KR20130047749A - 테트라넥틴-아포지단백질 a-i 지질 입자의 제조 방법, 지질 입자 및 이의 용도 - Google Patents

테트라넥틴-아포지단백질 a-i 지질 입자의 제조 방법, 지질 입자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (i) 변성 아포지단백질을 포함하는 제 1 용액을 제공하는 단계; (ii) 제 1 용액을 2개 이상의 지질 및 세제를 포함하지만 아포지단백질은 포함하지 않는 제 2 용액에 첨가하는 단계; 및 (iii) 세제를 상기 단계 (ii)에서 수득된 용액으로부터 제거함으로써 지질 입자를 제조하는 단계를 포함하는, 지질 입자의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

테트라넥틴-아포지단백질 A-I 지질 입자의 제조 방법, 지질 입자 및 이의 용도{METHOD FOR PRODUCING A TETRANECTIN-APOLIPOPROTEIN A-I LIPID PARTICLE, THE LIPID PARTICLE ITSELF AND ITS USE}
본 발명은 지단백질(lipoprotein) 및 지질 입자의 분야에 관한 것이다. 본원에는 아포지단백질(apolipoprotein), 포스파티딜콜린 및 지질을 포함하는 지질 입자의 제조 방법, 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I이 기재되어 있다.
혈장 지단백질은 혈액에서 지질 수송 및 대사를 수행하는 가용성 단백질-지질 복합체이다. 지단백질의 여러 주요 부류가 그의 밀도, 크기, 화학 조성 및 기능을 기준으로 분류된다. 이들 중에서, 달리 고밀도-지질 입자로도 언급되는 고밀도-지단백질(high-density-lipoprotein, HDL) 입자는 180 내지 360 kDa의 그의 평균 분자량에서 다양한 여러 하위부류(subclass)로 이루어진다. 이들의 평균 지질 및 단백질 함량은 각각 50 중량%이다. 포스파티딜콜린(PC)은 총 지질의 38%를 차지하고, 다음으로 콜레스테릴 에스터, 및 유리 콜레스테롤을 포함하여 소량의 다른 극성 및 비-극성 지질이 차지한다. 주 단백질 성분은 인간 HDL에서 총 단백질 중량의 약 60%를 나타내는 아포지단백질 A-I(Apo A-I)이다.
인체중, 특히 혈액과 같은 순환하는 체액중 콜레스테롤은 분리된 분자로서 존재하지 않고 특정 단백질과의 복합체(지단백질)의 형태로 존재한다. 콜레스테롤의 주 분획은 저밀도 지단백질(LDL) 또는 고밀도 지단백질(HDL)과 복합체화된다. LDL 입자는 주 단백성 화합물로서 아포지단백질 B를 포함하는 반면, HDL 입자는 주 단백성 화합물로서 아포지단백질 A-I을 포함한다.
HDL 입자에 의해 결합되는 콜레스테롤은 효소 레시틴-콜레스테롤-아실-트랜스퍼라제(LCAT)에 의해 에스터화된다. 콜레스테롤 에스터는 증가된 소수성을 가지며, HDL 입자의 코어 쪽으로 확산된다. HDL-콜레스테롤-에스터 입자는 간으로 전달되어 순환으로부터 제거될 수 있다.
HDL 입자 및 그의 주요 폴리펩티드 아포지단백질 A-I은 역 콜레스테롤 수송(reverse cholesterol transport, RCT)에 관여한다. 이때 아포지단백질 A-I은 세포로부터, 예를 들면, 혈관 벽의 세포로부터 콜레스테롤의 유출, 지질의 결합 및 레시틴-콜레스테롤-아세틸-트랜스퍼라제의 활성화를 증가시킴으로써 간에 의한 혈장 흐름을 통한 콜레스테롤의 제거를 증가시킨다. 이것은 세포막 단백질 ATP-결합-카세트-수송체-A-I(ATP-binding-cassette-transporter-A-I, ABCA-I)을 수반하는 능동 수송 과정이다.
아포지단백질 A-I 및 아포지단백질-기본 치료제, 예를 들면, 재구성 HDL 입자는 지난 세기의 70년대 후반 및 80년대 초반에 이미 확인되었다. 지질 입자를 함유하는 아포지단백질 A-I-밀라노(Milano)의 경우, 임상적 증거(죽상동맥경화증 환자에서 의미있는 플라크 감소를 의미)를 볼 수 있었다. 야생형 아포지단백질 A-I의 이량체 형태인 아포지단백질 A-I-밀라노는 아포지단백질 A-I 분자의 천연 돌연변이체를 따라 고안되었다. 이량체 형성은, 다이설파이드 결합의 형성을 가능하게 하는 시스테인에 의한 아미노산 잔기 173(아르기닌)의 교체에 의해 가능하게 된다.
국제특허공개 제 WO 2009/131704 호에는, 콜레스테롤과, 무기 물질을 포함하는 코어를 포함하는 다른 분자를 격리시키기에 적합한 나노구조물이 보고되어 있다. 혼합물을 수득하는 대략 한시간 이내에 중간 혼합물로부터 세제의 소모를 포함하는, 나노규모의 결합된 이중층의 제조 방법이 국제특허공개 제 WO 2009/097587 호에 보고되어 있다. 국제특허공개 제 WO 2006/125304 호에는 관상 동맥 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물이 보고되어 있다. 지질 대사 및 심혈관 질환에 관련되는 아포지단백질을 암호화하는 조성물이 미국특허공개 제 US 2002/10142953 호에 보고되어 있다. 국제특허공개 제 WO 2005/084642 호에는 아포단백질-코킬레이트(cochelate) 조성물이 보고되어 있다. 국제특허공개 제 WO 2007/137400 호에는 판막협착증의 치료를 위한 방법 및 화합물이 보고되어 있다. 급성 관상동맥 증후군의 치료 및 예방을 위한 약학 제형, 방법 및 투약 요법이 국제특허공개 제 WO 2005/041866 호에 보고되어 있다.
미국특허 제 US 6,287,590 호에는 공-동결건조에 의한 펩티드/지질 복합체의 형성이 보고되어 있다. 아포지단백질 A-I 작용제, 및 이상지혈증 질환을 치료하기 위한 이의 용도가 미국특허 제 US 6,037,323 호에 보고되어 있다.
국제특허공개 제 WO 2009/097587 호에는 나노규모의 결합된 이중층, 사용 방법 및 제조 방법이 보고되어 있다. 개선된 내약성(tolerability)을 갖는 면역원성 조성물중 소수성 단백질의 제형이 국제특허공개 제 WO 2005/065708 호에 보고되어 있다. 국제특허공개 제 WO 2006/069371 호에는 죽상동맥경화증을 예방, 억제 및/또는 역전시키기 위한 혈장 지질화 방법이 보고되어 있다. 막 단백질을 포함하는 프로테오리포좀의 형성이 프랑스특허 제 FR 2 915 490 호에 보고되어 있다.
본원에는 단백질을 포함하는 지질 입자의 제조 방법이 보고되어 있다. 지질 입자는 하나 이상의 지질 및 세제를 포함하는 용액으로의 신속 희석에 의해 변성 단백질을 포함하는 용액으로부터 형성될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 단계에서, 세제의 농도는 CMC 미만으로 감소된다. 이러한 방법에 의해, 상기 성숙 단계는 생략될 수 있고, 이에 따라, 본원에 보고된 방법을 사용하여 지질 입자의 보다 빠른 생산이 가능하다.
한 태양에서, 희석은 약 1:3(v:v) 내지 약 1:20(v:v)이다.
한 태양에서, 희석은 약 1:5(v:v) 내지 약 1:10(v:v)이다.
한 태양에서, 희석은 약 1:5(v:v)이다.
한 태양에서, 세제는 적어도 약 3의 인자로 희석된다. 한 태양에서, 세제는 적어도 약 5의 인자로 희석된다.
본원에 보고된 한 태양은 하기 단계를 포함하는 지질 입자의 제조 방법이다:
(i) 변성 단백질을 포함하는 제 1 용액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 제 1 용액을 하나 이상의 지질 및 세제를 포함하지만 단백질을 포함하지 않는 제 2 용액에 첨가하는 단계; 및
(iii) 세제를 상기 단계 (ii)에서 수득된 용액으로부터 제거함으로써 지질 입자를 제조하는 단계.
한 태양에서, 제 1 용액은 지질을 포함하지 않는다.
한 태양에서, 단백질은 재조합적으로 생성된 단백질이다.
한 태양에서, 단백질은 아포지단백질이다. 또 다른 태양에서, 아포지단백질은 정제된 아포지단백질이다.
한 태양에서, 아포지단백질은 서열번호 1, 2, 4 내지 52, 66 및 67의 아미노산 서열들로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1, 2, 4 내지 52, 66 및 67의 아미노산 서열들의 80% 이상을 포함하는 하나 이상의 연속 단편을 포함한다.
한 태양에서, 아포지단백질은 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1, 2, 4 내지 52, 66 또는 67의 아미노산 서열들의 80% 이상으로 된 하나 이상의 연속 단편이다.
한 태양에서, 아포지단백질은 아포지단백질 A-I이다. 한 태양에서, 아포지단백질 A-I은 인간 아포지단백질 A-I이다. 다른 태양에서, 아포지단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 66 또는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질(tetranectin-apolipoportein) A-I이다.
한 태양에서, 아포지단백질은 R151C 및 R197C로부터 선택된 돌연변이를 갖는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는다.
한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 2 배 이상의 부피인 부피를 갖는다.
한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 약 3 내지 약 20 배의 부피를 갖는다. 한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 약 5 내지 약 10 배의 부피를 갖는다.
한 태양에서, 하나 이상의 지질은 인지질, 지방산 및 스테로이드 지질로부터 선택된다.
한 태양에서, 하나 이상의 지질은 선택적으로 인지질, 지방산 및 스테로이드 지질로부터 서로 독립적으로 선택된 2개 이상의 지질이다. 또 다른 태양에서, 하나 이상의 지질은 1 내지 4개의 지질로부터 선택된다, 즉, 1개 지질, 2개 지질, 3개 지질 및 4개 지질을 포함하는 군으로부터 선택된다.
한 태양에서, 제 2 용액은 인지질, 지질 및 세제를 포함한다.
한 태양에서, 제 2 용액은 인지질, 지질, 세제 및 완충제염으로 이루어진다.
한 태양에서, 지질은 2개의 상이한 인지질이다. 또 다른 태양에서, 지질은 2개의 상이한 포스파티딜콜린이다. 또 다른 태양에서, 제 1 포스파티딜콜린 및 제 2 포스파티딜콜린은 1 또는 2개의 지방산 잔기, 또는 포스파티딜콜린의 글리세롤 주쇄에 에스터화된 지방산 잔기 유도체가 상이하다. 한 태양에서, 제 1 포스파티딜콜린은 POPC이고, 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다.
한 태양에서, 세제는 당-계(sugar-based) 세제, 폴리옥시알킬렌-계 세제, 담즙산염-계 세제, 합성 세제 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 태양에서, 세제는 콜산, 쯔비터젠트 및 이들의 염으로부터 선택된다.
본원에 기재된 바와 같은 방법들의 한 태양에서, 제 1 용액은 지질 입자를 실질적으로 포함하지 않는다.
한 태양에서, 상기 방법은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에, 단계 (ii)에서 수득된 용액을 배양하는 단계 (iia)를 포함한다. 한 태양에서, 배양 및/또는 제거는 4 내지 45 ℃의 온도에서 수행된다.
한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 60 시간동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 20 시간동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 2 내지 약 60 시간동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 12 내지 약 20 시간동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 16 시간동안 배양된다.
한 태양에서, 세제는 고 CMC를 갖는 세제이다. 또 다른 태양에서, 세제는 5 mM 이상의 CMC를 갖는 세제이다. 또 다른 태양에서, 세제는 10 mM 이상의 CMC를 갖는 세제이다.
한 태양에서, 세제의 농도는 제 2 용액 중에서 적어도 0.5 x CMC이다.
한 태양에서, 제거는 정용여과(diafiltration) 또는 투석 또는 흡착에 의해 이루어진다. 한 태양에서, 흡착은 친화성 또는 소수성 크로마토그래피로부터 선택된다. 한 태양에서, 제거는 투석에 의해 이루어진다.
한 태양에서, 제 1 용액은 제 1 부피를 가지고, 제 2 용액은 제 2 부피를 가지며, 제 1 용액중 단백질은 한정된 농도를 갖고, 제 2 용액중 지질 및 세제는 각각 한정된 농도를 갖는데, 이때 단계 (ii)에서 아포지단백질, 지질 및 세제의 농도는 지질 입자의 생성을 허용하도록 변화/감소된다.
한 태양에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(iv) 지질 입자를 정제함으로써 지질 입자를 제조하는 단계.
본원에 기재된 바와 같은 한 태양은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 지질 입자이다.
본원에 기재된 바와 같은 한 태양은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 아포지단백질을 포함하는 지질 입자를 포함하는 약학 조성물, 및 죽상동맥경화증의 치료를 위한 약제를 제조하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 지질 입자의 용도이다.
도 1은 그 지질 조성이 상이한 5개의 지질 입자를 사용하여 수행된 생체내 토끼 연구의 결과이다. 상단: 모든 제조된 회분에서 콜레스테롤 유동화(mobilization), 및 따라서, 효능을 볼 수 있다. 하단: 단일 인지질로서 DPPC의 사용에 의해 생성된 지질 입자에 대해 간 효소의 증가가 주목되었다.
도 2는 본 발명에 따른 POPC 및 아포지단백질의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석 결과이다; 1:20 내지 1:160의 몰 비.
도 3은 LCAT 활성에 대한 DPPC 및 POPC의 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 POPC 및/또는 DPPC를 함유하는 지질 입자내 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도를 나타낸 것이다.
도 5는 RXR-LXR 작용물질로 프라이밍되지 않은 세포에서 THP-1 유도된 포말 세포에 대한 콜레스테롤 유출을 나타낸 것이다.
도 6은 RXR-LXR 작용물질을 사용한 ABCA-1 경로 활성화후 THP-1 유도된 포말 세포에 대한 콜레스테롤 유출을 나타낸 것이다.
도 7은 상이한 아포지단백질 조성물의 시간 의존성 혈장 농도를 나타낸 것이다.
도 8은 혈장내 콜레스테롤 유동화 및 에스터화의 시간 및 농도 경과를 나타낸 것이다.
도 9는 100 mg/kg의 단일 정맥내 주사후 마우스에서 본 발명에 따른 아포지단백질을 포함하는 상이한 조성물에 의한 간 효소 방출을 비교한 것이다.
도 10은 생체내 토끼 연구 - 혈장내 자발적 용혈을 나타낸 것이다.
도 11은 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.5를 사용한 지질 입자의 분석용 SEC의 결과이다.
도 12는 pH 7.5에서 50 mM K2HPO4, 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 트레할로스를 사용한 지질 입자의 분석용 SEC의 결과이다.
도 13은 1:20 내지 1:320 몰 비의 POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 네이티브(native) PAGE 결과이다[레인 1: 네이티브 마커; 레인 2: 몰 비 1:320; 레인 3: 몰 비 1:160; 레인 4: 몰 비 1:80; 레인 5: 몰 비 1:80(f/t); 레인 6: 몰 비 1:40; 레인 7: 몰 비 1:20; 레인 8: 아포지단백질(육량체 생성)].
도 14는 1:20 내지 1:160의 몰 비의 POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석 결과이다.
도 15는 POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC 크로마토그램(UV280 신호)의 중첩을 나타낸 것이다.
도 16은 1:40의 몰 비에서 수득된 POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 분석 결과이다.
도 17은 1:20 내지 1:100의 몰 비로 수득된 DPPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 네이티브 PAGE 결과이다(1: 분자량 마커; 2: 지질을 함유하지 않는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I; 3: 1:20; 4: 1:40; 5: 1:60; 6: 1:80; 7: 1:100).
도 18은 1:60(최고 곡선) 내지 1:100(최저 곡선)의 몰 비에서 수득된 POPC:DPPC(3:1) 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 혼합물로 된 지질 입자의 SEC-MALLS 분석(UV280 신호) 결과이다.
도 19는 콜레이트, 쯔비터젠트 3-8, 3-10 및 3-12를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 네이티브 PAGE SDS 결과이다. 각 겔 상의 레인 1: 순수 아포지단백질; 각 겔 상의 레인 2: 참조물로서 0.1 x CMC 콜레이트 지질화 샘플.
도 20은 3 x CMC 쯔비터젠트 3-8 및 POPC를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석 결과이다(아포지단백질:인지질 몰 비 = 1:60).
도 21은 2 x CMC 쯔비터젠트 3-10 및 POPC를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석 결과이다(아포지단백질:인지질의 몰 비 = 1:60).
도 22는 POPC를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석 결과이다. 상단: 천연 테트라넥틴-아포지단백질 A-I로부터 생성된 지질 입자; 하단: 변성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I로부터 생성된 지질 입자.
도 23은 DMPC(1:100)(다이미리스토일 포스파타딜콜린)로 지질화된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(a) 및 PBS 중의 지질화되지 않은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(b)을 사용하여 수행된 생체내 토끼 연구의 결과이다.
도 24는 5 ℃ 및 40 ℃에서 저장된 야생형 아포지단백질 A-I(A) 및 본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(B)을 함유하는 지질 입자의 SE-HPLC 크로마토그램이다.
정의
용어 "아포지단백질(apolipoprotein)"은 지질 또는 지단백질 입자 각각으로 이루어진 단백질을 의미한다.
용어 "아포지단백질 A-I"은 단백질-지질 및 단백질-단백질 상호작용 성질을 갖는 양친매성(amphiphilic)의 나선형 폴리펩티드를 의미한다. 아포지단백질 A-I은, 243개 아미노산 잔기를 갖는 성숙 폴리펩티드로 분리되는 프로-아포지단백질로서 분비되는 267개 아미노산 잔기의 프리프로(prepro)-아포지단백질로서 간 및 소장에 의해 합성된다. 아포지단백질 A-I은 종종 프롤린인 링커 잔기에 의해 분리된 22개 아미노산 잔기로 각각 이루어진 6 내지 8개의 상이한 아미노산 반복서열로 이루어지며, 일부 경우에서는 여러 잔기들로 구성된 스트레치(stretch)로 이루어진다. 예시적인 인간 아포지단백질 A-I 아미노산 서열은 젠펩트(GenPept) 데이터베이스 엔트리 NM-000039 또는 데이터베이스 엔트리 X00566; 젠뱅크(GenBank) NP-000030.1(gi 4557321)에 보고되어 있다. 인간 아포지단백질 A-I(서열번호 6) 중에서, 천연 변이체, 예를 들면, P27H, P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D, D127N, K131의 결실, K131M, W132R, E133K, R151C(아미노산 잔기 151이 Arg에서 Cys로 변화됨, 아포지단백질 A-I-파리), E160K, E163G, P167R, L168R, E171V, P189R, R197C(아미노산 잔기 173이 Arg에서 Cys로 변화됨, 아포지단백질 A-I-밀라노) 및 E222K가 존재한다. 보존적 아미노산 변형을 갖는 변이체도 또한 포함된다.
한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 면역글로불린 A 프로테아제(IgA 프로테아제)의 절단 부위의 단편을 포함한다. IgA 프로테아제로부터 알려져 있는 인식 부위는 절단된 결합의 위치를 나타내는 "↓"를 갖는 하기의 서열을 포함한다:
Pro-Ala-Pro↓Ser-Pro (서열번호 61)
Pro-Pro↓Ser-Pro (서열번호 62)
Pro-Pro↓Ala-Pro (서열번호 63)
Pro-Pro↓Thr-Pro (서열번호 64)
Pro-Pro↓Gly-Pro (서열번호 65)
상기에서, 처음 3개가 보다 흔히 선택되고 절단된다.
용어 "아포지단백질 모방체"는 각각의 아포지단백질의 기능을 모방하는 합성 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, "아포지단백질 A-I 모방체"는 콜레스테롤의 제거, 즉 역 콜레스테롤 유출과 관련하여 천연 아포지단백질 A-I과 필적하는 생물학적 기능을 나타내는 합성 폴리펩티드이다. 한 태양에서, 아포지단백질 A-I 모방체는 소수성-친수성 계면에 군집된 양으로 하전된 아미노산 잔기 및 친수성 면 중앙에 군집된 음으로 하전된 아미노산 잔기를 갖는 하나 이상의 양친매성 알파-나선을 포함한다. 아포지단백질 A-I의 기능을 모방하기 위해, 아포지단백질 모방체는 15 내지 29개 아미노산 잔기, 한 태양에서는 22개 아미노산 잔기의 반복 폴리펩티드를 포함한다(PVLDEFREKLNEELEALKQKLK(서열번호 4); PVLDLFRELLNELLEALKQKLK (서열번호 5)).
용어 "하나 이상"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 의미한다. 용어 "2개 이상"은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 의미한다.
용어 "심혈관 질환"은 일반적으로 심장 또는 혈관과 관련된 질환 또는 질병, 예를 들면, 죽상동맥경화증, 관상동맥 심장 질환, 뇌혈관 질환, 대동맥장골동맥 질환, 허혈성 심장 질한 또는 말초 혈관 질환을 의미한다. 상기 질환은 대부분 대상의 사망을 야기하는 심근경색, 뇌졸중, 협심증, 일과성 허혈 발작, 울혈성 심부전, 대동맥류와 같은 질환의 결과로서의 이상 반응(adverse event)이 있기 전에는 발견될 수 없다.
용어 "콜레이트(cholate)"는 3α, 7α, 12α-트라이하이드록시-5β-콜란-24-오익산 또는 그의 염, 특히 나트륨염을 의미한다. 지질 입자의 생성은 아포지단백질을 세제 가용화된 지질과 함께 이들 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 수행될 수 있다.
용어 "임계 미셀 농도(critical micelle concentration)" 및 그의 약칭 "CMC"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 그 이상에서 개별적인 세제 분자(단량체)가 자발적으로 미셀(미셀, 원형봉, 라멜라(lamellar) 구조)로 응집되는 계면활성제 또는 세제의 농도를 의미한다.
용어 "보존적 아미노산 변형"은 본 발명에 따른 지질 입자 또는 아포지단백질의 특성에 영향을 미치거나 특성을 변화시키지 않는 아미노산 서열의 변형을 의미한다. 상기 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기술, 예를 들면, 부위-지향 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 변형은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 변형을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 부류들이 당해 분야에 정의되어 있다. 상기 부류로는 염기성 측쇄(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들이 포함된다. 그러므로, "변이체" 단백질은 본원에서, 10개 이하, 한 태양에서는 약 2 내지 약 5개의 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 "모" 단백질의 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 분자를 말한다. 아미노산 서열 변형은 문헌 [Riechmann, L. et al., Nature 332, 323-327 (1988); and Queen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)]에 기술된 바와 같은 분자 모델링을 기초로 한 돌연변이유발에 의해 수행될 수 있다.
용어 "세제(detergent)"는 표면 활성 화학 물질을 의미한다. "세제"는 일반적으로 비극성, 소수성 부분 및 극성, 친수성 부분을 갖는 양친매성 분자이다. 용어 "양쪽이온성(zwitterionic) 세제"는 전체 제로(zero) 전하를 갖는 동시에 하나 이상의 양으로 하전된 잔기 및 하나 이상의 음으로 하전된 잔기를 포함하는 표면 활성 화합물을 의미한다. 한 태양에서, 세제는 당-계 세제, 폴리옥시알킬렌-계 세제, 담즙산염-계 세제, 합성 세제 또는 이들의 혼합물로부터 선택된다. 용어 "당-계 세제"는 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드, n-노닐-베타-D-글루코피라노사이드, n-도데실-베타-D-말토피라노사이드 또는 5-사이클로헥실펜틸-베타-D-말토피라노사이드, 및 그의 유도체로부터 선택된 세제를 의미한다. 용어 "담즙산염-계 세제"는 나트륨 콜레이트, 칼륨 콜레이트, 리튬 콜레이트, 3-[(3-클로르아미도프로필)-다이메틸암모니오]-일-프로판 설포네이트(CHAPS), 3-[(3-클로르아미도프로필)-다이메틸암모니오]-2-하이드록실 프로판 설포네이트(CHAPSO) 및 그의 유도체로부터 선택된 세제를 의미한다. 용어 "폴리옥시알킬렌-계 세제"는 트윈(Tween) 20, 트리톤(Triton) X-100, 플루로닉(Pluronic) F68 및 그의 유도체로부터 선택된 세제를 의미한다. 용어 "합성 세제"는 쯔비터젠트 3-6, 쯔비터젠트 3-8, 쯔비터젠트 3-10, 쯔비터젠트 3-12 및 그의 유도체로부터 선택된 세제를 의미한다.
용어 "고밀도 지단백질 입자" 또는 그의 약칭 "HDL 입자"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 주요 단백성 화합물로서 아포지단백질 A-I을 포함하는 지질-단백질-복합체를 의미한다.
용어 "면역분석"은 고체상(포획 항체) 위에 흡착/고정화된 항체, 항원, 및 효소와 접합된 항원의 또 다른 에피토프에 대한 항체(추적 항체) 사이에 복합체의 형성을 포함하는, 단클론성 항체를 사용한 표준 고체-상 면역분석을 의미한다. 따라서, 샌드위치가 형성된다: 고체 상-포획 항체-항원-추적 항체. 상기 샌드위치에 의해 촉진된 반응에서, 항체-접합 효소의 활성은 배양 배지중 항원 농도에 비례한다. 표준 샌드위치 방법은 또한 포획 및 추적 항체가 항원의 상이한 에피토프에 결합하기 때문에 이중 항원 가교 면역분석으로도 불린다. 다른 유형의 분석법은 방사성면역분석, 형광 면역분석 및 효소-결합 면역분석이다. 상기 분석을 수행하기 위한 방법, 및 실제적 적용 및 절차는 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지되어 있다. 면역분석은 균질 또는 불균질 면역분석으로 수행될 수 있다.
용어 "지질 유출을 증가시키다" 및 그의 문법적 동의어는 세포 또는 플라크로부터 증가된 수준 및/또는 비율의 지질 유출, 지질 유출의 증진, 지질 유출의 향상, 지질 유출의 촉진, 지질 유출의 상향조절, 지질 유출의 개선 및/또는 지질 유출의 증대를 의미한다. 한 태양에서, 지질 유출은 인지질, 트라이글리세리드, 콜레스테롤 및/또는 콜레스테롤 에스터의 유출을 포함한다.
용어 "DMPC"는 인지질 다이미리스토일 포스파티딜콜린을 의미한다.
용어 "DPPC"는 1,2-다이팔미토일-포스파티딜콜린으로도 지칭되는 인지질 1,2-다이-팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린을 의미한다.
용어 "다량체(multimer)"는 2개 이상의 단량체로 이루어진 복합체를 의미한다. 다량체는 단량체 사이의 비-공유적 상호작용에 의해 생성된다. 각각의 단량체는 다량체화 영역을 포함한다. 한 태양에서, 다량체는 2 또는 3개의 단량체를 포함한다. 또 다른 태양에서, 다량체화 영역은 각 단량체에 포함된 개개 다량체화 영역 사이의 비-공유적 상호작용을 통해 상호작용한다. 용어 "다량체화 영역"은 2개 이상의 단량체성 분자를 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시킬 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 다량체화 영역은 상이하거나, 유사하거나 동일한 아미노산 서열의 다량체화 영역들과 상호작용할 수 있다. 한 태양에서, 다량체화 영역은 서열번호 53의 공통 아미노산 서열과 68% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴 삼량체화(trimerising) 구조 요소 또는 그의 유도체이다. 한 태양에서, 서열번호 53의 위치 50에서의 시스테인 잔기는 상이한 아미노산 잔기, 또 다른 태양에서는 세린 잔기, 또는 트레오닌 잔기, 또는 메티오닌 잔기로 치환된다. 다량체화 영역을 포함하는 폴리펩티드는 또한 다량체화 영역을 포함하는 하나 이상의 다른 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 다량체 형성은 단순히 폴리펩티드를 적합한 조건하에서 혼합함으로써 개시될 수 있다. 또 다른 태양에서, 다량체화 영역은 1 내지 10개의 잔기가 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단으로부터 결실되거나 상기 말단에 부가된 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 태양에서, 다량체화 영역은 6개 또는 9개의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 N-말단으로부터 결실된 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 태양에서, 다량체화 영역은 N-말단 아미노산 잔기 L 또는 N-말단 아미노산 잔기 C 및 L이 결실된 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는다. 한 태양에서, 다량체화 영역은 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소이며, 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는다. 다량체는 한 태양에서 호모머(homomer)이다.
다량체화 영역을 포함하는 상이한 아포지단백질이 결합되어 다량체 내에 혼입될 수 있기 때문에, 다량체는 호모머 또는 헤테로머(heteromer)일 수 있다. 한 태양에서, 다량체는 삼량체성 호모머이다.
한 태양에 따르면, 단량체화 영역은 테트라넥틴으로부터 수득된다. 한 태양에서, 다량체화 영역은 서열번호 54의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소를 포함한다. 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소의 삼량체화 효과는 삼량체를 형성하기 위한 다른 2개의 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소들의 감긴 코일(coiled coil) 구조와 상호작용하는 감긴 코일 구조에 의해 야기된다. 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 인간 테트라넥틴으로부터, 토끼 테트라넥틴으로부터, 뮤린 테트라넥틴으로부터, 또는 상어 연골의 C-형 렉틴으로부터 수득될 수 있다. 한 태양에서, 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 서열번호 53의 공통 서열과 68% 이상, 또는 75% 이상, 또는 81% 이상, 또는 87% 이상, 또는 92% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
용어 "비-공유적 상호작용"은 이온성 상호작용력(예를 들면, 염 가교), 비-이온성 상호작용력(예를 들면, 수소-결합), 또는 소수성 상호작용력(예를 들면, 반-데르-발스(van-der-Waals) 힘 또는 π-스태킹(stacking) 상호작용)과 같은 비-공유적 결합력을 의미한다.
용어 "상 전이 온도"는 탄화수소 쇄가 완전히 뻗고 밀접하게 패킹되어 있는 규칙적 겔 상으로부터, 탄화수소 쇄가 불규칙하게 배향되고 유체인 무질서한 액정 상으로의 액체 물리적 상태의 변화를 유도하는데 필요한 온도를 의미한다. 지질 입자의 생성은 사용된 인지질/인지질 혼합물의 상 전이 온도 이상에서 수행될 수 있다. 일부 포스파티딜콜린 및 그의 혼합물의 상 전이 온도가 하기 표 1에 열거되어 있다.
[표 1]
순수한 포스파티딜콜린 및 포스파티딜콜린 혼합물들의 전이 온도
Figure pct00001
용어 "포스파티딜콜린"은 1개의 글리세롤 잔기, 2개의 카복실산 잔기 및 1개의 포스포콜린 잔기로 이루어진 분자를 의미하며, 이때 글리세롤 잔기는 에스터 결합에 의해, 즉, 2개의 카복실산 에스터 결합 및 1개의 인산 에스터 결합에 의해 각각 다른 잔기에 공유 결합되며, 이때 인산 에스터 결합은 글리세롤 잔기의 1-하이드록실기 또는 3-하이드록실기에 대한 것이다. 용어 "카복실산 잔기"는 하나 이상의 아실기(R-C(O)O)를 포함하는 유기 잔기를 의미한다. 포스파티딜콜린은 임의의 종류 또는 공급원을 가질 수 있다. 한 태양에서, 포스파티딜콜린은 계란 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 다이팔미토일 포스파티딜콜린, 다이미리스토일 포스파티딜콜린, 다이스테아로일 포스파티딜콜린, 다이라우릴 포스파티딜콜린, 다이팔미토일 포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 다이올레오일 포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린, 1-올레오일-2-팔미토일 포스파티딜콜린, 및 그의 유사체 및 유도체로부터 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같은 모든 인지질은 임의의 공급원, 즉 (적절한 경우에) 대두, 우유, 계란 또는 심지어 인간을 제외한 동물의 내부 장기로부터 유도될 수 있으며, 이들은 천연 기원으로부터 유도되거나, 반-합성 또는 심지어 완전 합성될 수 있다.
"폴리펩티드"는 천연으로 생성되었든지 합성으로 생성되었든지 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산으로 이루어진 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩티드로 이루어지거나 100개 이상의 아미노산 잔기로 된 하나의 폴리펩티드를 포함하는 분자는 "단백질"로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 비-아미노산 성분, 예를 들면, 탄수화물기, 금속 이온 또는 카복실산 에스터를 포함할 수 있다. 상기 비-아미노산 성분은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의해 부가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드는 본원에서 그의 아미노산 주쇄 구조 또는 이를 암호화하는 핵산의 관점에서 정의된다. 탄수화물기와 같은 부가는 일반적으로 명시되지는 않지만, 존재할 수도 있다.
용어 "POPC"는 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린으로도 지칭되는 인지질 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린을 의미한다.
용어 "신속한"은 기껏해야 10 시간 이내에 완료되는 공정을 의미한다. 신속 희석은 제 1 용액이 10 시간 이내에 제 2 용액에 첨가되는 공정이다. 한 태양에서, 상기 공정은 기껏해야 5 시간내에, 다른 태양에서 기껏해야 2 시간내에 완료된다.
용어 "실질적으로 함유하지 않는"은 단백질 및 하나 이상의 지질을 포함하는 용액이 5%(w/w) 미만의 지질 입자, 2.5% 미만의 지질 입자, 1% 미만의 지질 입자, 또는 0.5% 미만의 지질 입자를 함유하는 것을 의미한다.
용어 "변이체"는 본원에 기재된 바와 같은 아포지단백질 또는 아포지단백질 모방체의 변이체를 또한 포함하며, 이때 상기 변이체에서 각각의 아포지단백질 또는 아포지단백질 모방체의 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 변형은 아포지단백질 수용체 또는 아포지단백질 전환 효소에 대한 아포지단백질의 친화도를 증가 또는 감소시킬 수 있거나, 각각의 아포지단백질에 비해 아포지단백질 변이체의 안정성을 증가시킬 수 있거나, 수용액중 각각의 아포지단백질에 비해 아포지단백질의 변이체의 용해도를 증가시킬 수 있거나, 숙주 세포 내/숙주 세포에 의한, 각각의 아포지단백질에 비해 아포지단백질 변이체의 재조합 생성을 증가시킬 수 있다.
본원에 기재된 바
지질 입자가 세제 및 하나 이상의 지질을 함유하지만 단백질은 함유하지 않는 용액으로의 신속 희석에 의해 변성 단백질을 함유하지만 세제 및 지질은 함유하지 않는 용액으로부터 직접적으로 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로 요구되는 성숙 단계가 생략될 수 있고, 이에 따라 지질 입자의 제조를 위한 더욱 단순하고 견고한 방법이 제공된다. 또한, 더욱 균질한 지질 입자가 형성된다.
지질 입자의 제조 방법
본원에는 하기 단계를 포함하는, 단백질을 포함하는 지질 입자의 제조 방법이 보고되어 있다:
(i) 변성 단백질을 포함하는 제 1 용액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 제 1 용액을 지질 및 세제를 포함하지만 단백질은 포함하지 않는, 즉, 단백질을 함유되지 않은 제 2 용액에 첨가하는 단계; 및
(iii) 세제를 상기 단계 (ii)에서 수득된 용액으로부터 제거함으로써 지질 입자를 제조하는 단계.
한 태양에서, 아포지단백질을 포함하는 지질 입자의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 변성 아포지단백질을 포함하는 제 1 용액을 제공하는 단계;
(ii) 상기 제 1 용액을 지질 및 세제를 포함하지만 아포지단백질은 포함하지 않는 제 2 용액에 첨가하는 단계; 및
(iii) 세제를 상기 단계 (ii)에서 수득된 용액으로부터 제거함으로써 지질 입자를 제조하는 단계.
한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 2 배 이상의 부피인 부피를 갖는다.
한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 약 3 내지 약 20 배의 부피를 갖는다. 한 태양에서, 제 2 용액은 제 1 용액의 약 5 내지 약 10 배의 부피를 갖는다.
한 태양에서, 제 2 용액은 인지질, 지방산 및 스테로이드 지질로부터 서로 독립적으로 선택된 2개 이상의 상이한 지질을 포함한다. 또 다른 태양에서, 2개 이상의 상이한 지질은 2개의 상이한 포스파티딜콜린이다. 한 태양에서, 제 1 포스파티딜콜린은 POPC이고, 제 2 포스파티딜콜린은 DPPC이다.
한 태양에서, 세제는 콜산, 쯔비터젠트 및 이들의 염으로부터 선택된다.
예를 들면, 인간 HDL 입자로부터 유도된 아포지단백질 A-I 또는 탈지질화 아포지단백질 A-I과 같은 천연 또는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드로부터 지질 입자를 생성하는 많은 상이한 방법들이 보고되었다. 이때, 예를 들면, 팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린과 같은 인지질과 나트륨 콜레이트와 같은 세제와의 수성 혼합물을 정제된 아포지단백질 A-I과 함께 배양하며, 이때 아포지단백질 A-I은 네이티브, 즉 비-변성 형태로 사용된다. 세제는 지질 입자의 생성 후에 투석 또는 정용여과에 의해 제거된다.
본원에 기재된 바와 같은 방법은 완전히 변성된 단백질을 단일 단계에서 리폴딩(refolding)시키고 지질화시킨다. 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용함으로써, 개선된 생성물 품질을 갖는 지질 입자가 수득될 수 있고, 단백질의 시간 소모적 전처리(preconditioning)가 생략될 수 있고, 생물약제 생성을 위한 대규모 공정이 처음으로 가능하다.
본원에 기재된 바와 같은 방법은 완전히 변성된 아포지단백질 A-I을 단일 단계에서 리폴딩시키고 지질화시킨다. 본원에 기재된 바와 같은 방법을 사용함으로써, 개선된 생성물 품질을 갖는 지질 입자가 수득될 수 있고, 아포지단백질 A-I의 시간 소모적 전처리가 생략될 수 있고, 생물약제 생성을 위한 대규모 공정이 처음으로 가능하다.
지질 입자 제조 공정 개발에 고려되어야 하는 요점은 (i) 생물 활성을 위한 필요조건, 및 (ii) 지질 입자의 제조성(manufacturability)에 대한 기술적 필요조건이다. 예를 들면, 아포지단백질을 포함하는 지질 입자의 제조를 위해 상기 필요조건들은 반대 방향으로 시사한다.
기술적인 견지에서, 16개 이하의 탄소원자 쇄를 갖는 카복실산 잔기를 함유하는 포화 인지질이 선택된다(예를 들면, 다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DPPC; 다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DMPC 등). 그와 반대로, 생물학적 데이터로부터, 16개 이상의 탄소원자의 쇄를 갖는 카복실산 잔기를 함유하는 불포화 인지질(예를 들면, 팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, POPC; 스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, SOPC)은 보다 효과적이며 비-간독성임을 추정할 수 있다.
지질들의 혼합물의 선택은 아포지단백질을 포함하는 지질 입자의 효능 및 간 안전성을 결정한다. 토끼를 이용한 DMPC 함유 지질 입자의 생체내 연구에서, 30 mg/kg으로 처리된 토끼는 심각한 부작용을 나타내었지만 생존한 반면, 100 mg/kg으로 처리된 토끼는 사망한 것으로 밝혀졌다. 결과는 지질화가 콜레스테롤 유동화에 필요하며 결과적으로 분자의 효능에 필요함을 명백히 시사하였다(도 23).
시험관내 기능 시험에서 DPPC 또는 POPC와 같은 단일 포스파티딜콜린을 함유하는 지질 입자가 LCAT를 활성화시킴이 확인되었다.
또한, 상이한 인지질의 조합의 경우 콜레스테롤 유출이 더 높은 것으로 나타났다.
[표 2]
생체내 토끼 연구를 위해 제조된, 지질 조성이 상이한 인지질 혼합물
Figure pct00002
상기 결과는 또한 모든 혼합물에 대해 콜레스테롤 유동화를 입증하는 생체내 데이터에 의해 확인되었다. 그러나, 단일 포스파티딜콜린 DPPC만을 함유하거나 DPPC와 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SM)의 혼합물을 함유하는 지질 입자의 경우, 간 효소에서 증가가 측정될 수 있다(도 1).
따라서, 또한 한 태양은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 지질 입자이다.
기술적 견지에서, 순수한 DPPC를 사용한 지질 입자의 제조는 순수한 POPC를 사용한 제조에 비해 더 편리하다. 침전물 생성의 위험이 상이한 인지질의 혼합물을 사용함으로써 감소된다. 또한, 순수한 DPPC에 대한 41 ℃의 상 전이 온도는 4 ℃의 상 전이 온도를 갖는 순수한 POPC에 비해 지질 입자를 제조하는 것을 더 용이하게 만든다. 또한, 수득된 생성물이 보다 균질하다. 이것은 단백질-지질 조성의 측정을 또한 가능하게 하는 분석 도구인 SEC-MALLS에 의한 지질 입자 분석에 의해 확인될 수 있다(단백질-접합체 분석). 도 2에는 크기 배제 크로마토그래피(UV280 검출)에서 분해된 샘플의 크로마토그램이 도시되어 있다. 샘플의 불균질성(inhomogeniety)은 다중의 분리 또는 반-분리 피크의 발생으로 알 수 있다.
지질 입자를 생성하기 위해 순수한 POPC를 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 POPC 분자의 수는, 한 태양에서, 40 내지 85, 한 태양에서 50 내지 80, 한 태양에서 54 내지 75이다.
지질 입자를 생성하기 위해 순수한 DPPC를 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 DPPC 분자의 수는, 한 태양에서, 50 내지 150, 한 태양에서 65 내지 135, 한 태양에서 76 내지 123, 한 태양에서 86 내지 102이다.
지질 입자를 생성하기 위해 1:3 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 인지질 분자의 수는, 한 태양에서, 약 50 내지 약 120, 한 태양에서 약 65 내지 약 105, 한 태양에서 약 72 내지 약 96이다.
지질 입자를 생성하기 위해 1:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 50 내지 120, 한 태양에서 60 내지 100, 한 태양에서 71 내지 92, 한 태양에서 71 내지 85이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 50 내지 105이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 60 내지 95이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 60 내지 90이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 60 내지 88이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 62 내지 80이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 66 내지 86이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 64 내지 70이다.
지질 입자를 생성하기 위해 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물을 사용하는 경우 지질 입자중 아포지단백질 단량체 당 지질 분자의 수는, 한 태양에서, 약 66이다.
아포지단백질 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 한 태양에서 1:40 내지 1:100의 아포지단백질 대 POPC 몰 비를 사용하고, 한 태양에서는 1:40 내지 1:80의 몰 비를 사용하며, 한 태양에서는 약 1:60의 몰 비를 사용한다.
아포지단백질 및 DPPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 한 태양에서 1:70 내지 1:100의 아포지단백질 대 DPPC 몰 비를 사용하고, 한 태양에서는 1:80 내지 1:90의 몰 비를 사용하며, 한 태양에서는 약 1:80의 몰 비를 사용한다.
아포지단백질, POPC 및 DPPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 한 태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(1:3 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비를 사용하고, 한 태양에서는 1:70 내지 1:90의 몰 비를 사용하며, 한 태양에서는 약 1:80의 몰 비를 사용한다.
아포지단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 한 태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(1:1 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비를 사용하고, 한 태양에서는 1:60 내지 1:80의 몰 비를 사용하며, 한 태양에서는 약 1:70의 몰 비를 사용한다.
아포지단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 한 태양에서 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(3:1 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비를 사용하고, 한 태양에서는 1:50 내지 1:70의 몰 비를 사용하며, 한 태양에서는 약 1:60의 몰 비를 사용한다.
한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 60 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 20 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 2 내지 약 60 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 12 내지 약 20 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 16 시간 동안 배양된다.
한 태양에서, 지질 입자의 제조를 위해 지질의 혼합물을 사용하는 경우, 혼합물은 4 내지 45 ℃, 한 태양에서는 10 내지 38 ℃, 한 태양에서는 15 내지 35 ℃의 상 전이 온도를 갖는다.
아포지단백질을 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 동결-건조, 냉동-해동, 세제 가용화 후 투석, 미세유동화, 초음파처리 및 균질화와 같은 다양한 방법들이 공지되어 있다.
지질 입자는, 한 태양에서, 지질 입자당 1 내지 10개의 아포지단백질 분자, 한 태양에서 지질 입자당 1 내지 8개의 아포지단백질 분자, 한 태양에서는 지질 입자당 1 내지 4개의 아포지단백질 분자의 평균 수를 포함한다.
한 태양에서, 지질 입자는 지질 입자당 적어도 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6, 또는 7, 또는 8, 또는 9 또는 10개의 아포지단백질 분자의 평균 수를 포함할 수 있다. 한 태양에서, 상기 평균 수는 1이다.
한 태양에서, 지질 입자는 아포지단백질 이외에 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 포함한다.
비제한적으로, 지질 입자는 효소 보조-인자, 및/또는 지질, 특히 콜레스테롤, 지질을 취하기 위한 담체로서 작용할 수 있다.
하나 이상의 세제가 본원에 기재된 바와 같은 지질 입자에 존재할 수 있다. 상기 세제는 임의의 약학적으로 허용되는 세제, 예를 들어, 비-이온성 또는 이온성 세제일 수 있다. 비-이온성 세제는 하나 이상의 하이드록실기를 함유하는 유기 화합물의 알킬렌 옥사이드 유도체일 수 있다. 한 태양에서, 비-이온성 세제는 에톡실화 및/또는 프로폭실화 알콜 또는 에스터 화합물 또는 그의 혼합물로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 에스터는 솔비톨 및 지방산의 에스터, 예를 들면, 솔비탄 모노올리에이트 또는 솔비탄 모노팔미테이트, 유성 슈크로스 에스터, 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 알킬 에터, 폴리옥시에틸렌 스테롤 에터, 폴리옥시에틸렌-폴리프로폭시 알킬 에터, 블록 중합체 및 세틸 에터, 폴리옥시에틸렌 피마자유 또는 수소화 피마자유 유도체 및 폴리글리세린 지방산 에스터로부터 선택된다. 한 태양에서, 비-이온성 세제는 플루로닉(Pluronic, 등록상표), 폴록사머(Poloxamer, 등록상표), 스판(Span, 등록상표), 트윈(Tween, 등록상표), 폴리솔베이트(Polysorbate, 등록상표), 틸록사폴(Tyloxapol, 등록상표), 에멀포르(Emulphor, 등록상표) 및 크레모포르(Cremophor, 등록상표)로부터 선택된다.
이온성 세제는 담관 약제(bile duct agent)일 수 있다. 한 태양에서, 이온성 세제는 콜산 또는 데옥시콜산, 또는 그의 염 및 유도체로부터, 또는 유리 지방산, 예를 들면, 올레산, 리놀레산 등으로부터 선택된다.
한 태양에서, 이온성 세제는 C10-C24 알킬아민 또는 알칸올아민과 같은 양이온성 지질, 및 양이온성 콜레스테롤 에스터로부터 선택된다. 한 태양에서, 세제는 고 CMC를 갖는 세제이다. 다른 태양에서, 세제는 5 mM 이상의 CMC를 갖는 세제이다.
한 태양에서, 지질 입자는 0.75 중량% 미만의 세제를 포함한다.
한 태양에서, 지질 입자는 0.30 중량% 미만의 세제를 포함한다.
한 태양에서, 지질 입자는 0.1 중량% 미만의 세제를 포함한다.
한 태양에서, 지질 입자는 0.05 중량% 미만의 세제를 포함한다.
한 태양에서, 세제는 당-계 세제, 폴리옥시알킬렌-계 세제, 담즙산염-계 세제, 합성 세제 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 태양에서, 세제는 콜산 또는 쯔비터젠트이다.
본 발명에 따른 방법의 한 태양에서 제 1 용액은 실질적으로 지질 입자를 함유하지 않는다.
한 태양에서, 상기 방법은 단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에, 단계 (ii)에서 수득된 용액을 배양하는 단계 (iia)를 포함한다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 60 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 0.5 내지 약 20 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 2 내지 약 60 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 12 내지 약 20 시간 동안 배양된다. 한 태양에서, 폴리펩티드는 세제와 함께 약 16 시간 동안 배양된다.
한 태양에서, 배양 및/또는 제거는 4 내지 45 ℃의 온도에서 이루어진다.
한 태양에서, 제거는 정용여과 또는 투석에 의해 수행된다.
한 태양에서, 제 1 용액은 제 1 부피를 가지고, 제 2 용액은 제 2 부피를 가지며, 제 1 용액중 아포지단백질과 같은 단백질은 한정된 농도를 가지고, 제 2 용액중 지질 및 세제는 각각 한정된 농도를 갖는데, 이때 단계 (ii)에서 아포지단백질, 지질 및 세제의 농도는 지질 입자의 생성을 허용하도록 변화/감소된다. 아포지단백질 용액의 희석 및 지질 및 세제의 첨가에 의해, 한편으로 아포지단백질 대 지질의 적합한 비 및 또한 다른 한편으로 지질 대 세제의 적합한 비가 조정되어 지질 입자를 형성하도록 한다.
한 태양에서, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(iv) 지질 입자를 정제함으로써 지질 입자를 제조하는 단계.
본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 상이한 지질 입자들이 제조될 수 있다.
예를 들면, 아포지단백질을 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 기술적 견지에서, 16개 이하의 원자의 쇄를 갖는 카복실산 잔기를 함유하는 포화 인지질이 선택된다(예를 들면, 다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DPPC; 다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DMPC 등). 그와 반대로, 생물학적 데이터로부터, 16개 이상의 C-원자의 쇄를 갖는 카복실산 잔기를 함유하는 불포화 인지질(예를 들면, 팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, POPC; 스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, SOPC)이 보다 효과적이며 비-간독성임을 추정할 수 있다.
포스파티딜콜린 DPPC 및 POPC 및 그의 혼합물을 아포지단백질을 함유하는 지질 입자의 제조에 사용할 수 있다. 상기 예시적인 포스파티딜콜린은 하나의 카복실산 잔기가 상이하며, 포스포글리세롤 주쇄에 에스터화된 하나의 동일한 카복실산 잔기를 갖는다. DPPC를 사용한 경우 지질 입자의 제조가 더 용이하였다. 반대로, POPC는 시험관내 기능 분석에서, 특히 유동화 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스터로의 전환에 필수적인 레시틴 콜레스테롤 아세틸 트랜스퍼라제(LCAT) 효소의 활성화에 기질로서 보다 효과적이었다. 상이한 몰 비의 2개의 포스파티딜콜린, 예를 들면, POPC 및 DPPC의 혼합물을 포함하는 지질 입자는 하나의 포스파티딜콜린만을 포함하는 지질 입자에 비해 개선된 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 4 참조).
예를 들면, 지질 입자는 POPC만을 함유할 수 있다. 아포지단백질 단량체 당 POPC 분자의 수는, 1:40 내지 1:80의 아포지단백질 대 지질 몰 비를 지질 입자 생성에 사용하는 경우, 54 내지 75로 달라질 수 있다. 한 태양에서, 아포지단백질 대 POPC의 몰 비는 1:40 내지 1:80이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:50 내지 1:70이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:60이다.
따라서, 아포지단백질 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 아포지단백질 대 POPC의 몰 비는 한 태양에서 1:40 내지 1:100이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:40 내지 1:80이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:60이다.
예를 들면, 지질 입자는 DPPC만을 함유할 수 있다. 아포지단백질 단량체 당 DPPC 분자의 수는, 1:40 내지 1:80의 아포지단백질 대 지질 몰 비를 지질 입자 생성에 사용하는 경우, 76 내지 123으로 달라질 수 있다. 한 태양에서, 아포지단백질 대 DPPC의 몰 비는 1:70 내지 1:100이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:75 내지 1:90이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:80이다.
예를 들면, 지질 입자는 1:3 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물로부터 출발하여 제조될 수 있다. 아포지단백질 단량체 당 인지질 분자의 수는, 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 지질 몰 비를 지질 입자 생성에 사용하는 경우, 72 내지 112로 달라질 수 있다. 한 태양에서, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC의 몰 비는 1:70 내지 1:90이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:75 내지 1:85이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:80이다.
따라서, 아포지단백질, POPC 및 DPPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(1:3 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비는 한 태양에서 1:60 내지 1:100이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:70 내지 1:90이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:80이다.
예를 들면, 지질 입자는 1:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물로부터 출발하여 제조될 수 있다. 아포지단백질 단량체 당 인지질 분자의 수는, 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 지질 몰 비를 지질 입자 생성에 사용하는 경우, 71 내지 111로 달라질 수 있다. 한 태양에서, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC의 몰 비는 1:60 내지 1:80이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:65 내지 1:75이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:70이다.
따라서, 아포지단백질, DPPC 및 POPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(1:1 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비는 한 태양에서 1:60 내지 1:100이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:60 내지 1:80이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:70이다.
예를 들면, 지질 입자는 3:1 몰 비의 POPC와 DPPC의 혼합물로부터 출발하여 제조될 수 있다. 아포지단백질 단량체 당 인지질 분자의 수는, 1:60 내지 1:100의 아포지단백질 대 지질 몰 비를 지질 입자 생성에 사용하는 경우, 46 내지 93으로 달라질 수 있다. 한 태양에서, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC의 몰 비는 1:50 내지 1:70이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:55 내지 1:65이며, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:60이다.
따라서, 아포지단백질, POPC 및 DPPC를 포함하는 지질 입자의 제조를 위해, 아포지단백질 대 POPC 및 DPPC(3:1 몰 비의 POPC 및 DPPC)의 몰 비는 한 태양에서 1:60 내지 1:100이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 1:50 내지 1:70이고, 한 태양에서 상기 몰 비는 약 1:60이다.
한 태양에서, 아포지단백질은 아포지단백질의 수용액으로 제공되며, 재조합체 생성 또는 임의의 다른 공급원의 아포지단백질 생성 후에 후속 공정으로부터 수득될 수 있고, 다양한 순도를 갖는 다양한 농도의 아포지단백질을 포함할 수 있다.
기본적으로, 지질 입자 생성은 폴리펩티드를 세제 가용화된 지질과 함께 그 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 달성된다. 투석에 의한 세제의 제거는 지질 이중층으로 이루어진 지질 입자의 생성을 제공한다.
기본적으로, 지질 입자 제조는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 또는 그의 다량체를 세제 가용화된 지질과 함께 그 각각의 전이 온도에서 배양함으로써 달성될 수 있다. 투석에 의한 세제의 제거는 α-나선 아포지단백질로 둘러싸인 지질 이중층으로 이루어진 지질 입자의 생성을 제공한다.
지질 입자는 침전 및/또는 크로마토그래피 단계의 조합에 의해 정제할 수 있다. 예를 들면, 과량의 세제, 즉, 지질 입자의 일부가 아닌 세제는 소수성 흡착 크로마토그래피 단계에서 제거할 수 있다. 한 태양에서, 지질 입자를 정제하는 방법의 한 단계는 소수성 흡착 크로마토그래피 단계를 포함한다. 또 다른 태양에서, 소수성 흡착 단계를 위한 크로마토그래피 물질은 엑스트랙티 겔(Extracti Gel) D(피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology)에서 시판, 미국 일리노이주 록포드 소재), 칼바이오솔브(CALBIOSORB, 등록상표)(칼바이오켐(Calbiochem)에서 시판, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SDR 30 하이퍼디(HyperD, 등록상표) 용매-세제 제거용 크로마토그래피 수지(폴 코포레이션(PALL Corp.)에서 시판, 미국 미시건주 앤 아보 소재)로부터 선택된다. 지질 입자는 세제-비함유 용액을 사용하여 소수성 흡착 물질로부터 회수된다.
한 태양에서, 고 CMC를 갖는 세제를 제거하기 위해 투석을 이용한다.
약학 및 진단 조성물
본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수득된 지질 입자는 질환 또는 질병의 치료 및/또는 진단에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 또는 본원에 기재된 바와 같은 지질 입자는 비정상적 간 수준, 또는 혈관내 플라크와 같은 신체 구성요소내 지질의 침착을 특징으로 하는 질환 또는 질병의 치료 및/또는 진단에 사용될 수 있다.
생성된 단백질-지질 복합체의 LCAT 촉진된 콜레스테롤 에스터화를 보조하는 능력을 측정하기 위해, 에탄올성 콜레스테롤 용액의 신속한 첨가에 의해 본원에 기재된 바와 같은 지질 입자에 콜레스테롤을 혼입시켰다. 순수한 POPC를 함유하는 지질 입자가 그의 아포지단백질 구성성분과 무관하게 DPPC를 함유하는 복합체, 예를 들면, 야생형 아포지단백질 A-I 또는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I보다 우수한 LCAT 기질이다(도 3).
POPC와 DPPC의 상이한 혼합물들을 포함하는 지질 입자중에서 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도는, 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도로부터 볼 수 있듯이 임의의 순수한 포스파티딜콜린보다 혼합물이 더 우수한 LCAT 기질임을 보여준다(표 3 및 도 4 참조).
[표 3]
다양한 인지질 혼합물을 포함하는 지질 입자에서 콜레스테롤 에스터화의 초기 속도
Figure pct00003
THP-1 단핵구성 백혈병 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트에 노출시켜 수득되고 방사능 표지된 콜레스테롤 추적자(tracer)를 부하시킨 대식세포 유사 인간 THP1 세포를 콜레스테롤 수용체 시험 화합물에 노출시켰다.
수용체 시험 화합물에 의해 유도된 유출 속도는 세포와 그 상등액중 방사능의 합에 대한 상등액중 콜레스테롤 방사능의 비로서 산출될 수 있으며, 수용체를 함유하지 않은 배지에 노출된 세포와 비교되어 선형 적합도(linear fit)에 의해 분석될 수 있다. 주로 ABCA-1을 상향조절하고 유출을 ABCA-1 매개 수송 쪽으로 편향되게 하는 것으로 알려져 있는 RXR-LXR 작용물질에 노출된 세포 및 노출되지 않은 세포를 사용하여 병행 실험을 수행할 수 있다.
RXR-LXR 지질 입자로 전처리되지 않은 세포에서, 비-지질화 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 사용하여 수득된 유출에 비해 콜레스테롤 유출에 더 높은 증가를 볼 수 있다. 시험된 시리즈에서는 유출에 대한 지질 혼합물의 단지 약간의 영향만을 관찰할 수 있다(도 5). RXR-LXR로 전처리된 세포에서는, 비-지질화 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 콜레스테롤 유출에서 필적할 만한 증가를 볼 수 있다. 전체 증가는 전처리되지 않은 세포에서 관찰된 것에 비해 더 높았다. 시험된 시리즈에서 유출에 대한 지질 혼합물의 단지 약간의 영향만을 관찰할 수 있다(도 6).
토끼에서 상이한 지질 입자들을 생체내 시험하였다. 지질 입자는 정맥내 주입으로 적용하였으며, 적용후 96 시간동안 연속 채혈을 수행하였다. 간 효소, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터의 값들을 측정하였다. 혈장 농도는, 초기 분포 단계 이후 로그-선형 경사의 혈장 농도를 포함하는 모든 시험한 지질 입자들에 대해 비슷하다(도 7). 표 4에서 볼 수 있듯이, 약동학적 파라미터는 모든 시험 화합물에 대해 유사하다. 관찰된 반감기는 1.5일에 가깝다.
[표 4]
측정된 약동학적 파라미터
Figure pct00004
도 8에서 볼 수 있듯이, 콜레스테롤은 혈장내에서 유동화되고 에스터화된다. 혈장 콜레스테롤 에스터 수준은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 농도가 이미 감소되고 있는 후에도 계속 증가한다. 혈장 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 수준이 약 0.5 mg/㎖(정상 야생형 아포지단백질 A-I의 약 50%)로 감소되었을 때에도, 증가된 콜레스테롤 에스터 수준이 여전히 검출될 수 있다.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자는 도 1 및 9에서 볼 수 있듯이 토끼에서 뿐 아니라 마우스에서도 간 효소를 유도하지 않는다. 또한, 정맥내 적용 2 시간후 수득된 혈장 샘플에서 용혈을 측정할 수 없다(도 10).
그러므로, 본 발명의 태양은 본원에 기재된 바와 같은 아포지단백질 또는 본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자를 포함하는 약학 조성물 및 진단 조성물이다.
본원에 기재된 바와 같은 지질 입자는 비-지질화 아포지단백질 및 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 다른 지질 입자들에 비해 개선된 생체내 성질을 갖는다.
[표 5]
상이한 아포지단백질 및 지질 입자들의 생체내 성질
Figure pct00005
콜레스테롤이 혈액중으로 유동화되는 효율은, 총 콜레스테롤의 각각의 편위(excursion)를 생체내 아포지단백질 투여후 아포지단백질 농도와 비교함으로써 측정할 수 있다. 정량적 평가를 위해, 기준선 보정된, 총 콜레스테롤의 농도-시간 곡선하 면적(AUC) 및 아포지단백질의 농도-시간 곡선하 면적의 비율을 산출하였다.
본원에 기재된 바와 같은 지질 입자, 특히 서열번호 1의 테트라넥틴-아포지단백질과, 3:1 몰 비의 POPC 및 DPPC를 포함하는 지질 입자는 생체내에서 증대된 콜레스테롤 유동화를 나타낸다.
테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I
상기에서 개략한 바와 같은 지질 입자 이외에, 본원에는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I도 또한 기술되어 있다.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 인간 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소와 야생형 인간 아포지단백질 A-I의 융합 단백질이다. 인간 테트라넥틴 부분의 아미노산 서열은 천연 절두(truncation) 부위인 위치 10의 이소류신 잔기로 출발하여 처음 9개 아미노산만큼 단축될 수 있다. 상기 절두의 결과로, 위치 4의 트레오닌 잔기에서의 O-글리코실화 부위가 결실되었다. 테트라넥틴 삼량체화 구조 요소 및 인간 아포지단백질 A-I 사이에 5개의 아미노산 잔기 "SLKGS"(서열번호 3)가 제거되었다.
개선된 발현 및 정제를 위해, N-말단 정제 태그, 예를 들면, 헥사히스티딘-태그, 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 포함하는 구조물이 제조될 수 있다. 특이적 절단의 결과로서, 2개의 아미노산(알라닌 및 프롤린)이 정제후 본 발명에 따라서 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 N-말단에서 유지되고, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
테트라넥틴 삼량체화 구조 요소는 개개 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체 각각의 사이에 비-공유적 상호작용에 의해 구성되는 삼량체성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 다량체의 생성을 가능하게 하는 영역을 제공한다.
대안적 정제 방법을 이용하여, 정제-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 생략시켜 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 생성할 수 있다.
한 태양에서, 아포지단백질은 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체 또는 아포지단백질 A-I 모방체일 수 있다.
아포지단백질 A-I은 효소적으로, NMR 분광학에 의해, 또는 단클론성 또는 다클론성 항-아포지단백질-A-I 항체를 사용하여 측정할 수 있다. 그러므로, 본원에 기재된 바와 같은 다른 태양은 본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I과 특이적으로 결합하는 다클론성 및 단클론성 항체이다. 상기 항체는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있는 방법으로 수득될 수 있다. 또한, 면역분석에 사용하기 위한 항체의 표지화도 당해 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
한 태양에서, 아포지단백질은 보존적 아미노산 치환을 포함하는 변이체, 또는 아포지단백질 A-I 모방체일 수 있다. 한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 서열번호 2 또는 서열번호 66 또는 서열번호 67(이때, X는 서열번호 68 내지 서열번호 105로부터 선택된다)의 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00006
(서열번호 2)
한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00007
(서열번호 66)
한 태양에서, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00008
(서열번호 67)
상기에서, X는 다음 아미노산 서열들 중 임의의 서열일 수 있다: A, G, S, P, AP, GP, SP, PP, GSAP(서열번호 68), GSGP(서열번호 69), GSSP(서열번호 70), GSPP(서열번호 71), GGGS(서열번호 72), GGGGS(서열번호 73), GGGSGGGS(서열번호 74), GGGGSGGGGS(서열번호 75), GGGSGGGSGGGS(서열번호 76), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 77), GGGSAP(서열번호 78), GGGSGP(서열번호 79), GGGSSP(서열번호 80), GGGSPP(서열번호 81), GGGGSAP(서열번호 82), GGGGSGP(서열번호 83), GGGGSSP(서열번호 84), GGGGSPP(서열번호 85), GGGSGGGSAP(서열번호 86), GGGSGGGSGP(서열번호 87), GGGSGGGSSP(서열번호 88), GGGSGGGSPP(서열번호 89), GGGSGGGSGGGSAP(서열번호 90), GGGSGGGSGGGSGP(서열번호 91), GGGSGGGSGGGSSP(서열번호 92), GGGSGGGSGGGSPP(서열번호 93), GGGGSAP(서열번호 94), GGGGSGP(서열번호 95), GGGGSSP(서열번호 96), GGGGSPP(서열번호 97), GGGGSGGGGSAP(서열번호 98), GGGGSGGGGSGP(서열번호 99), GGGGSGGGGSSP(서열번호 100), GGGGSGGGGSPP(서열번호 101), GGGGSGGGGSGGGGSAP(서열번호 102), GGGGSGGGGSGGGGSGP(서열번호 103), GGGGSGGGGSGGGGSSP(서열번호 104) 및 GGGGSGGGGSGGGGSPP(서열번호 105).
이종 폴리펩티드가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 균주에서 생성되는 경우, 아미노-말단 메티오닌 잔기는 통상적으로 프로테아제에 의해 효과적으로 절단되지 않으므로, 생성된 폴리펩티드에 아미노-말단 메티오닌 잔기가 부분적으로 존재한다.
하기의 실시예, 서열표 및 도면들은, 정확한 범위가 첨부된 특허청구범위에 나타나 있는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 나타낸 절차들에 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
서열표
서열번호 1 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(1).
서열번호 2 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(2).
서열번호 3 펩티드.
서열번호 4 아포지단백질 A-I 모방체(1).
서열번호 5 아포지단백질 A-I 모방체(2).
서열번호 6 인간 아포지단백질 A-I.
서열번호 7 인간 아포지단백질 A-II.
서열번호 8 인간 아포지단백질 A-IV.
서열번호 9 인간 아포지단백질 A-V.
서열번호 10 인간 아포지단백질 C-I.
서열번호 11 인간 아포지단백질 C-II.
서열번호 12 인간 아포지단백질 C-III.
서열번호 13 인간 아포지단백질 C-IV.
서열번호 14 인간 아포지단백질 D.
서열번호 15 인간 아포지단백질 E.
서열번호 16 인간 아포지단백질 F.
서열번호 17 인간 아포지단백질 H.
서열번호 18 인간 아포지단백질 L-I.
서열번호 19 인간 아포지단백질 L-II.
서열번호 20 인간 아포지단백질 L-III.
서열번호 21 인간 아포지단백질 L-IV.
서열번호 22 인간 아포지단백질 L-V.
서열번호 23 인간 아포지단백질 L-VI.
서열번호 24 인간 아포지단백질 M.
서열번호 25 인간 아포지단백질 O.
서열번호 26 인간 아포지단백질 OL.
서열번호 27 인간 아포지단백질 클러스.
서열번호 28 아포지단백질.
서열번호 29 아포지단백질.
서열번호 30 아포지단백질.
서열번호 31 아포지단백질.
서열번호 32 아포지단백질.
서열번호 33 아포지단백질.
서열번호 34 아포지단백질.
서열번호 35 아포지단백질.
서열번호 36 아포지단백질.
서열번호 37 아포지단백질.
서열번호 38 아포지단백질.
서열번호 39 아포지단백질.
서열번호 40 아포지단백질.
서열번호 41 아포지단백질.
서열번호 42 아포지단백질.
서열번호 43 아포지단백질.
서열번호 44 아포지단백질.
서열번호 45 아포지단백질.
서열번호 46 아포지단백질.
서열번호 47 아포지단백질.
서열번호 48 아포지단백질.
서열번호 49 아포지단백질.
서열번호 50 아포지단백질.
서열번호 51 아포지단백질.
서열번호 52 아포지단백질.
서열번호 53 인간 테트라넥틴 삼량체화 영역.
서열번호 54 단축 인간 테트라넥틴 삼량체화 영역.
서열번호 55 인간 인터페론 단편.
서열번호 56 헥사히스티딘 태그.
서열번호 57 융합 단백질.
서열번호 58 프라이머 N1.
서열번호 59 프라이머 N2.
서열번호 60 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 61 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 62 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 63 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 64 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 65 IgA 프로테아제 절단 부위.
서열번호 66 테트라넥틴-아포지단백질 A-I.
서열번호 67 his-태그를 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I.
서열번호 68 내지 105 링커.
재료 및 방법
크기-배제- HPLC:
크로마토그래피는 ASI-100 HPLC 시스템(디오넥스(Dionex), 독일 이드슈타인 소재) 상에서 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼을 사용하여 수행하였다. 용출 피크는 280 nm에서 UV 다이오드 배열 검출기(디오넥스)로 모니터링하였다. 농축 샘플을 1 mg/㎖로 용해시킨 후에, 안정한 기준선이 달성될 때까지 200 mM 인산 이수소 칼륨 및 250 mM 염화칼륨으로 이루어진 완충액(pH 7.0)으로 컬럼을 세척하였다. 분석 작업은 실온에서 30 분에 걸쳐 0.5 mg/분의 유량을 사용하여 등용매(isocratic) 조건하에서 수행하였다. 크로마토그램은 크로멜레온(Chromeleon)(디오넥스, 독일 이드슈타인 소재)을 사용하여 수동으로 적분하였다. %로 나타낸 응집률은 고분자량 형태의 곡선하 면적(AUC)을 단량체 피크의 AUC와 비교하여 측정하였다.
동적 광 산란( dynamic light scattering , DLS ):
DLS는 전형적으로 서브-마이크론 크기 범위의 입자 크기를 측정하기 위한 비-침습성 기술이다. 본 발명에서는, 1 nm 내지 6 ㎛의 크기 범위를 모니터링하기 위해 온도 조절 석영 큐벳(25 ℃)을 갖는 제타사이저(Zetasizer) 나노(Nano) S 장치(말번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 영국 워세스터셔 소재)를 사용하였다. 역산란 레이저광의 강도는 173˚의 각도에서 검출하였다. 상기 강도는, 입자 크기에 의해 좌우되는 입자 확산 속도에 의존성인 비율로 변동한다. 그러므로, 입자 크기 데이터는 산란광 강도의 변동에 대한 분석으로부터 산출될 수 있다(문헌 [Dahneke, B.E.(ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)]). 강도에 의한 크기 분포는 DTS 소프트웨어(말번)의 다중 협폭 모드를 이용하여 산출하였다. 실험은 희석하지 않은 샘플을 사용하여 수행하였다.
SEC - MALLS:
SEC-MALLS는 다음 3가지 검출 시스템: (i) UV 검출, (ii) 굴절률 검출, 및 (iii) 광산란 검출과 크기 배제 크로마토그래피의 조합이다. 크기에 의한 분리를 위해, GE 헬쓰케어의 슈퍼로즈(Superose) 6 컬럼 10/300 GL 컬럼을 사용한다. 상기 방법은 0.4 ㎖/분의 유량을 적용하는 PBS 완충액(pH 7.4)을 사용하여 등용매성으로 실행된다. 3개의 검출기 시스템은 직렬로 연결된다. 완전 지질 입자(단백질-지질 입자) 신호는 굴절률 검출기로 모니터링하는 반면, 280 nm에서 측정된 UV 흡광도는 단백질 부분에 의해 유도된 신호를 측정한다. 지질 분획의 비율은 완전 신호로부터 단백질 UV 신호의 단순한 차감에 의해 수득된다. 광산란을 적용하여 각각의 종의 분자량의 검출이 가능하며, 따라서 지질 입자의 완전하고 상세한 기술이 가능하다.
세제 측정:
잔류 세제의 측정은 증발 광산란 검출기와 커플링된 역상 크로마토그래피(RP-ELSD)로 수행하였다. 컬럼으로 페노메넥스(Phenomenex)(독일 아샤펜부르크 소재)의 루나(Luna) C18 4.6 x 150 mm, 5 ㎛, 100 Å을 사용하였다. 10 kDa의 막을 통한 원심분리 후에, 90 ㎕의 관류(flow-through)를 HPLC 분리에 사용하였다. 용출은 0.1%(v/v) 트라이플루오로 아세트산을 함유하는 74%(v/v) 메탄올 용액을 사용하여 등용매 조건하에서 수행하였다. 컬럼 온도는 30 ℃로 설정하였다. 검출은 30 ℃의 분무 온도, 80 ℃의 증발 온도 및 1.0 ℓ/분의 기류를 적용하여 증발 광산란 검출기로 수행하였다. 잔류 세제의 정량화는 0.22 ㎍ 내지 7.5 ㎍ 콜레이트 범위의 콜레이트의 경우에, 보정 곡선의 작성에 의해 측정하였다.
단백질 측정:
단백질 농도는, 아미노산 서열을 기준으로 계산된 몰 흡광 계수를 이용하여, 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
재조합 DNA 기술:
표준 방법을 이용하여 문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약들은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
실시예 1
에스케리치아 콜라이 발현 플라스미드의 제조 및 설명
재조합 수단에 의해 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드를 제조하였다. 발현된 융합 폴리펩티드의 N-말단으로부터 C-말단 방향으로의 아미노산 서열은 다음과 같다:
- 아미노산 메티오닌(M),
- CDLPQTHSL의 아미노산 서열을 갖는 인터페론 서열의 단편(서열번호 55),
- GS 링커,
- HHHHHH의 아미노산 서열을 갖는 헥사-히스티딘 태그(서열번호 56),
- GS 링커,
- VVAPPAP의 아미노산 서열을 갖는 IgA 프로테아제 절단 부위(서열번호 60), 및
- 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I.
전술한 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드는 IgA 프로테아제를 사용한 시험관내 효소적 절단에 의해 그로부터 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 융합 폴리펩티드가 방출되는 전구체 폴리펩티드이다.
전구체 폴리펩티드 암호화 융합 유전자는 적절한 핵산 절편의 연결에 의해 공지된 재조합 방법 및 기술을 사용하여 조립하였다. 화학 합성에 의해 제조된 핵산 서열은 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 서열번호 31의 융합 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 제조를 위한 발현 플라스미드는 다음과 같이 제조하였다.
에스케리치아 콜라이 발현 플라스미드의 제조
플라스미드 4980(4980-pBRori-URA3-LACI-SAC)은 에스케리치아 콜라이에서 코어-스트렙타비딘의 발현을 위한 발현 플라스미드이다. 상기 플라스미드는 플라스미드 1966(1966-pBRoiri-URA3-LACI-T-반복서열; 유럽특허 제 EP-B 1 422 237 호에 기재됨)으로부터 유도된 3142 bp의 긴 EcoRI/CelII-벡터 단편을 435 bp의 긴 코어-스트렙타비딘 암호화 EcoRI/CelII-단편과 접합시켜 생산하였다.
상기 코어-스트렙타비딘 에스케리치아 콜라이 발현 플라스미드는 하기의 요소들을 포함한다:
- 에스케리치아 콜라이에서의 복제를 위한 벡터 pBR322로부터의 복제 기점(문헌 [Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43, 77-90 (1979)]에 따른 bp 위치 2517-3160에 상응),
- 에스케리치아 콜라이 pyrF 돌연변이 균주(우라실 영양요구성)의 상보성에 의한 플라스미드 선별을 가능케 하는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제(문헌 [Rose, M. et al., Gene 29, 113-124 (1984)])를 암호화하는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)의 URA3 유전자,
- 다음을 포함하는 코어-스트렙타비딘 발현 카세트: 문헌 [Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV, 121-152 (1990)]에 따른 합성 리보솜 결합 부위를 포함하는 T5 하이브리드 프로모터(문헌 [Bujard, H., et al., Methods. Enzymol. 155, 416-433 (1987) and Stueber, D., et al., Immunol. Mehtods IV, 121-152 (1990)]에 따른 T5-PN25/03/04 하이브리드 프로모터), 코어-스트렙타비딘 유전자, 2개의 박테리오파지-유도된 전사 종결자: λ-T0 종결자(문헌 [Schwarz, E., et al., Nature 272, 410-414 (1978)]) 및 fd-종결자(문헌 [Beck E. and Zink, B., Gene 1-3, 35-58 (1981)]),
- 에스케리치아 콜라이로부터의 lacI 억제 유전자(문헌 [Farabaugh, P.J., Nature 274, 765-769 (1978)]).
단일 인접 EcoRI 및 CelII 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 이용하여 벡터 4980으로부터 코어-스트렙타비딘 구조 유전자를 절제하고, 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 EcoRII/CelII 제한효소 부위 인접 핵산을 3142 bp의 긴 EcoRI/CelII-4980 벡터 단편내에 삽입시킴으로써 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 폴리펩티드의 발현을 위한 최종 발현 플라스미드를 제조하였다.
실시예 2
테트라넥틴 - 아포지단백질 A-1의 발현
융합 단백질의 발현을 위해, 에스케리치아 콜라이 영양요구성(PyrF)(유럽특허공개 제 EP 0972838 호 및 미국특허 제 US 6,291,245 호)의 상보성에 의한 항생물질-비함유 플라스미드 선별을 가능하게 하는 에스케리치아 콜라이 숙주/벡터 시스템을 사용하였다.
에스케리치아 콜라이 K12 균주 CSPZ-2(leuB, proC, trpE, th-1, ΔpyrF)를 전기천공에 의해 발현 플라스미드 p(IFN-His6-IgA-테트라넥틴-아포지단백질 A-I)로 형질전환시켰다. 형질전환된 에스케리치아 콜라이 세포는 먼저 37 ℃에서 아가 플레이트 상에서 성장시켰다.
발효 프로토콜 1:
예비-발효를 위해, 약 1 g/ℓ L-류신, 약 1 g/ℓ L-프롤린 및 약 1 mg/ℓ 티아민-HCl로 보충된, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비-발효를 위해, 배플(baffle)을 갖는 1000 ㎖ 엘렌메이어(Erlenmeyer)-플라스크중의 300 ㎖의 M9-배지에 1차 종자 은행(seed bank) 앰플로부터 2 ㎖를 접종하였다. 배양은 1 내지 3의 흡광도(578 nm)가 수득될 때까지 37 ℃에서 13 시간동안 회전 진탕기상에서 수행하였다.
발효를 위해 문헌 [Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20, 17-27 (1991)]에 따른 회분용 배지를 사용하였다: 27.6 g/ℓ 글루코스*H2O, 13,3 g/ℓ KH2PO4, 4.0 g/ℓ (NH4)2HPO4, 1.7 g/ℓ 시트레이트, 1.2 g/ℓ MgSO4*7H2O, 60 mg/ℓ 철(III)시트레이트, 2.5 mg/ℓ CoCl2*6H2O, 15 mg/ℓ MnCl2*4H2O, 1.5 mg/ℓ CuCl2*2H2O, 3 mg/ℓ H3BO3, 2.5 mg/ℓ Na2MoO4*2H2O, 8 mg/ℓ Zn(CH3COO)2*2H2O, 8.4 mg/ℓ 티트리플렉스(Titriplex) III, 1.3 ㎖/ℓ 신페로닉(Synperonic) 10% 소포제. 회분용 배지는 5.4 mg/ℓ 티아민-HCl 및 1.2 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린 각각으로 보충하였다. 공급물 1 용액은 19.7 g/ℓ MgSO4*7H2O로 보충된 700 g/ℓ 글루코스를 함유하였다. pH 조절용 알칼리성 용액은 50 g/ℓ L-류신 및 50 g/ℓ L-프롤린 각각으로 보충된 12.5%(w/v) NH3 수용액이었다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해시켰다.
발효는 10 ℓ 바이오스타트(Biostat) C DCU3 발효조(사토리우스(Sartorius), 독일 멜중엔 소재)에서 수행하였다. 6.4 ℓ의 멸균 발효 회분용 배지 및 예비-발효로부터의 300 ㎖ 접종원으로부터 출발하여, 회분 발효는 37 ℃, pH 6.9 ± 0.2, 500 밀리바 및 10 ℓ/분의 통기율에서 수행하였다. 초기 보충된 글루코스가 고갈된 후, 온도를 28 ℃로 변화시키고 발효는 유가식(fed-batch)으로 접어들었다. 이때 용존 산소의 상대 값(pO2)은, 일정하게 증가하는 교반기 속도(10 시간 이내에 550 rpm에서 1000 rpm으로, 및 16 시간 이내에 1000 rpm에서 1400 rpm으로) 및 통기율(10 시간내에 10 ℓ/분에서 16 ℓ/분으로, 및 5 시간내에 16 ℓ/분에서 20 ℓ/분으로)과 함께 공급물 1을 첨가함으로써 50%(DO-스타트, 예를 들면, 문헌 [Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2, 79-85 (1987)] 참조)로 유지하였다. 추가 아미노산의 공급은 약 8 시간의 배양후 pH가 조절 하한치(6.70)에 도달했을 때, 알칼리성 용액의 첨가로부터 비롯되었다. 재조합 치료용 단백질의 발현은 70의 흡광도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.
발효 마지막에, 세포질 및 가용성 발현 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을, 발효조내 전체 배양액을 수거전 1 또는 2 시간동안 50 ℃로 가열시키는 가열 단계를 이용하여 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체로 전이시켰다(예를 들면, 유럽특허 제 EP-B 1 486 571 호 참조). 그런 다음, 발효조의 내용물을 관류 원심분리기(13,000 rpm, 13 ℓ/h)로 원심분리하고, 수거된 바이오매스를 추가 처리시까지 -20 ℃에서 저장하였다. 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 단백질은 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 불용성 세포 파편 분획에서만 발견되었다.
합성된 융합 단백질은 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)의 형태로 불용성 세포 파편 분획에서만 발견되었다.
발효조에서 취한 샘플들, 유도전에 하나의 샘플 및 단백질 발현 유도후 끝난 시점에서 나머지 샘플들을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일량의 세포(OD목표 = 5)를 5 ㎖ PBS 완충액에 재현탁시키고, 얼음 위에서 초음파처리에 의해 파쇄하였다. 이어서, 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮겼다. 이것은 가용성 및 불용성 발현 목표 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각각의 상등액(= 가용성) 분획에 300 ㎕, 및 각각의 펠릿(= 불용성) 분획에 400 ㎕의 SDS 샘플 완충액(문헌 [Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)])을 가하였다. 샘플을 95 ℃에서 진탕하에 15 분간 가열하여 샘플 중 모든 단백질을 가용화시키고 농축시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각각의 샘플을 4 내지 20% TGX 크리테리온 스테인 프리(Criterion Stain Free) 폴리아크릴아미드 겔(바이오-래드(Bio-Rad))로 옮겼다. 또한 5 ㎕의 분자량 표준물(프리시젼 플러스 프로테인 스탠다드(Precision Plus Protein Standard, 바이오-래드) 및 알고 있는 생성 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3가지 양(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량화 표준물을 겔 위에 위치시켰다.
200 V에서 60 분동안 전기영동을 실행한 후, 겔을 겔도크(GelDOC) EZ 영상장치(imager)(바이오-래드)로 옮기고 UV 방사선으로 5 분간 처리하였다. 겔 영상을 이미지 랩(Image Lab) 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 3개의 표준물을 사용하여, 선형 회귀 곡선을 >0.99의 계수를 사용하여 산출하고, 그로부터 원래 샘플중 목표 단백질의 농도를 산출하였다.
발효 프로토콜 2:
예비-발효를 위해, 약 1 g/ℓ L-류신, 약 1 g/ℓ L-프롤린 및 약 1 mg/ℓ 티아민-HCl로 보충된, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2nd edition (December 1989)]에 따른 M9 배지를 사용하였다.
예비-발효를 위해, 배플을 갖는 1000 ㎖ 엘렌메이어-플라스크중의 300 ㎖의 변형된 M9-배지에 아가 플레이트로부터 또는 1차 종자 은행 앰플로부터의 1 내지 2 ㎖를 접종하였다. 배양은 1 내지 3의 흡광도(578 nm)가 수득될 때까지 37 ℃에서 13 시간동안 회전 진탕기상에서 수행하였다.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 발효 및 고수율 발현을 위해, 하기의 회분 배지 및 공급물을 사용하였다:
8.85 g/ℓ 글루코스, 63.5 g/ℓ 효모 추출물, 2.2 g/ℓ NH4Cl, 1.94 g/ℓ L-류신, 2.91 g/ℓ L-프롤린, 0.74 g/ℓ L-메티오닌, 17.3 g/ℓ KH2PO4*H2O, 2.02 g/ℓ MgSO4*7H2O, 25.8 mg/ℓ 티아민-HCl, 1.0 ㎖/ℓ 신페로닉 10% 소포제. 공급물 1 용액은 1.67 g/ℓ L-메티오닌 및 5 g/ℓ L-류신 및 L-프롤린 각각으로 보충된 333 g/ℓ 효모 추출물 및 333 g/ℓ 85% 글리세롤을 함유하였다. 공급물 2는 600 g/ℓ L-프롤린의 용액이었다. pH 조절용 알칼리성 용액은 10%(w/v) KOH 용액이었으며, 산으로 75% 글루코스 용액을 사용하였다. 모든 성분들은 탈이온수에 용해시켰다.
발효는 10 ℓ 바이오스타트 C DCU3 발효조(사토리우스, 독일 멜중엔 소재)에서 수행하였다. 5.15 ℓ의 멸균 발효 회분용 배지 및 예비-발효로부터의 300 ㎖ 접종원으로부터 출발하여, 유가식 발효는 25 ℃, pH 6.7 ± 0.2, 300 밀리바 및 10 ℓ/분의 통기율에서 수행하였다. 초기 보충된 글루코스가 고갈되기 전에, 배양물이 15의 흡광도(578 nm)에 도달했으며, 공급물 1이 70 g/h로 출발했을 때 발효는 유가식으로 접어들었다. 배양물중 글루코스 농도를 모니터링한 결과, 공급물 1은 글루코스 축적은 배제되고 6.9의 조절 상한치 부근의 pH를 유지하면서 150 g/h의 최대치로 증가하였다. 50의 흡광도(578 nm)에서 공급물 2는 10 ㎖/h의 일정한 공급 속도하에 출발하였다. 용존 산소의 상대 값(pO2)은, 동시에 증가하는 교반기 속도(500 rpm에서 1500 rpm으로), 통기율(10 ℓ/분에서 20 ℓ/분으로) 및 압력(300 밀리바에서 500 밀리바로)에 의해 50% 이상으로 유지되었다. 재조합 치료용 단백질의 발현은 90의 흡광도에서 1 mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다.
발효조에서 취한 7개의 샘플들, 유도전에 하나의 샘플 및 단백질 발현 유도후 끝난 시점에서 나머지 샘플들을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. 모든 샘플로부터 동일량의 세포(OD목표 = 5)를 5 ㎖ PBS 완충액에 재현탁시키고, 얼음 위에서 초음파처리에 의해 파쇄하였다. 이어서, 100 ㎕의 각각의 현탁액을 원심분리하고(15,000 rpm, 5 분), 각각의 상등액을 회수하여 별도의 바이알로 옮겼다. 이것은 가용성 및 불용성 발현 목표 단백질을 구별하기 위한 것이다. 각각의 상등액(= 가용성) 분획에 300 ㎕, 및 각각의 펠릿(= 불용성) 분획에 200 ㎕의 SDS 샘플 완충액(문헌 [Laemmli, U.K., Nature 227, 680-685 (1970)])을 가하였다. 샘플을 95 ℃에서 진탕하에 15 분간 가열하여 샘플 중 모든 단백질을 가용화시키고 농축시켰다. 실온으로 냉각시킨 후에 5 ㎕의 각각의 샘플을 10% 비스-트리스(Bis-Tris) 폴리아크릴아미드 겔(노바겐(Novagen))로 옮겼다. 또한 5 ㎕의 분자량 표준물(프리시젼 플러스 프로테인 스탠다드, 바이오-래드) 및 알고 있는 생성 단백질 농도(0.1 ㎍/㎕)를 갖는 3가지 양(0.3 ㎕, 0.6 ㎕ 및 0.9 ㎕)의 정량화 표준물을 겔 위에 위치시켰다.
200 V에서 35 분동안 전기영동을 실행한 후, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R 염료로 염색하고, 열수로 탈색하고, 디지털화를 위해 흡광도 측정장치(optical densitometer)(GS710, 바이오-래드)로 옮겼다. 겔 영상을 퀀티티 원(Quantity One) 1-D 분석 소프트웨어(바이오-래드)를 사용하여 분석하였다. 3개 표준물을 사용하여, 선형 회귀 곡선을 >0.98의 계수를 사용하여 산출하고, 그로부터 원래 샘플중 목표 단백질의 농도를 산출하였다.
발효 마지막에, 세포질 및 가용성 발현 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을, 발효조내 전체 배양액을 수거전 1 또는 2 시간동안 50 ℃로 가열시키는 가열 단계를 이용하여, 불용성 단백질 응집체, 소위 봉입체(IB)로 전이시켰다(예를 들면, 유럽특허 제 EP-B 1 486 571 호 참조). 가열 단계 후에, 합성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 전구체 단백질은 IB 형태의 불용성 세포 파편 분획에서만 발견되었다.
발효조의 내용물을 4 내지 8 ℃로 냉각시키고, 관류 원심분리기(13,000 rpm, 13 ℓ/h)로 원심분리하고, 수거된 바이오매스를 추가 처리시까지 -20 ℃에서 저장하였다. 총 수거된 바이오매스 수율은 발현 구조물에 따라서 39 내지 90 g/ℓ 건조물 범위였다.
실시예 3
테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I의 제조
봉입체 제조는 인산칼륨 완충액 또는 트리스 완충액(0.1 M, 1 mM MgSO4로 보충, pH 6.5)에 수거된 세균 세포를 재현탁시켜 수행하였다. DNA 분해효소(DNAse)의 첨가후, 세포를 900 바의 압력에서 균질화에 의해 파쇄하였다. 1.5 M NaCl 및 60 mM EDTA를 포함하는 완충액을 균질화된 세포 현탁액에 가하였다. 25%(w/v) HCl을 사용하여 pH 값을 5.0으로 조정한 후, 추가 원심분리 단계후에 최종 봉입체 슬러리를 수득하였다. 상기 슬러리를 추가의 처리까지 1회용 멸균 비닐 봉지에 넣어 -20 ℃에서 저장하였다.
봉입체 슬러리(약 15 kg)를 구아니디늄 하이드로클로라이드 용액(150 ℓ, 6.7 M)에 가용화시켰다. 가용화물을 심층 여과에 의해 정화시킨 후, 용액을 Zn-킬레이트 친화성 크로마토그래피 물질에 적용하였다. 융합 폴리펩티드를 Zn-킬레이트 크로마토그래피 물질로 정제하고 IgA 프로테아제로 분리하였다. 그런 후에, 폴리펩티드를 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 더 정제하였다. 상기 단계들은 우레아 함유 용액(7 M) 중에서, 즉, 변성 조건하에서 수행하였다. 상기 단계들은 폴리펩티드 단편, 내독소 및 추가 불순물의 제거에 이용되었다. 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드 함유 용액내로의 정용여과를 수행하였다. 수득된 최종 용액은 변성된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 함유하였다.
실시예 4
테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I의 리폴딩 및 지질화
(a) 일반적 방법
순수한 결정성 POPC 또는 DPPC(리포이드(Lipoid), 스위스 소재)를 1:1.35의 인지질:콜레이트 몰 비로 콜레이트를 함유하는 수성 완충액(지질화 완충액)에 용해시켰다. 혼합물을 질소 대기하에 배양하고, 투명 용액이 수득될 때까지 실온(POPC) 또는 55 ℃(DPPC)에서 빛으로부터 보호하였다. 투명한 지질-콜레이트 용액을 4 ℃(POPC)로 냉각하거나 41 ℃(DPPC)에서 저장하였다. 정제된 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 4 ℃(POPC) 또는 41 ℃(DPPC)에서 한정된 아포지단백질:인지질 비로 첨가하였다. 지질 입자 생성을 위해, 반응 혼합물을 질소 대기하에 4 ℃(POPC) 또는 41 ℃(DPPC)에서 밤새 배양하고 빛으로부터 보호하였다. 최종적으로, 지질화 완충액에 대한 광범위 투석(4 ℃/41 ℃)에 의해 콜레이트를 제거하였다. 최종적으로 샘플을 원심분리하여 침전 물질을 제거하였다.
순수한 POPC 또는 순수한 DPPC를 함유하는 콜레이트 가용화 지질 용액을 전술한 바와 같이 제조하였다. 지질 용액을 목적하는 비로 혼합하여 지질 혼합물을 제조한 후 각각의 Tm(Tm = 상 전이온도)에서 저장하였다. 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자 제조는 선택된 지질 혼합물의 각각의 Tm에서 수행하는 것을 제외하고 순수한 지질 용액에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다.
하기의 지질화 완충액을 시험하였다:
1. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 슈크로스로 보충된 50 mM 인산 칼륨 완충액.
2. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7.5% 슈크로스, 10 mM 메티오닌으로 보충된 50 mM 인산수소이칼륨 완충액.
3. pH 7.5에서 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌으로 보충된 250 mM 트리스-하이드록실아미노 메탄(트리스).
4. pH 7.5에서 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7% 트레할로스, 10 mM 메티오닌으로 보충된 50 mM 인산수소이칼륨 완충액.
테트라넥틴-아포지단백질 A-I 샘플로부터 제조된 지질 입자의 균질성을 분석용 SEC로 평가하였다(도 11 및 12). 대체로, 지질화 완충액의 선택은 인지질의 선택에 비해 단지 미미한 영향을 갖는다. DPPC-지질 입자는 하나의 주피크로 용출되는 반면, POPC-지질 입자는 2개의 피크 패턴을 나타낸다. 지질화 완충액의 선택은 아포지단백질의 정제 과정 및 안정화된 지질-비함유 아포지단백질의 공급에 의해 영향을 받았다. 지질 입자 생성은 지질화 완충액과 관계없이 실현가능한 것으로 나타났다. 시험한 다양한 완충액 중에서, 가장 적절한 지질화 완충액은 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5인 것으로 확인되었다.
지질화 혼합물은 정해진 양의 아포지단백질 각각을 함유하였으며, 인지질, 에를 들어, POPC의 양을 그에 따라 계산하였다. 지질의 몰 양의 모든 계산은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체를 기준으로 하였다.
(b) POPC 및 콜레이트
[표 6]
순수한 POPC를 사용한 예로서 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 사용한 지질 입자 제조. 아포지단백질:인지질의 몰 비는 단백질 단량체에 대해 계산됨. 대조군: 지질을 첨가하지 않고 배양된 아포지단백질(순수 Apo) 및 아포지단백질을 함유하지 않는 지질(Apo 비함유).
Figure pct00009
1:40 내지 1:160의 몰 비가 전 과정동안 투명하게 유지되었다. 과량의 인지질로 인한 혼탁도 단백질 침전도 관찰되지 않았다.
지질 입자 샘플을 네이티브 PAGE로 분석하였다(도 13 참조). 가장 균질한 밴드 패턴은 샘플 1:80에서 나타났다(레인 4). 또한, 1 x 냉동/해동(-80 ℃)은 샘플의 외관을 변화시키지 않았다(레인 5). 샘플 1:320 및 1:160의 밴드 패턴은 다중 밴드를 야기하는 불균질 생성물을 나타낸다(레인 2 및 3). 샘플 1:40 및 또한 1:20은 주 생성물 밴드 아래의 추가 밴드를 갖는다(레인 6 및 7). 순수한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 이동 패턴은 도 13의 레인 8에 나타나 있다.
SEC-MALLS 분석을 이용하여 지질 입자의 균질성 및 그의 아포지단백질-인지질 조성에 대한 보다 상세한 정보를 얻었다(단백질-접합체 분석). 도 14는 SEC 분해된 샘플의 크로마토그램을 나타낸 것이다(UV280 검출). 이때, 1:160 샘플은 3개의 분리된 피크로 나뉜다. 1:80 샘플은 이중 피크로 보여진 바와 같이 상이한 크기의 2개 이상의 종을 함유하는 것으로 나타났다. 샘플 1:20으로부터 수득된 피크는 가장 균질한 생성물을 나타낸다.
실험은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(3.84 mg/㎖; 샘플 당 10 mg)을 사용하여 수행하였으며, 아포지단백질:인지질의 몰 비는 다섯 단계들에서 1:40에서 1:80으로 증가하였다. 1:40 미만의 몰 비에서는 지질 입자 생성이 불완전하였다. 1:80 이상의 몰 비는 실험적으로 배제된다: 투석에 의한 콜레이트 제거후 샘플이 혼탁해졌다. 또한, 지질 입자는 보다 높은 지질 비에서 보다 불균질해졌다.
[표 7]
순수한 POPC를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자 생성. 아포지단백질:인지질의 몰 비는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체를 기준으로 계산하였다
Figure pct00010
-3 ℃의 전이 온도에서 배양동안 모든 샘플은 광학적으로 투명하게 유지되었다. 투석에 의한 콜레이트 제거후 샘플 1:40 내지 1:65의 혼탁도 증가가 관찰되었다. 침전물은 원심분리에 의해 제거될 수 있었으며, 샘플은 그 뒤에 투명하게 유지되었다.
SEC-MALLS 분석을 이용하여, 생성된 지질 입자의 균질성 및 그의 아포지단백질-인지질 조성에 대한 상세한 정보를 얻었다(단백질-접합체 분석). 모든 지질 입자는 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC; 도 15) 상에서 동등하게 균질하여 작은 포스트피크(post-peak)를 나타내었으며, 이것은 보다 낮은 몰 비에서 더 현저하다. 또한, 보다 높은 몰 비에서 피크 패턴에 보다 고분자량으로의 현저한 이동이 있다. 각각의 체류 시간은 표 8에 나타내었다.
[표 8]
크기 배제 크로마토그래피 결과 요약; 퍼센트는 곡선하 면적(AUC)의 적분에 의해 계산하였다
Figure pct00011
단백질-접합체 분석(표 8에 요약된)은 SEC 컬럼으로부터 용출된 각 지질 입자에 대한 단백질(단백질 MW) 및 지질 성분(지질 MW)의 총 분자량의 산출을 가능하게 한다. 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체(32.7 kDa) 및 POPC(760 Da)의 분자량을 기준으로, 지질 입자의 조성을 계산할 수 있다(n 단백질 및 n POPC). 모든 몰 비에서 지질 입자 주피크에서 밝혀진 아포지단백질 성분의 분자량은 지질 입자당 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 삼량체에 상응하는 약 100 kDa였다. 비 n(POPC)/n(단백질 단량체)는 지질 입자중 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체 당 POPC 분자의 수를 제공한다. 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체 당 POPC 분자의 수는 1:40 내지 1:80까지의 몰 비가 적용되었긴 하지만 54 내지 75로 달라진다. 단백질% 값은 지질화 정도에 대한 파라미터이다. 지질 입자중 단백질의 퍼센트가 낮을수록 지질화 정도가 높다.
[표 9]
도 16에 나타낸 바와 같은 POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자에 대한 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00012
(c) DPPC 및 콜레이트
지질화에 앞서 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 pH 7.5에서 50 mM KH2PO4, 250 mM 아르기닌 하이드로클로라이드, 7% 트레할로스, 10 mM 메티오닌에 대해 투석하였다. 테트라넥틴-아포지단백질 A-I(3.84 mg/㎖, 샘플 당 3 mg)은 다섯 단계들에서 지질 농도를 증가시킨 1:60에서 1:100까지의 몰 비를 사용하여 지질화시켰다. 지질화 완충액은 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌(pH 7.5)이었다.
[표 10]
DPPC를 사용한 아포지단백질의 지질 입자의 샘플 개요
Figure pct00013
지질 입자 제조동안 단백질의 침전도 과량의 지질로 인한 혼탁도 관찰되지 않았다. 최종 생성물중 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 수율은 지질화에 DPPC를 더 많이 사용할 수록 더 높았다.
잔류 지질-비함유 아포지단백질은 네이티브 PAGE상에서 1:20 샘플에서 나타났다(레인 3, 도 17). 네이티브 PAGE 상에서 1:40 및 1:60 샘플이 가장 균질하게 보이는(레인 4 및 5) 반면, 1:80 및 1:100 샘플은 주 지질 입자 밴드 이상의 보다 높은 추가의 분자 밴드를 함유한다(레인 6 및 7).
SEC-MALLS 단백질 접합체 분석을 이용하여 DPPC 지질 입자(MW DPPC: 734 Da) 제조후 수득된 지질 입자의 조성을 특성화하였다. 균질한 SEC 피크가 1:80의 몰 비 이하에서 수득되었다. 보다 높은 지질 비에서 프리피크(pre-peak)가 나타났다(예를 들면, 표 11의 1:90 샘플 참조).
[표 11]
DPPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 SEC-MALLS 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00014
최고 지질화 정도(최저 단백질%)는 1:80 내지 1:90 몰 비에서 나타났다. 또한, DLS 결과 14 내지 17 nm의 입자 크기에서 1:80 내지 1:90 비에서 가장 균질한 입자 생성(>98%)을 보였다.
(d) 75% DPPC /25% POPC
하기의 파라미터를 사용하여 상기 실시예의 (a) 내지 (c)에 기재된 바에 따라서 지질 입자 제조를 수행하였다:
단백질: 테트라넥틴-아포지단백질 A-I, 3.84 mg/㎖, 샘플당 3 mg
지질화 완충액: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5
지질화: 34 ℃
투석: 4 ℃
시험 몰 비: 다섯 단계들에서 지질을 증가시키면서 1:60에서 1:100까지
지질 입자 생성은 간단하며 순수한 지질을 사용한 공정에 필적하였다. 모든 샘플들은 공정 및 투석동안 투명하게 유지되었다. 지질 입자의 수율은 시험한 모든 비에 대해 유사하였다(약 85%). SEC-MALLS 분석은 1:80의 몰 비가 90.9% 주피크, 프리피크 부재 및 9.1% 포스트피크 하에 가장 균질한 지질 입자를 제공함을 보여주었다. 단백질 접합체 분석은 모든 샘플의 주 종들 중에서 지질 입자당 하나의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 삼량체의 존재를 나타내었다(도 18 및 표 12 및 13 참조).
[표 12]
SEC 결과 요약: 퍼센트는 AUC의 적분에 의해 산출하였다
Figure pct00015
[표 13]
75% DPPC/25% POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
Figure pct00016
(e) 50% DPPC /50% POPC
하기의 파라미터를 사용하여 상기 실시예의 (a) 내지 (c)에 기재된 바에 따라서 지질 입자 제조를 수행하였다:
단백질: 테트라넥틴-아포지단백질 A-I, 3.84 mg/㎖, 샘플당 3 mg
지질화 완충액: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5
지질화: 27 ℃
투석: 실온
시험 몰 비: 다섯 단계들에서 지질을 증가시키면서 1:60에서 1:100까지
모든 샘플들은 공정 및 투석동안 투명하게 유지되었다. 지질 입자의 수율은 시험한 모든 비에 대해 유사하였다.
[표 14]
SEC 결과 요약: 퍼센트는 AUC의 적분에 의해 산출하였다
Figure pct00017
테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자 제조에 50% DPPC 및 50% POPC의 지질 혼합물을 사용하여, 1:70의 몰 비에서 가장 균질한 생성물이 수득되었다(표 14 참조). 상기 생성물은 주피크에 대해 89.9% 순수하였으며, 하나의 단일 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 삼량체를 함유하였다(표 15 참조).
[표 15]
50% DPPC/50% POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 갖는 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00018
(f) 25% DPPC /75% POPC
하기의 파라미터를 사용하여 상기 실시예의 (a) 내지 (c)에 기재된 바에 따라서 지질 입자 제조를 수행하였다:
단백질: 테트라넥틴-아포지단백질 A-I, 3.84 mg/㎖, 샘플당 3 mg
지질화 완충액: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌, pH 7.5
지질화: 18 ℃
투석: 실온
시험 몰 비: 다섯 단계들에서 지질을 증가시키면서 1:60에서 1:100까지
지질 입자 제조는 간단하였으며 순수한 지질을 사용한 공정에 필적하였다. 모든 샘플들은 공정 및 투석동안 투명하게 유지되었다.
[표 16]
SEC 결과 요약; 퍼센트는 AUC의 적분에 의해 산출하였다
Figure pct00019
테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자 제조에 25% DPPC 및 75% POPC의 지질 혼합물을 사용하여, 1:60의 몰 비에서 가장 균질한 생성물이 수득되었다(표 17 참조). 상기 생성물은 주피크에 대해 90.2% 순수하였으며, 하나의 단일 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 삼량체를 함유하였다(표 15 참조).
[표 17]
25% DPPC/75% POPC 및 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00020
(g) 쯔비터젠트를 사용한 지질 입자 제조
콜레이트를 합성 세제 쯔비터젠트로 대체하는 것을 제외하고 하기의 파라미터를 사용하여, 상기 실시예의 (a) 내지 (c)에 기재된 바에 따라 지질 입자 제조를 수행하였다.
단백질: 테트라넥틴-아포지단백질 A-I, 23.5 mg/㎖
완충액: 50 mM 트리스-HCl, 7.2 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 10 mM 메티오닌, pH 8
지질 완충액: 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.5
100% POPC, 아포지단백질:인지질의 몰 비 = 1:60.
[표 18]
지질 입자 제조의 다양한 접근 방법 및 관찰 결과/파라미터의 샘플 개요
Figure pct00021
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자를 네이티브 PAGE 상에서 분석하였다. 지질-비함유 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 140 kDa에서 이동한 반면(도 19의 레인 1), 지질 입자들은 232 kDa 내지 440 kDa 사의의 보다 높은 분자량으로 특징적인 이동을 나타내었다.
지질-비함유 테트라넥틴-아포지단백질 A-I은 각각의 세제 0.1 x CMC만을 사용하여 제조한 모든 샘플에서 검출되었지만 지질 입자는 검출되지 않았다(도 19, 레인 2, 8, 13 및 19). 그러나, 0.5 x CMC의 세제 농도는 쯔비터젠트 3-8 및 3-10으로 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 사용한 지질 입자 제조를 가능하게 하기에 충분하였다(레인 3, 9 및 14). 쯔비터젠트 3-12를 사용한 경우 지질 입자 제조는 2.0 x CMC의 농도에 이를 때까지 일어나지 않았다(레인 21).
도 20은 3 x CMC 쯔비터젠트 3-8 및 POPC(아포지단백질:인지질 몰 비 = 1:60)를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자의 SEC-MALLS 크로마토그램을 나타낸 것이다. 단백질 접합체 분석 결과는 표 18에 요약되어 있다. 지질 입자 분획은 SEC 크로마토그램에서 2개의 중첩 피크에서 보여지듯이 2개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 두 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 분자의 수(피크 1에 대해 4.2 및 피크 2에 대해 3.5)에서 구별된다.
[표 19]
쯔비터젠트 3-8의 존재하에 제조된 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
Figure pct00022
도 21은 SEC-MALLS 분석의 크로마토그램을 나타내고 있으며, 표 19는 2 x CMC 쯔비터젠트 3-10 및 POPC(아포지단백질:인지질 몰 비 = 1:60)를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자에 대한 단백질 접합체 분석의 요약을 나타내고 있다. 두 피크 모두 각각 3.5 및 5개 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 분자를 포함하는 지질 입자를 함유한다.
[표 20]
쯔비터젠트 3-10의 존재하에 제조된 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
Figure pct00023
쯔비터젠트 3-12 및 POPC(아포지단백질:인지질 몰 비 = 1:60)를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자 제조 결과가 표 21에 요약되어 있다. 지질 입자 분획은 SEC 크로마토그램에서 2개의 중첩 피크에서 보여지듯이 2개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 두 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 분자의 수에서 구별된다.
[표 21]
쯔비터젠트 3-12의 존재하에 제조된 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
Figure pct00024
콜레이트 및 POPC(아포지단백질:인지질 몰 비 = 1:60)를 사용한 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자 제조 결과가 표 21에 요약되어 있다. 지질 입자 분획은 SEC 크로마토그램에서 2개의 중첩 피크에서 보여지듯이 2개의 상이한 종들로 이루어진다. 그러나, 이들 두 종은 매우 유사하며, 주로 입자당 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 분자의 수에서 구별된다.
[표 22]
콜레이트의 존재하에 제조된 지질 입자의 단백질-접합체 분석 요약
Figure pct00025
실시예 5
리폴딩 및 지질 입자 제조를 위한 신속 희석 방법
(a) POPC 및 나트륨 콜레이트
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3(프로토콜 1)에 따라 정제하였다. 정제 후, 완충액을 정용여과에 의해 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드를 함유하는 용액(pH 7.4)으로 교환하였다. 단백질 농도는 28 mg/㎖로 조정하였다.
실온에서 100 몰/ℓ의 POPC를 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트를 함유하는 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 지질 저장액을 제조하였다. 지질 저장액을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 77 ㎖의 지질 저장 혼합물을 1478 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl(pH 7.4)에 희석시켜 리폴딩 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 실온에서 7 시간동안 더 교반하였다.
250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드(pH 7.4)중의 162 ㎖ 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 리폴딩 완충액에 첨가하여 리폴딩 및 지질 입자 제조를 개시하였다. 이에 의해 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:10 희석액이 생성되었다. 상기 용액을 일정하게 교반하면서 실온에서 16 시간동안 배양하였다. 세제의 제거는 정용여과에 의해 수행하였다.
[표 23]
POPC를 사용하여 신속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00026
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3(프로토콜 2)에 따라 정제하였다. 정제 후, 완충액을 정용여과에 의해 50 mM 트리스, 10 mM L-메티오닌, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드를 함유하는 용액(pH 7.4)으로 교환하였다. 단백질 농도는 20.4 mg/㎖로 조정하였다.
실온에서 100 몰/ℓ의 인지질(3:1 비의 POPC:DPPC)을 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 10 mM L-메티오닌, 135 mM 나트륨 콜레이트를 함유하는 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 지질 저장액을 제조하였다. 3.7 ㎖의 지질 저장 혼합물을 35.6 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl(pH 7.4)에 희석시켜 리폴딩 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 실온에서 2 시간동안 더 교반하였다.
50 mM 트리스, 10 mM L-메티오닌, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드(pH 8.0)중의 9.8 ㎖ 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 리폴딩 완충액에 첨가하여 리폴딩 및 지질 입자 제조를 개시하였다. 이에 의해 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:5 희석액이 생성되었다. 상기 용액을 일정하게 교반하면서 실온에서 밤새 배양하였다. 세제의 제거는 정용여과에 의해 수행하였다.
[표 24]
POPC/DPPC/콜레이트 혼합물을 사용하여 신속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00027
(b) POPC 및 DPPC 및 나트륨 콜레이트
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제하였다. 정제후에, 완충액을 정용여과에 의해 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드를 함유하는 완충액(pH 7.4)으로 교환시켰다. 단백질 농도는 30 mg/㎖로 조정하였다.
2개의 별도의 지질 저장액을 제조하였다. 용액 A는 실온에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트를 함유하는 완충액(pH 7.4)에 100 몰/ℓ의 POPC를 용해시켜 제조하였다. 용액 B는 41 ℃에서 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트(pH 7.4)에 100 몰/ℓ의 DPPC를 용해시켜 제조하였다. 지질 저장액 A 및 B를 3:1의 비로 혼합하고 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 384 ㎖의 지질 저장 혼합물을 6365 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl(pH 7.4)에 희석시켜 리폴딩 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 실온에서 24 시간동안 더 교반하였다.
250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드(pH 7.4)중의 750 ㎖ 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 용액을 리폴딩 완충액에 첨가하여 리폴딩 및 지질 입자 제조를 개시하였다. 이에 의해 구아니디늄 하이드로클로라이드의 1:10 희석액이 생성되었다. 상기 용액을 일정하게 교반하면서 실온에서 12 시간 이상동안 배양하였다. 세제의 제거는 정용여과에 의해 수행하였다.
[표 25]
POPC:DPPC = 1:1을 사용하여 신속 희석에 의해 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00028
(c) 상이한 구아니디늄 하이드로클로라이드 농도
본 발명에 따른 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 봉입체로부터 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 과정을 거쳐 정제하였다(실시예 1 내지 3 참조). 정제 후에, 완충액을 정용여과에 의해 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드를 함유하는 용액(pH 7.4)으로 교환시켰다. 단백질 농도를 28 mg/㎖로 조정하였다.
실온에서 100 몰/ℓ의 POPC를 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트를 함유하는 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 지질 저장액을 제조하였다. 지질 저장액을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 지질 저장액을 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl(pH 7.4)에 희석시켜 리폴딩 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 실온에서 12 시간동안 더 교반하였다. 다양한 양의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 리폴딩 완충액에 희석시켰다: 1:5, 1:7.5, 1:10, 1:12.5. 이에 의해 리폴딩 완충액중 상이한 잔류 농도의 구아니디늄 하이드로클로라이드가 생성되었다. 상기 용액을 실온 o/n에서 교반시켜 리폴딩 및 지질 입자 생성을 개시하였다. 세제 제거는 투석에 의해 수행하였다.
[표 26]
상이한 희석비하에 신속 희석으로 수득된 지질 입자의 단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00029
(d) 우레아의 존재하에 POPC 및 나트륨 콜레이트
테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 실시예 1 내지 3에 따라 정제하였다. 정제 후, 완충액을 정용여과에 의해 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 우레아를 함유하는 용액(pH 7.4)으로 교환하였다. 단백질 농도는 28 mg/㎖로 조정하였다.
실온에서 100 몰/ℓ의 POPC를 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl, 135 mM 나트륨 콜레이트를 함유하는 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 지질 저장액을 제조하였다. 상기 지질 저장액을 실온에서 2 시간동안 배양하였다. 77 ㎖의 지질 저장 혼합물을 1478 ㎖의 250 mM 트리스-HCl, 140 mM NaCl(pH 7.4)에 희석시켜 리폴딩 완충액을 제조하였다. 상기 완충액을 실온에서 7 시간동안 더 교반하였다.
250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 6.7 M 우레아(pH 7.4)중의 162 ㎖ 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 용액을 리폴딩 완충액에 첨가하여 리폴딩 및 지질 입자 제조를 개시하였다. 이에 의해 우레아의 1:10 희석액이 생성되었다. 상기 용액을 일정하게 교반하면서 실온에서 16 시간동안 배양하였다. 세제의 제거는 정용여과에 의해 수행하였다.
(e) POPC 및 나트륨 콜레이트 및 야생형 아포지단백질 A-I
또 다른 예시적인 두 번째 방법으로, pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 인간 아포지단백질 A-I(야생형 아포지단백질 A-I)을 지질화 완충액중에 1:5(v/v)로 희석시켜 0.6 mg/㎖의 단백질 농도를 수득하였다. 지질화 완충액은 7 mM 콜레이트, 240:1의 지질 대 단백질 비에 상응하는 4 mM POPC 및 1.3 mM DPPC로 이루어졌다. SEC-MALLS를 이용하여 복합체 생성을 분석하였다. 약 2개의 아포지단백질 분자가 약 200개 지질 분자로 이루어진 복합체에서 발견되었다.
[표 27]
단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00030
실시예 6
변성 또는 네이티브 단백질로부터 출발한 지질 입자 제조
실시예 4에 기재된 바와 같은 방법(첫 번째 방법)은 지질 입자 제조를 위해 천연 아포지단백질을 필요로 하는 반면, 실시예 5에 기재된 방법(두 번째 방법)은 지질 입자 제조에 완전히 변성된 아포지단백질로부터 출발한다.
예시적인 첫 번째 방법에서, pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 변성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을, 3.46 mg/㎖의 단백질 농도에서 pH 7.5에서 250 mM 트리스, 140 mM NaCl, 10 mM 메티오닌으로 이루어진 완충액에 대해 광범위하게 투석시켰다. 이어서, POPC와 콜레이트의 혼합물을 가하여 용액중 6 mM POPC 및 8 mM 콜레이트의 최종 농도를 수득하였다. 상기 농도는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체 분자 당 POPC 60 분자의 비(60:1)에 상응한다. 계속해서 세제를 정용여과에 의해 제거하였다. 생성된 단백질-지질 복합체의 분석은 SEC-MALLS에 의해 수행하였다. 상기 방법을 이용하여, 생성된 종의 약 60%가 3개보다 많은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 단량체로 이루어진 불균질 생성물이 생성되었다.
예시적인 두 번째 방법에서는, pH 8.0에서 6.7 M 구아니디늄 하이드로클로라이드, 50 mM 트리스, 10 mM 메티오닌 중의 변성 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 지질화 완충액 중에 1:10(v/v)으로 희석시켜 2.5 mg/㎖의 단백질 농도를 수득하였다. 지질화 완충액은 60:1의 지질 대 단백질 비에 상응하는 6 mM 콜레이트 및 4.5 mM POPC로 이루어졌다. 상기 방법을 이용하여, 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 분자 당 60개 분자의 지질이 결합된, 90% 이상의 단일 생성 종을 포함하는 균질 생성물이 생성되었다(도 22 참조).
[표 28]
단백질 접합체 분석 요약
Figure pct00031
실시예 7
콜레이트 - 및 쯔비터젠트 - 가용화 POPC / DPPC 에 의한 인슐린-F의 지질화
지질 입자 제조를 위해 선택된 단백질은 상업적으로 시판하는 인슐린(휴마로그(Humalog, 등록상표), 인슐린 리스프로(Insulin Lispro), 릴리(Lilly))이다. 상기 단백질의 분자량은 5808 Da이다. 지질 입자중 인슐린에 대한 검출 한계를 증가시키기 위해, 단백질을 NHS-플루오레세인(6-[플루오레세인-5(6)-카복스아미도] 헥사노산 N-하이드록시숙신이미드 에스터, 시그마 앨드리치 #46940-5MG-F)으로 표지화시켰다.
NHS-플루오레세인-표지된 인슐린(인슐린-F)의 쯔비터젠트- 및 콜레이트-매개 지질화는 POPC 및 DPPC의 1:1 혼합물을 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 수행하였다. 0.5 mM 지질 혼합물을 PBS(pH 7.4) 중의 1 x CMC 콜레이트, 2 x CMC 쯔비터젠트 3-8 또는 5 x CMC 쯔비터젠트 3-10에 용해시켰다. 지질의 가용화는 45 ℃에서 초음파 욕(ultrasonic bath)에서 1 시간동안 달성하였다. 인슐린-F를 가용화된 지질에 1:2(쯔비터젠트 3-8) 또는 1:1.2(쯔비터젠트 3-10 및 콜레이트)의 단백질:지질 몰 비로 가하였다. 지질화 혼합물을 실온에서 1 시간동안 배양한 후 PBS(pH 7.4)에 대한 광범위 투석에 의해 세제를 제거하였다.
생성된 지질 입자 및 대조군 샘플을 형광 검출(494 nm 여기, 521 nm 발광) 및 UV280 흡수를 이용하여 SE-HPLC 상에서 분석하였다. 지질화 접근 방법 당 3개의 상이한 샘플들을 SE-HPLC 상에서 분석하였다: PBS에 용해된 인슐린-F, PBS중의 인슐린 F를 함유하지 않는 리포솜, 및 인슐린-F를 포함하는 지질 입자. 비-지질화 인슐린-F는 약 40 분의 용출 시간에 컬럼으로부터 용출되며, 피크는 형광 및 UV280 검출로 검출하였다. 지질화 인슐린-F 샘플은 형광 및 UV280으로 검출된 2개의 별도의 피크로서 컬럼으로부터 용출되었다. 후기 피크(약 40 분에서 최대 피크)는 인슐린-F 대조군 샘플과 함께 동시-이동한다. 15 분 용출 시간에서의 초기 피크는 순수한 인슐린-F보다 높은 분자량을 가지며, 지질화 인슐린-F로 이루어진다. 단백질 비함유 지질 입자는 15 분의 용출 시간에 용출되었다.
실시예 8
아포지단백질의 적용
(a) LACT 활성에 대한 DPPC 및 POPC 의 영향
팔미토일 올레오일 포스파티딜콜린(POPC) 또는 다이팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 및 재조합 야생형 아포지단백질 A-I 또는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자를 LCAT에 의한 콜레스테롤 에스터화를 보조하는 그의 능력에 대해 시험하였다.
삼중수소화 콜레스테롤(4%; 몰 기준으로 포스파티딜콜린 함량에 대해)을 에탄올성 콜레스테롤 용액의 첨가에 의해 지질 입자에 혼입시켰다. 생성된 단백질-지질 복합체의 LCAT 촉진된 콜레스테롤 에스터화를 보조하는 능력을 37 ℃에서 125 ㎕(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaN3; pH 7.4; 2 mg/㎖ HuFAF 알부민; 4 mM 베타 머캅토-에탄올) 중 0.2 ㎍/㎖ 재조합 LCAT 효소(ROAR 바이오케미칼)의 존재하에 1 시간동안 시험하였다. 클로로폼:메탄올(2:1)을 첨가하여 반응을 중단시키고, 지질을 추출하였다. 에스터화 "퍼센트"는 TLC에 의한 콜레스테롤-콜레스테릴 에스터 분리 및 섬광 계수 후에 산출하였다. 20% 미만의 추적자가 생성 에스터에 혼입되었기 때문에, 반응 속도는 실험 조건하에서 일정한 것으로 간주할 수 있다. 데이터를 XL적합 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 마이클리스 멘텐(Michaelis Menten) 식에 적합화시켰다. 결과의 가시화에 대해서는 도 3을 참조하시오.
(b) LCAT 활성에 대한 DPPC / POPC 혼합물의 영향
세제로 콜레이트를 사용하여, 재조합 야생형 아포지단백질 A-I을 3H 콜레스테롤, DPPC/POPC 혼합물 및 콜레이트와 1:4:80:113 몰 비로 혼합시켜 지질 입자를 제조하였다. DPPC/POPC 혼합물은 100% POPC; 75% POPC; 50% POPC; 25% POPC를 함유하였다.
투석에 의해 콜레이트를 제거한 후, 생성된 단백질-지질 복합체의 LACT 촉진된 콜레스테롤 에스터화를 보조하는 능력을 시험하였다. 3H 콜레스테롤(4%; 몰 기준으로 포스파티딜콜린 함량에 대해)을 에탄올성 콜레스테롤 용액의 첨가에 의해 지질 입자에 혼입시켰다. 생성된 단백질-지질 복합체의 LCAT 촉진된 콜레스테롤 에스터화를 보조하는 능력을 37 ℃에서 125 ㎕(10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaN3; pH 7.4; 2 mg/㎖ HuFAF 알부민; 4 mM 베타 머캅토에탄올) 중 0.2 ㎍/㎖ 재조합 LCAT 효소(ROAR 바이오케미칼)의 존재하에 1 시간동안 시험하였다. 클로로폼:메탄올(2:1)을 첨가하여 반응을 중단시키고, 지질을 추출하였다. 에스터화 "퍼센트"는 TLC에 의한 콜레스테롤-콜레스테릴 에스터 분리 및 섬광 계수 후에 산출하였다. 20% 미만의 추적자가 생성 에스터에 혼입되었기 때문에, 반응 속도는 실험 조건하에서 일정한 것으로 간주할 수 있다. 데이터를 XL적합 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 마이클리스 멘텐 식에 적합화시키고, 도 4에 나타내었다.
[표 3a]
겉보기 동력학적 파라미터
Figure pct00032
(c) THP -1 유도된 포말 세포에 대한 콜레스테롤 유출
THP-1 단핵구성 백혈병 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트에 노출시켜 대식세포 유사 인간 THP-1 세포를 수득하였다. 이어서, 3H 콜레스테롤 추적자를 함유하는 아세틸화 LDL의 존재하에 더 배양시켜 세포를 부하시켰다. 그 다음, 상기 모델 포말 세포를 4 내지 8 시간동안 콜레스테롤 수용체 시험 화합물(하기 참조)에 노출시켰다.
세포 배양 상등액을 수거하고, 세포를 5% NP40 중에서 용해시켰다. 분획성 유출은 세포 및 상등액중 방사능의 합계에 대한 상등액중 콜레스테롤 방사능의 비로서 산출하였다. 수용체를 함유하지 않는 배지에 노출된 세포로부터의 유출을 차감하고, 선형 적합에 의해 유출 속도를 산출하였다. 유출 속도는 기준물로서 10 ㎍/㎖ 야생형 아포지단백질 A-I에 대한 세포로부터의 유출을 이용하여 표준화시켰다(상대 유출 속도). 2개의 별도의 실험에서 수득된 상대 유출 속도를 콜레스테롤 수용체 농도의 함수 및 마이클리스 멘텐 식에 적합화된 데이터로서 플로팅하였다.
ABCA-1 수송체를 상향조절시키고 콜레스테롤 수송을 ABCA-1 매개 유출쪽으로 편향시키는 것으로 알려진 RXR-LXR 작용물질에 노출된 세포를 이용하여 병행 실험을 수행하였다.
시험한 시리즈에서는 지질 혼합물의 중간 정도의 영향만이 관찰되었다(도 5 및 표 29).
[표 29]
상이한 샘플들
Figure pct00033
포말 세포의 RXR-LXR 전처리는 비-처리 세포에 비해 최대 속도의 6배 증가하에 비-지질화 물질에 대한 유출을 매우 증가시켰다. 지질 입자에 대한 영향은, 2배 증가하에, 훨씬 적어서, 콜레스테롤 유출에 대한 ABCA-1 수송체의 보다 적은 기여를 반영한다(도 6).
(d) 생체내 연구
5개의 지질 입자 변이체를 연구하였다:
(i) POPC 단독
(ii) DPPC 단독
(iii) POPC:DPPC 3:1
(iv) POPC:DPPC 1:1
(v) DPPC:SM 9:1
0.5 시간동안 토끼에게 80 mg/kg을 주사한 후(n = 3 마리 토끼/시험 화합물) 주사후 96 시간동안 연속 채혈하였다.
ELISA에 의한 아포지단백질 수준의 분석:
- 약물 수준
- 간 효소, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터의 혈장 값에 대한 데이터.
혈장 농도는 약간의 분명한 초기 "분포" 단계 후 농도의 로그-선형 경사를 나타내는 모든 시험한 조성물에 대해 매우 유사하였다(도 7, 표 3b).
[표 3b]
약동학적 데이터
Figure pct00034
측정된 약동학적(PK) 파라미터는 모든 시험한 화합물에 대해 유사하였다. 또한, 낮은 개인간 변이성을 나타내었다. 측정된 반감기는 1.5 일에 가까웠다, 즉, 야생형 아포지단백질 A-I에 비해 증가하였다. 분포 부피는 혈장 부피(토끼에서 약 40 ㎖/kg)에 유사하다.
(f) 콜레스테롤 유동화
콜레스테롤은 혈장에서 유동화되고 에스터화된다. 혈장 콜레스테릴 에스터 수준은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I이 이미 감소하는 후에도 계속 증가하였다. 혈장 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 수준이 0.5 mg/㎖(정상 야생형 아포지단백질 A-I의 약 50%)로 감소되었을 때, 증가된 콜레스테롤 에스터 수준을 여전히 검출할 수 있다(도 8).
(g) 간 효소 방출
POPC를 함유하는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 포함하는 지질 입자는 간 효소 방출을 유도하지 않는다(도 1). 토끼와 유사하게, POPC 또는 POPC/DPPC 혼합물을 함유하는 본 발명에 따른 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 단일 정맥내 주사는 마우스에서도 안전하다. 1:3 몰 비의 DPPC:POPC를 함유하는 아포지단백질 조성은 POPC 단독에 필적하였다(도 9).
5개 제제 어느 것에서도 주사후 2 시간까지 의미있는 용혈이 관찰되지 않았다. 용혈은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I의 정맥내 적용후 2 시간째에 수득된 혈장 샘플에서 적색으로서 광도계에 의해 측정되었다. 전혈의 100% 용혈(0.44% 트리톤 X-100-최종 농도에 의해 발생)을 보정에 이용하였다(도 10).
(h) 인간 제정맥 내피 세포에 대한 테트라넥틴 - 아포지단백질 A-I의 소염 효과
계대 5 내지 10 HUVEC(인간 제정맥 내피 세포)를 각각의 테트라넥틴-아포지단백질 A-I 제제 중에서 16 시간동안 배양하고 마지막 4 시간동안 TNFα로 자극하였다. VCAM1 표면 발현을 FACS에 의해 특이 항체를 사용하여 검출하였다.
실시예 9
지질 입자 안정성
N-말단 히스티딘-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 함유하는 야생형 아포지단백질 A-I을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 에스케리치아 콜라이에서 발현시키고 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 히스티딘-태그를 IgA 프로테아제 절단에 의해 제거하였다. 1:150 비의 단백질 대 리포이드(Lipoid) S100 대두 인지질 혼합물을 사용하여 지질 입자(HDL 입자)를 구성하였다. 상기 입자를 7.3의 pH 값에서 5 mM 인산나트륨 및 1% 슈크로스를 함유하는 완충액에 저장하였다. SE-HPLC는 지질화 후 배양시 및 10 일간 배양시 3개의 뚜렷한 피크를 나타내었다. 40 ℃에서 배양한 후, 체류 시간 10.8 분에서 뚜렷한 피크가 검출될 수 있으며(전체 단백질의 47%), 상기 피크는 5 ℃에서 저장한 샘플에서는 부재한다. 10.8 분의 피크는 단백질 불안정화로 인한 가용성 고분자량 조립체의 생성을 나타낸다.
POPC:DPPC 혼합물(3:1의 POPC 대 DPPC 비)로부터 출발하여 수득된, 본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I을 함유하는 HDL 입자도 또한 5 ℃ 및 40 ℃에서 배양하였다. 승온에서의 배양은 약한 정도의 프리피크 형성을 유도하나, 10.8 분에서의 고분자량 조립체로의 의미있는 이동은 유도하지 않는다(11 분에서 2% 미만의 증가). 이것은 야생형 아포지단백질 A-I을 함유하는 입자에 비해 개선된 HDL 입자 안정성을 시사한다.
실시예 10
콜레스테롤 유동화
콜레스테롤이 혈액내로 유동화되는 효율은 총 콜레스테롤의 각각의 편위를 생체내 아포지단백질 투여후 아포지단백질 농도와 비교함으로써 측정할 수 있다. 정량적 평가를 위해, 총 콜레스테롤의 농도-시간 곡선하 기준선 보정 면적(AUC)과 아포지단백질의 농도-시간 곡선하 면적의 비율을 산출하였다.
상기 실험에서 하기의 물질들을 분석하였다:
- 상기 실시예에서 기재된 바와 같이 에스케리치아 콜라이에서 발현되고 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된, N-말단 히스티딘-태그 및 IgA 프로테아제 절단 부위를 함유하는 야생형 아포지단백질 A-I; 상기 히스티딘-태그는 IgA 프로테아제 절단에 의해 제거하였으며; 지질 입자(HDL 입자)는 1:150 비의 단백질 대 리포이드 S100 대두 인지질 혼합물을 사용하여 조립하였다,
- 아포지단백질 A-I 밀라노 변이체; 지질 입자(HDL 입자)는 1:40 비의 단백질 대 POPC를 사용하여 조립하였다,
- 본원에 기재된 바와 같은 테트라넥틴-아포지단백질 A-I; 지질 입자(HDL 입자)는 1:60 비의 단백질 대 POPC 및 DPPC(3:1 비의 POPC 및 DPPC)를 사용하여 조립하였다.
3 개의 HDL 입자를 래트에 적용하였다. 각각의 AUC 비에 대해 수득된 값들을 표 30에 나타내었다.
[표 30]
콜레스테롤 유동화
Figure pct00035
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for producing a tetranectin-apolipoprotein A-I lipid particle, the lipid particle itself and its use <130> 26972 <140> PCT/EP2011/064600 <141> 2011-08-25 <150> EP10008995.2 <151> 2010-08-30 <160> 105 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (1) <400> 1 Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I (2) <400> 2 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 35 40 45 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 50 55 60 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 65 70 75 80 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 85 90 95 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 100 105 110 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 115 120 125 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 130 135 140 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 145 150 155 160 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 165 170 175 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 180 185 190 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 195 200 205 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 210 215 220 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 225 230 235 240 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 245 250 255 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 260 265 270 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Lys Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein A-I mimetic (1) <400> 4 Pro Val Leu Asp Glu Phe Arg Glu Lys Leu Asn Glu Glu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apolipoprotein A-I mimetic (2) <400> 5 Pro Val Leu Asp Leu Phe Arg Glu Leu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Lys Gln Lys Leu Lys 20 <210> 6 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 7 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Lys Leu Leu Ala Ala Thr Val Leu Leu Leu Thr Ile Cys Ser Leu 1 5 10 15 Glu Gly Ala Leu Val Arg Arg Gln Ala Lys Glu Pro Cys Val Glu Ser 20 25 30 Leu Val Ser Gln Tyr Phe Gln Thr Val Thr Asp Tyr Gly Lys Asp Leu 35 40 45 Met Glu Lys Val Lys Ser Pro Glu Leu Gln Ala Glu Ala Lys Ser Tyr 50 55 60 Phe Glu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Thr Pro Leu Ile Lys Lys Ala Gly 65 70 75 80 Thr Glu Leu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Phe Val Glu Leu Gly Thr Gln 85 90 95 Pro Ala Thr Gln 100 <210> 8 <211> 396 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Leu Ala Leu Val Ala Val Ala 1 5 10 15 Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Ala Asp Gln Val Ala Thr Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Ser Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu His 35 40 45 Leu Gln Lys Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Asn Ala Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Glu Val Asn Thr Tyr Ala Gly Asp Leu Gln Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Thr Glu Leu His Glu Arg Leu Ala Lys Asp Ser Glu 85 90 95 Lys Leu Lys Glu Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Arg 100 105 110 Leu Leu Pro His Ala Asn Glu Val Ser Gln Lys Ile Gly Asp Asn Leu 115 120 125 Arg Glu Leu Gln Gln Arg Leu Glu Pro Tyr Ala Asp Gln Leu Arg Thr 130 135 140 Gln Val Asn Thr Gln Ala Glu Gln Leu Arg Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ala Gln Arg Met Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn Ala Asp Ser Leu Gln 165 170 175 Ala Ser Leu Arg Pro His Ala Asp Glu Leu Lys Ala Lys Ile Asp Gln 180 185 190 Asn Val Glu Glu Leu Lys Gly Arg Leu Thr Pro Tyr Ala Asp Glu Phe 195 200 205 Lys Val Lys Ile Asp Gln Thr Val Glu Glu Leu Arg Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Thr Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Thr Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile 245 250 255 Ser Ala Ser Ala Glu Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Pro Leu Ala Glu 260 265 270 Asp Val Arg Gly Asn Leu Arg Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Ala Glu Leu Gly Gly His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Arg Arg Val Glu Pro Tyr Gly Glu Asn Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Gln Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro His Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Ser Phe Phe Ser Thr Phe Lys Glu Lys Glu Ser Gln Asp Lys Thr Leu 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Leu Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln Gln Glu Gln Gln 370 375 380 Gln Glu Gln Val Gln Met Leu Ala Pro Leu Glu Ser 385 390 395 <210> 9 <211> 366 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Ser Met Ala Ala Val Leu Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ala Phe Ser Ala Thr Gln Ala Arg Lys Gly Phe Trp Asp Tyr Phe Ser 20 25 30 Gln Thr Ser Gly Asp Lys Gly Arg Val Glu Gln Ile His Gln Gln Lys 35 40 45 Met Ala Arg Glu Pro Ala Thr Leu Lys Asp Ser Leu Glu Gln Asp Leu 50 55 60 Asn Asn Met Asn Lys Phe Leu Glu Lys Leu Arg Pro Leu Ser Gly Ser 65 70 75 80 Glu Ala Pro Arg Leu Pro Gln Asp Pro Val Gly Met Arg Arg Gln Leu 85 90 95 Gln Glu Glu Leu Glu Glu Val Lys Ala Arg Leu Gln Pro Tyr Met Ala 100 105 110 Glu Ala His Glu Leu Val Gly Trp Asn Leu Glu Gly Leu Arg Gln Gln 115 120 125 Leu Lys Pro Tyr Thr Met Asp Leu Met Glu Gln Val Ala Leu Arg Val 130 135 140 Gln Glu Leu Gln Glu Gln Leu Arg Val Val Gly Glu Asp Thr Lys Ala 145 150 155 160 Gln Leu Leu Gly Gly Val Asp Glu Ala Trp Ala Leu Leu Gln Gly Leu 165 170 175 Gln Ser Arg Val Val His His Thr Gly Arg Phe Lys Glu Leu Phe His 180 185 190 Pro Tyr Ala Glu Ser Leu Val Ser Gly Ile Gly Arg His Val Gln Glu 195 200 205 Leu His Arg Ser Val Ala Pro His Ala Pro Ala Ser Pro Ala Arg Leu 210 215 220 Ser Arg Cys Val Gln Val Leu Ser Arg Lys Leu Thr Leu Lys Ala Lys 225 230 235 240 Ala Leu His Ala Arg Ile Gln Gln Asn Leu Asp Gln Leu Arg Glu Glu 245 250 255 Leu Ser Arg Ala Phe Ala Gly Thr Gly Thr Glu Glu Gly Ala Gly Pro 260 265 270 Asp Pro Gln Met Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe 275 280 285 Arg Gln Asp Thr Tyr Leu Gln Ile Ala Ala Phe Thr Arg Ala Ile Asp 290 295 300 Gln Glu Thr Glu Glu Val Gln Gln Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Gly 305 310 315 320 His Ser Ala Phe Ala Pro Glu Phe Gln Gln Thr Asp Ser Gly Lys Val 325 330 335 Leu Ser Lys Leu Gln Ala Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Thr 340 345 350 His Ser Leu His Asp Gln Gly His Ser His Leu Gly Asp Pro 355 360 365 <210> 10 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Arg Leu Phe Leu Ser Leu Pro Val Leu Val Val Val Leu Ser Ile 1 5 10 15 Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Ala Gln Gly Thr Pro Asp Val Ser Ser 20 25 30 Ala Leu Asp Lys Leu Lys Glu Phe Gly Asn Thr Leu Glu Asp Lys Ala 35 40 45 Arg Glu Leu Ile Ser Arg Ile Lys Gln Ser Glu Leu Ser Ala Lys Met 50 55 60 Arg Glu Trp Phe Ser Glu Thr Phe Gln Lys Val Lys Glu Lys Leu Lys 65 70 75 80 Ile Asp Ser <210> 11 <211> 101 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Thr Arg Leu Leu Pro Ala Leu Phe Leu Val Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Gly Phe Glu Val Gln Gly Thr Gln Gln Pro Gln Gln Asp Glu Met Pro 20 25 30 Ser Pro Thr Phe Leu Thr Gln Val Lys Glu Ser Leu Ser Ser Tyr Trp 35 40 45 Glu Ser Ala Lys Thr Ala Ala Gln Asn Leu Tyr Glu Lys Thr Tyr Leu 50 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Arg Ser Leu Ala 210 215 220 Pro Tyr Ala Gln Asp Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Leu Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Gln Ala Glu Glu Leu Lys Ala Lys Ile 245 250 255 Ser Ala Asn Ala Asp Glu Leu Arg Gln Lys Leu Val Pro Val Ala Glu 260 265 270 Asn Val His Gly His Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Leu Glu Leu Arg Ser His Leu Asp Gln Gln Val Glu Glu Phe Arg 290 295 300 Leu Lys Val Glu Pro Tyr Gly Glu Thr Phe Asn Lys Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Val Glu Asp Leu Arg Gln Lys Leu Gly Pro Leu Ala Gly Asp Val 325 330 335 Glu Gly His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asp Leu Arg Asp Lys Val Asn 340 345 350 Thr Phe Phe Ser Thr Leu Lys Glu Glu Ala Ser Gln Gly Gln Ser Gln 355 360 365 Ala Leu Pro Ala Gln Glu Lys Ala Gln Ala Pro Leu Glu Gly 370 375 380 <210> 52 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Met Phe Leu Lys Ala Val Val Leu Thr Val Ala Leu Val Ala Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Gln Ala Glu Val Thr Ser Asp Gln Val Ala Asn Val Met Trp 20 25 30 Asp Tyr Phe Thr Gln Leu Ser Asn Asn Ala Lys Glu Ala Val Glu Gln 35 40 45 Leu Gln Lys Thr Asp Val Thr Gln Gln Leu Asn Thr Leu Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Leu Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Ala Asp Asp Leu Gln Asn Lys Leu 65 70 75 80 Val Pro Phe Ala Val Gln Leu Ser Gly His Leu Thr Lys Glu Thr Glu 85 90 95 Arg Val Arg Glu Glu Ile Gln Lys Glu Leu Glu Asp Leu Arg Ala Asn 100 105 110 Met Met Pro His Ala Asn Lys Val Ser Gln Met Phe Gly Asp Asn Val 115 120 125 Gln Lys Leu Gln Glu His Leu Arg Pro Tyr Ala Thr Asp Leu Gln Ala 130 135 140 Gln Ile Asn Ala Gln Thr Gln Asp Met Lys Arg Gln Leu Thr Pro Tyr 145 150 155 160 Ile Gln Arg Met Gln Thr Thr Ile Gln Asp Asn Val Glu Asn Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Met Val Pro Phe Ala Asn Glu Leu Lys Glu Lys Phe Asn Gln 180 185 190 Asn Met Glu Gly Leu Lys Gly Gln Leu Thr Pro Arg Ala Asn Glu Leu 195 200 205 Lys Ala Thr Ile Asp Gln Asn Leu Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Ala 210 215 220 Pro Leu Ala Glu Gly Val Gln Glu Lys Leu Asn His Gln Met Glu Gly 225 230 235 240 Leu Ala Phe Gln Met Lys Lys Asn Ala Glu Glu Leu Gln Thr Lys Val 245 250 255 Ser Thr Asn Ile Asp Gln Leu Gln Lys Asn Leu Ala Pro Leu Val Glu 260 265 270 Asp Val Gln Ser Lys Leu Lys Gly Asn Thr Glu Gly Leu Gln Lys Ser 275 280 285 Leu Glu Asp Leu Asn Lys Gln Leu Asp Gln Gln Val Glu Val Phe Arg 290 295 300 Arg Ala Val Glu Pro Leu Gly Asp Lys Phe Asn Met Ala Leu Val Gln 305 310 315 320 Gln Met Glu Lys Phe Arg Gln Gln Leu Gly Ser Asp Ser Gly Asp Val 325 330 335 Glu Ser His Leu Ser Phe Leu Glu Lys Asn Leu Arg Glu Lys Val Ser 340 345 350 Ser Phe Met Ser Thr Leu Gln Lys Lys Gly Ser Pro Asp Gln Pro Leu 355 360 365 Ala Leu Pro Leu Pro Glu Gln Val Gln Glu Gln Val Gln Glu Gln Val 370 375 380 Gln Pro Lys Pro Leu Glu Ser 385 390 <210> 53 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <302> Trimerising module <310> WO 98/56906 <311> 1998-06-11 <312> 1998-12-17 <313> (1)..(51) <400> 53 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu 50 <210> 54 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu 1 5 10 15 Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 <210> 55 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu 1 5 <210> 56 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexahistidine tag <400> 56 His His His His His His 1 5 <210> 57 <211> 310 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein <400> 57 Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Ala Pro Ile Val Asn Ala Lys 20 25 30 Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu 35 40 45 Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu 50 55 60 Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp 65 70 75 80 Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr 85 90 95 Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys 100 105 110 Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg 115 120 125 Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys 130 135 140 Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val 145 150 155 160 Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln 165 170 175 Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu 180 185 190 Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp 210 215 220 Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg 225 230 235 240 Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu 245 250 255 Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu 260 265 270 Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val 275 280 285 Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr 290 295 300 Lys Lys Leu Asn Thr Gln 305 310 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N1 <400> 58 aaaaaagcgg ccgcgacaat tcgcgcgcga aggcg 35 <210> 59 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer N2 <400> 59 aaaaaagcgg ccgctcactg cccgctttcc agtcgg 36 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 60 Val Val Ala Pro Pro Ala Pro 1 5 <210> 61 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 61 Pro Ala Pro Ser Pro 1 5 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 62 Pro Pro Ser Pro 1 <210> 63 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 63 Pro Pro Ala Pro 1 <210> 64 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 64 Pro Pro Thr Pro 1 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA protease cleavage site <400> 65 Pro Pro Gly Pro 1 <210> 66 <211> 285 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I <220> <221> MISC_FEATURE <223> X = A or G or S or T <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 66 Xaa Pro Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu 20 25 30 Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val Asp Glu Pro Pro Gln Ser 35 40 45 Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu 50 55 60 Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu 65 70 75 80 Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr 85 90 95 Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu 100 105 110 Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met 115 120 125 Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys 145 150 155 160 Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu 165 170 175 His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp 180 185 190 Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr 195 200 205 Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys 210 215 220 Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu 225 230 235 240 His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu 245 250 255 Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu 260 265 270 Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 275 280 285 <210> 67 <211> 291 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tetranectin-apolipoprotein A-I with N-terminal His-tag <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of AP, GP, SP, PP, GSAP, GSGP, GSSP, GSPP, GGGS, GGGGS, GGGSGGGS, GGGGSGGGGS, GGGSGGGSGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, GGGSAP, GGGSGP, GGGSSP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGSPP, GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGSGGGSAP, GGGSGGGSGP, GGGSGGGSSP, GGGSGGGSPP, GGGSGGGSGGGSAP, GGGSGGGSGGGSGP, GGGSGGGSGGGSSP, GGGSGGGSGGGSPP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = any one of GGGGSAP, GGGGSGP, GGGGSSP, GGGGSPP, GGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSSP, GGGGSGGGGSPP, GGGGSGGGGSGGGGSAP, GGGGSGGGGSGGGGSGP, GGGGSGGGGSGGGGSSP, and GGGGSGGGGSGGGGSPP. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 67 Met His His His His His His Xaa Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp Val 1 5 10 15 Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr Leu 20 25 30 Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr Val 35 40 45 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 50 55 60 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 65 70 75 80 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 85 90 95 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 100 105 110 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 115 120 125 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 130 135 140 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 145 150 155 160 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 165 170 175 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 180 185 190 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 195 200 205 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala 210 215 220 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 225 230 235 240 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 245 250 255 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 260 265 270 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 275 280 285 Asn Thr Gln 290 <210> 68 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 68 Gly Ser Ala Pro 1 <210> 69 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 2 <400> 69 Gly Ser Gly Pro 1 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 3 <400> 70 Gly Ser Ser Pro 1 <210> 71 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 4 <400> 71 Gly Ser Pro Pro 1 <210> 72 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 5 <400> 72 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 6 <400> 73 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 7 <400> 74 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 8 <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 9 <400> 76 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 10 <400> 77 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 78 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 11 <400> 78 Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 79 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 12 <400> 79 Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 13 <400> 80 Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 81 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 14 <400> 81 Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 15 <400> 82 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 16 <400> 83 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 17 <400> 84 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 18 <400> 85 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 86 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 19 <400> 86 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 20 <400> 87 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 21 <400> 88 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 89 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 22 <400> 89 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 90 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 23 <400> 90 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 24 <400> 91 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 92 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 25 <400> 92 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 26 <400> 93 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 27 <400> 94 Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 28 <400> 95 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 29 <400> 96 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 30 <400> 97 Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 31 <400> 98 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro 1 5 10 <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 32 <400> 99 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 33 <400> 100 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Pro 1 5 10 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 34 <400> 101 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 35 <400> 102 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala 1 5 10 15 Pro <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 36 <400> 103 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Pro <210> 104 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 37 <400> 104 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 1 5 10 15 Pro <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 38 <400> 105 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro 1 5 10 15 Pro

Claims (15)

  1. (i) 변성 단백질을 포함하는 제 1 용액을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제 1 용액을 하나 이상의 지질 및 세제를 포함하지만 단백질은 포함하지 않는 제 2 용액에 첨가하는 단계; 및
    (iii) 세제를 단계 (ii)에서 수득된 용액으로부터 제거함으로써 지질 입자를 제조하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 입자의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 2 용액이 제 1 용액의 약 3 내지 20 배의 부피를 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 용액이 지질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단백질이 서열번호 1, 2, 4 내지 52, 66 또는 67의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나, 서열번호 1, 2, 4 내지 52, 66 또는 67의 아미노산 서열의 80% 이상을 포함하는 하나 이상의 연속 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    단백질이 서열번호 1, 2, 66 또는 67의 아미노산 서열을 갖는 테트라넥틴-아포지단백질 A-I인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 지질이 2개의 상이한 포스파티딜콜린인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    첫 번째 포스파티딜콜린이 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(POPC)이고, 두 번째 포스파티딜콜린이 1,2-다이-팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린(DPPC)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세제가 콜산, 쯔비터젠트(Zwittergent) 및 이들의 염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (ii) 이후 및 단계 (iii) 이전에,
    (iia) 단계 (ii)에서 수득된 용액을 배양하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양 및/또는 제거가 4 내지 45 ℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    배양이 약 2 내지 약 60 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세제가 고 임계 미셀 농도(CMC)를 갖는 세제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제거가 정용여과, 투석 또는 흡착에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 지질 입자.
  15. 제 14 항에 따른 지질 입자를 포함하는 약학 조성물.
KR1020137005032A 2010-08-30 2011-08-25 테트라넥틴-아포지단백질 a-i 지질 입자의 제조 방법, 지질 입자 및 이의 용도 KR20130047749A (ko)

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