한편으로 고밀도 지질 입자로서 나타낸다)는 이의 평균 분자량이 180 kDa 내지 360 kDa으로 다양한 여러 하위 부류들로 구성된다. 이들의 평균 지질 및 단백질 함량은 각각 50 중량%이다. 포스파티딜콜린(PC)이 전체 지질의 38%를 차지하고 이어서 콜레스테릴 에스터 및 소량의 다른 극성 및 비-극성 지질, 예를 들어 유리 콜레스테롤이 뒤를 잇는다. 주요 단백질 성분은 아포지방단백질 A-I(아포 A-I)이며, 인간 HDL 중 전체 단백질 중량의 약 60%에 상당한다.

HDL 입자 및 이의 주요 폴리펩타이드 아포지방단백질 A-I는 역 콜레스테롤 수송(RCT)에 관여한다. 그 점에서 상기 아포지방단백질 A-I는 세포로부터, 예를 들어 혈관벽 세포로부터의 콜레스테롤 유출, 지질의 결합 및 레시틴-콜레스테롤-아세틸-트랜스퍼라제의 활성화 및 이에 의해 간에 의한 혈장 흐름을 통한 콜레스테롤의 제거를 증가시킨다. 이는 세포막 단백질 ATP-결합-카세트-수송자-A-I(ABCA-I)를 수반하는 능동 수송 공정이다.

아포지방단백질 A-I 및 아포지방단백질-기재 치료제, 예를 들어 재구성 HDL 입자는 지난 세기의 70년대 말에서 80년대 초에 이미 동정되었다. 지질 입자를 함유하는 아포지방단백질 A-I-밀라노(Milano)의 경우 임상적 증거(동맥경화증 환자에 있어서 현저한 플라크 감소를 의미한다)가 입증될 수 있었다. 야생형 아포지방단백질 A-I의 이량체 형태인 아포지방단백질 A-I-밀라노는 상기 아포지방단백질 A-I 분자의 천연 돌연변이체에 따라 구상되었다. 상기 이량체 형성은 다이설파이드 결합의 형성을 허용하는 시스테인에 의한 아미노산 잔기 173(아르기닌)의 교환에 의해 가능하게 된다.

WO 2009/131704에 무기 물질을 포함하는 코어를 포함하는 나노구조물이 보고되어 있으며, 상기 구조물은 콜레스테롤 및 다른 분자의 격리에 적합하다. WO 2006/125304에는 관상 동맥 질병의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물이 보고되어 있다. 지질 대사 및 심혈관 질병과 관련된 아포지방단백질을 암호화하는 조성물이 US 2002/0142953에 보고되어 있다. WO 2005/084642에 아포단백질-코킬레이트 조성물이 보고되어 있다. WO 2009/036460에는 개질된 인간 아포지방단백질 A-I 폴리펩타이드 및 이의 용도가 보고되어 있다. 인간 아포지방단백질 A-I 단백질 뮤테인의 이량체 및/또는 올리고머 형태의 식물 생산이 WO 2008/017906에 보고되어 있다. WO 2007/137400에 판막협착의 치료를 위한 방법 및 화합물이 보고되어 있다. WO 2006/100567에 하전된 지방단백질 복합체 및 이의 용도가 보고되어 있다.

US 2002/0156007에 아포지방단백질 유사체들이 보고되어 있다. 테트라넥틴 삼량체화 폴리펩타이드가 US 2010/0028995에 보고되어 있다. 문헌[Graversen, J.H., et al., J. Cardiovascular Pharmacol. (51 (2008) 170-177)]은 상기 아포지방단백질 A-I의 삼량체화가 혈장 제거를 늦추고 죽상동맥경화 억제 성질을 보전함을 보고한다. 심혈관 질병의 치료를 위한 신규의 치료 양상인 고밀도 지방단백질 투여가 문헌[Sirtori, C.R., et al. (Curr. Med. Chem. Immunol. Endocrine Metabol. Agents 5 (2005) 321-333]에 보고되어 있다.

WO 03/097696에는 허혈성 재관류의 치료를 위한 방법 및 조성물이 보고되어 있다. 나노규모의 결합된 이중층, 사용 및 생산 방법이 WO 2009/097587에 보고되어 있다. WO 2007/098122에 황반 변성 및 관련된 눈병의 치료 방법이 보고되어 있다. 아포지방단백질 유사체들이 WO 02/38609에 보고되어 있다. WO 2005/041866에는 약학 제형이 보고되어 있다. 관상동맥 증후군의 치료 및 예방을 위한 방법 및 투여 섭생이 보고되어 있다. 유전자 요법, 아포지방단백질 A-I 작용물질을 공급하기 위한 접근법 및 이상지질혈증 질환의 치료를 위한 이의 용도가 WO 99/16409에 보고되어 있다. WO 2008/106660에는 단리된 인지질-단백질 입자가 보고되어 있다. 아포지방단백질(APO A-I) 유사 펩타이드/인지질 복합체를 사용하는 확장기 기능부전의 예방 및 치료 방법이 WO 2010/083611에 보고되어 있다. WO 2008/156873에서 APO A-I 펩타이드 유사물질이 보고된다. 캡슐화된 HDL 유사 펩타이드가 WO 2008/094905에 보고되어 있다. WO 98/56906에 삼량체화 모듈이 보고되어 있다.

본 발명에서 하나의 태양으로서 개선된 생산 성질, 특히 배양 중 더 적은 부산물 형성 및 개선된 하류 공정 성질을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 보고한다.

또한 본 발명에서 하나의 태양으로서 아포지방단백질, 포스파티딜콜린 및 추가의 지질, 예를 들어 인지질, 리소인지질, 갈락토세레브로사이드, 강글리오사이드, 세레브로사이드, 글리세라이드, 지방산, 트라이글리세라이드 또는 스테로이드 지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터 또는 이들의 유사체 또는 유도체를 포함하는 지질 입자를 보고한다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질 입자는 단지 한 가지 유형의 아포지방단백질을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질 입자는 하나의 아포지방단백질, 포스파티딜콜린, 추가의 지질 및 세제로 이루어진다.

하나의 실시태양에서, 상기 추가의 지질은 포스파티딜콜린이며, 이때 상기 두 포스파티딜콜린은 모두 상기 포스파티딜콜린의 포스포글리세롤 주쇄에 에스터화되는 하나 또는 2 개의 카복실산 부분 또는 카복실산 부분 유도체가 상이하다.

추가의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 인간 아포지방단백질 A, 또 다른 실시태양에서 다량체화 도메인에 접합된 인간 아포지방단백질, 및 더욱 추가의 실시태양에서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I이다. 하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 서열번호 1, 2, 6, 66 및 67 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖거나 상기 선택된 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체인 아포지방단백질 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 a) 아포지방단백질, b) 포스파티딜콜린, 및 c) 추가의 지질을 포함하며, 이때 상기 아포지방단백질은 상기 지질이 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 세린, 스핑고신 I-포스페이트, 콜레이트, 또는 다이미리스토일 포스파티딜글리세롤인 경우 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I이고/이거나, 상기 아포지방단백질은 상기 지질이 작은 알킬 쇄 인지질, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 스핑고마이엘린, 스핑고지질, 강글리오사이드, 세레브로사이드, 리소레시틴, 세팔린, 카르디오리핀, 다이세틸포스페이트 또는 콜레스테롤인 경우 아포지방단백질 A-I 밀라노가 아니다.

또 다른 실시태양에서 상기 지질 입자는 a) 아포지방단백질, b) 포스파티딜콜린, 및 c) 추가의 지질을 포함하며, 이때 상기 아포지방단백질은 상기 지질이 포스파티딜에탄올아민, 스핑고신 I-포스페이트, 또는 콜레이트인 경우 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I이고/이거나, 상기 아포지방단백질은 상기 지질이 작은 알킬 쇄 인지질, 스핑고마이엘린, 스핑고지질, 강글리오사이드, 세레브로사이드, 리소레시틴, 세팔린, 카르디오리핀, 다이세틸포스페이트 또는 콜레스테롤인 경우 아포지방단백질 A-I 밀라노가 아니다.

하나의 실시태양에서 상기 추가의 지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티드산을 제외한 임의의 지질이다.

하나의 실시태양에서 상기 추가의 지질은 제 2 포스파티딜콜린이다. 하나의 실시태양에서 상기 포스파티딜콜린은 POPC이고 상기 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다.

하나의 실시태양에서 상기 포스파티딜콜린 대 상기 지질의 몰비는 99:1 내지 1:99이다. 또 다른 실시태양에서 상기 포스파티딜콜린 대 상기 지질의 몰비는 99:1 내지 10:90이다. 추가의 실시태양에서 상기 포스파티딜콜린 대 상기 지질의 몰비는 99:1 내지 25:75이다. 또 다른 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 상기 포스파티딜콜린 및 상기 지질과 비공유적으로 회합된다.

하나의 실시태양에서 상기 POPC 대 DPPC의 몰비는 99:1 내지 1:99이다. 또 다른 실시태양에서 상기 POPC 대 DPPC의 몰비는 99:1 내지 10:90이다. 추가의 실시태양에서 상기 POPC 대 DPPC의 몰비는 99:1 내지 25:75이다.

또 다른 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 POPC 및 DPPC와 비공유적으로 회합된다.

하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 3 개의 아포지방단백질 단량체를 포함하는 다량체이다. 또 다른 실시태양에서 상기 다량체는 3 개의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 0.75 중량% 미만의 세제를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 세제는 당-기재 세제, 폴리옥시알킬렌-기재 세제, 담즙-염 기재 세제, 합성 세제, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서 상기 세제는 콜산이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 40 내지 120, 하나의 실시태양에서 50 내지 110, 하나의 실시태양에서 54 내지 102, 하나의 실시태양에서 60 내지 90, 하나의 실시태양에서 65 내지 70이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 60 내지 90이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 포스파티딜콜린 분자 및 지질 분자를 합한 수는 약 66이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 40 내지 115, 추가의 실시태양에서 50 내지 110, 및 또 다른 실시태양에서 54 내지 102이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 60 내지 90이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 및 DPPC 분자들을 합한 수는 약 66이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 큐빌린, 스캐빈저 수용체 부류 B 유형 1(SR-BI), ATP-결합 카세트 1(ABCA-1), 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT), 콜레스테릴-에스터 전달 단백질(CETP), 또는 인지질 전달 단백질(PLTP)로 이루어진 군 중에서 선택된 수용체에 결합할 수 있다.

본 발명에 보고된 바와 같은 추가의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화를 위한 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

약제의 제조를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에 있어서 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화를 위한 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

약제의 제조를 위한 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 급성 관상동맥 증후군, 죽상동맥경화증, 대상의 혈관 중 죽상동맥경화성 플라크, 대상의 판막협착증, 패혈성 쇼크, 협심증, 심근경색, 불안정 협심증, 동맥 협착증, 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증, 관상동맥 협착증, 혈관성 치매 또는 일과성 흑암시의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 역 콜레스테롤 수송의 유도, 플라크 진정의 유도, 죽상동맥경화성 플라크의 청소 또는 용해 또는 안정화, 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배, HDL 입자 수의 증가 또는 내독소의 제거에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 급성 관상동맥 증후군, 죽상동맥경화증, 혈관 중 죽상동맥경화성 플라크, 판막협착증, 패혈성 쇼크, 협심증, 심근경색, 불안정 협심증, 동맥 협착증, 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증, 관상동맥 협착증, 혈관성 치매, 또는 일과성 흑암시가 있는 개인에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개인의 치료 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개인에게 역 콜레스테롤 수송의 유도, 플라크 진정의 유도, 죽상동맥경화성 플라크의 청소 또는 용해 또는 안정화, 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배, HDL 입자 수의 증가, 또는 내독소의 제거에 유효한 양의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 역 콜레스테롤 수송을 유도하거나, 플라크 진정을 유도하거나, 죽상동맥경화성 플라크를 청소 또는 용해 또는 안정화하거나, 동맥 벽에서부터 간까지 콜레스테롤을 재분배하거나, HDL 입자의 수를 증가시키거나, 내독소를 제거하는 방법이다.

하나의 실시태양에서 상기 비-정상적인 지질 수준은 체액 중에서이다. 또 다른 실시태양에서 상기 체액은 전혈 또는 혈청이다.

하나의 실시태양에서 상기 비-정상적인 지질 수준은 증가된 콜레스테롤 수준이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 함유 침착물은 혈관 중 플라크이다.

하나의 실시태양에서 상기 질병은 심혈관 질병이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 i) 치료 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자를 치료 또는 인공 시스템이 필요한 대상에게 투여하고, ii) 선택적으로 대상의 지질 수준 또는 지질 함유 침착물의 변화를 모니터링함을 포함하는, 체내 비-정상적인 지질 수준 또는 지질 함유 침착물을 특징으로 하는 질병 또는 상태의 치료 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 급성 관상동맥 증후군의 2차 예방이 필요한 환자에게 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 환자의 2차 예방 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 진단용 조성물이며, 이때 상기 아포지방단백질은 표지되어 샘플 또는 대상 내에서 상기 표지된 아포지방단백질 또는 지질 입자의 검출을 허용한다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 진단을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 비-정상적인 지질 수준 또는 지질 함유 침착물의 존재를 특징으로 하는 질병 또는 상태를 앓고 있는 대상의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질뿐만 아니라 본 발명에 보고된 바와 같은 핵산을 포함하는 세포이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이의 전구약물이다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 하나 이상의 보존적인 아미노산 변형을 갖는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지며, 상기 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환되거나, 첨가되거나 결실된다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I이다. 하나의 실시태양에서 상기 아미노산 서열은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체, 또는 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 삼량체는 큐빌린, 스캐빈저 수용체 부류 B 유형 1(SR-BI), ATP-결합 카세트 1(ABCA-1), 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT), 콜레스테릴-에스터 전달 단백질(CETP), 또는 인지질 전달 단백질(PLTP)로 이루어진 군 중에서 선택된 수용체에 결합할 수 있다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 3 개의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 포함하는 다량체이며, 이때 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체는 서로 공유 결합되지 않는다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드이다.

하나의 실시태양에서 상기 융합 단백질은 N-에서 C-말단 방향으로 아미노산 메티오닌(M), CDLPQTHSL(서열번호 55)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편, GS 링커, HHHHHH(서열번호 56)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그, GS 링커, VVAPPAP(서열번호 60)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 융합 단백질은 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포이다. 하나의 실시태양에서 상기 세포는 에스케리키아 콜라이 균주, 예를 들어 CSPZ-2, K12 균주 294 (ATCC 31446), B, X 1776 (ATCC 31537), W3110 (ATCC 273325), BL21, RM_82, SCS_110, G, XL-1_F-, SE_13009, LA_5709, C 600, CSH_1, TG_1, UT400, 및 UT5600 중에서 선택된다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66 및 서열번호 67의 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, b) 포스파티딜콜린, 및 c) 지질을 포함하는 지질 입자이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질은 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 세린, 스핑고신 I-포스페이트, 콜레이트, 및 다이미리스토일 포스파티딜글리세롤 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서 상기 지질은 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티드산을 제외한 임의의 지질이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 66 및 서열번호 67의 아미노산 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, b) 제 1 포스파티딜콜린, 및 c) 제 2 포스파티딜콜린을 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 제 1 포스파티딜콜린은 POPC이고 상기 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자를 생성시키기 위한 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 1:99이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자를 생성시키기 위한 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 10:90이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자를 생성시키기 위한 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 25:75이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자를 생성시키기 위한 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 50:50이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자를 생성시키기 위한 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 약 75:25이다.

하나의 실시태양에서 상기 제 1 포스파티딜콜린은 POPC이고 상기 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 1:99이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 10:90이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 25:75이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 99:1 내지 50:50이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 상기 제 1 포스파티딜콜린 대 상기 제 2 포스파티딜콜린의 몰비는 약 75:25이다.

하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 상기 제 1 포스파티딜콜린 및 상기 지질과 비-공유적으로 회합된다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 상기 제 1 포스파티딜콜린 및 상기 제 2 포스파티딜콜린과 비-공유적으로 회합된다.

하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 3 개의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 포함하는 다량체이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 0.75 중량% 미만의 세제를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 세제는 당-기재 세제, 폴리옥시알킬렌-기재 세제, 담즙-염 기재 세제, 합성 세제 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 세제는 콜산 또는 쯔비터전트(Zwittergent)이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자를 합한 수는 40 내지 120, 추가의 실시태양에서 50 내지 110, 및 또 다른 실시태양에서 54 내지 102이다. 하나의 실시태양에서 상기 인지질은 포스파티딜콜린이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE)의 예방을 위한,

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화를 위한 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

약제의 제조를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에 있어서 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE)의 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화를 위한 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

약제의 제조를 위한 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

급성 관상동맥 증후군이 있는 환자에게서 2차 예방을 위한,

2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE)의 예방을 위한,

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이 대상의 역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정을 유도하기에 충분한 양으로 포함되는, 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료를 위한,

역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도를 위한,

대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배를 위한,

대상의 판막협착증의 예방 또는 치료를 위한,

대상의 HDL 입자의 수의 증가를 위한,

대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시를 위한,

내독소의 제거를 위한,

패혈성 쇼크의 예방을 위한,

협심증의 치료를 위한,

심근경색의 치료를 위한,

불안정 협심증의 치료를 위한,

동맥 협착증, 예를 들어 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료를 위한,

혈관성 치매의 치료를 위한, 또는

일과성 흑암시의 치료를 위한

방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 급성 관상동맥 증후군, 2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE), 죽상동맥경화증, 대상의 혈관 중 죽상동맥경화성 플라크, 대상의 판막협착증, 패혈성 쇼크, 협심증, 심근경색, 불안정 협심증, 동맥 협착증, 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증, 관상동맥 협착증, 혈관성 치매 또는 일과성 흑암시의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 역 콜레스테롤 수송의 유도, 플라크 진정의 유도, 죽상동맥경화성 플라크의 청소 또는 용해 또는 안정화, 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배, HDL 입자 수의 증가 또는 내독소의 제거에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 ER에서 급성 CV 사건을 나타내는 환자에게서 중재술-후 적용시 2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE)의 예방을 위해, 또는 급성 관상동맥 증후군이 있거나, 죽상동맥경화증이 있거나, 혈관 중 죽상동맥경화성 플라크가 있거나, 판막협착증이 있거나, 패혈성 쇼크가 있거나, 협심증이 있거나, 심근경색이 있거나, 불안정 협심증이 있거나, 동맥 협착증이 있거나, 말초 동맥 질병(PAD)이 있거나, 경동맥 협착증이 있거나, 뇌동맥 협착증이 있거나, 관상동맥 협착증이 있거나, 혈관성 치매가 있거나, 일과성 흑암시가 있는 개인에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개인의 예방 방법 또는 치료 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개인에게 역 콜레스테롤 수송의 유도, 또는 플라크 진정의 유도, 또는 죽상동맥경화성 플라크의 청소 또는 용해 또는 안정화, 또는 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배, 또는 HDL 입자 수의 증가, 또는 내독소의 제거에 유효한 양의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개인에게서 역 콜레스테롤 수송을 유도하거나, 플라크 진정을 유도하거나, 죽상동맥경화성 플라크를 청소 또는 용해 또는 안정화하거나, 동맥 벽에서부터 간까지 콜레스테롤을 재분배하거나, HDL 입자의 수를 증가시키거나, 내독소를 제거하는 방법이다.

하나의 실시태양에서 상기 비-정상적인 지질 수준은 체액 중에서이다. 또 다른 실시태양에서 상기 체액은 전혈 또는 혈청이다.

하나의 실시태양에서 상기 비-정상적인 지질 수준은 증가된 콜레스테롤 수준이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 함유 침착물은 혈관 중 플라크이다.

하나의 실시태양에서 상기 질병은 심혈관 질병이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은

i) 치료 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자를 치료 또는 인공 시스템이 필요한 대상에게 투여하고,

ii) 선택적으로 대상의 지질 수준 또는 지질 함유 침착물의 변화를 모니터링함

을 포함하는, 체내 비-정상적인 지질 수준 또는 지질 함유 침착물을 특징으로 하는 질병 또는 상태의 치료 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 급성 관상동맥 증후군의 2차 예방이 필요한 대상에게 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 환자의 2차 예방 방법이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 2차적인 주요 심혈관계 부작용(MACE)의 예방이 필요한 대상에게 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 A-I 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 투여함을 포함하는 상기 부작용의 예방 방법이며, 이때 상기 대상은 ER에서 급성 CV 사건을 나타낸다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 다량체, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 진단용 조성물이며, 이때 상기 아포지방단백질은 표지되어 샘플 또는 대상 내에서 상기 표지된 아포지방단백질 또는 지질 입자의 검출을 허용한다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 진단을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 비-정상적인 지질 수준 또는 지질 함유 침착물의 존재를 특징으로 하는 질병 또는 상태를 앓고 있는 대상의 예방 또는 치료를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자의 용도이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 융합 단백질뿐만 아니라 본 발명에 보고된 바와 같은 핵산을 포함하는 세포이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 66의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 서열번호 67의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 아포지방단백질 A-I 또는 이의 변이체; 및 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린을 포함하는 지질 입자이며, 이때 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 50 내지 90이고, 상기 아포지방단백질 A-I는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 약 66이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 아포지방단백질 A-I 또는 이의 변이체; 및 -1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린을 포함하는 지질 입자이며, 이때 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 90이고, 상기 아포지방단백질 A-I는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 약 66이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 아포지방단백질 A-I 또는 이의 변이체; 및 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린을 포함하는 지질 입자이며, 이때 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 90이고, 상기 아포지방단백질 A-I는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 약 66이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 아포지방단백질 A-I 또는 이의 변이체; 및 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린을 포함하는 지질 입자이며, 이때 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 90이고, 상기 아포지방단백질 A-I는 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 약 66이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 아포지방단백질 A-I 또는 이의 변이체; 및 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린을 포함하는 지질 입자이며, 이때 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 90이고, 상기 아포지방단백질 A-I는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 60 내지 88이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 62 내지 80이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 64 내지 70이다. 하나의 실시태양에서 상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는 약 66이다.

도 1은 지질 조성이 상이한 5 개의 지질 입자를 사용하여 수행한 생체 내 토끼 연구의 결과를 나타낸다. 상부: 콜레스테롤 가동화, 및 따라서 모든 준비된 배치들에 대해 효능이 입증될 수 있었다. 하부: 간 효소의 증가는 단일 인지질로서 DPPC의 사용에 의해 발생된 지질 입자에 대해 주목되었다.
도 2는 본 발명에 따른 POPC 및 아포지방단백질의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석을 나타낸다; 몰비 1:20 내지 1:160.
도 3은 LCAT 활성에 대한 DPPC 및 POPC의 영향을 나타낸다.
도 4는 POPC 및/또는 DPPC를 함유하는 지질 입자에서 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도를 나타낸다.
도 5는 RXR-LXR 작용물질로 감작되지 않은 세포에서 THF-1 유도된 거품 세포에 대한 콜레스테롤 유출을 나타낸다.
도 6은 PXR-LXR 작용물질을 사용하여 ABCA-I 경로 활성화 후의 THP-1 유도된 거품 세포에 대한 콜레스테롤 유출을 나타낸다.
도 7은 상이한 아포지방단백질 조성물의 시간 의존적인 혈장 농도를 나타낸다.
도 8은 혈장에서 콜레스테롤 가동화 및 에스터화의 시간 및 농도 과정을 나타낸다.
도 9는 100 ㎎/㎏의 단일 i.v. 주사 후 마우스에서 본 발명에 따른 아포지방단백질을 포함하는 상이한 조성물들에 의한 간 효소 방출의 비교를 나타낸다.
도 10은 생체 내 토끼 연구 - 혈장에서 자발적인 용혈을 나타낸다.
도 11은 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.5를 사용하는 지질 입자의 분석학적 SEC를 나타낸다.
도 12는 50 mM K₂HPO₄, 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 트레할로스, pH 7.5를 사용하는 지질 입자의 분석학적 SEC를 나타낸다.
도 13은 1:20 내지 1:320(레인 1: 고유 마커; 레인 2: 몰비 1:320; 레인 3: 몰비 1:160; 레인 4: 몰비 1:80; 레인 5: 몰비 1:80(f/t); 레인 6: 몰비 1:40; 레인 7: 몰비 1:20; 레인 8: 아포지방단백질(헥사머 형성))의 몰비의 POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 고유 PAGE를 나타낸다.
도 14는 1:20 내지 1:160의 몰비의 POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석을 나타낸다.
도 15는 POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 SEC 크로마토그램(UV280 신호)의 중첩을 나타낸다.
도 16은 1:40의 몰비로 수득된 POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석을 나타낸다.
도 17은 1:20 내지 1:100(1: 분자량 마커; 2: 지질 부재하의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I; 3: 1:20; 4: 1:40; 5: 1:60; 6: 1:80; 7: 1:100)의 몰 비로 수득된 DPPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 고유 PAGE를 나타낸다.
도 18은 1:60(최상위 곡선) 내지 1:100(최하위 곡선)의 몰비로 수득된 POPC:DPPC = 3:1 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 혼합물의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석(UV 280 신호)을 나타낸다.
도 19는 콜레이트, 쯔비터전트 3-8, 3-10, 및 3-12를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 고유 PAGE SDS를 나타낸다. 각 젤 상의 레인 1: 순수한 아포지방단백질; 각 젤 상의 레인 2: 기준물질로서 0.1 x CMC 콜레이트 지질화된 샘플.
도 20은 3 x CMC 쯔비터전트 3-8 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자(아포지방다백질:인지질의 몰비 = 1:60)의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석을 나타낸다.
도 21은 2 x CMC 쯔비터전트 3-10 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자(아포지방다백질:인지질의 몰비 = 1:60)의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석을 나타낸다.
도 22는 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석을 나타낸다. 상부: 고유 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I로부터 형성된 지질 입자; 하부: 변성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I로부터 형성된 지질 입자.
도 23은 DMPC(1:100)(다이미리스토일 포스파티딜콜린)로 지질화된(a) 및 PBS 중의 지질화되지 않은(b) 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 사용하여 수행한 생체 내 토끼 연구의 결과를 나타낸다.
도 24는 5 ℃ 및 40 ℃에서 보관된 야생형 아포지방단백질 A-I(A) 및 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I(B)를 함유하는 지질 입자의 SE-HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

정의

"아포지방단백질"이란 용어는 각각 지질 또는 지방단백질 중에 포함된 단백질을 나타낸다.

"아포지방단백질 A-I"란 용어는 단백질-지질 및 단백질-단백질 상호작용 성질을 갖는 양친성, 나선형 폴리펩타이드를 나타낸다. 아포지방단백질 A-I는 간 및 소장에 의해 267 아미노산 잔기의 프리프로(prepro)-아포지방단백질로서 합성되며, 이는 프로-아포지방단백질로서 분비되고 243 아미노산 잔기를 갖는 성숙한 폴리펩타이드로 절단된다. 아포지방단백질 A-I는 6 내지 8 개의 상이한 아미노산 반복부로 이루어지며, 상기 반복부는 각각, 종종 프롤린이고 일부의 경우 여러 잔기들로 형성된 신장부로 이루어지는 링커 부분에 의해 분리되는 22 개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 예시적인 인간 아포지방단백질 A-I 아미노산 서열이 진펩트(GenPept) 데이터베이스 목록 NM-000039 또는 데이터베이스 목록 X00566; 진뱅크(GenBank) NP-000030.1(gi 4557321)에 보고되어 있다. 인간 아포지방단백질 A-I(서열번호 6) 중에서 천연 변이체, 예를 들어 P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D, D127N, K131의 결실, K131M, W132R, E133K, R151C(아미노산 잔기 151이 Arg에서 Cys로 바뀌었다, 아포지방단백질 A-I-파리(Paris)), E160K, E163G, P167R, L168R, E171V, P189R, R197C(아미노산 잔기 173이 Arg에서 Cys로 바뀌었다, 아포지방단백질 A-I-밀라노) 및 E222K가 존재한다. 또한 보존적인 아미노산 변형을 갖는 변이체가 포함된다.

하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 면역글로불린 A 프로테아제(IgA 프로테아제)의 절단 부위의 단편을 포함한다. IgA 프로테아제로부터 공지된 인식 부위들은 하기의 서열을 가지며, 이때 "↓"는 절단된 결합의 위치를 나타낸다:

Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro (서열번호 61)

Pro-Pro↓Ser-Pro (서열번호 62)

Pro-Pro↓Ala-Pro (서열번호 63)

Pro-Pro↓Thr-Pro (서열번호 64)

Pro-Pro↓Gly-Pro (서열번호 65),

이때 상기 처음 3 개가 보다 빈번히 선택되고 절단된다.

"아포지방단백질 유사물질"이란 용어는 각각의 아포지방단백질의 작용을 모방하는 합성 폴리펩타이드를 나타낸다. 예를 들어 "아포지방단백질 A-I 유사물질"은 천연 아포지방단백질 A-I로서 콜레스테롤의 제거, 즉 역 콜레스테롤 유출에 관하여 필적하는 생물학적 작용을 나타내는 합성 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질 A-I 유사물질은 소수성-친수성 계면에 양으로 하전된 아미노산 잔기들이 밀집해 있고 친수성 표면의 중심에 음으로 하전된 아미노산 잔기들이 밀집해 있는 하나 이상의 양친성 알파-나선을 포함한다. 아포지방단백질 A-I의 작용을 모방하기 위해서 상기 아포지방단백질 유사물질은 15 내지 29 개의 아미노산 잔기, 하나의 실시태양에서 22 개의 아미노산 잔기의 반복 폴리펩타이드를 포함한다(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK(서열번호 4); PVLDLFRELLNELLEAL KQKLK(서열번호 5)).

"심혈관 질병"이란 용어는 일반적으로 심장 또는 혈관에 관한 질병 또는 상태, 예를 들어 동맥경화증, 관상동맥 심장 질병, 뇌혈관 질병, 대동맥 장골동맥 질병, 허혈성 심장 질병 또는 말초 혈관 질병을 나타낸다. 상기와 같은 질병은 상기 질병의 결과로서 부작용, 예를 들어, 대개는 대상을 사망케 하는, 심근경색, 발작, 협심증, 일과성 뇌 허혈 발작, 울혈성 심부전, 대동맥류 발생 전에는 발견되지 않을 수도 있다.

"콜레이트"란 용어는 3α,7α,12α-트라이하이드록시-5β-콜란-24-오익 산 또는 이의 염, 특히 나트륨 염을 나타낸다.

"임계 미셀 농도"란 용어 및 호환적으로 사용될 수 있는 이의 약어 "CMC"는 개별적인 세제 분자(단량체)가 자발적으로 미셀(미셀, 둥근 막대, 라멜라 구조 등)로 모이는 상기 계면활성제 또는 세제의 농도를 나타낸다.

"보존적인 아미노산 변형"이란 용어는 본 발명에 따른 지질 입자 또는 아포지방단백질의 특징에 영향을 미치지 않거나 상기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 서열의 변형을 나타낸다. 변형을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 위치 선택적 돌연변이 및 PCR-매개된 돌연변이에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적인 아미노산 변형은 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것들을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리들이 당해 분야에서 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 아이소류신), 및 방향족 측쇄(예를 들어 타이로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들을 포함한다. 따라서 "변이체" 단백질은 본 발명에서 "모" 단백질의 아미노산 서열로부터 아미노산 서열이 10 개 이하, 하나의 실시태양에서 약 2 내지 약 5 개의 첨가, 결실, 및/또는 치환에 의해 상이한 분자를 지칭한다. 아미노산 서열 변형을 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327], 및 [Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]에 개시된 바와 같은 분자 설계를 기본으로 하는 돌연변이에 의해 수행할 수 있다.

상이한 아미노산 서열들의 상동성 및 동일성을 널리 공지된 연산, 예를 들어 BLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80, BLOSUM 85, 또는 BLOSUM 90을 사용하여 계산할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 연산은 BLOSUM 30이다.

상기 지질 입자의 형성을, 상기 아포지방단백질을 세제 용해된 지질과 이들의 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 수행할 수 있다. "세제"란 용어는 표면 활성 화학 물질을 나타낸다. "세제"는 일반적으로 비-극성, 소수성 부분 및 극성, 친수성 부분을 갖는 양친성 분자이다. "쯔비터이온성 세제"란 용어는 전체적으로 0의 전하를 갖고 동시에 하나 이상의 양으로 하전된 부분과 하나 이상의 음으로 하전된 부분을 포함하는 표면 활성 화학 화합물을 나타낸다. 하나의 실시태양에서 상기 세제는 당-기재 세제, 폴리옥시알킬렌-기재 세제, 담즙-염 기재 세제, 합성 세제 및 이들의 조합 중에서 선택된다. "당-기재 세제"란 용어는 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드, n-노닐-베타-D-글루코피라노사이드, n-도데실-베타-D-말토피라노사이드, 또는 5-사이클로헥실펜틸-베타-D-말토피라노사이드, 및 이들의 유도체 중에서 선택된 세제를 나타낸다. "담즙-염 기재 세제"란 용어는 나트륨 콜레이트, 칼륨 콜레이트, 리튬 콜레이트, 3-[(3-클로로아미도프로필) 다이메틸암모니오]-일-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-클로로아미도프로필) 다이메틸암모니오]-2-하이드록실 프로판 설포네이트(CHAPSO), 및 이들의 유도체 중에서 선택된 세제를 나타낸다. "폴리옥시알킬렌-기재 세제"란 용어는 트윈(Tween) 20, 트리톤(Triton) X-100, 플루로닉(Pluronic) F68, 및 이들의 유도체 중에서 선택된 세제를 나타낸다. "합성 세제"란 용어는 쯔비터전트 3-6, 쯔비터전트 3-8, 쯔비터전트 3-10, 쯔비터전트 3-12, 및 이들의 유도체 중에서 선택된 세제를 나타낸다.

작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"은 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기 위해, 필요한 투여량으로 필요한 기간 동안에 유효한 양을 지칭한다.

"고밀도 지방단백질 입자"란 용어 또는 호환적으로 사용될 수 있는 이의 약어 "HDL 입자"는 주 단백질성 화합물로서 아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질-단백질-복합체를 나타낸다.

"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어들은 호환적으로 사용되며 외부 핵산이 도입된 세포를 지칭하며, 상기와 같은 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이들은 계대 수에 상관없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래한 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일할 필요는 없으나, 돌연변이를 포함할 수도 있다. 최초에 형질전환된 세포에서 선별되거나 선택된 바와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본 발명에 포함된다.

"지질 유출물 증가"란 용어 및 이의 문법적인 상당 어구는 세포 또는 플라크로부터의 지질 유출물의 증가된 수준 및/또는 비율, 지질 유출물의 증진, 지질 유출물의 향상, 지질 유출물의 촉진, 지질 유출물의 상향조절, 지질 유출물의 개선 및/또는 지질 유출물의 증대를 나타낸다. 하나의 실시태양에서, 상기 지질 유출물은 인지질, 트라이글리세라이드, 콜레스테롤, 및/또는 콜레스테롤 에스터의 유출물을 포함한다.

"개인" 또는 "대상"은 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서 상기 개인 또는 대상은 인간이다.

"DPPC"란 용어는 인지질 1,2-다이-팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(또한 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린으로서 지칭된다)을 나타낸다.

"다량체"란 용어는 2 개 이상의 단량체들로 이루어지는 복합체를 나타낸다. 다량체는 상기 단량체들 간의 비-공유 상호작용에 의해 형성된다. 각각의 단량체는 다량체화 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 다량체는 2 또는 3 개의 단량체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 각각의 단량체 중에 포함된 개별적인 다량체화 도메인들 간의 비-공유 상호작용을 통해 상호작용한다. "다량체화 도메인"이란 용어는 2 개 이상의 단량체성 분자들을 공유적으로 또는 비-공유적으로 회합시킬 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 다량체화 도메인은 상이하거나, 유사하거나, 동일한 아미노산 서열의 다량체화 도메인들과 상호작용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 서열번호 53의 공통 아미노산 서열과 68% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소 또는 이의 유도체이다. 하나의 실시태양에서 서열번호 53의 50 번 위치의 시스테인 잔기가 상이한 아미노산 잔기에 의해, 또 다른 실시태양에서 세린 잔기, 또는 쓰레오닌 잔기, 또는 메티오닌 잔기에 의해 치환된다. 다량체화 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 다량체화 도메인을 또한 포함하는 하나 이상의 다른 폴리펩타이드와 회합할 수 있다. 상기 다량체 형성을 단순히 상기 폴리펩타이드들을 적합한 조건 하에서 혼합함으로써 개시시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지며 상기 서열에서 1 내지 10 개의 잔기가 상기 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단으로부터 결실되거나 상기 말단에 첨가되었다. 추가의 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지며 상기 서열에서 6 개 또는 9 개의 아미노산 잔기가 상기 아미노산 서열의 N-말단으로부터 결실되었다. 더욱 또 다른 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 가지며 상기 서열에서 N-말단 아미노산 잔기 L 또는 N-말단 아미노산 잔기 C 및 L이 결실되었다. 하나의 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소이며 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는다. 상기 다량체는 하나의 실시태양에서 호모머(homomer)이다.

상기 다량체는 호모머 또는 헤테로머(heteromer)일 수 있는데, 그 이유는 다량체화 도메인을 포함하는 상이한 아포지방단백질들을 결합시켜 다량체에 통합시킬 수 있기 때문이다. 하나의 실시태양에서 상기 다량체는 삼량체성 호모머이다.

하나의 실시태양에 따라 상기 다량체화 도메인을 테트라넥틴으로부터 획득한다. 하나의 실시태양에서 상기 다량체화 도메인은 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소를 포함한다. 상기 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소의 삼량체화 효과는 삼량체를 형성하는 2 개의 다른 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소들의 나선형 코일 구조와 상호작용하는 나선형 코일 구조에 의해 유발된다. 상기 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소를 인간 테트라넥틴으로부터, 토끼 테트라넥틴으로부터, 쥐 테트라넥틴으로부터, 또는 상어 연골의 C-형 렉틴으로부터 획득할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 서열번호 53의 공통 서열과 68% 이상, 또는 75% 이상, 또는 81% 이상, 또는 87% 이상, 또는 92% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.

"비-공유 상호작용"이란 용어는 비-공유 결합력, 예를 들어 이온성 상호작용력(예를 들어 염 가교), 비-이온성 상호작용력(예를 들어 수소-결합), 또는 소수성 상호작용력(예를 들어 반-데르-발스력 또는 π-적층 상호작용)을 나타낸다.

기준 폴리펩타이드 서열에 대한 "아미노산 서열 일치 퍼센트(%)"는, 최대의 서열 일치 퍼센트를 성취하기 위해, 상기 서열 일치 부분으로서 임의의 보존적인 치환들은 고려하지 않고, 필요한 경우 상기 서열들을 정렬하고 간격을 도입시킨 후에, 상기 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적합한 매개변수들을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치% 값들을 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 발생시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 고안되었고, 소스 코드는 미국 저작권 사무소(미국 20559 워싱톤 디씨 소재)에서 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 상기 사무소에 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수하거나, 상기 소스 코드로부터 수집할 수도 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 운영 체계상에서 사용하기 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.

ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 A의, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 또는 B와의, 또는 B에 대비한 아미노산 서열 일치%(이를 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 또는 B와, 또는 B에 대비하여 일정%의 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현할 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:

100 x 분율 X/Y

이때, X는 A와 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 동일한 합치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 총 수이다. 상기 아미노산 서열 A의 길이가 상기 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 일치%는 A에 대한 B의 아미노산 서열 일치%와 동일하지 않을 것이다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 아미노산 서열 일치%를 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 단락에서 개시한 바와 같이 획득한다.

"약학 제형"이란 용어는, 함유된 활성 성분의 생물 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형을 투여하려는 대상에게 허용할 수 없이 독성인 추가적인 성분들은 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약학적으로 허용가능한 담체"는 대상에게 무독성인, 활성 성분 이외의, 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.

"포스파티딜콜린"이란 용어는 하나의 글리세롤 부분, 2 개의 카복실산 부분 및 하나의 포스포콜린 부분으로 이루어지는 분자를 나타내며, 이때 상기 글리세롤 부분은 에스터 결합, 즉 2 개의 카복실산 에스터 결합 및 하나의 인산 에스터 결합에 의해 각각 다른 부분들에 공유 결합되며, 이에 의해 상기 인산 에스터는 상기 글리세롤 부분의 1-하이드록실 기 또는 3-하이드록실 기에 결합한다. "카복실산 부분"이란 용어는 하나 이상의 아실 기(R-C(O)O)을 포함하는 유기 부분을 나타낸다. 상기 포스파티딜콜린은 임의의 종류 또는 임의의 공급원을 가질 수도 있다. 하나의 실시태양에서 상기 포스파티딜콜린은 계란 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 다이팔미토일 포스파티딜콜린, 다이미리스토일 포스파티딜콜린, 다이스테아로일 포스파티딜콜린, 다이라우릴 포스파티딜콜린, 다이팔미토일 포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 다이올레오일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 및 이들의 유사체 및 유도체 중에서 선택된다.

본 발명에 사용된 바와 같은 모든 인지질들은 임의의 공급원, 즉 (적합한 경우)대두, 우유, 계란 또는 심지어 인간을 제외한 동물의 내장 기관으로부터 유래할 수도 있으며, 이들 인지질은 천연 기원, 또는 반-합성 또는 심지어 완전히 합성으로부터 유도될 수도 있다.

"POPC"란 용어는 인지질 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(또한 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린으로서 지칭됨)을 나타낸다.

본 발명에 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적인 어미 변화들, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 개인의 자연적인 치료 과정을 변경시키고자 하는 임상적인 중재를 지칭하며 예방을 위해서 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.

"변이체"란 용어는 본 발명에 보고된 바와 같은 아포지방단백질 또는 아포지방단백질 유사물질의 변이체를 또한 포함하며, 이때 상기 변이체에서 상기 각각의 아포지방단백질 또는 아포지방단백질 유사물질의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 상기 변형은 아포지방단백질 수용체 또는 아포지방단백질 전환 효소에 대한 상기 아포지방단백질의 친화성을 증가 또는 감소시키거나, 각각의 아포지방단백질에 비해 상기 아포지방단백질 변이체의 안정성을 증가시키거나, 각각의 아포지방단백질에 비해 상기 아포지방단백질 변이체의 수용액에 대한 용해도를 증가시키거나, 각각의 아포지방단백질에 비해 상기 아포지방단백질 변이체의 숙주 세포 중의/숙주 세포에 의한 재조합 생산을 증가시킬 수도 있다.

지질 입자

본 발명에서 a) 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, b) 포스파티딜콜린, 및 c) 추가의 지질을 포함하는 지질 입자를 보고한다.

하나의 실시태양에서, 상기 지질 입자는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 제 1 포스파티딜콜린 및 제 2 포스파티딜콜린을 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 제 1 포스파티딜콜린과 상기 제 2 포스파티딜콜린은 상기 포스파티딜콜린의 포스포-글리세롤 주쇄에 에스터화된 하나 또는 2 개의 카복실산 부분 또는 카복실산 부분 유도체가 상이하다. 하나의 실시태양에서 상기 제 1 포스파티딜콜린은 POPC이고 상기 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I, 상기 포스파티딜콜린, 및 상기 지질 입자는 비-공유적으로 회합된다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 재조합적으로 생산된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I이다.

지질 조합의 선택은 아포지방단백질을 포함하는 지질 입자의 효능 및 간 안전성을 결정한다. 토끼를 사용하는 DMPC 함유 지질 입자의 생체 내 연구에서, 30 ㎎/㎏으로 처리한 토끼는 심한 부작용을 나타내었지만 생존한 반면, 100 ㎎/㎏으로 처리한 토끼는 죽는 것으로 밝혀졌다.

시험관 내 작용성 시험은 단일 포스파티딜콜린, 예를 들어 DPPC 또는 POPC를 함유하는 지질 입자가 LCAT를 활성화함을 입증하였다.

콜레스테롤 유출물은 상기 지질 입자가 상이한 인지질들의 조합을 포함한 경우 더 많음을 또한 입증하였다.

생체 내 토끼 연구를 위해 제조된 지질 조성이 상이한 인지질 조합
지질 입자의 생산을 위해 사용된 인지질 몰비	LCAT 기질	콜레스테롤 유출물
POPC	있음	있음
POPC : DPPC 3:1	있음	있음
POPC : DPPC 1:1	있음	있음
POPC : DPPC 1:3	없음	있음
DPPC	없음	있음

상기 결과는 또한 모든 조합들에 대한 콜레스테롤 가동성을 입증하는 생체 내 데이터에 의해 확인되었다. 그러나, 오직 단일 포스파티딜콜린 DPPC만을 함유하거나, DPPC와 스핑고마이엘린(SM)의 조합을 함유하는 지질 입자들의 경우 간 효소의 증가가 측정될 수 있다(도 1).

기술적 관점에서 순수한 DPPC를 갖는 지질 입자의 형성이 순수한 POPC를 갖는 상기 형성에 비해 더 편리하다. 침전물 형성의 위험성은 상이한 인지질들의 조합을 사용함으로써 감소된다. 또한 순수한 DPPC에 대한 41 ℃의 상 전이 온도는 4 ℃의 상 전이 온도를 갖는 순수한 POPC에 비해 상기 지질 입자를 더 제조하기 용이하게 한다. 또한 상기 수득된 생성물은 보다 균질하다. 이는 상기 단백질-지질 조성의 측정을 또한 허용하는 분석 도구인 SEC-MALLS를 통한 지질 입자 분석(단백질-접합체 분석)에 의해 확인될 수 있다. 도 2에서 크기-배제 크로마토그래피(UV280 검출)에서 분석된 샘플의 크로마토그램을 도시한다. 샘플의 불균질성을 다수의 분리되거나 반-분리된 피크의 존재에 의해 알 수 있다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 POPC 분자의 수는, 순수한 POPC를 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 40 내지 85이고, 하나의 실시태양에서 50 내지 80이고, 하나의 실시태양에서 54 내지 75이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 DPPC 분자의 수는, 순수한 DPPC를 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 50 내지 150이고, 하나의 실시태양에서 65 내지 135이고, 하나의 실시태양에서 76 내지 123이고, 하나의 실시태양에서 86 내지 102이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수는, 1:3 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 약 50 내지 약 120이고, 하나의 실시태양에서 약 65 내지 약 105이고, 하나의 실시태양에서 약 72 내지 약 96이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 1:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 50 내지 120이고, 하나의 실시태양에서 60 내지 100이고, 하나의 실시태양에서 71 내지 92이고, 하나의 실시태양에서 71 내지 85이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 50 내지 105이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 60 내지 95이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 60 내지 90이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 60 내지 88이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 62 내지 80이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 62 내지 86이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 64 내지 70이다.

상기 지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 지질 분자의 수는, 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 하나의 실시태양에서 약 66이다.

아포지방단백질 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 생산을 위해서 하나의 실시태양에서 1:40 내지 1:100의 아포지방단백질 대 POPC의 몰비를 사용하고, 하나의 실시태양에서 1:40 내지 1:80의 몰비를 사용하며, 하나의 실시태양에서 약 1:60의 몰비를 사용한다.

아포지방단백질 및 DPPC를 포함하는 지질 입자의 생산을 위해서 하나의 실시태양에서 1:70 내지 1:100의 아포지방단백질 대 DPPC의 몰비를 사용하고, 하나의 실시태양에서 1:80 내지 1:90의 몰비를 사용하며, 하나의 실시태양에서 약 1:80의 몰비를 사용한다.

아포지방단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 생산을 위해서 하나의 실시태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지방단백질 대 POPC 및 DPPC(이때 POPC 및 DPPC는 1:3의 몰비이다)의 몰비를 사용하고, 하나의 실시태양에서 1:70 내지 1:90의 몰비를 사용하며, 하나의 실시태양에서 약 1:80의 몰비를 사용한다.

아포지방단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 생산을 위해서 하나의 실시태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지방단백질 대 POPC 및 DPPC(이때 POPC 및 DPPC는 1:1의 몰비이다)의 몰비를 사용하고, 하나의 실시태양에서 1:60 내지 1:80의 몰비를 사용하며, 하나의 실시태양에서 약 1:70의 몰비를 사용한다.

아포지방단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 생산을 위해서 하나의 실시태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지방단백질 대 POPC 및 DPPC(이때 POPC 및 DPPC는 3:1의 몰비이다)의 몰비를 사용하고, 하나의 실시태양에서 1:50 내지 1:70의 몰비를 사용하며, 하나의 실시태양에서 약 1:60의 몰비를 사용한다.

하나의 실시태양에서 지질들의 혼합물을 상기 지질 입자의 생산에 사용하는 경우 상기 혼합물은 4 ℃ 내지 45 ℃, 하나의 실시태양에서 10 ℃ 내지 38 ℃, 및 하나의 실시태양에서 15 ℃ 내지 35 ℃의 상 전이 온도를 갖는다.

상기 지질 입자는 하나의 실시태양에서 지질 입자당 평균 1 내지 10의 아포지방단백질 분자 수, 하나의 실시태양에서 지질입자당 평균 1 내지 8의 아포지방단백질 분자 수, 및 하나의 실시태양에서 지질 입자당 평균 1 내지 4의 아포지방단백질 분자 수를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 지질 입자당 평균 1 이상, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9, 또는 10의 아포지방단백질 분자 수를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 평균수는 1이다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 상기 아포지방단백질 이외에 하나 이상의 추가의 폴리펩타이드를 포함한다.

제한하는 것은 아니지만, 상기 지질 입자는 효소적 보조-인자 및/또는 지질, 특히 콜레스테롤을 흡수하기 위한 담체로서 작용할 수도 있다.

하나 이상의 세제가 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자 중에 존재할 수 있다. 상기와 같은 세제는 임의의 세제, 즉 약학적으로 허용가능한 세제 또는 무독성 농도의 다른 세제, 예를 들어 비-이온성 또는 이온성 세제일 수 있다. 상기 비-이온성 세제는 하나 이상의 하이드록실 기를 함유하는 유기 화합물의 알킬렌 옥사이드 유도체일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 비-이온성 세제는 에톡실화 및/또는 프로폭실화된 알콜 또는 에스터 화합물 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서 상기 에스터는 솔비톨 및 지방산의 에스터, 예를 들어 솔비탄 모노올리에이트 또는 솔비탄 모노팔미테이트, 유성 슈크로스 에스터, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 스테롤 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리프로폭시 알킬 에테르, 블록 중합체 및 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 피마자유 또는 수소화된 피마자유 유도체 및 폴리글리세린 지방산 에스터 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 비-이온성 세제는 플루로닉(등록상표), 폴록사머(Poloxamer)(등록상표), 스판(Span)(등록상표), 트윈(등록상표), 폴리솔베이트(Polysorbate)(등록상표), 타이록사폴(Tyloxapol)(등록상표), 이멀포어(Emulphor)(등록상표) 및 크레모포어(Cremophor)(등록상표) 중에서 선택된다.

상기 이온성 세제는 담관 작용제일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 이온성 세제는 콜산 및 데옥시콜산, 및 이들의 염 및 유도체, 및 유리 지방산, 예를 들어 올레산, 리놀레산 및 다른 것들 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서 상기 이온성 세제는 C₁₀-C₂₄ 알킬아민 및 알칸올아민 및 양이온성 콜레스테롤 에스터와 같은 양이온성 지질 중에서 선택된다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 0.75 중량% 미만의 세제를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 지질 입자는 0.3 중량% 미만의 세제를 포함한다.

하나의 실시태양에서 상기 세제는 당-기재 세제, 폴리옥시알킬렌-기재 세제, 담즙-염 세제, 합성 세제, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 세제는 콜산이다.

콜레스테롤을 혈액 내로 가동화하는 효율은 생체 내 아포지방단백질의 투여 후 아포지방단백질 농도와 총 콜레스테롤의 각각의 회유(excursion)를 비교함으로써 측정될 수 있다. 정량적인 평가를 위해서, 총 콜레스테롤의 농도 시간 곡선 하 기준선 보정 면적(AUC)과 아포지방단백질의 농도-시간 곡선 하 면적의 몫을 계산하였다.

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 특히 서열번호 1의 테트라넥틴-아포지방단백질 및 3:1 몰비의 POPC 및 DPPC를 포함하는 지질 입자는 생체 내에서 증대된 콜레스테롤 가동화(mobilization)를 나타낸다.

테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I

상기 개략된 바와 같은 지질 입자 외에 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 또한 본 발명에서 보고한다.

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 인간 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소 및 야생형 인간 아포지방단백질 A-I의 융합 단백질이다. 상기 인간 테트라넥틴 부분의 아미노산 서열을 천연 절두 부위인 10 번 위치의 아이소류신 잔기에서 시작하여 처음 9 개 아미노산에 의해 단축시킬 수 있다. 상기 절두의 결과로서, 4 번 위치의 쓰레오닌 잔기에서 O-글리코실화 부위가 결실되었다. 상기 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소와 인간 아포지방단백질 A-I 사이에서 5 개의 아미노산 잔기 "SLKGS"(서열번호 3)가 제거되었다.

개선된 발현 및 정제를 위해서 N-말단 정제 태그, 예를 들어 헥사히스티딘-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조물을 생성시킬 수 있다. 상기 특이적인 절단의 결과로서 2 개의 아미노산, 즉 첫 번째로서 알라닌 또는 글리세린 또는 세린 또는 프롤린 및 두 번째로서 프롤린이 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 N-말단에서 유지된다. 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.

상기 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 상기 개별적인 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체들 각각의 사이의 비-공유 상호작용에 의해 구성되는 삼량체성 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 다량체의 형성을 허용하는 도메인을 제공한다.

또 다른 정제 방법을 사용함으로써, 정제-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 생략시켜 서열번호 2의 아미노산 서열의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 생성시킬 수 있다.

하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 보존적인 아미노산 치환을 포함하는 변이체일 수 있다.

아포지방단백질 A-I를 효소에 의해, NMR 분광학을 통해, 또는 단클론성 또는 다클론성 항-아포지방단백질-A-I 항체에 의해 측정할 수 있다. 따라서 본 발명에 보고된 바와 같은 다른 태양들은 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I와 특이적으로 결합하는 다클론성 및 단클론성 항체이다. 상기와 같은 항체들을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다. 또한 면역분석에 사용하기 위한 상기 항체들의 표지화를 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법으로 수행할 수 있다.

하나의 실시태양에서 상기 아포지방단백질은 보존적인 아미노산 치환을 포함하는 변이체, 또는 아포지방단백질 A-I 유사물질일 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 서열번호 2, 또는 서열번호 66, 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 가지며, 이때 X는 서열번호 68 내지 서열번호 105 중에서 선택된다.

따라서, 하나의 실시태양에서 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 IVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 (A,G,S,T)PIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(서열번호 66)의 아미노산 서열을 갖는다.

하나의 실시태양에서, 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 (M)HHHHHHXIVNAKKDVVNTKMFEELKSRLDTLAQEVALLKEQQALQTVDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(서열번호 67)의 아미노산 서열을 가지며, 이때 X는 하기의 아미노산 서열 A, G, S, P, AP, GP, SP, PP, GSAP(서열번호 68), GSGP(서열번호 69), GSSP(서열번호 70), GSPP(서열번호 71), GGGS(서열번호 72), GGGGS(서열번호 73), GGGSGGGS(서열번호 74), GGGGSGGGGS(서열번호 75), GGGSGGGSGGGS(서열번호 76), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 77), GGGSAP(서열번호 78), GGGSGP(서열번호 79), GGGSSP(서열번호 80), GGGSPP(서열번호 81), GGGGSAP(서열번호 82), GGGGSGP(서열번호 83), GGGGSSP(서열번호 84), GGGGSPP(서열번호 85), GGGSGGGSAP(서열번호 86), GGGSGGGSGP(서열번호 87), GGGSGGGSSP(서열번호 88), GGGSGGGSPP(서열번호 89), GGGSGGGSGGGSAP(서열번호 90), GGGSGGGSGGGSGP(서열번호 91), GGGSGGGSGGGSSP(서열번호 92), GGGSGGGSGGGSPP(서열번호 93), GGGGSAP(서열번호 94), GGGGSGP(서열번호 95), GGGGSSP(서열번호 96), GGGGSPP(서열번호 97), GGGGSGGGGSAP(서열번호 98), GGGGSGGGGSGP(서열번호 99), GGGGSGGGGSSP(서열번호 100), GGGGSGGGGSPP(서열번호 101), GGGGSGGGGSGGGGSAP(서열번호 102), GGGGSGGGGSGGGGSGP(서열번호 103), GGGGSGGGGSGGGGSSP(서열번호 104), 및 GGGGSGGGGSGGGGSPP(서열번호 105)중 어느 하나일 수 있다.

폴리펩타이드가 에스케리키라 콜라이 균주에서 재조합적으로 생산되는 경우 N-말단 메티오닌 잔기는 대개 에스케리키아 콜라이 프로테아제에 의해 효율적으로 절단되지 않음을 알아야 한다. 따라서, 상기 N-말단 메티오닌 잔기는 상기 생산된 폴리펩타이드 중에 부분적으로 존재한다.

성질:

본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자를 비-정상적인 지질 수준 또는 체 성분 내 지질의 침착물, 예를 들어 혈관 중 플라크를 특징으로 하는 질병 또는 상태의 치료 및/또는 진단에 사용할 수 있다.

LCAT 촉매화된 콜레스테롤 에스터화를 지지하는 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자의 능력을 측정하기 위해서 콜레스테롤을 에탄올성 콜레스테롤 용액의 첨가에 의해 상기 지질 입자에 통합시킬 수 있다. 순수한 POPC를 함유하는 지질 입자가 이의 아포지방단백질 구성성분과 관계없이 DPPC를 함유하는 복합체, 예를 들어 야생형 아포지방단백질 A-I 또는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I보다 더 양호한 LCAT 기질이다(도 3).

POPC 및 DPPC의 상이한 혼합물들을 포함하는 지질 입자에서 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도는 혼합물이 단일의 순수한 포스파티딜콜린보다 더 양호한 LCAT 기질임을 보인다. 이는 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도로부터 알 수 있다(표 2 및 도 4를 참조하시오).

인지질의 상이한 혼합물들을 포함하는 지질 입자에서 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도
지질 입자의 생산에 사용되는 인지질 몰비	K m [μM]	V max [nmol 에스터/h/㎍ LCAT ]
POPC	4.6	1.6
POPC:DPPC 3:1	0.4	1.9
POPC:DPPC 1:1	0.5	1.8
POPC:DPPC 1:3	1.0	1.7
DPPC	0.9	1.8

THP-1 단구성 백혈병 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트에 노출시킴으로써 수득하고 방사성 표지된 콜레스테롤 추적자를 실은 인간 THP1 세포와 같은 대식세포를 콜레스테롤 수용체 시험 화합물에 노출시킬 수 있다.

수용체 시험 화합물에 의해 유도된 유출 속도를, 상등액 중의 콜레스테롤 방사성 대 세포 + 이의 상등액 중의 방사성의 합의 비로서 계산하고 수용체를 함유하지 않는 배지에 노출된 세포와 비교하고 선형 적합도에 의해 분석하였다. 병행 실험을, 주로 ABCA-1을 상향조절하고 ABCA-1 매개된 수송 쪽으로 유출을 편향시키는 것으로 공지된 RXR-LXR 작용물질에 노출된 세포 및 이에 노출되지 않은 세포를 사용하여 수행하였다.

RXR-LXR 지질 입자로 전-처리되지 않은 세포에서, 지질화되지 않은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I에 의해 획득된 유출에 비해 더 높은 콜레스테롤 유출의 증가를 볼 수 있다. 유출에 대한 상기 지질 혼합물의 단지 작은 영향만이 상기 일련의 시험에서 관찰될 수 있다(도 5). 지질화되지 않은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 사용하여, RXR-LXR로 전-처리된 세포에서 필적할만한 콜레스테롤 유출의 증가를 볼 수 있다. 전체적인 증가는 전-처리되지 않은 세포에 대해 관찰된 경우에 비해 더 높았다. 유출에 대한 상기 지질 혼합물의 단지 작은 영향만이 상기 일련의 시험에서 관찰될 수 있다(도 6).

상이한 지질 입자들을 토끼에서 생체 내 시험하였다. 상기 지질 입자를 정맥 내 주입으로서 적용하고 일련의 혈액 샘플링을 적용 후 96 시간에 걸쳐 수행하였다. 간 효소, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 에스터의 값들을 측정하였다. 혈장 농도는 초기 분포 상을 포함하여 모든 시험된 지질 입자들의 경우 필적하였으며 이어서 혈장 농도의 로그-선형 하락이 이어졌다(도 7). 표 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 약동학적 매개변수들은 모든 시험 화합물들에 대해 유사하다. 관찰된 반감기들은 1.5일에 가깝다.

측정된 약동학적 매개변수들
지질 입자의 생산에 사용된 인지질 몰비	C L [ ml /h/ kg ]	V ss [ ml / kg ]	T 1 /2 [h]	C max [ mg / ml ]
POPC	0.89±0.22	45.0±2.5	36.9±8.2	2.40±0.19
POPC:DPPC 3:1	0.82±0.06	37.8±5.6	34.2±4.5	2.65±0.28
POPC:DPPC 1:1	0.85±0.14	43.1±5.9	38.6±10.6	2.34±0.31
DPPC	0.96±0.10	37.8±4.9	30.2±7.7	2.29±0.19
DPPC:SM 9:1	1.28±0.62	50.7±8.7	31.3±8.2	1.91±0.33

도 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 콜레스테롤은 혈장 중에서 가동화되고 에스터화된다. 혈장 콜레스테롤 수준은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 농도가 이미 감소하고 있는 후에조차 계속해서 증가한다. 혈장 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 수준이 약 0.5 ㎎/㎖(정상적인 야생형 아포지방단백질 A-I의 약 50%)까지 감소한 경우, 증가된 콜레스테롤 에스터 수준을 여전히 검출할 수 있다.

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자는 도 1 및 9로부터 알 수 있는 바와 같이 토끼에서 뿐만 아니라 마우스에서 간 효소를 유도하지 않는다. 또한 정맥 내 적용 후 2 시간째에 수득한 혈장 샘플에서 용혈을 측정할 수 없다(도 10).

따라서 본 발명에 보고된 바와 같은 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자, 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 약학 조성물 및 진단 조성물이다.

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자는 지질화되지 않은 아포지방단백질 및 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 다른 지질 입자들에 비해 개선된 생체 내 성질을 갖는다.

상이한 아포지방단백질 및 지질 입자의 생체 내 성질
단백질	지질 입자에 포함되는 것	적용되는 대상	최고 적용 용량	급성 간 독성학적 효과	참고문헌
아포지방단백질 A-I 돌연변이체	입자 없음	래트	경구, 1 g/kg	500 mg/kg 까지 독성 효과 없음	US 2005/0287636
A-I, 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	DMPC	마우스	i.v. 1 내지 1.2 mg/마우스	개시되지 않음	WO 2002/38609; Graversen, (2008)
프로 아포지방단백질 A-I	SM	보고되지 않음	보고되지 않음	주사, 200 mg/kg의 용량에서 독성	WO 2003/096983
아포지방단백질 A-I	PG/SM	토끼	i.v. 15 mg/kg	개시되지 않음	WO 2006/100567
아포지방단백질 A-I	PC (대두)	인간	80 mg/kg	간 기능 시험 이상(알라닌 아미노트랜스퍼라제가 10 배 증가함)으로 인해 처리 군이 조기 중단되었음	WO 2007/137400
아포지방단백질 A-I 밀라노 변이체	POPC	인간	45 mg/kg	상승된 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 수준(정상의 상한의 3x)의 발생으로 인해 한 명의 환자가 철회됨	Nissen, S.E., et al., JAMA 290 (2003) 2292-2300
테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	DMPC	토끼	100 mg/kg	모든 시험된 동물에서 3 내지 4 시간 후 사망
테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	POPC/DPPC	토끼	100 mg/kg	증가가 관찰되지 않음
테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	POPC/DPPC	래트	i.v. 500 mg/kg	증가가 관찰되지 않음
테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	POPC/DPPC	키노몰구스 원숭이	i.v. 200 mg/kg	증가가 관찰되지 않음

지질 입자의 형성

본 발명에 보고된 바와 같은 지질 입자의 형성에 대해서 상이한 방법들, 예를 들어 동결-건조, 동결-해동, 세제 용해에 이은 투석, 미세유동화, 초음파 처리, 및 균질화가 공지되어 있다.

예를 들어 인지질과 세제와의 수성 혼합물을 정제된 아포지방단백질과 배양할 수 있다. 상기 아포지방단백질을 고유한 형태로 첨가할 수 있다. 그 후에 상기 세제를 투석 또는 정용여과에 의해 제거한다. 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자의 형성을, 단량체성 또는 다량체성 형태의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 세제 용해된 지질과 이들 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 성취할 수 있다. 투석에 의한 상기 세제의 제거 결과 지질 입자가 형성된다. 아포지방단백질을 함유하는 지질 입자의 통상적인 형성 방법은 예를 들어 문헌[Jonas, A., Methods Enzymol. 128 (1986) 553-582] 또는 [Experimental Lung Res. 6 (1984) 255-270]에 개시된 바와 같은 콜레이트 방법을 기본으로 한다. 투석에 의한 상기 세제의 제거 결과 지질 입자가 형성된다.

상기 지질 입자 형성에 대해 고려해야 하는 주된 요점은 i) 생물 활성에 대한 요건, 및 ii) 상기 지질 입자의 제조용이성(manufacturability)에 관한 기술적 요건이다. 아포지방단백질을 포함하는 지질 입자의 형성에 대해 이들 요건은 상반된 방향을 가리킨다.

기술적 관점으로부터 16 개 이하의 탄소 원자의 쇄를 갖는 카복실산 부분을 함유하는 포화된 인지질(예를 들어 다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DPPC; 다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DMPC 등)을 선택할 것이다. 이와 대조적으로 생물학적 데이터로부터 16 개 이상의 탄소 원자의 쇄를 갖는 카복실산 부분을 함유하는 불포화된 인지질(예를 들어 팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, POPC; 스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, SOPC)이 보다 유효하고 비-간독성임을 추정할 수 있다.

포스파티딜콜린 DPPC 및 POPC 및 이들의 혼합물을 아포지방단백질을 함유하는 지질 입자의 형성에 사용할 수 있다. 이들 예시적인 포스파티딜콜린은 하나의 카복실산 부분이 상이하며 포스포글리세롤 주쇄에 에스터화된 하나의 동일한 카복실산 부분을 갖는다. 상기 지질 입자의 제조는 DPPC를 사용하는 경우 더 용이하였다. 대조적으로 POPC는 시험관 내 작용 분석에서, 특히 가동화된 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스터로의 전환에 필요한 레시틴 콜레스테롤 아세틸 트랜스퍼라제(LCAT) 효소의 활성화를 위한 기질로서 보다 유효하였다. 상이한 몰비의 2 개의 포스파티딜콜린, 예를 들어 POPC 및 DPPC의 혼합물을 포함하는 지질 입자가 단지 하나의 포스파티딜콜린만을 포함하는 지질 입자에 비해 개선된 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 도 4를 참조하시오).

인간 HDL 입자로부터 유도된 재조합 아포지방단백질 또는 탈지질화된 아포지방단백질로부터 지질 입자를 재조성하는 상이한 방법들이 보고되었다(HDL = 고밀도 지방단백질). 예를 들어 인지질과 세제와의 수성 혼합물을 정제된 아포지방단백질과 배양한다. 상기 아포지방단백질을 고유한 형태로 첨가한다. 그 후에 상기 세제를 투석 또는 정용여과에 의해 제거한다. 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자의 형성을, 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 또는 이의 다량체를 세제 용해된 지질과 이들 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 성취할 수 있다. 투석에 의한 상기 세제의 제거 결과 지질 입자가 형성된다.

상기 지질 입자를 침전 및/또는 크로마토그래피 단계의 조합에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어 과잉의 세제, 즉 상기 지질 입자의 부분이 아닌 세제를 소수성 흡착 크로마토그래피 단계에 의해 제거할 수 있다. 상기 지질 입자를 세제-비함유 용액에 의해 상기 소수성 흡착 물질로부터 회수할 수 있다.

본 발명의 이해를 돕기 위해서 하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타낸다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 나타낸 과정으로 변형을 수행할 수 있는 것으로 생각된다.

서열 목록의 설명

서열번호 1 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I(1).

서열번호 2 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I(2).

서열번호 3 절제된 펩타이드.

서열번호 4 아포지방단백질 A-I 유사물질(1).

서열번호 5 아포지방단백질 A-I 유사물질(2).

서열번호 6 인간 아포지방단백질 A-I.

서열번호 7 인간 아포지방단백질 A-II.

서열번호 8 인간 아포지방단백질 A-IV.

서열번호 9 인간 아포지방단백질 A-V.

서열번호 10 인간 아포지방단백질 C-I.

서열번호 11 인간 아포지방단백질 C-II.

서열번호 12 인간 아포지방단백질 C-III.

서열번호 13 인간 아포지방단백질 C-IV.

서열번호 14 인간 아포지방단백질 D.

서열번호 15 인간 아포지방단백질 E.

서열번호 16 인간 아포지방단백질 F.

서열번호 17 인간 아포지방단백질 H.

서열번호 18 인간 아포지방단백질 L-I.

서열번호 19 인간 아포지방단백질 L-II.

서열번호 20 인간아포지방단백질 L-III.

서열번호 21 인간 아포지방단백질 L-IV.

서열번호 22 인간 아포지방단백질 L-V.

서열번호 23 인간 아포지방단백질 L-VI.

서열번호 24 인간 아포지방단백질 M.

서열번호 25 인간 아포지방단백질 O.

서열번호 26 인간 아포지방단백질 OL.

서열번호 27 인간 아포지방단백질 clus.

서열번호 28 내지 52 아포지방단백질.

서열번호 53 인간 테트라넥틴 삼량체화 도메인.

서열번호 54 단축된 인간 테트라넥틴 삼량체화 도메인.

서열번호 55 인간 인터페론 단편.

서열번호 56 헥사히스티딘 태그.

서열번호 57 융합 단백질.

서열번호 58 프라이머 N1.

서열번호 59 프라이머 N2.

서열번호 60 내지 65 IgA 프로테아제 절단 부위.

서열번호 66 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I.

서열번호 67 his-태그를 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I.

서열번호 68 내지 105 링커.

물질 및 방법

크기-배제- HPLC :

크로마토그래피를 ASI-100 HPLC 시스템(다이오넥스(Dionex), 독일 이드스타인 소재) 상에서 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼으로 수행하였다. 용출 피크를 UV 다이오드 배열 검출기(다이오넥스)에 의해 280 ㎚에서 모니터링하였다. 상기 농축된 샘플을 1 ㎎/㎖로 용해 후에 상기 컬럼을 200 mM 인산 이수소 칼륨 및 250 mM 염화 칼륨 pH 7.0으로 이루어진 완충제로 안정한 기준선이 성취될 때까지 세척하였다. 상기 분석 실행을 실온에서 30 분에 걸쳐 0.5 ㎖/분의 유속을 사용하여 등용매 조건 하에서 수행하였다. 상기 크로마토그램들을 크로멜레온(Chromeleon)(다이오넥스, 독일 이드스타인 소재)으로 수동으로 적분하였다. 응집%를 고 분자량 형태의 곡선 하 면적(AUC)과 단량체 피크의 AUC를 비교함으로써 측정하였다.

동적 광 산란( DLS ):

DLS는 입자 크기, 전형적으로는 서브마이크론 크기 범위로 입자 크기를 측정하기 위한 비-침습적인 기법이다. 본 발명에서 온도 조절 석영 큐벳(25 ℃)이 있는 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) S 장치(맬번 인스트루먼츠(Malvern Instruments, 영국 워세스터셔 소재)를 1 ㎚ 내지 6 ㎛의 크기 범위를 모니터링하기 위해 사용하였다. 상기 역 산란된 레이저 광의 강도를 173°의 각도로 검출하였다. 상기 강도는 입자 확산 속도에 의존하는 속도로 변동하며, 상기 속도는 차례로 입자 크기에 의해 좌우된다. 따라서 입자 크기 데이터를 산란된 광 강도의 변동 분석으로부터 생성시킬 수 있다(문헌[Dahneke, B.E. (ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983)]; [Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)]). 강도에 의한 크기 분포를 DTS 소프트웨어(맬번)의 다중 협폭 방식을 사용하여 계산하였다. 실험을 희석되지 않은 샘플로 수행하였다.

SEC - MALLS :

SEC-MALLS는 크기 배제 크로마토그래피와 3 개의 검출기 시스템, 즉 i) UV 검출, ii) 굴절률 검출 및 iii) 광 산란 검출과의 조합이다. 크기에 의한 분리를 위해서 GE 헬쓰케어(Healthcare)로부터의 슈퍼로스(Superose) 6 컬럼 10/300 GL 컬럼을 사용한다. 상기 방법을 0.4 ㎖/분의 유속을 적용하여 PBS 완충제 pH 7.4로 등용매에 의해 실시한다. 3 개의 검출기 시스템을 직렬로 연결한다. 완전한 지질 입자(단백질-지질 입자) 신호를 상기 굴절률 검출기에 의해 모니터링하는 반면 280 ㎚에서 측정된 UV 흡광도는 상기 단백질 부분에 의해 유도된 신호를 측정한다. 상기 지질 분획의 비율을 상기 완전한 신호로부터 단백질 UV 신호의 단순한 공제에 의해 획득한다. 광 산란의 적용은 각각의 종들의 분자 질량의 검출을 허용하며, 따라서 상기 지질 입자의 완전하고 상세한 설명을 허용한다.

세제 측정:

잔류 세제의 측정을 증발 광 산란 검출기(RP-ELSD)와 결합된 역상 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 컬럼으로서 페노메넥스(Phenomenex)(독일 아챠펜부르크 소재)로부터의 루나(Luna) C18 4.6 x 150 ㎜, 5 ㎛, 100 Å을 사용하였다. 10 kDa 멤브레인을 통한 원심분리 후에 90 ㎕의 관류를 HPLC 분리에 사용하였다. 용출을 0.1%(v/v) 트라이플루오로 아세트산을 함유하는 74%(v/v) 메탄올 용액을 사용하여 등용매 조건 하에서 수행하였다. 컬럼 온도를 30 ℃로 설정하였다. 검출을 30 ℃의 분무 온도, 80 ℃의 증발 온도 및 1.0 ℓ/분의 기체 흐름을 적용하여 증발 광 산란 검출기에 의해 수행하였다. 잔류 세제의 정량분석을, 콜레이트의 경우에 0.22 ㎍ 내지 7.5 ㎍ 콜레이트 범위의 교정 곡선의 확립에 의해 수행하였다.

단백질 측정:

단백질 농도를 아미노산 서열을 기초로 하여 계산한 몰 소광 계수를 사용하여, 280 ㎚에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다.

재조합 DNA 기법:

표준 방법들을 사용하여 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 개시된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물학 시약들을 제조사의 설명에 따라 사용하였다.

실시예 1

에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드의 제조 및 설명

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 폴리펩타이드를 재조합 수단에 의해 제조하였다. N-에서 C-말단 방향으로 상기 발현된 융합 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같다:

-아미노산 메티오닌(M),

-CDLPQTHSL(서열번호 55)의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편,

-GS 링커,

-HHHHHH(서열번호 56)의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그,

-GS 링커,

-VVAPPAP(서열번호 60)의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위, 및

-서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I.

상술한 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 폴리펩타이드는 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 융합 폴리펩타이드가 IgA 프로테아제를 사용하는 시험관 내 효소 절단에 의해 방출된 전구체 폴리펩타이드이다.

상기 전구체 폴리펩타이드 암호화 융합 유전자를 적합한 핵산 구획들의 연결에 의해 공지된 재조합 방법 및 기법으로 조립하였다. 화학 합성에 의해 제조된 핵산 서열을 DNA 서열화에 의해 확인하였다. 서열번호 31의 융합 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 생산을 위한 발현 플라스미드를 하기와 같이 제조하였다.

에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드의 제조

플라스미드 4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 에스케리키아 콜라이에서 코어-스트렙트아비딘의 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 이를 플라스미드 1966(1966-pBRori-URA3-LACI-T-반복부; EP-B 1 422 237에 보고됨)으로부터 유도된 3142 bp 길이 EcoRI/CelII-벡터 단편과 435 bp 길이 코어-스트렙트아비딘 암호화 EcoRI/CelII-단편을 연결함으로써 생성시켰다.

상기 코어-스트렙트아비딘 에스케리키아 콜라이 발현 플라스미드는 하기의 요소들을 포함한다:

-에스케리키아 콜라이에서 복제를 위한 벡터 pBR322로부터의 복제 기원(문헌[Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90]에 따른 bp 위치 2517-3160에 상응함),

-오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지아에의 URA3 유전자(문헌[Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124])(에스케리키아 콜라이 pyrF 돌연변이 균주(유라실 영양요구성)의 상보성에 의해 플라스미드 선택을 허용한다),

-하기를 포함하는 코어-스트렙트아비딘 발현 카세트

·스튜에버 디(Stueber, D) 등(하기 참조)에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터(문헌[Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433] 및 [Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152]에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터),

·상기 코어-스트렙트아비딘 유전자,

·2 개의 박테리오파지-유도된 전사 종결자, λ-T0 종결자(문헌[Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414]) 및 fd-종결자(문헌[Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58]),

-에스케리키아 콜라이로부터의 lacI 리프레서 유전자(문헌[Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769]).

상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 전구체 폴리펩타이드의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드를, 단일의 측면인접 EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 사용하여 벡터 4980으로부터 상기 코어-스트렙트아비딘 구조 유전자를 절제하고 상기 전구체 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 EcoRII/CelII 제한 부위 측면인접한 핵산을 상기 3142 bp 길이 EcoRI/CelII-4980 벡터 단편 내에 삽입함으로써 제조하였다.

실시예 2

테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I의 발현

실시예 1에 개시된 바와 같은 융합 단백질의 발현을 위해서 에스케리키아 콜라이 영양요구성 (PyrF)의 상보성에 의해 무항생제 플라스미드 선택을 가능하게 하는 에스케리키아 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다(EP 0 972 838 및 US 6,291,245).

에스케리키아 콜라이 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를, 발현 플라스미드 p(IFN-His6-IgA-테트라넥틴-아포지방단백질 A-I)를 사용하는 일렉트로포레이션에 의해 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 에스케리키아 콜라이 세포를 먼저 아가 플레이트 상에서 37 ℃ 상에서 증식시켰다.

발효 프로토콜 1:

예비-발효를 위해서 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 ㎎/ℓ의 티아민-HCl이 보충된, 샘브룩(Sambrook) 등에 따른 M9 배지(문헌[Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989])를 사용하였다.

예비-발효를 위해서 배플이 있는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 300 ㎖의 M9-배지를 1차 종자 은행 앰풀로부터의 2 ㎖로 접종하였다. 상기 배양을 1 내지 3의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 37 ℃에서 13 시간 동안 회전 진탕기 상에서 수행하였다.

발효를 위해서 리젠베르크(Riesenberg) 등에 따른 배치 배지를 사용하였다(문헌[Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27]: 27.6 g/ℓ 글루코스*H₂O, 13.3 g/ℓ KH₂PO₄, 4.0 g/ℓ (NH₄)₂HPO₄, 1.7 g/ℓ 시트레이트, 1.2 g/ℓ MgSO₄*7　H₂O, 60 ㎎/ℓ 철(III) 시트레이트, 2.5 ㎎/ℓ CoCl₂*6　H₂O, 15 ㎎/ℓ MnCl₂*4　H₂O, 1.5 ㎎/ℓ CuCl₂*2　H₂O, 3 ㎎/ℓ H₃BO₃, 2.5 ㎎/ℓ Na₂MoO₄*2　H₂O, 8 ㎎/ℓ Zn(CH₃COO)₂*2　H₂O, 8.4 ㎎/ℓ 티트리플렉스(Titriplex) III, 1.3 ml/ℓ 신페로닉(Synperonic) 10% 소포제). 상기 배치 배지는 5.4 ㎎/ℓ의 티아민-HCl 및 1.2 g/ℓ의 L-류신 및 L-프롤린이 각각 보충되었다. 상기 공급물 1 용액은 19.7 g/ℓ의 MgSO₄*7H₂O가 보충된 700 g/ℓ의 글루코스를 함유하였다. pH 조절용 알칼리성 용액은 50 g/ℓ의 L-류신 및 50 g/ℓ의 L-프롤린이 각각 보충된 수성 12.5%(w/v) NH₃ 용액이었다. 모든 성분들을 탈이온수에 용해시켰다.

상기 발효를 10 ℓ 바이오스탯(Biostat) C DCU3 발효기(자르토리우스(Sartorius) 독일 멜슝겐 소재)에서 수행하였다. 6.4 ℓ 멸균 발효 배치 배지 + 상기 예비-배양으로부터의 300 ㎖의 접종물로 출발하여, 배치 발효를 37 ℃, pH 6.9±0.2, 500 mbar에서 10 ℓ/분의 통기 정도로 수행하였다. 처음에 보충된 글루코스가 고갈된 후에, 온도를 28 ℃로 이동시켰으며 상기 발효가 유가 방식에 돌입하였다. 이때 용존 산소(pO2)의 상대적인 값을, 공급물 1을 일정하게 증가하는 교반기 속도(10 시간 이내에 550 rpm으로부터 1000 rpm까지 및 16 시간 이내에 1000 rpm으로부터 1400 rpm까지) 및 통기 정도(10 시간 동안 10 ℓ/분으로부터 16 ℓ/분까지 및 5 시간 동안 16 ℓ/분으로부터 20 ℓ/분까지)와 함께 첨가함으로써 50%에서 유지시켰다(DO-스탯, 예를 들어 문헌[Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. (1987) 79-85]을 참조하시오). 상기 추가적인 아미노산과의 공급은 상기 알칼리 용액의 첨가로부터 생성되었으며, 이때 pH는 대략 8 시간의 배양 후에 조절 하한(6.70)에 도달하였다. 상기 재조합 치료 단백질의 발현은 70의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.

상기 발효의 끝에서 세포질성 및 가용성의 발현된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는, 상기 발효기 중의 전체 배양물 브로쓰를 수확 전에 1 내지 2 시간 동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계에 의해, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체로 전이된다(예를 들어 EP-B 1 486 571을 참조하시오). 그 후에, 상기 발효기의 내용물을 병류 원심분리기로 원심분리시키고(13,000 rpm, 13 ℓ/h), 수확된 바이오매스를 추가의 가공과정까지 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 합성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 전구체 단백질은 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 오직 불용성 세포 찌꺼기 분획에서만 독점적으로 발견되었다.

상기 합성된 융합 단백질은 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 불용성 세포 찌꺼기 분획에서 독점적으로 발견되었다.

상기 발효기로부터 취한 샘플들(하나는 유도 전의 것이고 다른 것들은 단백질 발현 유도 후 전용 시점에서의 것들)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD_표적 = 5)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리를 통해 분쇄시켰다. 이어서 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각 상등액을 회수하고 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 가용성과 불용성의 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각 상등액(가용성) 분획에 300 ㎕, 및 각 펠릿(=불용성) 분획에 400 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 진탕 하에 95 ℃에서 15 분간 가열하여 상기 샘플들 중의 모든 단백질들을 용해시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각 샘플을 4 내지 20% TGX 기준 염색 부재 폴리아크릴아미드 젤(바이오-래드(Bio-Rad))로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시즌 플러스 프로테인 스탠다드(Precision Plus Protein Standard, 바이오-래드) 및 기지의 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3 개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량분석 기준을 상기 젤 상에 위치시킨다.

상기 전기영동을 200 V에서 60 분간 실행시켰으며 그 후에 상기 젤을 GelDOC EZ 이미저(바이오-래드)로 옮기고 UV 조사 하에 5 분간 처리하였다. 젤 상들을 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 상기 3 개 표준을 사용하여 >0.99의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하고 이로부터 원래 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.

발효 프로토콜 2:

예비-배양을 위해서 약 1 g/ℓ의 L-류신, 약 1 g/ℓ의 L-프롤린 및 약 1 ㎎/ℓ의 티아민-HCl이 보충된 문헌[Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition, New York, (December 1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.

예비-배양을 위해서 배플을 갖는 1000 ㎖ 삼각-플라스크 중의 변형된 M9-배지 300 ㎖에 아가 플레이트로부터, 또는 1차 종자 은행 앰풀로부터의 1 내지 2 ㎖을 접종하였다. 상기 배양을 1 내지 3의 광학 밀도(578 ㎚)가 획득될 때까지 37 ℃에서 13 시간 동안 회전 진탕기 상에서 수행하였다.

발효 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 고 수율 발현을 위해서 하기의 배치 배지 및 공급물들을 사용하였다:

8.85 g/ℓ 글루코스, 63.5 g/ℓ 효모 추출물, 2.2 g/ℓ NH₄Cl, 1.94 g/ℓ L-류신, 2.91 g/ℓ L-프롤린, 0.74 g/ℓ L-메티오닌, 17.3 g/ℓ KH₂PO₄*H₂O, 2.02 g/ℓ MgSO₄*7H₂O, 25.8 mg/ℓ 티아민-HCl, 1.0 ml/ℓ 신페로닉 10% 소포제. 상기 공급물 1 용액은 1.67 g/ℓ L-메티오닌 및 5 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린 각각이 보충된 333 g/ℓ 효모 추출물 및 333 g/ℓ 85%-글리세롤을 함유하였다. 상기 공급물 2는 600 g/ℓ L-프롤린의 용액이었다. 상기 pH 조절용 알칼리 용액은 10%(w/v) KOH 용액이었으며 산으로서 75% 글루코스 용액을 사용하였다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해되었다.

상기 발효를 10 ℓ 바이오스탯 C DCU3 발효기(자르토리우스, 독일 멜슝겐 소재)에서 수행하였다. 5.15 ℓ 멸균 발효 배치 배지 + 상기 예비-배양으로부터의 300 ㎖의 접종물로 출발하여, 유가 발효를 25 ℃, pH 6.7±0.2, 300 mbar에서 10 ℓ/분의 통기 정도로 수행하였다. 처음에 보충된 글루코스가 고갈되기 전에, 상기 배양물은 15의 광학 밀도(578 ㎚)에 도달하였으며 상기 발효가 유가 방식에 돌입하였고 이때 공급물 1을 70 g/ℓ로 출발하였다. 상기 배양물 중의 글루코스 농도를 모니터링하면서 공급물 1을, 글루코스 축적을 피하고 pH를 6.9의 조절 상한 부근에서 유지시키면서 최대 150 g/ℓ로 증가시켰다. 50의 광학 밀도(578 ㎚)에서, 공급물 2는 10 ㎖/h의 일정한 공급률로 시작하였다. 용존 산소(pO₂)의 상대적인 값을, 교반기 속도(500 rpm에서 1500 rpm), 통기 정도(10 ℓ/분으로부터 20 ℓ/분까지) 및 압력(300 mbar로부터 500 mbar까지)을 동시에 증가시킴으로써 50% 이상에서 유지시켰다. 상기 재조합 치료 단백질의 발현은 90의 광학 밀도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.

상기 발효기로부터 취한 7 개의 샘플들(하나는 유도 전의 것이고 다른 것들은 단백질 발현 유도 후 전용 시점에서의 것들)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한다. 모든 샘플로부터 동일한 양의 세포(OD_표적 = 5)를 5 ㎖의 PBS 완충제에 현탁하고 얼음 상에서 초음파 처리를 통해 분쇄시켰다. 이어서 100 ㎕의 각 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각 상등액을 회수하고 별도의 바이알로 옮긴다. 이는 가용성과 불용성의 발현된 표적 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각 상등액(가용성) 분획에 300 ㎕, 및 각 펠릿(=불용성) 분획에 200 ㎕의 SDS 샘플 완충제(문헌[Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685])를 가한다. 샘플들을 진탕 하에 95 ℃에서 15 분간 가열하여 상기 샘플들 중의 모든 단백질들을 용해시키고 환원시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각 샘플을 10% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 젤(노바겐(Novagen))로 옮긴다. 추가로 5 ㎕의 분자량 표준(프리시즌 플러스 프로테인 스탠다드, 바이오-래드) 및 기지의 생성물 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3 개 량(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량분석 기준을 상기 젤 상에 위치시킨다.

상기 전기영동을 200 V에서 35 분간 실행시켰으며 이어서 상기 젤을 쿠마씨 브릴리언트 블루 R 염료로 염색하고, 가열된 물로 탈염시키고, 디지털화를 위해서 광학 농도계(GS710, 바이오-래드)로 옮겼다. 젤 상들을 콴터티 원(Quantity One) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 상기 3 개 표준을 사용하여 >0.98의 계수로 선형 회귀 곡선을 계산하고 이로부터 원래 샘플 중의 표적 단백질의 농도를 계산하였다.

상기 발효의 끝에서 세포질성 및 가용성의 발현된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1은, 상기 발효기 중의 전체 배양물 브로쓰를 수확 전에 1 내지 2 시간 동안 50 ℃로 가열하는 가열 단계에 의해, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)로 전이되었다(예를 들어 EP-B 1 486 571 참조하시오). 상기 가열 단계 후에, 상기 합성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A1 전구체 단백질은 IB의 형태로 오직 불용성 세포 찌꺼기 분획에서만 독점적으로 발견되었다.

상기 발효기의 내용물을 4 내지 8 ℃로 냉각시키고, 병류 원심분리기로 원심분리시키고(13,000 rpm, 13 ℓ/h), 수확된 바이오매스를 추가의 가공과정까지 -20 ℃에서 보관한다. 상기 수확된 총 바이오매스 수율은 상기 발현된 구조물에 따라 건조 물질 39 g/ℓ 내지 90 g/ℓ의 범위였다.

실시예 3

테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I의 제조

봉입체 제조를 칼륨 포스페이트 완충 용액 또는 트리스 완충 용액(0.1 M, 1 mM MgSO₄, pH 6.5가 보충됨) 중에 실시예 2의 수확된 세균 세포를 재현탁함으로써 수행하였다. DNAse의 첨가 후에 상기 세포를 900 bar의 압력에서 균질화에 의해 분쇄하였다. 1.5 M NaCl 및 60 mM EDTA를 포함하는 완충 용액을 상기 균질화된 세포 현탁액에 가하였다. 상기 pH 값을 25%(w/v) HCl로 5.0으로 조절한 후에 최종 봉입체 슬러리를 추가의 원심분리 단계 후에 수득하였다. 상기 슬러리를 추가 가공시까지 일회용 멸균 플라스틱 주머니 중에서, -20 ℃에서 보관하였다.

상기 봉입체 슬러리(약 15 ㎏)를 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액(150 ℓ, 6.7 M)에 용해시켰다. 심층 여과에 의한 상기 용해물의 등명화 후에, 상기 용액을 Zn-킬레이트 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하였다. 상기 융합 폴리펩타이드를 Zn-킬레이트 크로마토그래피 물질에 의해 정제하고 IgA 프로테아제에 의해 절단한다. 그 후에 상기 폴리펩타이드를 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 추가로 정제하였다. 이들 단계를 유레아 함유 용액(7 M)에서, 즉 변성 조건 하에서 수행하였다. 이들 단계를 폴리펩타이드 단편, 내독소, 및 추가의 불순물을 제거하기 위해 사용하였다. 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 함유 용액 내로의 정용여과를 수행하였다. 상기 수득된 최종 용액은 변성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 함유한다.

실시예 4

테트라넥틴 - 아포지방단빅질 A-I의 리폴딩 및 지질화

하기에서 서열번호 1의, 선행 실시예 1 내지 3에서 생성된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 사용하였다.

a) 일반적인 방법

순수한 결정성 POPC 또는 DPPC(리포이드(Lipoid), 스위스 소재)를 1:1.35의 몰비로, 콜레이트를 함유하는 수성 완충제(지질화 완충제)에 용해시켰다. 상기 혼합물을 등명한 용액이 수득될 때까지 질소 분위기 하에서 배양하고 실온(POPC) 또는 55 ℃(DPPC)에서 빛을 차단하였다. 상기 등명한 지질-콜레이트 용액을 4 ℃(POPC)로 냉각시키거나 41 ℃(DPPC)에서 보관하였다. 정제된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 한정된 아포지방단백질:인지질 비로 4 ℃(POPC) 또는 41 ℃(DPPC)에서 가하였다. 지질 입자 형성을 위해서 상기 반응 혼합물을 질소 분위기 하에 4 ℃(POPC) 또는 41 ℃(DPPC)에서 밤새 배양하고 빛을 차단하였다. 최종적으로 콜레이트를 지질화 완충제에 대한 연장된 투석(4 ℃/41 ℃)에 의해 제거하였다. 최종적으로 샘플을 원심분리시켜 침전된 물질을 제거하였다.

순수한 POPC 또는 순수한 DPPC를 함유하는 콜레이트 용해된 지질 용액을 상술한 바와 같이 제조하였다. 지질 혼합물을, 목적하는 비로 상기 지질 용액들을 합하여 제조한 다음 각각의 T_m(T_m = 상 전이 온도)에서 보관하였다. 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자 형성을, 순수한 지질 용액에 대해 개시한 바와 같이, 그러나 상기 선택된 지질 혼합물의 각각의 T_m에서 수행하였다.

하기의 지질화 완충제들을 시험하였다:

1. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 슈크로스가 보충된 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제

2. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 슈크로스, 10 mM 메티오닌이 보충된 50 mM 인산 수소 이칼륨 완충제

3. pH 7.5에서 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌이 보충된 250 mM 트리스-하이드록실아미노 메탄(TRIS)

4. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7% 트레할로스, 10 mM 메티오닌이 보충된 50 mM 인산 수소 이칼륨 완충제.

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 샘플로부터 형성된 지질 입자의 균질성을 분석학적 SEC에 의해 평가하였다(도 11 및 12). 전체적으로, 상기 지질화 완충제의 선택은 인지질의 선택에 비해 단지 작은 영향만을 미친다. DPPC-지질 입자는 하나의 주요 피크로서 용출되는 반면 POPC-지질 입자는 2 개의 피크 패턴을 보인다. 상기 지질화 완충제의 선택은 상기 아포지방단백질의 정제 공정 및 안정화된 무-지질 아포지방단백질의 공급에 의해 영향을 받았다. 지질 입자 형성은 상기 지질화 완충제와 관계없이 가능한 것으로 나타났다. 시험된 다양한 완충제들 중에서 가장 적합한 지질화 완충제는 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5인 것으로 확인되었다.

지질화 혼합물은 한정된 양의 각각의 아포지방단백질을 함유하였으며, 인지질, 예를 들어 POPC의 양을 상응하게 계산하였다. 지질의 몰량의 모든 계산은 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 기준으로 하였다.

b) POPC 및 콜레이트

순수한 POPC를 사용하는 예로서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I와의 지질 입자 형성. 아포지방단백질:인지질의 몰비를 상기 단백질 단량체에 대해 계산한다. 대조군: 지질의 첨가 없이 배양된 아포지방단백질(순수한 아포) 및 아포지방단백질 없이 배양된 지질(아포 없음).
아포지방단 백질:인지질 몰비	밤새 배양 후 관찰	투석전 단백질 농도 [ mg / ml ]	투석후 단백질 농도 [ mg / ml ]	투석후 관찰
1:320	등명함	0.67	n.d.	탁함
1:160	등명함	1.34	1.47	등명함
1:80	등명함	2.68	2.6	등명함
1:40	등명함	5.36	4.87	등명함
1:20	탁함	10.73	5.02	탁함*
아포만	탁함	2.68	0.51	탁함*
아포 없음	등명함	-	-	등명함
*원심분리 후 등명함

1:40 내지 1:160의 몰비가 전체 공정 동안 분명하게 남아있는다. 과잉의 인지질이나 단백질 침전 중 어느 것을 통해서도 탁도는 관찰되지 않았다.

지질 입자 샘플을 고유 PAGE에 의해 분석하였다(도 13 참조). 가장 균일한 밴드 패턴은 샘플 1:80에 대해서 발견되었다(레인 4). 또한 1 x 동결/해동(-80 ℃)은 상기 샘플의 외관을 변경시키지 않았다(레인 5). 샘플 1:320 및 1:160의 밴드 패턴들은 다중 밴드를 생성시키는 불균질 생성물을 가리킨다(레인 2 및 3). 샘플 1:40 및 또한 1:20은 주 생성물 밴드 아래에 추가적인 밴드를 갖는다(레인 6 및 7). 순수한 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 이동 패턴을 도 13의 레인 8에 나타낸다.

SEC-MALLS 분석을 사용하여 상기 지질 입자의 균질성 및 이의 아포지방단백질-인지질 조성(단백질-접합체 분석)에 대한 보다 상세한 정보를 획득하였다. 도 14는 SEC 분석된 샘플(UV280 검출)의 크로마토그램을 나타낸다. 이때 상기 1:160 샘플은 3 개의 분리된 피크로 분할된다. 상기 1:80 샘플은 이중 피크로서 나타나는 바와 같이 상이한 크기의 2 개 이상의 종들을 함유하는 것으로 나타났다. 샘플 1:20으로부터 획득된 피크가 가장 균질한 생성물을 나타낸다.

상기 실험을 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I(3.84 ㎎/㎖; 10 ㎎/샘플)를 사용하여 수행하였으며 아포지방단백질:인지질의 몰비는 5 개의 단계에서 1:40에서부터 1:80으로 증가하였다. 1:40 이하의 몰비에서 상기 지질 입자 형성은 불완전하다. 1:80 이상의 몰비는 실험에 의해 제외된다: 투석에 의해 콜레이트의 제거 후에 상기 샘플들은 탁하게 되었다. 더욱이 상기 지질 입자는 보다 높은 지질 비에서는 보다 불균질하게 되었다.

순수한 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자 형성. 아포지방단백질:인지질의 몰비는 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 기준으로 계산되었다.
아포지방단백질 :인지질의 몰비	투석전 단백질 농도 [ mg / ml ]*	투석후 단백질 농도 [ mg / ml ]*	수율 [%]	투석 후 관찰
1:40	3.5	2.67	76	침전
1:45	3.5	2.74	78	침전
1:50	3.5	2.94	84	침전
1:55	3.5	3.05	87	침전
1:60	3.5	3.19	91	침전
1:65	3.5	3.34	95	침전
1:70	3.5	3.52	100**
1:75	3.5	3.56	100**
1:80	3.5	3.57	100**
*투석 전 및 후의 부피 2.6 ㎖ **상기 방법의 SD 내에서

-3 ℃의 전이 온도에서 배양 중 모든 샘플들은 광학적으로 등명하게 남아있었다. 투석에 의한 콜레이트의 제거 후 상기 샘플 1:40 내지 1:65의 증가하는 탁도가 관찰되었다. 침전물을 원심분리에 의해 제거할 수 있었으며 상기 샘플들은 그 후에 등명하게 남아있었다.

SEC-MALLS 분석을 사용하여 상기 형성된 지질 입자의 균질성 및 이의 아포지방단백질-인지질 조성(단백질-접합체 분석)에 대한 상세한 정보를 획득하였다. 모든 지질 입자들은 분석학적 크기 배제 크로마토그래피(SEC; 도 15) 시 필적할 정도로 균질하였으며 이는 작은 후 피크(post peak)를 나타내었고 이는 더 낮은 몰비에서 더욱 현저하다. 또한, 보다 높은 분자량 쪽의 보다 높은 몰비에서 피크 패턴의 주목할만한 이동이 존재한다. 각각의 체류 시간을 표 7에 제공한다.

크기 배제 크로마토그래피 결과의 요약; 곡선 아래 면적(AUC)의 적분에 의해 백분율을 계산하였다.
UV280	주요 피크 체류 시간 [ min .]	주요 피크 [%]	후 피크 [%]	총 면적 [ mAU * min ]
POPC 1:40	56.2	89.3	10.7	322.3
POPC 1:45	55.9	89.7	10.4	331.3
POPC 1:50	55.8	90.0	10.0	333.2
POPC 1:55	55.7	91.0	9.1	342.5
POPC 1:60	55.6	90.8	9.2	331.7
POPC 1:65	55.3	90.9	9.2	337.2
POPC 1:70	55.2	91.1	8.9	326.5
POPC 1:75	55.1	91.3	8.7	347.1
POPC 1:80	54.8	92.0	8.0	347.8

상기 단백질-접합체 분석(표 8에 요약됨)은 상기 SEC 컬럼으로부터 용출된 각각의 지질 입자에 대한 단백질(MW 단백질) 및 지질 성분의 전체 분자량의 계산을 가능하게 한다. 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체(32.7 kDa) 및 POPC(760 Da)의 분자량들을 기준으로, 상기 지질 입자의 조성을 계산할 수 있다(n 단백질 및 n POPC). 모든 몰비에서 상기 지질 입자 주요 피크에서 발견된 아포지방단백질 성분의 분자량은 대략 100 kDa이었으며 이는 지질입자당 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I에 상응한다. 비 n(POPC)/n(단백질 단량체)는 상기 지질 입자 중 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체당 POPC 분자의 수를 제공한다. 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체당 POPC 분자의 수는, 1:40 내지 1:80의 몰비가 적용되었다 하더라도 54 내지 75로 변한다. 상기 단백질% 값은 지질화 정도에 대한 매개변수이다. 상기 지질 입자 중의 단백질의 백분율이 낮을수록, 상기 지질화의 정도는 높다.

도 16에 도시된 바와 같은 POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 단백질 접합체 분석의 요약
		MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n (단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n ( POPC )	n( POPC )/ n(단량체)	% 단백질
1:40	주요 피크	238	104	3.3	135	178	54	44
	후 피크	230	148	4.6	81	107	23	65
1:45	주요 피크	238	101	3.2	138	182	57	42
	후 피크	184	118	3.7	66	87	24	64
1:50	주요 피크	244	100	3.1	143	188	61	41
	후 피크	187	118	3.7	70	92	25	63
1:55	주요 피크	247	99	3.1	148	195	63	40
	후 피크	182	107	3.3	75	99	30	59
1:60	주요 피크	248	98	3.1	150	197	64	40
	후 피크	183	106	3.3	76	100	30	58
1:65	주요 피크	255	97	3.0	158	208	69	38
	후 피크	191	103	3.2	88	116	36	54
1:70	주요 피크	260	97	3.0	163	214	71	37
	후 피크	196	100	3.1	95	125	40	51
1:75	주요 피크	266	99	3.1	168	221	71	37
	후 피크	208	118	3.7	91	120	32	56
1:80	주요 피크	275	99	3.1	176	232	75	36
	후 피크	215	112	3.5	103	136	39	52

c) DPPC 및 콜레이트

지질화 전에 상기 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 pH 7.5에서 50 mM KH₂PO₄, 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7% 트레할로스, 10 mM 메티오닌에 대해 투석하였다. 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I(3.84 ㎎/㎖, 3 ㎎/샘플)를 1:60 내지 1:100의 몰비를 사용하여 지질화하였으며 5 단계에서 지질 농도가 증가하였다. 상기 지질화 완충제는 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5이었다.

아포지방단백질과 DPPC와의 지질 입자의 샘플 개관
아포지방단백질 :인지질의 몰비 *	밤새 배양 후 관찰	단백질 기준 수율 [%]
1:20	등명함	85
1:40	등명함	88
1:60	등명함	89
1:80	등명함	91
1:100	등명함	94
아포만	등명함	86
아포 없음	등명함	침전된 DPPC
*단백질 단량체에 대해 계산됨

지질 입자 형성 중에 과잉의 지질을 통해 단백질의 침전도 탁도도 관찰되지 않았다. 최종 생성물 중의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 수율은 더 높았으며 더 많은 DPPC가 지질화에 사용되었다.

잔류 지질-비함유 아포지방단백질이 고유 PAGE 상에서 1:20 샘플에서 발견되었다(레인 3, 도 17). 상기 1:40 및 1:60 샘플이 고유 PAGE 상에서 가장 균질한 것으로 보인 반면(레인 4 및 5) 1:80 및 1:100 샘플은 주요 지질 입자 밴드 위에서 추가로 더 높은 분자 밴드를 함유한다(레인 6 및 7).

SEC-MALLS 단백질 접합체 분석을 사용하여 DPPC 지질 입자 형성(MW DPPC: 734 Da) 후 수득된 지질 입자의 조성물을 특성화하였다. 균일한 SEC 피크가 1:80 이하의 몰비에서 획득되었다. 더 높은 지질 비에서 전-피크(pre-peak)가 나타났다(예를 들어 표 10에서 1:90 샘플 참조).

DPPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석 요약
아포지방단백질:인지질의 몰비	피크	MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n (단백질)	MW 지질 [ kDa ]	n ( DPPC )/ n (단백질)	% 단백질
1:60	1	724	298	9.0	425	193	41.2
1:65	1	281	109	3.3	171	77	38.9
1:70	1	273	103	3.1	169	76	37.9
1:75	1	286	103	3.1	183	83	36.0
1:80	1	295	100	3.0	194	88	34.1
1:85	1	307	99	3.0	207	94	32.6
1:90	1	361	117	3.5	244	110	32.6
	2	319	101	3.0	217	98	31.8
1:95	1	397	134	4.0	262	118	33.8
	2	327	100	3.0	226	102	30.8
1:100	1	405	132	4.0	273	123	32.6
	2	344	101	3.0	243	110	29.3

가장 높은 지질화 정도(가장 낮은 단백질 백분율)가 1:80 내지 1:90의 몰비에서 발견된다. 또한 DLS는 14 내지 17 ㎚의 입자 크기에서 1:80 내지 1:90(>98%)의 비에서 가장 균질한 입자 형성을 밝혀냈다.

d) 75% DPPC /25% POPC

지질 입자 형성을 하기의 매개변수들을 사용하여 본 실시예의 항목 a) 내지 c)에 보고된 바와 같이 상응하게 수행하였다:

단백질: 3.84 ㎎/㎖, 3 ㎎/샘플에서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I

지질화 완충제: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌 pH 7.5

지질화: 34 ℃에서

투석: 4 ℃에서

시험된 몰비: 5 개의 단계에서 지질을 증가시키면서 1:60 내지 1:100

지질 입자 형성은 간단하였으며 순수한 지질을 사용하는 공정에 필적하였다. 모든 샘플들이 상기 공정 및 투석 동안 등명하게 남아있었다. 상기 지질 입자의 수율은 시험된 모든 비에서 유사하였다(약 85%). SEC-MALLS 분석은 1:80의 몰비가 가장 균질한 지질 입자를 생성시켰음을 보였으며, 이때 90.9% 주요 피크, 전-피크 없음 및 9.1% 후-피크를 가졌다. 단백질 접합체 분석은 모든 샘플의 주요 종들에서 지질 입자당 하나의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 삼량체의 존재를 밝혀냈다(도 18 및 표 11 및 12를 참조하시오).

SEC 결과의 요약; AUC의 적분에 의해 백분율을 계산하였다.
UV280	주요 피크 체류시간	전 피크 [%]	주요 피크 [%]	후 피크 [%]	전체 [ mAU * min ]
75/25 DPPC/POPC 1:60	58.3	-	89.7	10.3	360.5
75/25 DPPC/POPC 1:65	58.3	-	89.2	10.8	383.7
75/25 DPPC/POPC 1:70	58.3	-	89.5	10.5	376.8
75/25 DPPC/POPC 1:75	58.4	-	90.3	9.7	367.0
75/25 DPPC/POPC 1:80	58.3	-	90.9	9.1	383.5
75/25 DPPC/POPC 1:85	58.2	10.4	79.5	10.1	356.4
75/25 DPPC/POPC 1:90	58.3	10.2	81.5	8.3	344.6
75/25 DPPC/POPC 1:95	58.0	16.9	74.9	8.2	377.4
75/25 DPPC/POPC 1:100	58.0	21.0	70.4	7.7	365.0

75% DPPC/25% POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
		MW 전체	MW 단백질 [ kDa ]	n (단백질 단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n (지질)	n(지질)/ n(단량체)	% 단백질
1:60	주요 피크	257	96	3.0	161	217	72	37
	후 피크	92	75	2.3	17	23	10	82
1:65	주요 피크	263	95	3.0	167	226	76	36
	후 피크	116	102	3.2	14	19	6	88
1:70	주요 피크	268	95	3.0	173	234	79	35
	후 피크	93	83	2.6	10	14	5	89
1:75	주요 피크	275	95	3.0	180	243	82	34
	후 피크	98	82	2.6	16	22	8	84
1:80	주요 피크	279	95	3.0	184	248	84	34
	후 피크	97	86	2.7	11	15	6	89
	전 피크	329	104	3.3	224	302	93	32
1:85	주요 피크	291	96	3.0	195	263	88	33
	후 피크	129	107	3.3	22	30	9	83
	전 피크	443	107	3.3	237	320	96	31
1:90	주요 피크	293	95	3.0	197	266	90	33
	후 피크	126	102	3.2	25	34	11	81
	전 피크	384	110	3.4	274	370	108	29
1:95	주요 피크	303	96	3.0	207	280	93	32
	후 피크	130	103	3.2	27	36	11	79
	전 피크	398	111	3.5	287	388	112	28
1:100	주요 피크	310	96	3.0	213	288	96	31
	후 피크	122	86	2.7	36	49	18	71

e) 50% DPPC /50% POPC

지질 입자 형성을 하기의 매개변수들을 사용하여 본 실시예의 항목 a) 내지 c)에 보고된 바와 같이 상응하게 수행하였다:

단백질: 3.84 ㎎/㎖, 3 ㎎/샘플에서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I

지질화 완충제: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌 pH 7.5

지질화: 27 ℃에서

투석: 실온에서

시험된 몰비: 5 개의 단계에서 지질을 증가시키면서 1:60 내지 1:100

모든 샘플들이 상기 공정 및 투석 동안 등명하게 남아있었다. 상기 지질 입자의 수율은 시험된 모든 비에서 유사하였다.

SEC 결과의 요약; 백분율을 AUC의 적분에 의해 계산하였다
UV280	주요 피크 체류 시간 [ min ]	전 피크 [%]	주요 피크 [%]	후 피크 [%]	전체 [ mAU * min ]
50/50 DPPC/POPC 1:60	58.2	-	88.9	11.1	341.3
50/50 DPPC/POPC 1:65	58.3	-	89.3	10.7	349.6
50/50 DPPC/POPC 1:70	58.3	-	89.9	10.1	336.9
50/50 DPPC/POPC 1:75	58.2	6.1	84.3	9.6	347.4
50/50 DPPC/POPC 1:80	58.1	8.5	82.2	9.3	356.9
50/50 DPPC/POPC 1:85	58.0	11.3	79.8	8.9	352.7
50/50 DPPC/POPC 1:90	58.0	14.4	77.1	8.5	356.5
50/50 DPPC/POPC 1:95	58.0	19.3	72.6	8.1	367.0
50/50 DPPC/POPC 1:100	57.9	36.6	65.8	7.6	365.3

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자 형성을 위해 50% DPPC 및 50% POPC의 지질 혼합물을 사용하여, 가장 균질한 생성물을 1:70의 몰비에서 수득하였다(표 14 참조). 상기 생성물은 주요 피크에 대해 89.9% 순수하였으며 하나의 단일 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 삼량체를 함유하였다(표 14 참조).

50% DPPC/50% POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 갖는 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질
1:60	주요 피크	331	124	3.9	207	277	71	38
	후 피크	131	106	3.3	24	32	10	81
1:65	주요 피크	264	95	2.9	169	226	78	36
	후 피크	127	112	3.5	16	21	6	88
1:70	주요 피크	273	96	3.0	178	238	79	35
	후 피크	258	213	6.7	45	60	9	82
	전 피크	319	108	3.4	211	282	83	34
1:75	주요 피크	271	93	2.9	178	238	82	34
	후 피크	126	106	3.3	20	27	8	84
	전 피크	333	108	3.4	225	301	89	32
1:80	주요 피크	278	95	2.9	184	246	85	34
	후 피크	122	100	3.1	21	28	9	83
	전 피크	359	109	3.4	250	335	98	30
1:85	주요 피크	284	94	2.9	189	253	87	33
	후 피크	132	118	3.7	14	19	5	89
	전 피크	373	109	3.4	264	353	104	29
1:90	주요 피크	286	94	2.9	192	257	89	33
	후 피크	133	110	3.4	23	31	9	83
	전 피크	390	111	3.5	278	372	106	29
1:95	주요 피크	290	94	2.9	195	261	90	33
	후 피크	162	136	4.3	26	35	8	84
	전 피크	404	113	3.5	291	390	111	28
1:100	주요 피크	293	94	2.9	199	266	92	32
	후 피크	142	107	3.3	35	47	14	75

f) 25% DPPC /75% POPC

지질 입자 형성을 하기의 매개변수들을 사용하여 본 실시예의 항목 a) 내지 c)에 보고된 바와 같이 상응하게 수행하였다:

단백질: 3.84 ㎎/㎖, 3 ㎎/샘플에서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I

지질화 완충제: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌 pH 7.5

지질화: 18 ℃에서

투석: 실온에서

시험된 몰비: 5 개의 단계에서 지질을 증가시키면서 1:60 내지 1:100

지질 입자 형성은 간단하였으며 순수한 지질을 사용하는 공정에 필적할만하였다. 모든 샘플들이 상기 공정 및 투석 동안 등명하게 남아있었다.

SEC 결과의 요약; 백분율을 AUC의 적분에 의해 계산하였다.
UV280	주요 피크 체류 시간 [ min ]	전 피크 %	주요 피크 %	후 피크 %	전체 [ mAU * min ]
25/75 DPPC/POPC 1:60	58.2	-	90.2	9.8	342.6
25/75 DPPC/POPC 1:65	58.2	4.6	85.9	9.4	345.6
25/75 DPPC/POPC 1:70	58.1	8.8	82.3	8.9	353.2
25/75 DPPC/POPC 1:75	58.0	9.0	82.4	8.6	357.5
25/75 DPPC/POPC 1:80	57.9	10.8	81.2	8.0	356.7
25/75 DPPC/POPC 1:85	57.9	21.2	71.0	7.8	366.3
25/75 DPPC/POPC 1:90	57.8	26.1	66.4	7.5	357.8
25/75 DPPC/POPC 1:95	57.7	32.7	60.5	6.8	365.9
25/75 DPPC/POPC 1:100	57.6	36.1	57.5	6.4	373.4

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자 형성을 위해 25% DPPC 및 75% POPC의 지질 혼합물을 사용하여, 가장 균질한 생성물을 1:60의 몰비에서 수득하였다(표 16 참조). 상기 생성물은 주요 피크에 대해 90.2% 순수하였으며 하나의 단일 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 삼량체를 함유하였다(표 15 참조).

25% DPPC/75% POPC 및 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질
1:60	주요 피크	254	100	3.1	153	203	66	40
	후 피크	127	110	3.4	17	23	7	86
	전 피크	272	132	4.1	141	187	46	48
1:65	주요 피크	259	100	3.1	159	211	68	39
	후 피크	183	131	4.1	7	9	2	95
	전 피크	280	121	3.8	159	211	56	43
1:70	주요 피크	264	99	3.1	165	219	71	38
	후 피크	119	105	3.3	14	19	6	88
	전 피크	291	109	3.4	183	243	71	37
1:75	주요 피크	268	98	3.1	170	226	73	37
	후 피크	120	101	3.2	19	25	8	84
	전 피크	311	114	3.6	197	261	73	37
1:80	주요 피크	276	96	3.0	176	234	78	36
	후 피크	137	127	4.0	10	13	3	93
	전 피크	331	115	3.6	216	287	80	35
1:85	주요 피크	278	98	3.1	180	239	77	35
	후 피크	139	117	3.7	22	29	8	85
	전 피크	345	113	3.5	232	308	88	33
1:90	주요 피크	285	98	3.1	187	248	80	34
	후 피크	143	110	3.4	33	44	13	77
	전 피크	363	115	3.6	248	329	91	32
1:95	주요 피크	292	97	3.0	194	257	86	33
	후 피크	155	122	3.8	33	44	12	79
	전 피크	377	117	3.7	260	345	93	31
1:100	주요 피크	298	98	3.1	200	265	86	33
	후 피크	160	114	3.6	46	61	17	71

g) 쯔비터전트를 사용하는 지질 입자 형성

지질 입자 형성을 하기의 매개변수들을 사용하여 본 실시예의 항목 a) 내지 c)에 보고된 바와 같이 상응하게 수행하였으나, 단 콜레이트를 합성 세제 쯔비터전트에 의해 대체하였다:

단백질: 23.5 ㎎/㎖에서 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I

완충제: 50 mM 트리스-HCl, 7.2 M 구아니디늄 하이드로클로라이 드, 10 mM 메티오닌, pH 8

지질화 완충제: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.5

100% POPC, 아포지방단백질:인지질의 몰비 = 1:60

지질 입자 형성의 다양한 접근법 및 관찰/매개변수의 샘플 개관
샘플	세제 [%]	탁도			투석 후 부피 [ ml ]	투석 후 c [㎍/ ml ]	[ mg ] TN -Apo A-I	수율 [%]
		용해된 지질	지질화	투석 후
쯔비터전트 3-8
0.1 x CMC	0.8	+++	+++	+++	2.1	2230.18	4.68	99.6
0.5 x CMC	4.2	++	++	+	2.9	1536.81	4.46	94.8
1 x CMC	8.4	+	+	+	3	1475.07	4.43	94.2
2 x CMC	16.7	-	-	-	4.3	1081.27	4.65	98.9
3 x CMC	25.1	-	-	-	5.5	839.85	4.62	98.3
쯔비터전트 3-10
0.1 x CMC	0.1	+++	+++	+++	2	2361.56	4.72	100.5
0.5 x CMC	0.6	+++	++	++	2	2221.38	4.44	94.5
1 x CMC	1.2	++	+	+	2.1	2267.16	4.76	101.3
2 x CMC	2.5	+	+	(+)	2.3	2082.18	4.79	101.9
5 x CMC	6.2	-	-	-	2.5	1941.61	4.85	103.3
10 x CMC	12.3	-	-	-	4	1073.92	4.30	91.4
쯔비터전트 3-12
0.1 x CMC	0.01	+++	+++	+++	2	2722.85	5.45	115.9
1 x CMC	0.1	+++	+++	+++	2	2158.81	4.32	91.9
2 x CMC	0.2	+++	+++	++	2	2636	5.27	112.2
20 x CMC	1.9	+	+	+	2.1	2525.69	5.30	112.8
100 x CMC	9.4	-	-	-	3.5	1567.85	5.49	116.8
300 x CMC	28.1	-	-	-	5.6	1069.04	5.99	127.4
콜레이트
0.1 x CMC	0.06	+++	+++	+++	2	2323.09	4.65	98.9
0.5 x CMC	0.3	+	-	-	2	2301.15	4.60	97.9
1 x CMC	0.6	-	-	-	2	2316.86	4.63	98.6
2 x CMC	1.2	-	-	-	2.5	1178.72	2.95	62.7
5 x CMC	3	-	-	-	2.5	2435.34	6.09	129.5
10 x CMC	6	-	-	-	3.5	1814.69	6.35	135.1

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자를 고유 PAGE 상에서 분석하였다. 지질-비함유 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I는 140 kDa에서 이동하는 반면(도 19에서 레인 1), 지질 입자는 232 kDa 내지 440 kDa의 보다 높은 분자량으로의 특징적인 이동을 보인다.

단지 0.1 x CMC의 각 세제로 제조된 모든 샘플들에서 지질-비함유 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I가 검출되었지만 지질 입자는 검출되지 않았다(도 19, 레인 2, 8, 13 및 19). 그러나, 0.5 x CMC의 세제 농도면 쯔비터전트 3-8 및 3-10이 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I와의 지질 입자 형성을 가능하게 하기에 충분하였다(레인 3, 9 및 14). 쯔비터전트 3-12의 경우 2.0 x CMC의 농도에 도달할 때까지 지질 입자 형성은 발생하지 않았다(레인 21).

도 20은 3x CMC 쯔비터전트 3-8 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자(아포지방단백질:인지질의 몰비 = 1:60)의 SEC-MALLS 크로마토그램을 도시한다. 상기 단백질 접합체 분석의 결과를 표 18에 요약한다. 상기 지질 입자 분획은 상기 SEC 크로마토그램에서 2 개의 중복 피크에서 나타나는 바와 같이 2 개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 2 개의 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 분자의 수가 다르다(피크 1의 경우 4.2 및 피크 2의 경우 3.5).

쯔비터전트 3-8의 존재 하에서 형성된 지질 입자의 단백질-접합체 분석의 요약
x CMC		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질	Rh (w) ( QELS ) [ nm ]
2	전 피크	345 268	147 113	4.6 3.6	198 154	261.5 203.2	57 56	42.5 42.4	7.7 6.5
	주요 피크
3	전 피크	323	134	4.2	188	249.9	60	41.6	7.4
	주요 피크	257	110	3.5	146	192.9	55	43.0	6.5

도 21은 SEC-MALLS 분석의 크로마토그램을 도시하고 표 19는 2 x CMC 쯔비터전트 3-10 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자(아포지방단백질:인지질의 몰비 = 1:60)에 대한 단백질 접합체 분석의 요약이다. 상기 두 피크는 모두 각각 3.5 및 5 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 분자를 포함하는 지질 입자를 함유한다.

쯔비터전트 3-10의 존재 하에서 형성된 지질 입자의 단백질-접합체 분석의 요약
x CMC		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질	Rh (w) ( QELS ) [ nm ]
2	전 피크	373	161	5.0	211	278.7	56	43.2	7.8
	주요 피크	272	112	3.5	159	210.3	60	41.4	6.6
5	전 피크	345	150	4.7	195	256.6	55	43.6	7.5
	주요 피크	263	112	3.5	151	199.1	57	42.6	6.6
10	전 피크	405	151	4.7	253	334.1	71	37.4	7.9
	주요 피크	265	110	3.3	154	203.2	58	41.8	6.5

쯔비터전트 3-12 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자 형성(아포지방단백질:인지질의 몰비 = 1:60)의 결과를 표 20에 요약한다. 상기 지질 입자 분획은 상기 SEC 크로마토그램에서 2 개의 중복 피크에서 나타나는 바와 같이 2 개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 2 개의 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 분자의 수가 다르다.

쯔비터전트 3-12의 존재 하에서 형성된 지질 입자의 단백질-접합체 분석의 요약
x CMC		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질	Rh (w) ( QELS ) [ nm ]
100
	주요 피크	487	342	10.7	145	191.3	18	70.2	11.9
300
	주요 피크	241	208	6.5	32	43.3	7	86.4	8.5

콜레이트 및 POPC를 사용하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자 형성(아포지방단백질:인지질의 몰비 = 1:60)의 결과를 표 21에 요약한다. 상기 지질 입자 분획은 상기 SEC 크로마토그램에서 2 개의 중복 피크에서 나타나는 바와 같이 2 개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 2 개의 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 분자의 수가 다르다.

콜레이트의 존재 하에서 형성된 지질 입자의 단백질-접합체 분석의 요약
CMC		MW 전체	MW 단백질	n (단백질 단량체)	MW 지질	n (지질)	n(지질)/ n (단량체)	% 단백질	Rh (w) (QELS) [ nm ]
0.5	전 피크	1295	461	14.5	829	1091	75	35.9	12.7
	주요 피크	361	153	4.8	207	273	57	42.5	7.7
	후 피크	283	115	3.6	168	221	62	40.6	6.8
1	전 피크	1050	414	12.9	623	836	65	39.5	11.8
	주요 피크	337	154	4.8	182	240	50	45.9	7.6
	후 피크	284	121	3.8	162	214	56	42.7	6.9
2	전 피크	332	143	4.5	188	248	55	43.2	7.3
	주요 피크	269	111	3.5	158	209	60	41.2	6.5
5	전 피크	314	143	4.5	171	225	50	45.6	7.5
	주요 피크	278	118	3.7	158	208	56	42.7	6.8
10	전 피크	292	135	4.2	156	206	50	46.3	7.3
	주요 피크	271	115	3.6	155	204	57	42.6	6.6

실시예 5

리폴딩 및 지질 입자 형성을 위한 신속한 희석 방법

하기에서 서열번호 1의, 선행 실시예 1 내지 3에서 생성된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 사용하였다.

a) POPC 및 나트륨 콜레이트

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제하였다(프로토콜 1). 정제 후에, 상기 완충제를 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4를 함유하는 용액으로 정용여과에 의해 교환하였다. 상기 단백질 농도를 28 ㎎/㎖로 조절하였다.

지질 모액을, 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4를 함유하는 완충제에 POPC 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 지질 모액을 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 리폴딩 완충제를, 77 ㎖의 지질 모액 혼합물을 1478 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4 내로 희석하여 제조하였다. 상기 완충제를 실온에서 추가로 7 시간 동안 교반하였다.

리폴딩 및 지질 입자 형성을, 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4 중의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 162 ㎖을 리폴딩 완충제에 첨가하여 개시시켰다. 이는 상기 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:10 희석을 생성시킨다. 상기 용액을 꾸준히 교반하면서 16 시간 동안 실온에서 배양하였다. 상기 세제의 제거를 정용여과에 의해 수행하였다.

POPC에 의한 고속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
피크	MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n (단백질 단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n (지질)	n (지질) / n (단백질)	% 단백질
전 피크	347	141	4.4	207	272	62	41
주요 피크	269	111	3.5	159	209	60	41

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제하였다(프로토콜 2). 정제 후에, 상기 완충제를 50 mM 트리스, 10 mM L-메티오닌, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4를 함유하는 용액으로 정용여과에 의해 교환하였다. 상기 단백질 농도를 20.4 ㎎/㎖로 조절하였다.

지질 모액을, 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM L-메티오닌, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4를 함유하는 완충제에 인지질(POPC:DPPC 2:1 몰비) 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 리폴딩 완충제를, 3.7 ㎖의 지질 모액을 35.6 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4 내로 희석하여 제조하였다. 상기 완충제를 실온에서 추가로 2 시간 동안 교반하였다.

리폴딩 및 지질 입자 형성을, 50 mM 트리스, 10 mM L-메티오닌, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 8.0 중의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 9.8 ㎖을 리폴딩 완충제에 첨가하여 개시시켰다. 이는 상기 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:5 희석을 생성시킨다. 상기 용액을 꾸준히 교반하면서 밤새 실온에서 배양하였다. 상기 세제의 제거를 정용여과에 의해 수행하였다.

POPC/DPPC/콜레이트 혼합물에 의한 고속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
피크	MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n 단백질 ( 아포 -단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n 지질	n 지질 / n 단백질	% 단백질
전 피크	419	167	5.2	251	333	64	41
주요 피크	252	101	3.2	151	200	63	41

b) POPC 및 DPPC 및 나트륨 콜레이트

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제하였다. 정제 후에, 상기 완충제를 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4를 함유하는 용액으로 정용여과에 의해 교환하였다. 상기 단백질 농도를 30 ㎎/㎖로 조절하였다.

2 개의 별도의 지질 모액을 제조하였다. 용액 A를, 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4를 함유하는 완충제에 POPC 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 용액 B를, 41 ℃에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4 중에 DPPC 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 지질 모액 A 및 B를 3:1의 비로 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 리폴딩 완충제를, 384 ㎖의 지질 모액 혼합물을 6365 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4 내로 희석하여 제조하였다. 상기 완충제를 실온에서 추가로 24 시간 동안 교반하였다.

리폴딩 및 지질 입자 형성을, 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4 중의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 750 ㎖을 리폴딩 완충제에 첨가하여 개시시켰다. 이는 상기 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:10 희석을 생성시킨다. 상기 용액을 꾸준히 교반하면서 12 시간 이상 실온에서 배양하였다. 상기 세제의 제거를 정용여과에 의해 수행하였다.

POPC:DPPC = 1:1에 의한 고속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
피크	MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n (단백질 단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n (지질)	n (지질) / n (단백질)	% 단백질
주요 피크	263	102	3.2	161	214	67	39
후 피크	182	85	2.7	97	129	48	47

c) 상이한 구아니디늄 하이드로클로라이드 농도

본 발명에 따른 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 봉입체로부터 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 공정상에서 정제하였다(실시예 1 내지 3을 참조하시오). 정제 후에, 상기 완충제를 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, pH 7.4를 함유하는 용액으로 정용여과에 의해 교환하였다. 상기 단백질 농도를 28 ㎎/㎖로 조절하였다.

지질 모액을, 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4를 함유하는 완충제에 POPC 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 지질 모액을 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 리폴딩 완충제를, 지질 모액을 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4 내로 희석하여 제조하였다. 상기 완충제를 실온에서 추가로 12 시간 동안 교반하였다. 다양한 양의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 리폴딩 완충제로 1:5, 1:7.5, 1:10, 1:12.5 희석하였다. 이는 상기 리폴딩 완충제 중에 상이한 잔류 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드를 생성시킨다. 상기 용액을 실온에서 밤새 교반시켜 리폴딩 및 지질 입자 형성을 개시시켰다. 세제 제거를 투석에 의해 수행하였다.

상이한 희석비로 급속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
희석	피크	MW 전체 [ kDa ]	MW 단백질 [ kDa ]	n (단백질 단량체)	MW 지질 [ kDa ]	n (지질)	n (지질) / n (단백질)	% 단백질
1:5	주요	273	103	3,2	170	226	70	38
1:7.5	주요	272	100	3,1	173	230	73	37
1:10	주요	266	106	3,3	160	212	64	40
1:12.5	주요	281	101	3,2	180	239	76	36

d) 유레아 존재 하의 POPC 및 나트륨 콜레이트

테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제한다. 정제 후에, 상기 완충제를 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 유레아, pH 7.4를 함유하는 용액으로 정용여과에 의해 교환한다. 상기 단백질 농도를 28 ㎎/㎖로 조절한다.

지질 모액을, 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트, pH 7.4를 함유하는 완충제에 POPC 100 몰/ℓ를 용해시킴으로써 제조하였다. 상기 지질 모액을 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 리폴딩 완충제를, 77 ㎖의 지질 모액 혼합물을 1478 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4 내로 희석하여 제조한다. 상기 완충제를 실온에서 추가로 7 시간 동안 교반한다.

리폴딩 및 지질 입자 형성을, 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 유레아, pH 7.4 중의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 용액 162 ㎖을 리폴딩 완충제에 첨가하여 개시시킨다. 이는 상기 유레아의 1:10 희석을 생성시킨다. 상기 용액을 꾸준히 교반하면서 16 시간 동안 실온에서 배양한다. 상기 세제의 제거를 정용여과에 의해 수행한다.

e) POPC 및 나트륨 콜레이트 및 야생형 아포지방단백질 A-I

또 다른 예시적인 두 번째 방법에서 pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 인간 아포지방단백질 A-I(야생형 아포지방단백질 A-I)를 지질화 완충제에 1:5(v/v) 희석하여 0.6 ㎎/㎖의 단백질 농도를 생성시켰다. 상기 지질화 완충제는 7 mM 콜레이트, 4 mM POPC 및 1.3 mM DPPC로 이루어지며 이는 240:1의 지질 대 단백질 비에 상응한다. SEC-MALLS를 사용하여 복합체 형성을 분석하였다. 대략 2 개의 아포지방단백질 분자가 대략 200 개의 지질 분자로 이루어지는 복합체에서 발견되었다.

단백질 접합체 분석의 요약
출발 물질		MW 전체	MW 단백 질	n (단백질 단량체)	MW 지질	지질의 수	지질:단백질 비
변성된 것	주요 피크	235	71	2.2	163	216	1: 97

실시예 6

변성 또는 고유 단백질로부터 출발하는 지질 입자 형성

하기에서 서열번호 1의, 선행 실시예 1 내지 3에서 생성된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 사용하였다.

실시예 4에 보고된 바와 같은 방법(첫 번째 방법)은 지질 입자 형성을 위해 고유 아포지방단백질을 필요로 하는 반면 실시예 5에 보고된 방법(두 번째 방법)은 지질 입자 형성을 위해 완전히 변성된 아포지방단백질로 시작한다.

예시적인 첫 번째 방법에서 pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 변성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 pH 7.5에서 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌으로 이루어진 완충제에 대해 3.46 ㎎/㎖의 단백질 농도로 광범위하게 투석시켰다. 이어서 POPC 및 콜레이트의 혼합물을 가하여 상기 용액 중에 6 mM POPC 및 8 mM 콜레이트의 최종 농도를 제공하였다. 이는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체의 분자당 60 분자의 POPC의 비(60:1)에 상응한다. 세제를 정용여과에 의해 후속 제거하였다. 형성된 단백질-지질 복합체의 분석을 SEC-MALLS에 의해 수행하였다. 상기 방법을 사용하여, 형성된 종의 대략 60%가 3 개 초과의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 단량체를 포함하는 불균질 생성물이 형성되었다.

예시적인 두 번째 방법에서 pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 변성된 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 지질화 완충제에 직접 희석하여(1:10(v/v)) 2.5 ㎎/㎖의 단백질 농도를 생성시켰다. 상기 지질화 완충제는 6 mM 콜레이트 및 4.5 mM POPC로 이루어졌으며 이는 60:1의 지질 대 단백질 비에 상응하였다. 상기 방법을 사용하여 90% 초과의 단일의 형성된 종을 포함하는 균질한 생성물(이때 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 분자당 60 개의 지질 분자가 결합되었다)이 형성되었다.

단백질 접합체 분석의 요약
출발 물질		MW 전체	MW 단백질	n (단백 질단량체 )	MW 지질	지질 수	지질:단백질 비
고유	전 피크 (60%)	321	131	4.1	190	250	61
	주요 피크 (40%)	269	107	3.3	162	213	65
변성된 것	주요 피크 (>90%)	269	111	3.5	159	209	60

실시예 7

콜레이트 - 및 쯔비터전트 -용해된 POPC / DPPC 에 의한 인슐린-F의 지질화

지질 입자 형성을 위해 선택된 단백질은 상업적으로 입수할 수 있는 인슐린이다(휴멀로그(Humalog)(등록상표), 인슐린 리스프로, 릴리(Insulin Lispro, Lilly)). 상기 단백질의 분자량은 5808 Da이다. 상기 지질 입자 중의 인슐린에 대한 검출 한계를 증가시키기 위해서 상기 단백질을 NHS-플루오레세인(6-[플루오레세인-5(6)-카복스아미도]헥산산 N-하이드록시숙신이미드 에스터, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) #46940-5MG-F)으로 표지하였다.

NHS-플루오레세인-표지된 인슐린(인슐린-F)의 쯔비터전트- 및 콜레이트-매개된 지질화를 POPC 및 DPPC의 1:1 혼합물을 사용하여 실시예 4에 보고된 바와 같이 수행하였다. 0.5 mM 지질 혼합물을 PBS pH 7.4 중의 1 x CMC 콜레이트, 2 x CMC 쯔비터전트 3-8 또는 5 x CMC 쯔비터전트 3-10에 용해시켰다. 상기 지질의 용해를 초음파 욕에서 45 ℃에서 1 시간 동안 성취하였다. 인슐린-F를 상기 용해된 지질에 1:2(쯔비터전트 3-8) 또는 1:1.2(쯔비터전트 3-10 및 콜레이트)의 단백질:지질 몰비로 가하였다. 상기 지질화 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 배양한 다음 PBS pH 7.4에 대해 광범위하게 투석시켜 상기 세제를 제거하였다.

상기 형성된 지질 입자 및 대조용 샘플을 형광 검출(494 ㎚ 여기, 521 ㎚ 방출) 및 UV280 흡수를 사용하여 SE-HPLC 상에서 분석하였다. 지질화 접근 당 3 개의 상이한 샘플, 즉 PBS 중에 용해된 인슐린-F, PBS 중의 인슐린 F 부재 하의 리포솜, 및 인슐린-F를 포함하는 지질 입자를 SE-HPLC 상에서 분석하였다. 지질화되지 않은 인슐린-F가 약 40 분 용출 시간에서 상기 컬럼으로부터 용출되고 피크가 형광 및 UV280 검출에 의해 검출된다. 지질화된 인슐린-F 샘플이 형광 및 UV280에 의해 검출된 2 개의 분리된 피크로서 상기 컬럼으로부터 용출된다. 늦은 피크(대략 40 분에서 최대 피크)가 상기 인슐린-F 대조용 샘플과 함께 이동한다. 15 분 용출 시간의 이른 피크는 순수한 인슐린-F보다 더 높은 분자량을 가지며 지질화된 인슐린-F로 이루어진다. 단백질 비함유 지질 입자가 15 분 용출 시간에 용출된다.

실시예 8

아포지방단백질의 적용

a) LCAT 활성에 대한 DPPC 및 POPC 의 영향

팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린(POPC) 또는 다이팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 재조합 야생형 아포지방단백질 A-I 또는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자를 LCAT에 의한 콜레스테롤 에스터화를 지지하는 이의 능력에 대해 검사하였다.

삼중수소화된 콜레스테롤(4%; 몰 기준으로 포스파티딜콜린 함량에 비해)을 에탄올성 콜레스테롤 용액의 첨가에 의해 지질 입자에 통합시켰다. LCAT 촉매화된 콜레스테롤 에스터화를 지지하는 상기 생성된 단백질-지질 복합체의 능력을 125 ㎕(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaN₃; pH 7.4; 2 ㎎/㎖ HuFAF 알부민; 4 mM 베타 머캅토에탄올) 중의 0.2 ㎍/㎖ 재조합 LCAT 효소(ROAR 바이오케미칼)의 존재 하에 37 ℃에서 1 시간 동안 시험하였다. 상기 반응을 클로로폼:메탄올(2:1)의 첨가에 의해 정지시키고 지질을 추출하였다. 에스터화 "퍼센트"를 TLC 및 섬광 카운팅에 의해 콜레스테롤-콜레스테릴 에스터 분리 후에 계산하였다. 상기 추적자의 20% 미만이 상기 형성된 에스터에 통합됨에 따라, 반응 속도를 상기 실험 조건 하에서 일정한 것으로 간주할 수 있었다. 데이터를 XLfit 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 미카엘리스 멘텐 식에 대입하였다. 상기 결과의 가시화에 대해서 도 3을 참조하시오.

b) LCAT 활성에 대한 DPPC / POPC 혼합물의 영향

지질 입자를 세제로서 콜레이트를 사용하여, 재조합 야생형 아포지방단백질 A-I와 ³H 콜레스테롤, DPPC/POPC 혼합물, 및 콜레이트를 1:4:80:113의 몰비로 혼합함으로써 제조하였다. DPPC/POPC 혼합물은 100% POPC; 75% POPC; 50% POPC; 25% POPC 중 어느 하나를 함유하였다.

투석에 의한 콜레이트 제거 후에, LCAT 촉매화된 콜레스테롤 에스터화를 지지하는 상기 생성된 단백질-지질 복합체의 능력을 시험하였다. ³H 콜레스테롤(4%; 몰 기준으로 포스파티딜콜린 함량에 비해)을 에탄올성 콜레스테롤 용액의 첨가에 의해 지질 입자에 통합시켰다. LCAT 촉매화된 콜레스테롤 에스터화를 지지하는 상기 생성된 단백질-지질 복합체의 능력을 125 ㎕(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaN₃; pH 7.4; 2 ㎎/㎖ HuFAF 알부민; 4 mM 베타 머캅토에탄올) 중의 0.2 ㎍/㎖ 재조합 LCAT 효소(ROAR 바이오케미칼)의 존재 하에 37 ℃에서 1 시간 동안 시험하였다. 상기 반응을 클로로폼:메탄올(2:1)의 첨가에 의해 정지시키고 지질을 추출하였다. 에스터화 "퍼센트"를 TLC 및 섬광 카운팅에 의해 콜레스테롤-콜레스테릴 에스터 분리 후에 계산하였다. 상기 추적자의 20% 미만이 에스터에 통합됨에 따라, 반응 속도를 상기 실험 조건 하에서 일정한 것으로 간주할 수 있었다. 데이터를 XLfit 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 미카엘리스 멘텐 식에 대입하였으며 이를 도 4에 나타낸다.

[표 2a]

c) THP -1 유도된 거품 세포에 대한 콜레스테롤 유출

인간 THP-1 세포와 같은 대식세포를, THP-1 단구성 백혈병 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트에 노출시킴으로써 수득하였다. 후속적으로 세포를 ³H 콜레스테롤 추적자를 함유하는 아세틸화된 LDL의 존재 하에서 추가의 배양에 의해 로딩하였다. 이어서 상기 거품 세포 모델을 4 시간 내지 8 시간 동안 콜레스테롤 수용체 시험 화합물(하기 참조)에 노출시켰다.

세포 배양 상등액을 수확하고 세포를 5% NP40에 용해시켰다. 유출 분획을 상기 세포 + 상등액 중의 방사성의 합에 대한 상기 상등액 중의 콜레스테롤 방사성의 비로서 계산하였다. 수용체를 함유하지 않는 배지에 노출된 세포로부터의 유출을 공제하고 유출 속도를 선형 적합도에 의해 계산하였다. 유출 속도를 기준으로서 세포로부터 10 ㎍/㎖ 야생형 아포지방단백질 A-I(상대 유출 속도)까지의 유출을 사용하여 표준화하였다. 2 개의 별도의 실험들에서 획득한 상대 유출 속도를 콜레스테롤 수용체 농도의 함수로서 플롯팅하고 데이터를 미카엘리스 멘텐 식에 대입하였다.

병행 실험을, ABCA-1 수송자를 상향조절하고 콜레스테롤 수송을 ABCA-1 매개된 유출 쪽으로 편향시키는 것으로 공지된 RXR-LXR 작용물질에 노출된 세포를 사용하여 수행하였다.

상기 지질 혼합물의 단지 적당한 영향만이 상기 일련의 시험에서 관찰되었다(도 5 및 표 27).

상이한 샘플들
하기를 갖는 테트라넥 틴- 아포지방단백질 A-I	아포지방단백질 :인지질의 몰비	제조 방법
100 % POPC/ 0 % DPPC	1:60	콜레이트
75 % POPC/ 25 % DPPC	1:60	콜레이트
50 % POPC/ 50 % DPPC	1:70	콜레이트
0 % POPC/ 100 % DPPC	1:80	콜레이트
-	없음

상기 거품 세포의 RXR-LXR 전처리는 상기 지질화되지 않은 물질에 대한 유출을 강하게 증가시켰으며, 이때 처리되지 않은 세포에 비해 6 배의 최대 속도 증가가 있었다. 지질 입자에 대한 영향은 훨씬 적게, 2 배 증가하였으며, 이는 상기 콜레스테롤 유출물로의 상기 ABCA-1 수송자의 더욱 낮은 기여를 반영하였다(도 6).

d) 생체 내 연구

5 개의 지질 입자 변이체들을 연구하였다:

i) 단지 POPC

ii) 단지 DPPC

iii) POPC:DPPC 3:1

iv) POPC:DPPC 1:1

v) DPPC:SM 9:1

토끼에게 0.5 시간에 걸쳐 80 ㎎/㎏을 정맥 내 주입한 다음(n = 3 토끼/시험 화합물) 주입 후 96 시간에 걸쳐 일련의 채혈을 수행하였다.

ELISA에 의한 아포지방단백질 수준의 분석:

-약물 수준

-간 효소, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터의 혈장 값에 대한 데이터.

혈장 농도는 모든 시험된 조성물들에 대해 매우 유사하며, 이는 농도의 현저한 초기 "분포" 상에 이어서 로그-선형 감소가 거의 없음을 나타낸다(도 7, 표 3).

[표 3a]

상기 측정된 약동학(PK) 매개변수들은 모든 시험된 화합물들에 대해 유사하였다. 또한 낮은 개체-간 변화성이 발견되었다. 상기 측정된 반감기는 1.5일에 가깝다, 즉 야생형 아포지방단백질 A-I에 비해 증가하였다. 상기 분배 부피는 혈장 부피(토끼에서 약 40 ㎖/㎏)와 유사하다.

f) 콜레스테롤 가동화

콜레스테롤은 혈장에서 가동화되고 에스터화된다. 혈장 콜레스테릴 에스터 수준은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I가 이미 감소한 후에조차 계속해서 증가한다. 혈장 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 수준이 0.5 ㎎/㎖(통상적인 야생형 아포지방단백질 A-I의 약 50%)까지 감소한 경우, 증가된 콜레스테롤 에스터 수준이 여전히 검출될 수 있다(도 8).

g) 간 효소 방출

POPC를 함유하는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 포함하는 지질 입자는 간 효소 방출을 유도하지 않는다(도 1). 상기 토끼와 유사하게, POPC 또는 POPC/DPPC 혼합물을 함유하는 본 발명에 따른 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 단일 정맥 내 주사는 마우스에서 안전하다. DPPC:POPC를 1:3의 몰비로 함유하는 아포지방단백질 조성물은 POPC 단독에 필적하였다(도 9).

상기 5 개의 제제 중 어느 것에서도 주입 후 2 시간까지 현저한 용혈이 관찰되지 않았다. 용혈을, 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I의 i.v. 적용 후 2 시간째에 수득된 혈장 샘플에서 적색 색상으로서 광도측정에 의해 측정하였다. 전혈의 100% 용혈(0.44% 트리톤 X-100-최종 농도에 의해 생성됨)을 교정에 사용하였다(도 10).

h) 인간 탯줄 정맥 내피 세포에 대한 테트라넥틴 - 아포지방단백질 A-I의 소염 효과

계대 5 내지 10 회의 HUVEC(인간 탯줄 정맥 내피 세포)를 16 시간 동안 각각의 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I 제제 중에서 배양하고 최종 4 시간 동안 TNFα로 자극하였다. VCAM1 표면 발현을 FACS에 의해 특이 항체로 검출하였다.

실시예 9

지질 입자 안정성

N-말단 히스티딘-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 함유하는 야생형 아포지방단백질 A-I를 에스케리키아 콜라이에서 발현시키고 상기 실시예들에서 보고한 바와 같이 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상기 히스티딘-태그를 IgA 프로테아제 절단에 의해 제거하였다. 지질 입자(HDL 입자)를 1:150 비의 단백질 대 리포이드(Lipoid) S100 대두 인지질 혼합물을 사용하여 조립하였다. 상기 입자를 7.3의 pH 값에서 5 mM 나트륨 포스페이트 및 1% 슈크로스를 함유하는 완충제 중에서 보관하였다. SE-HPLC는 지질화 후 배양 및 10일간 배양 시 3 개의 뚜렷한 피크를 나타내었다. 40 ℃에서 배양 후, 체류 시간 10.8 분째에 우세한 피크를 검출할 수 있으며(전체 단백질의 47%), 이는 5 ℃에서 보관된 샘플 중에는 존재하지 않는다. 10.8 분 피크는 단백질 탈안정화에 기인한 가용성의 큰 분자량 조립체의 형성을 가리킨다.

POPC:DPPC 혼합물(POPC 대 DPPC 비 3:1)로부터 출발하여 수득된 본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I를 함유하는 HDL 입자를 또한 5 ℃ 및 40 ℃에서 배양하였다. 상승된 온도에서의 배양은 약한 정도의 전-피크 형성을 유도하지만, 10.8 분에서 고 분자량 조립체로의 현저한 이동은 유도하지 않는다(11 분째에 <2% 증가). 이는 야생형 아포지방단백질 A-I를 함유하는 입자에 비해 개선된 HDL 입자 안정성을 가리킨다.

실시예 10

콜레스테롤 가동화

콜레스테롤이 혈액 내로 가동화되는 효율을, 생체 내 아포지방단백질의 투여 후 아포지방단백질 농도를 갖는 전체 콜레스테롤의 각각의 회유를 비교함으로써 측정할 수 있다. 정량적인 평가를 위해서, 총 콜레스테롤의 농도-시간 곡선 하 기준선 보정 면적(AUC)과 아포지방단백질의 농도-시간 곡선 하 면적의 몫을 계산하였다.

본 실험에서 하기의 물질들을 분석하였다:

-에스케리키아 콜라이에서 발현되고 상기 실시예들에서 보고된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 N-말단 히스티딘-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 함유하는 야생형 아포지방단백질 A-I; 상기 히스티딘-태그를 IgA 프로테아제 절단에 의해 제거하였으며; 지질 입자(HDL 입자)를 1:150 비의 단백질 대 이포이드 S100 대두 인지질 혼합물을 사용하여 조립하였다,

-아포지방단백질 A-I 밀라노 변이체; 지질 입자(HDL 입자)를 1:40 비의 단백질 대 POPC를 사용하여 조립하였다,

-본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I; 지질 입자(HDL 입자)를 1:60 비의 단백질 대 POPC 및 DPPC(3:1 비의 POPC 및 DPPC)를 사용하여 조립하였다.

상기 3 개의 HDL 입자를 래트에게 적용하였다. 상기 각각의 AUC 비에 대해 획득된 값들을 표 29에 나타낸다.

콜레스테롤 가동화
	지질	AUC (시간 의존적인 혈중 콜레스테롤 농도) ---------------------------------------------- AUC (시간 의존적인 혈중 아포지방단백질 A-I 농도)
야생형 아포지방단백질 A-I	대두 인지질 혼합물	0.0002 (mmol/l)/(㎍/ml)).
아포지방단백질 A-I 밀라노 변이체	POPC	0.0004 (mmol/l)/(㎍/ml)).
본 발명에 보고된 바와 같은 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I	POPC:DPPC 3:1	0.0013 (mmol/l)/(㎍/ml)

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Tetranectin-apolipoprotein A-I, lipid particles containing it and its use <130> 26624 <140> PCT/EP2011/064062 <141> 2011-08-25 <150> EP10008993.7 <151> 2010-08-30 <150> EP10188392.4 <151> 2010-10-21 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (1) <400> 1 Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (2) <400> 2 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 35 40 45 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 50 55 60 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 65 70 75 80 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 85 90 95 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 100 105 110 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 130 135 140 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 165 170 175 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 180 185 190 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 195 200 205 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 210 215 220 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu 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Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Ser Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Glu Asn Val 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Thr Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Thr Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Gln Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Glu Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Met Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Arg His Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Leu Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Asn Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Pro Glu Gln Gln Arg Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Glu Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Gln 385 390 395 400 Gln Glu Gln Gln Arg Glu Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln 405 410 415 Gln Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 420 425 <210> 49 <211> 395 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Phe Leu Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Arg Ala Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Val Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Thr Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln 35 40 45 Phe Gln Lys Thr Asp Val Thr Gln Gln Leu Ser Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Asp Ala Ser Thr Tyr Ala Asp Gly Val His Asn Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Val Val Gln Leu Ser Gly His Leu Ala Lys Glu Thr Glu 85 90 95 Arg Val Lys Glu Glu Ile Lys Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Asp Arg 100 105 110 Met Met Pro His Ala Asn Lys Val Thr Gln Thr Phe Gly Glu Asn Met 115 120 125 Gln Lys Leu Gln Glu His Leu Lys Pro Tyr Ala Val Asp Leu Gln Asp 130 135 140 Gln Ile Asn Thr Gln Thr Gln Glu Met Lys Leu Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ile Gln Arg Met Gln Thr Thr Ile Lys Glu Asn Val Asp Asn Leu His 165 170 175 Thr Ser Met Met Pro Leu Ala Thr Asn Leu Lys Asp Lys Phe Asn Arg 180 185 190 Asn Met Glu Glu Leu Lys Gly His Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Thr Val Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val 245 250 255 Ser Ala Lys Ile Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu 260 265 270 Asp Val Gln Ser Lys Val Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Glu Asp Leu Asn Arg Gln Leu Glu Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Thr Val Glu Pro Met Gly Glu Met Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Leu Glu Gln Phe Arg Gln Gln Leu Gly Pro Asn Ser Gly Glu Val 325 330 335 Glu Ser His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Ser Leu Arg Glu Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Met Ser Thr Leu Glu Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Pro Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala Gln Glu Gln Ala 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 50 <211> 401 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 1 5 10 15 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Ser Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 20 25 30 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 35 40 45 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 50 55 60 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Lys 65 70 75 80 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Lys Glu Leu Glu Glu Val Arg Ala Arg 85 90 95 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Glu Asn Val 100 105 110 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Thr Asp Gln Leu Arg Thr 115 120 125 Gln Val Asn Thr Gln Thr Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 130 135 140 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 145 150 155 160 Thr Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Gln Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 165 170 175 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 180 185 190 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 195 200 205 Pro Tyr Ala Gln Asp Ala Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 210 215 220 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 225 230 235 240 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 245 250 255 Asp Met Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 260 265 270 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Arg His Val Glu Glu Phe Arg 275 280 285 Leu Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 290 295 300 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 305 310 315 320 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 325 330 335 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Asn Thr Leu 340 345 350 Ser Leu Pro Glu Pro Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Glu 355 360 365 Gln Gln Gln Glu Gln Gln Glu Glu Gln Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln 370 375 380 Glu Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu 385 390 395 400 Ser <210> 51 <211> 382 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Val Thr 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Asn Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Gly Ser Asn Ala Lys Lys Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Thr Glu Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Thr Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Arg Arg Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Thr Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Val 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Gly Pro Phe Thr Gly Gly Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Val Gln Gln Leu Gln Arg Gln Leu Lys Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Glu Arg Met Glu Ser Val Leu Arg Gln Asn Ile Arg Asn Leu Glu 165 170 175 Ala Ser Val Ala Pro Tyr Ala Asp Glu Phe Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Ser Leu Thr Pro Tyr Ala Glu Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Lys Ile Asp Gln Asn Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Gln Ala Glu Glu Leu Lys Ala Lys Ile 245 250 255 Ser Ala Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gln Lys Leu Val Pro Val Ala Glu 260 265 270 Asn Val His Gly His Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Leu Glu Leu Arg Ser His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Leu Lys Val Glu Pro Tyr Gly Glu Thr Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Val Glu Asp Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro Leu Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Thr Phe Phe Ser Thr Leu Lys Glu Glu Ala Ser Gln Gly Gln Ser Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Gln Glu Lys Ala Gln Ala Pro Leu Glu Gly 370 375 380 <210> 52 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Val Ala Leu Val Ala Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gln Ala Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Thr Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln 35 40 45 Leu Gln Lys Thr Asp Val Thr Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Ala Asp Asp Leu Gln Asn Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Val Gln Leu Ser Gly His Leu Thr Lys Glu Thr Glu 85 90 95 Arg Val Arg Glu Glu Ile Gln Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Ala Asn 100 105 110 Met Met Pro His Ala Asn Lys Val Ser Gln Met Phe Gly Asp Asn Val 115 120 125 Gln Lys Leu Gln Glu His Leu Arg Pro Tyr Ala Thr Asp Leu Gln Ala 130 135 140 Gln Ile Asn Ala Gln Thr Gln Asp Met Lys Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ile Gln Arg Met Gln Thr Thr Ile Gln Asp Asn Val Glu Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Met Val Pro Phe Ala Asn Glu Leu Lys Glu Lys Phe Asn Gln 180 185 190 Asn Met Glu Gly Leu Lys Gly Gln Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Ala Glu Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val 245 250 255 Ser Thr Asn Ile Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu 260 265 270 Asp Val Gln Ser Lys Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Glu Asp Leu Asn Lys Gln Leu Asp Gln Gln Val Glu Val Phe Arg 290 295 300 Arg Ala Val Glu Pro Leu Gly Asp Lys Phe Asn Met Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Lys Phe Arg Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Gly Asp Val 325 330 335 Glu Ser His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asn Leu Arg Glu Lys Val Ser 340 345 350 Ser Phe Met Ser Thr Leu Gln Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Leu 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Pro Glu Gln Val Gln Glu Gln Val Gln Glu Gln Val 370 375 380 Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser 385 390 <210> 53 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <302> Trimerising module <310> WO 98/56906 <311> 1998-06-11 <312> 1998-12-17 <313> (1)..(51) <400> 53 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu 50 <210> 54 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexahistidine tag <400> 56 His His His His His His 1 5 <210> 57 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 57 Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys 20 25 30 Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu 35 40 45 Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu 50 55 60 Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp 65 70 75 80 Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr 85 90 95 Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys 100 105 110 Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys 130 135 140 Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln 165 170 175 Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu 180 185 190 Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp 210 215 220 Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg 225 230 235 240 Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu 260 265 270 Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val 275 280 285 Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr 290 295 300 Lys Lys Leu Asn Thr Gln 305 310 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N1 <400> 58 aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg 35 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N2 <400> 59 aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg 36 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 60 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 61 Pro Ala Pro Ser Pro 1 5 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 62 Pro Pro Ser Pro 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 63 Pro Pro Ala Pro 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 64 Pro Pro Thr Pro 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 65 Pro Pro Gly Pro 1 <210> 66 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I <220> <221> MISC_FEATURE <223> X = A or G or S or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Xaa Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 67 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I with N-terminal His-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of AP, GP, SP, PP, GSAP, GSGP, GSSP, GSPP, GGGS, GGGGS, GGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGSGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGSAP, GGGSGP, GGGSSP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGSPP, GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGSGGGSAP, GGGSGGGSGP, GGGSGGGSSP, GGGSGGGSPP, GGGSGGGSGGGSAP, GGGSGGGSGGGSGP, GGGSGGGSGGGSSP, GGGSGGGSGGGSPP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSSP, GGGGSGGGGSPP, GGGGSGGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSGGGGSSP, and GGGGSGGGGSGGGGSPP. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 67 Met His His His His His His Xaa Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val 1 5 10 15 Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu 20 25 30 Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 45 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 65 70 75 80 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 85 90 95 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 100 105 110 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 115 120 125 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 130 135 140 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 165 170 175 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 180 185 190 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 195 200 205 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 210 215 220 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 225 230 235 240 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 260 265 270 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 275 280 285 Asn Thr Gln 290 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 68 Gly Ser Ala Pro 1 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 69 Gly Ser Gly Pro 1 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 70 Gly Ser Ser Pro 1 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 4 <400> 71 Gly Ser Pro Pro 1 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 72 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 6 <400> 73 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 7 <400> 74 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 8 <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 9 <400> 76 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 10 <400> 77 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 11 <400> 78 Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 12 <400> 79 Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 13 <400> 80 Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 81 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 14 <400> 81 Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 15 <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 16 <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 17 <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 18 <400> 85 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 19 <400> 86 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 20 <400> 87 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 21 <400> 88 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 22 <400> 89 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 23 <400> 90 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 24 <400> 91 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 25 <400> 92 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 26 <400> 93 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 27 <400> 94 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 28 <400> 95 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 29 <400> 96 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 30 <400> 97 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 31 <400> 98 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 32 <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 33 <400> 100 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 34 <400> 101 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 35 <400> 102 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 36 <400> 103 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 37 <400> 104 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Pro <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 38 <400> 105 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Pro

Claims (51)

1. 아포지방단백질 A-I;
   1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 및 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린; 및
   콜레이트 및 쯔비터전트(Zwittergent)로부터 선택된 세제
   로 이루어진 지질 입자로서, 상기 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜 콜린 대 상기 1,2-다이팔미토일-포스파티딜 콜린의 몰비가 99:1 내지 25:75인 지질 입자.
2. 제 1 항에 있어서,
   아포지방단백질 A-I가 3 개의 단량체를 포함하는 다량체임을 특징으로 하는 지질 입자.
3. 제 1 항에 있어서,
   아포지방단백질 A-I가 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 66 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지방단백질 A-I임을 특징으로 하는 지질 입자.
4. 제 1 항에 있어서,
   아포지방단백질 A-I의 아미노산 서열이 하나 이상의 보존적인 아미노산 변형을 가짐을 특징으로 하는 지질 입자.
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서,
   큐빌린, 스캐빈저 수용체 부류 B 유형 1(SR-BI), ATP-결합 카세트 1(ABCA-1), 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT), 콜레스테릴-에스터 전달 단백질(CETP) 및 인지질 전달 단백질(PLTP)로 이루어진 군 중에서 선택된 수용체에 결합함을 특징으로 하는 지질 입자.
7. 제 1 항에 있어서,
   지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 40 내지 120임을 특징으로 하는 지질 입자.
8. 제 1 항에 있어서,
   아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 50 내지 110임을 특징으로 하는 지질 입자.
9. 제 1 항에 있어서,
   아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 54 내지 102임을 특징으로 하는 지질 입자.
10. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 60 내지 90임을 특징으로 하는 지질 입자.
11. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 60 내지 88임을 특징으로 하는 지질 입자.
12. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 62 내지 80임을 특징으로 하는 지질 입자.
13. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 64 내지 70임을 특징으로 하는 지질 입자.
14. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 66 내지 86임을 특징으로 하는 지질 입자.
15. 제 1 항에 있어서,
    지질 입자 중의 아포지방단백질 단량체당 인지질 분자의 수가 66임을 특징으로 하는 지질 입자.
16. 급성 관상동맥 증후군이 있는 환자의 2차 예방;
    죽상동맥경화증의 예방 또는 치료;
    역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도;
    대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배;
    대상의 판막협착증의 예방 또는 치료;
    대상의 HDL 입자의 수의 증가;
    대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시;
    내독소의 제거;
    패혈성 쇼크의 예방;
    협심증의 치료;
    심근경색의 치료;
    불안정 협심증의 치료;
    동맥 협착증, 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료;
    혈관성 치매의 치료; 또는
    일과성 흑암시의 치료를 위한,
    제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 지질 입자를 포함하는 약학 조성물.
17. 삭제
18. 삭제
19. 제 1 항 내지 제 4 항 및 제 6 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    급성 관상동맥 증후군이 있는 환자의 2차 예방;
    죽상동맥경화증의 예방 또는 치료;
    역 콜레스테롤 수송 및/또는 플라크 진정의 유도;
    대상의 혈관에서 죽상동맥경화성 플라크의 청소/용해/안정화 또는 대상의 동맥 벽에서부터 간까지의 콜레스테롤 재분배;
    대상의 판막협착증의 예방 또는 치료;
    대상의 HDL 입자의 수의 증가;
    대상의 역 콜레스테롤 수송의 개시;
    내독소의 제거;
    패혈성 쇼크의 예방;
    협심증의 치료;
    심근경색의 치료;
    불안정 협심증의 치료;
    동맥 협착증, 말초 동맥 질병(PAD), 경동맥 협착증, 뇌동맥 협착증 또는 관상동맥 협착증의 치료;
    혈관성 치매의 치료; 또는
    일과성 흑암시의 치료를 위한,
    약제로서 사용하기 위한 지질 입자.
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