CS272790A2 - Peptides with biological effect - Google Patents

Description

Oblast techniky Z i ·'

Vynález se týkáceutických prostředků

X peptidů s biologickým účinkem as jejich obsahem farma-

Dosavadní stav techniky . Řada polypeptidových hormonů, například růstový hor-mon mají svůj význam v lékařství nebo při chovu hospodář-ských zvířat. Růstové hormony se tvoří u všech obratlovcůa je známo, že podporují růst (somatogenese) a podporujítvorbu mléka (laktogenese ) <. Řízení tvorby a uvolňování růstového hormonu (GH) jezávislé na dalších hormonech nebo "faktorech", které mohouzpůsobit zvýšení nebo snížení množství růstového hormonu uobratlovců. Uvolňování růstového hormonu je odpovědí na ú-činek peptidu, který toto uvolňování působí, tj. tak zvaného faktoru, uvolňujícího růstový hormon (GRF), hormonu, u-volňujícího růstový hormon (GHRH) nebo somatocrininu.

Dvě původní zprávy ze Salk Institute popisovaly pep-tid, uvolňující růstový hormon, s obsahem 44 aminokyselinz lidského pankreatického nádoru (hp) ( Rivier a další,Nátuře, London 300, 276-278, 1982 aGuillemin a další,Science, 218, 585-587, 1982). Tato látka specificky uvol- v nuje růstový hormon ve fysiologických dávkách a bylo pro-kázáno, že je totožná s hormonem, uvolňujícím za normálníchpodmínek růstový hormon a tvořeným v hypothalamu, s účin-kem na pituitární somatotropiny, Rovnováha mezi somatosta-tinem ( faktorem, inhibujícím somatotropin) a GRF je patr-ně základní podmínkou učinku na hypyfyzu, určujícím charak-teristiku uvolňování GH u savců,, 2

Byly popsány řetězce aminokyselin GRF z celé řady ži-vočišných druhů ( Felix a další, Annual Reports of Medici-nal Chemistry 20, 185^192, 1985). Jde o peptidy s obsahem 44aminokyselin, nejkonstantnější část tohoto řetězce je v roz-sahu zbytků aminokyselin 1 až 27, k největšímu počtu varia-cí dochází v rozmezí zbtyků 31-44. Existuje velká zkříženáúčinnost celého řetězce, například hpGRF-44 vyvolává dobrouodpověď u koz, jak bylo popsáno v publikaci Hart a další,Journal of Endocrinology 103, 173-178, 1984. Mimoto je u-činnost molekuly závislá převážně na aminokyselinách v ob-lasti 1 až 27 a řada analogů této oblasti vykazuje zvýšenouúčinnost v modelových pokusech na různých živočišných dru-zích ( Laňce a další, Biochemical and Biophysical ResearchCommunication 119 Cl), 265-272, 1984. Stejně jako v případěpoužití u člověka může podávání hpGRF u skotu zvýšit tvorbumléka ( Enright a další, Journal of Dairy Science 69, 344-351, 1986) a zvýšit retenci dusíku ( Moseley a další, Do-mestic Animal Endocrinology 4 (1), 51-59, 1987). vzhledem keevé účinnosti na uvolňování GH»

Specifické řetězce pro určité druhy (Felix 1985): 1-27 společný řetězec: YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIM 28-44 lidský GRF: SRQQGESNQERGARARL-NH2 vepř GRF: SRQQGERNQEQGAKVRL-NH2 koza GRF: nrqqgernqeqgakvrl-nh2 ovce GRF: nrqqgernqeqgakvrl-nh2 skot GRF: nrqqgfrnqeqgakvrl-nh9 (Je užito standardního označení aminokyselin jedním písme-nem - Příloha I) .

Bylo také již uvedeno, že účinnost hormonů může být ovlivněna protilátkani, které se proti nim vytvoří. Napři- podle EP 137 234 vedly protilátky proti růstovému hormonu,čištěné a podané zvířatům ke zvýšení účinnosti tohoto hor-monu. Tyto protilátky je rovněž možno vyvolat in šitu vak-cinací vhodnými fragmenty hormonu, jak bylo uvedeno v EP284 406 a 303 488.

Avšak Armstrong a další, Biotechnology in Growth Re-gulation, Ed. Heap R.B. , Prosser C.G and Lamming G.E, But-terworth a Co., Ltd., 1989 uvádějí, že imunizace proti celémolekule GRF má za následek ztrátu účinnosti tohoto hormo-nu. Mimoto Reynolds a další, Biotechnology in Growth Regu-lation, ed. Heap R.B., Prosser G.G. and Lamming G.E., But-terworth a Co., Ltd,,1989 prokazují, že imunizace protiurčitým fragmentům faktoru, uvolňujícího kortikotropin(CRF) omezuje jeho účinnost, jak bylo možno porkázat sní-ženou koncentrací tohoto hormonu v krvi.

Podstata vynálezu

Na rozdíl od svrchu uvedených zjištění bylo nyní ob-jeveno, že účinnost GRF je možno zvýšit u obratlovců tak,že se těmto obratlovcům podá určitý fragment GRF, který vy-volá tvorbu protilátek proti intaktnímu GRF. Tato poten-ciace GRF pravděpodobně bude stimulovat růst, složení kar-kasu, produkci mléka a další biologické účinky G1I u tohotoobratlovce. Je zřejmé, že pod pojmem "fragment" se vyluču-je použití celé molekuly GRF.

Podstatou vynálezu je tedy způsob potenciace (zvýše-ní nebo podpora) účinnosti faktoru, uvolňujícího růstovýhormon u obratlovce, při němž se obratlovci podá fragments primární strukturní homologií s oblastí v rozmezí 28 až44 aminokyselin v řetězci GRF (jde zejména o oblast v roz-mezí aminokyselin 31 až 44 řetězce GRF) nebo část tohotořetězce nebo antigenně nebo imunogenně ekvivalentní peptid 4 nebo molekula nebo sůl. Jak již bylo uvedeno, pod pojmem"potenciace" se rozumí, že uvedené fragmenty působí přímonebo nepřímo vzestup účinnosti hormonu»

Uvedené peptidy mohou být odvozeny od nativní bíl-koviny od bílkoviny, synthetizované chemicky nebo připra-vené.při použití rekombinantního genu v příslušném systémupro expresi při použití známých postupů. V hpGRF má oblast 31 až 44 následující řetězec:

Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu

Pod pojmem "primární strukturní homologie" se rozumípeptidy, které jsou přesným duplikátem odpovídajících ob-lastí molekul GRF z jiných druhů a další peptidy, které ob-sahují " konservativní substituce" pro jednu nebo větší po-čet aminokyselin tak, že protilátky, které se vytvoří připoužití tohoto peptidu mají v podstatě nezměněné vlast-nosti. Je tedy pojem " konservativní substituce" funkčnípojem. Příkladem substitucí, které mohou být v tomto smyslukonservativní zahrnují ty substituce, které jsou v podstatěstejným způsobem hydrofobní, mají stejný rozměr, jsou stej-ně aromatické a/nebo mají stejný náboj jako původní zbytkyaminokyselin. Všechny tyto sibstituce a modifikace jsou o-becně známé v chemii peptidů. Například je možno zaměnit vtomto smyslu následující aminokyseliny: místo prolinu jemožno užít glycin a obráceně, místo glycinu lze užít ala-nin nebo valin a obráceně, isoleucin je možno užít místo methioninu nebo leucinu a obráceně histidin lze užít místolysinu a obráceně, serin lze užít místo asparaginu a obrá-ceně, threonin je možno užít místo cysteinu a obráceně, se-rin lze užít místo threoninu stejně jako alanin a obráceněa glutamin je možno užít místo asparaginu a obráceně.

Pod pojmem " antigenně ekvivalentní" se rozumí pep-tid nebo jeho ekvivalent, který je specificky rozpoznáván 5 určitými protilátkami které, v případě že byly vytvořenyproti peptidům podle vynálezu nebo jejich částem způsobípotenciaci biologického učinku růstového hormonu, resp.faktoru, uvolňujícího růstový hormon u stejného nebo pří-buzného obratlovce.

Pod pojmem " imunogenně ekvivalentní" se rozumí, žepeptid je možno užít ve formě vhodného prostředku k vyvo-lání tvorby protilátek u obratlovce, přičemž tyto protilát-ky způsobí potenciaci učinku faktoru, uvolňujícího růstovýhormon u tohoto obratlovce.

Zvláště je možno užít antigenně nebo imunogenně ek-vivalentní peptidy, které jsou o něco kratší nebo delšínež je uvedená oblast nebo které tuto oblast v podstatěpřekrývájí.Odchylky od řetězce vlastního GRF živočicha mo-hou vyvolat větší imunologickou odpověď a přitom je tímtozpůsobem možno stále ještě získat protilátky, které budourozpoznávat autentický GRF tohoto živočicha nebo cílovýGRF ( například exogenně přivedený formou implantátu). Jetedy s výhodou možno aplikovat malý peptid podle vynálezuz odlišného druhu ( je například možno podat peptidy ovcevepřům) nebo je možno kombinovat v podaném peptidu takénepřírodní a nekonservativní aminokyseliny jako náhradu zaaminokyseliny původní.

Mimoto je možno užít peptidy, v nuchž je jeden nebovětší počet zbytků aminokyselin modifikován před nebo posyntéze peptidu za předpokladu, že fukce tohoto peptidu,zvláště produkce protilátek in vivo zůstane v podstatě za-chována.Tyto modifikace zahrnují tvorbu solí s kyselinaminebo bázemi, zejména s fysiologicky přijatelnými organický-mi nebo anorganickými kyselinami nebo bázemi za tvorby es-teru nebo amidu na terminální karboxylové skupině a navá-zání ochranných skupin na aminoskupiny, např. N-terc„buto- xykarbonylové skupiny. Tyto modifikace mohou chránit peptidpřed metabolisací in vivo. Peptidy mohou být přítomny jakojednotlivé nebo mnohočetné kopie, může například docházet ktandemovému opakování, jako (31-44)+(31-44) nebo k opaková-ní typu (31-44)+(44-31). Tento typ opakování může být sámo sobě dostatečně antigenně účinný, takže nemusí být nutnépoužít nosič. Může být také výhodné vytvořit peptid jako smyčku, jejíř N-terminální a C-terrainální zakončení jsou spolu spoje-na, nebo přidat jeden nebo větší počet cysteinových zbytkůna jedno ze zakončení ke zvýšení antigenity a/nebo k umož-nění tvorby disulfidových vazeb. V případě, že je peptid kovalentně vázán na nosič, s výhodou polypeptid, pak může býtuspořádání takové, že peptid podle vynálezu vytváří smyčku»Peptidy mohou být podrobeny amidaci na C-terminálním zakon-čení a na N-terminální zakončení je současně možno přidataminokyselinu, například cystein k usnadnění konjugace neboke zlepšení potenciální imunogenity.

Podstatou vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek > v s antigenním účinkem, který obsahuje alespoň jeden z uvede?ných peptidů a popřípadě nosič a pomocné látky.

Podle současných imunologických teorií by měl každýprostředek s imunógenníra účinkem obsahovat nosič ke stimu-laci nebo k usnadnění stimulace imunologického systému. No-siče pravděpodobně obsahují ( nebo společně s antigenem vy-tvářejí) pomocný epitop pto T-bunky. Peptidy mohou být spo-jeny, například zesítěním, s odděleným nosičem, napříkladsérovým albuminem, myoglobinem, bakteriálními toxoidy aklíčovým haemocyanincm.

Nosiče, vyvinuté v poslední době, které indukují po- mocný epitop pro T-buňky zahrnují antigen jádra viru hepa- titidy B ( také označovaný jako nukleokapsidová bílkovina), předpokládanými epitopy pro T-bunky jsou například řetězceThr-Ala-Ser-Gly-Va1-AIa-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys, β-galaktosi-dázy a peptid 163-171 z interleukinu-1. Na tuto poslednílátku je možno pohlížet jako na nosný peptid nebo na pomoc-nou látku nebo jako na obojí. Je také možno podřobit zesí-tění několik kopií stejných nebo nuzných peptidů podle vy-nálezu. V této situaci pak není k disposici izolovaný no-síc, avšak funkce nosiče se vytvoří zesítěním. Jako vhodnézesítující činidlo je možno použít činidla, uvedená v kata-logu Sigma and Pierce, například glutaraldehyd, karbodiimida sukcinimidyl-4-(N-maleimido methyl)cyklohexan-l-karboxylát,tato poslední látka využívá skupinu -SH na C-terminálnímcysteinovém zbytku ( v případě, že je obsažen).

Zesítění nebo konjugace při použití MBS (m-maleimid-benzoyl-N-hydroxysukcinimid) nebo glutaraldehydu se s výho-dou provádí na peptid, například na vlastní peptid, na epi-top pro T-bunky nebo na haemocyanin. V případě, že se peptid získává expresí příslušnéhořetězce nukleotidů ve vhodném hostiteli, pak může býtvhodné dosáhnout exprese peptidu ve formě složené bílkovi-ny s peptidem, který vytváří epitop pto T-buňky a má rovněžfunkci nosiče. Příkladem takového uspořádání může být sys-tém "Ecosec" (Kabigen). Ecosec je obchodní název.

Pro přidávání k vakcinám jsou známy také pomocné z z prostředky, naoríklad Freundův úplný nebo neúplný pomocnýprostředek, hydroxid hlinitý, saponin, DEAE-dextran, mura-myldipeptid, minerální oleje, neutrální oleje (napříkladmiglyol) rostlinné oleje ( například arašídový olej), pro-středky typu "Iscom", liposomy, Novasomy nebo podobné pro-středky, polyoly "Pluronic" nebo pomocné systémy typu Ribi.Například GB 2189141. Pluronic je obchodní název.

Peptidy podle vynálezu mohou být vázány na jiné anti? z geny, aby bylo dosaženo dvojího učinku. Je například možno r>ep tid vázat na část nebo na celou molekulu somatostatinu,čímž je možno získat kromě protilátek proti GRF také proti-látky proti somatostatinu nebo je možno peptid vázat načást molekuly nebo na celou molekulu sexuálního hormonu kdosažení současné imunokastrace, nebo je možno provést vaz-bu na část nebo na celou molekulu hormonu, který uvolňujeluteinizační hormon (LHRH) nebo současně také na část nebo z na celou molekulu růstového hormonu za účelem jeho poten-ciace nebo na jakýkoliv jiný peptidový hormon, který se u-častní růstu a modulace složení karkasu.

Peptidy a pomocné látky a/nebo nosiče je možno zpra-covat na prostředky jakýmkoliv vhodným způsobem, kterýje v oboru znám při použití známých nosných prostředí a po-stupů. Prostředky mohou být zejména založeny na biologickydegradovatelných polymerech, například laktidglykolidovýchkopolymerech, tak jak byly popsány například v EP-A-58481(ICI). Peptidy podle vynálezu ( at již jsou nebo nejsou vá-zány na jiné antigeny) je možno užít v kombinaci s dalšímiimunizačními postupy ( například proti virovým, bakteriál-ním beno parasitámím infekcím) jako látky, které podporu- z ji jejich účinek«,

Vynález rovněž poskytuje protilátky proti GRF, zamě-řené proti řetězcům GRF od oblasti, zahrnující 28-44 (jdezejména o protilátky proti GRF, taměřené proti fragmentuGRF 31-44 nebo 35-44) nebo antigenné nebo imunologicky ek-vivalentní peptidy nebo jejich soli. Tyto protilátky protiGRF mohou tvořit komplex s GRF nebo s fragmenty GRF.

Vynález také umožňuje postup, při němž.se působína zdravého nebo abnormálního obratlovce malým peptidemnebo antigenním prostředkem, popsaným svrchu nebo proti-látkou proti GRF (vhodné je také působení protilátkani pro-ti GRF ve formě komplexu s GRF nebo fragmentem GRF) za ú-čelem modifikace biologických vlastností tohoto obratlovce,, 9

Jde zejména o ty biologické účinky, které jsou spojeny s GH.Je nanříklad možno urychlit růst tohoto obratlovce nad běž-nou míru nebo nad běžnou rychlost růstu nebo je možno zpo-malený růst urychlit a dosáhnout rychlosti normální., Podob-ně je možno podpořit nebo urychlit tvorbu mléka a vyvolati další účinky.GH, jako například ovlivnit složení karka-su. Je například možno podpořit retenci dusíku a tím i změ-nit složení ve prospěch libového masa na úkor tuku. Pod poj-mem "obratlovec" se rozumí člověk a další obratlovci»

Malé peptidy a antigenní prostředky podle vynálezu jemožno podávat nitrožilně, podkožně nebo nitrosvalově, jevšak možno je podat i intranasálně, transdermálně, orálněa rektálně. Antigen je možno podat také expresí ve forměsložené bílkoviny s použitím geneticky pozměněné bakterie,kvasinky nebo viru, k jehož replikaci dojde v obratlovcijako v hostiteli. Peptidy a antigeny podle vynálezu je ze-jména možno podávat s využitím bakteriálního nosiče známýmzpůsobem, například při použití dvojité mutanty (aro) Sal-monel ( PCT/GB8S/01143, zveřejněná pod číslem W089/05856).Prostředky jsou obvykle sterilní a ( pro parenterální po-užití) v podstatě apyrogenní, jednotlivá dávka obvykle ob-sahuje 1 až 1 000/ug malého peptidu podle vynálezu, typic-ky 10 až 500 /Ug, s výhodou 50 yug nebo ještě méně. Můžebýt zapotřebí jedné nebo opakované imunizace, tak jak jeto v oboru známo. Prostředky je možno připravit a podávatobvyklým způsobem, aplikaci provede obvykle lékař a/neboveterinární lékař.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby některého zesvrchu uvedených peptidů způsoby, známými z chemie peptidůnebo příslušným štěpením nativní molekuly GPF, Peptidy jemožno svnthetizovat obecným postupem, který byl uveden vpublikaci Stewart a další, v Solid Phase Peptide Synthesis,Freeman W.H.(publisher), San Francisco, 1969. nebo postupem 10 popsaným v publikace Marglin and Merrifield, Ann. Rev. Biochem. 39, S41-866, 1970 a v dalších publikacích.

Známé postupy pro syntézu peptidů n pevné fázi a po-dobné postupy obvykle nejsou vhodné pro průmyslovou výrobuve velkém měřítku ( přestože tak tomu může být v budouc-nosti), takže běžným postupem pro získání velkých množstvípeptidů je obvykle pěstování vhodného organismu, transfor-movaného polynukleotidovým řetězcem, který je kódem propožadovaný peptid. Vynález proto zahrnuje rovněž tyto pó-ly nukleotidůvé řetězce, vektory pro transformaci a expresis obsahem těchto polynukleotidů, organismy, transformovanétěmito vektory a způsoby pěstování těchto organismů.

Vynález se rovněž týká obratlovců s výjimkou člově-ka, jejichž vlastnosti byly pozměněny svrchu uvedeným způ-sobem .

Vynález bude podrobněji osvětlen v souvislsti s při-loženými výkresa, na nichž jsou znázorněna některá provedení vynálezu.

Na obr. 1 je znázorněna odpověď na atenuovaný GRF uovcí, imunizovaných antisérem proti GRF 1-14.

Na obr. 2 je znázorněna potenciační odpověď na GRFu ovcí, imunizovaných antisérem proti GRF 31-44.

Na obr. 3 je znázorněna potenciační odpověď na GRFu ovcí imunizovaných antisérem 35-44.

Na obr. 4 je znázorněna titrační křivka, ukazujícívývoj protilátek proti GRF a odpověď u imunizovanéhozvířete.

Na obr. 5 je shrnuto působení protilátek proti GRF'1-14, 31-44 nebo 35-44 v průběhu 4 hodin jako biologickáodpověď ovcí na GRF. 11

Na obr. 6 je znázorněno působení protilátek protiGRF 1-14, 31-44 nebo 35-44 v průběhu prvních 60 minut.

Obecné postupy 1. Příprava peptidů

Není-li uvedeno jinak, byly peptidy syntetizoványFmoc-polyamidovým postupem při santéze peptidů na pevnéfázi. Přechodná ochrana Ν-α-aninoskupiny byla provedenapomocí 9-fluorenylmethyloxykarbonylové skupiny (Fmoc).Odštěpení této ochranné skupiny, která je vysoěe labilnívůči působení baží se provádí působením 20% piperidinu vN,N-di methyl formamidu.

Funkční skupiny na postranních řetězcích jsou chrá-něny ve formě svých butyléterů ( v případě šeřinu, threo-ninu a tyrosinu), butylesterů ( v případě kyseliny glutamo-vé a asparagové) vefcmrě butoxykarbonylového derivátu ( vpřípadě lysinu a histidinu), tritylového derivátu ( v pří-padě cysteinu) a 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfony1 o -vého derivátu ( v případě argininu). V případě, že C-ter-minálními zbytky jsou glutamin nebo asanragin, užije se kochraně těchto amidoskupin na postranním řetězci 4,4-di-methoxybenzhydryl ová skupina. Základem použité pevné fáze je polydimethylakrylami-dový polymer, který je· tvořen třemi monomery, a to dimcthylakrylamidu (kostra), bis-akryloylethylenu (zesítující či-nidlo) a methylester akryloy1sarkosinu (funkční látka).Ja-ko odštěpitclné činidlo pro spojení peptidů k pryskyřicise užije derivát kyseliny 4-hydroxymethylfenoxyoctové, la-bilní v kyselém prostředí. 12 Všechny deriváty aminokyselin se přidávají ve forměpředem vytvořených symetrických anhydridů s výjimkou aspa-raginu a glutaminu, které se přidávají postupem s využitímN,N-dicyklohexylkarbodiimidu a 1-hydroxybenzotriazolu. Všechny vazné reakce a odstraňování ochranných skupinse sledují při použití ninhydrinu, kyseliny trinitrobenzen-sulfonové nebo isotinu.

Po ukončení syntézy se peptidy odštěpí od pryskyřicea současně se odstraní ochranné skupiny na postranních ře-tězcích působením 95% kyseliny trifluoroctové s obsahem 5 %směsi, která uvolněné látky váže, jde obvykle o ethyndithiol,fenol, anisol a vodu, přesná volba závisí na použitých ami-nokyselinách a na peptidu, který je synthetizován. KyselinatriΓ1uoroctová se odstraní odpařením ve vakuu s následnýmrozetřením odparku s diethyléterem za získání surového pep-tidu. Jakákoliv pomocná látka pro vazbu uvolněných ochran-ných skupin se později odstraní jednoduchou extrakcí a lyo-filizací se pak získá surový peptid, prostý těchto látek. Čištění je možno provést jakoukoliv chromatografiínebo kombinací chromatografických postupů jako chromato-grafií, vylučující molekuly určitého rozměru, chramatogra_fií na iontoměniči, afinitní chromatografií ř napříkladpři použití příslušné monoklonální protilátky) nebo vysoko-tlakou kapalinovou chromatografií v reversní fázi. Analýzupeptidů je možno uskutečnit chromatografií na tenké vrstvě,vysokotlakou kapalinovou chromatografií v reversní fázi,analyou aminokyselin po hvdrolyze působením kyseliny a a-nalyzou hmotovým spektometrem při bombardování rychlými a-tomy (FAB). 13 2. Konjugace peptidu i) Konjugace vaječného albuminu 3,0 mg peptidu se rozpustí ve 300 ^ul dimethylforma-midu. Pak se přidá 150 χΐ vaječného albuminu ( 10 mg/ml)ve fysiologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým puf-rem (Dulbecco- PBS) a směs se důkladně promíchá. Pak sepomalu přidá 250 ^ul čerstvě připraveného 0,04 M glutar-aldehydu za míchání v průběhu 10 minut a pak se směs nechástát ještě 60 minut při teplotě místnosti za míchání (Spi-ramix, Denley Instruments). Pak se přidá 1,0 ml PBS a pakještě 100 /ul glutaraldehydu o koncentraci 0,04 M jako svr-chu. Směs se nechá stát 60 minut při teplotě místnosti apak se dialyzuje přes noc při teplotě 4 °C proti PBS „ ii) Konjugace s haemocyaninem (Keahole Limpět Haemocyanin (KLH) 5 mg peptidu se podrobí konjugaci s KLH při použitím-maleimidbenzoyl-N-hydroxysukcinimidu - MBS podle publika-ce Lernen R.A. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78,3403-3407, 1981 (Pierce and Warriner Ltd., Chester, GB) ne-bo při použití náhodné metody s použitím glutaraldehydu,která se provádí následujícím způsobem: 5 mg hpGRF peptiduse rozpustí ve 250/Ul PBS (Dulbecco) a 500/Ul KLH (lOmg/mlv PBS) a směs se promíchá. Pak se po kapkách přidá 500/ul0,04 M glutaraldehydu (Sigma) za míchání. V míchání se po-kračuje 60 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá ještě1,5 ml PBS, pak ještě oOO^ul 0,04 M glutaraldehydu a směsse míchá ještě 30 minut. Pak se reakční směs dialyzuje připoužití membrány Spectropor, která oddělí látky s molekulo-vou hmotností 1 000 přes noc proti 100 objemům PBS. 14 3 . Zesí tění 1,4 mg peptidu se rozpustí ve 140/Ul dimethy1formamidua přidá se 17O/ul 0,04 M glutaraldehydu jako svrchu. Jinakse postup provádí svrchu uvedeným způsobem. V případě, že senepožaduje ani zesítění ani konjugace, rozpustí se peptid vd ime thy 1 fortnamidu , disperguje se v PBS. avšak nedialyzuje se

Negativní kontrola

Paralelní negativní kontroly byly získány při použitíovalbuminu ( nebo KLH) bez peptidu nebo při použití poly-lysinu s molekulovou hmotností 1000 až 2000 se zesítěnímjako svrchu. 4. Freundúv pomocný prostředek a jeho podávání

Po dialyze se doplní objem svrchu uvedených příprav-ků na 4,5 ml při použití PBS a emulze typu " voda v oleji",připravené při použití dvou objemů Freundova kompletníhopomocného činidla ( Difco nebo Sigma FCA)« Toho je možnodosáhnout při použití ultrazvuku za studená nebo při pou-žití Potterova homgenizátoru. Emulze jsou testovány pomocídisperze ( nebo její nepřítomnosti) na povrchu vody»

Injekce byly podávány podkožně na dvou místech (jednana každém boku) ovcím Cheviot ( ve stáří 9 až 12 měsíců,kastrovaní samci, 30 až 35 kg). Byl podán 1 ml na každoustranu. Druhá, podobná imunizace byla provedena po 28 až42 dnech při použití čerstvé připraveného peptidu, honju-govaného stejným způsobem, avšak emulgovaného ve Freundověneúplném pomocném prostředku (FIAo Difco nebo Sigma) o Jaké-koliv následující imunizace byly podobné a byly prováděnyv intervalu 28 dnů. Myším bylo podáváno 0,1 ml prostředkuintraperitoneálně v podobných intervalech» 15 5. Jiná pomocná činidla a jejich podávání DEAE-dextran, plňě hydratovaný pres noc ve dvojná-sobně destilované vodě (Pharmacia), saponin (Sigma), ahydroxid hlinitý ( "Al-hydrogel" ) byly užity jednotlivěnebo ve směsích. Po dialyze bylo přidáno 3,1 ml PBS a 7 ml5% DEAE-dextranu (Dd) a pak 2,8 ml 5mg/ml saponinu nebo5,9 ml PBS a 7 ml 5% Dd nebo 10,1 ml PBS a 2,8 ml 5 mg/mlsaponinu. Hydroxid hlinitý (A10H) byl užit v množství1,0 mg/ml v případě potřeby. Nebylo nutno směs emulgovat,avšak bylo dbáno toho, aby směs tvořila homogenní suspenzi.Pak byl podán 1 ml směsi ovcím svrchu uvedeným způsobem.Imunizace byla rovněž prováděna v obdobných intervalech, 6. Vzorky krve (ovce)

Vzorky krve byly odebírány z véna jugularis ovcí těs-ně před podáváním a pak v různých intervalech. Po vytvoře-ní sraženiny ( obvykle po 3 až 5 hodinách) při teplotě míst-nosti bylo sérum po odstředění odebráno k radioimunologic-kým zkouškám na protilátky. Větší vzorky séra byly spojenyv množství 150 ar 200 ml, zmrazený na -20 °C a pak frakcio-novány za získání frakce IgG pro použití při zkouškách.

Vzorky krve ( myši)

Malé vzorky krve 0,25 až 0,5 ml byly odebrány z ret-roorbitálního plexu nebo z ocasní žíly a zpracovány stejnějako vzorky ovčí krve. Větší vzorky odebírány nebyly, 7. Radioimunologické zkoušky

Není-li uvedeno jinak, byly protilátky proti peptidům, které se váží také na faktor, uvolňující růstový hormon sta- noveny přímou vazbou svrchu popsaným způsobem ( Aston a dal- ší, Molec. Immunol, 22, 271-275, 1985 a také Chard T,, 16

An Introduction to Radioimmunoassay and Realted Techniques, 3. vydání, Elsevier, Amsterodam). Příklady provedení vynálezu Příklad 1

1A: Imunizace myší a ovcí proti hpGRF 31-44 a detekce proti-látek proti hpGRF

Metoda: V Cambridge Research Biochemicals, Cambridge, GB bylsynthetizován následující řetězec, kterj7 byl pak čištěn po-mocí HPLC za získání peptidu, čistého na 80 %. 30 35 40

Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg- 44

Leu-NHg

Tento peptid je amidován v poloze 44 a v poloze 30 jepřidán cysteinový zbytek k usnadnění konjugace při použitíMBS ( viz dále) nebo ke zlepšení potenciální imunogenici ty» 5 mg peptidu bylo konjugováno s hemocyaninem ( Key-hole Limpet) při použití m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuk-cinimidu a postupu s použitím glutaraldehydu. Objem oboukonjugačních vzorků byl upraven na 5 ml„ Pak bylo přidáno10 ml úplného Freundova pomocného činidla (FCA-Sigma) <> Pakbyl vzorek zchla^n na 0 °C a emulgován pomocí ultrazvukupři použití předeni zchlazené sondy»

Hotové vzorky byly užity k imunizaci dvou skupin my-ší a ovcí. Ovcím bylo podáno množství 1 ml na dvou místech 17 boku podkožně, celkem bylo podáno jedné ovci 667_ug pepti-du. Bylo užito pět skopců North Cheviot ve stáří 18 měsíců. V případě myší bylo užito šest myší (Balb/C), každé bylo po-dáno 100 /Ug prptidu ve FCA) intraperitoneálně. Všem zvířatům byl odebrán vzorek krve po čtyřech týd-nech a ihned potom jim byla podána další dávka, podobná dáv-ce předchozí až na to, že byla podána polovina množství pep-tidu ve Freundově neúplném pomocném prostředku (FIA-Sigma)o Všem zvířatům byly odebrány krevní vzorky po,dalších 15dnech a pak ( pouze u ovcí) vždy po dalším týdnu. Všem zví-řatům byly podány ještě další dávky peptidu ve FIA 28 dnůpo první podpůrné dávce. Séra z těchto krevních vzorků byla zkoumána na pří-tomnost protilátek proti GRF kompetitivní radioimunologic-kou zkouškou při použití 3-[ liodtyrosylo váného faktoru-1-44-amidu, uvolňujícího růstový hormon (Amersham, Bucks,GB)a Sac-Cel proti myším a proti ovcí ( Immunodiagnostics Ltd).Jako předběžná positivní kontrola pro tento systém byla uži-ta králičí protilátka proti GRF ( Metachem Diagnostics Ltd.Northampton, GB) a Sac-Cel proti králíkům. V případě ovcíbyl užit preparát IgG, získaný ze směsi sér. Výsledky Výsledky, uvedené v následující tabulce ukazují,pře-žití zvířat s positivní reakcí na protilátky v alespoň dvouodběrech krve v procentech.

Konjugační metoda Myši Balb/C(přežití) Ovce Cheviot(přežití) MBS 33 % 40 % (6/6) (5/5 ) Glutaraldehyd 40 % 60 % (5/6) (5/5 ) 18

1B Imunizace ovcí proti různým řetězcům aminokyselin, od-vozených od GRF

Metoda Následující řetězce byly synthetizovány v CambridgeResearch Biochemicals, Cambridge, GB a byly čištěny pomocíHPLC na čistotu vyšší než 80

Cys°+ 1-14: (I) Cys-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- -Val-Leu 15-27 + Cys28: (II) Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Iie-Met-Cys 2 1

Cys τ 22-35: (III) Cys-Leu-Leu-Glri-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu--Ser-Asn 2 0

CysJU+ 31-44 NHp: (IV) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-uly-Ala-Arg-Ala--Arg-Leu-NIIo

Cys30 + 31-39: (V) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 31-39 : (VI) Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 19

Cys34+ 35-44 NHg: (VII) Cs-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH^

Cys29+ 30-43+Lys44NH9: (VIII) Cys-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala- -Arg-Val-Arg-Lys-NHg Všechny tyto peptidy byly rozpuštěny v 50 ir.M fysiolo-gického roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem o pH7,2, (PBS) a konjugovány se stejnou hmotností haemocyaninu(Keyhole Limpet (KHL, Sigma Poole, GB) při použití glutar- aldehydu svrchu popsaným způsobem. Tento materiál byl pak * emulgován ve Freundově úplném pomocném činidle a podán pod-kožně ovcím ( South Down x Kent), 1 ml byl rozdělen na dvěmísta buku každé ovce. Celková počáteční dávka byla přibliž-ně 50/Ug peptidu/ovce. Bylo užito 5 ovcí pro každou skupinuvčetně negativní kontroly (pouze KLH). Další podobné imuni-zace byly provedeny po 28 a 70 dnech po počáteční dávce.

Tyto dávky obsahovaly 50 a 5 /Ug peptidu/ovce. Všem zvířatům byly odebrány vzorky krve do zkumavek"Monovette", určených pro krevní séra z jugulární žíly vednech -5, +14, +27, +35, +42, i56, +63, +70, +84, +98 a+ 112 dnů ( relativně k prmí imunizaci). Mimoto byly ode-brány větší vzorky až 200 ml při vhodných příležitostechpro následující přípravu protilátek. Séra ze všech vozrkúbyla oddělena a skladována při teplotě -20 °C před provede-ním zkoušek na přítomnost protilátek proti GHF člověka kom-petitivní radioimunologickou zkouškou, tak jak bylo popsá-no svrchu. Výsledky Všechny ovce imunizaci přežily. V tabulce je uveden počet zvířat s positivními protilátkami v alespoň 2 odběrech.

Peptid positivní reakce v % zvířat 20 I 40 II 20 III 40 IV 60 v 40 VI 20 VII 60 VIII 0 negativní kontrola 0

Struktura peptidu VIII je velmi vzdálena od struktu-ry lidského řetězce GRF a více se blíží řetězcům GRF ovce/skotu/vepře. Analýza dot-blot ( líarlow a Lané, 19SS) pro-kázala, že protilátky proti tomuto antigenu se vytvořily u60 % zvířat, bude pravděpodobně rozpoznáván antigen ovce adalší antigeny. Závěry

Protilátka je možno vyvolat proti celé řadě polypep-tidů, odvozených od řetězce grf, tyto protilátky budou rozpoznávat intaktní molekulu, od níž byly odvozeny a/nebopůvodní imunogen. Příklad 2

X

Potencip.ce učinku GRF in vitro působením antiséra

Metoda Při použití systému in vitro podle publikace Machlina další, Endocrinology 95, 1350-1357 (1974), avšak při pou 21 žití ovčích hypofys byla zkoumána účinnost GRF v přítomnos-ti a v nepřítomnosti různých typů ovčích antisér. GH vezkušebním vzorku byl stanoven metodou podle publikace Harta další, Hormone and Metabolic Research 7,(1),35-40,1975,s tím rozdílem, ža standard byl rozpuštěn v příslušném pro-středí in vitro a bylo užito Sac-cel proti morčeti (Wellco-me Diagnostics) místo popsaného systému nosiče s dvojí pro-tilátkou.

Pak byla přidána antiséra ( 5/Ul) s obsahem hpGRF vkoncentraci 1000/Ug/ml, v nižší než potřebné koncentraci amimoto byly užity také vzorky, které tuto látku neobsahova-ly. Materiál byl přidán do vyhloubení, která obsahovalasouvislou vrstvu hypofysárních buněk a 1 ml čerstvého prost-ředí bez fetálního telecího séra. Všechny zkoušky byly pro-vedeny se čtyřnásobným opakováním. Po 4 hodinách bylo prost-ředí odstraněno při teplotě 37 °C a pak bylo uchováváno přiteplotě -20 °C pro následující analýzu na GH „ Výs 1edky V následující tabulce jsou uvedena množství GH, pro-kázaného v prostředí, v němž byly pěstovány hypofysární buň-ky in vitro za svrchu uvedených podmínek, radioimunologic- kou zkouškou. Hodnoty jsou vyjádřeny jako zg GH/ml/5 hodin, / uvedena je také standardní odchylka,,

Ovčí antiserum prot i O 1,0 10,0 100,0 1000,0 22 GRF 1-44 přidán v zug/tnl ve formě antiséra/ hpGRF 1-29,glutaraldehyd,konjugace so va 1buminem <1,0 <1,0 <1,0 14,9+11,0 25,6+9,4 pouze nosič glutaraldehyd, <1,0 z e s i t ě ný ovalbumin 30,2+7,9 61,7+8,6 82,9+16 103,4+11,1

hpGRF Cys +30-44-NHpMBS konjugace sovalbuminem <1,0 63,1±9,1 79,2+10,9 101,3+10,1 99,7+14,3 Závěry Výsledky prokazují, že protilátky proti oblasti 30-44molekuly GRF mohou podporovat aktivitu této látky in vitro,kdežto protilátky proti oblasti 1-29 sníží účinnost přida-ného GRF. Zvýšení účinnosti ve svrchu uvedeném smyslu je při-bližně sedmi- až desetinásobné. Příklad 3 Čištění protilátek z antisér Sérum z velkého odběru krve od některých ovcí byločištěno za získání frakce protilátek, které pak bylo možnopoužít při následujícím pokusu in vivo. Bylo užito postupupodle publikace Harlow E. a Lané D, Antibodies: A laborato-ry manual. Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988.Frakcionací síranem amonným ve dvou stupních byla získána 23 částečně čištěná frakce, která byla dialyzována proti 5 milfosforečnanu sodnému o pH 6,5 před čištěním po vsázkách připoužití matrice DEAE. Získaný preparát byl podroben zkouš-kám na účinnost a pak byl skladován při teplotě -20 °C vPBS bez konservačního prostředku. Příklad 4 z

Potenciace účinnosti GRF in vivo protilátkami proti GRF

Metoda 15 ovcí (ještě nepřipuštěné skotské polokrevné samice)se střední hmotností 43 kg byly opatřeny kathetry, zavedený-mi na jedné straně do a. carotis a do v. jugularis 24 hodinpřed prvním pokusem. Zvířata byla krmena dva týdny před po-kusem peletovaným krmivém s obsahem 16 % surové bílkovinyv množství 3,5 % živé hmotnosti. Krmivo bylo odebráno 18 ho-din před pokusem a v průběhu odběru.

Bylo užito základního schématu pro pořadí podávánílátek u každé ovce ( latinský čtverec), bylo užito tří zá-kladních materiálů: 1) GRF [lidský 1-44 amid, Cambridge Research Biochemicals]samotný, l^ug/kg 2) samotná protilátka [ekvivalentní přibližně desetinásob-nému přebytku dávky GRF] 3) GRF v dávce l^ug/kg, předem uvedený do komplexu s proti-látkou [ v desetinásobném přebytku jako svrchu] opatrnýmmíšením hodinu při teplotě místnosti

Protilátky ze tří různých antisér proti řetězcům GRF 1-14, 31-44 nebo 35-44 byly náhodně podány pokusným ovcím,bylo užito vždy 5 ovcí na jednu skupinu. 24

Vzorky krve byly odebrány z žilního kathetru v dese-timinutových intervalech před podáním a při podání GRFa/nebo antiséra kathetrem v a. carotis v "čase 0". Šestdalších vzorků žilní krve bylo odebráno v pětiminutovýchintervalech ( do t+ 30 minut), v 10-minutových intervalechdo t + 60 minut a posledních 8 vzorků bylo odebráno po inter-valech 30 minut ( do t+240 minut). Před odběrem 5 ml žilníkrve do heparinizovaných zkumavek bylo množství počáteční 2ml odloženo. Vzorky byly odstředěny a plasma byla oddělenaa skladována při -20 °C do provedení zkoušky na koncentracirůstového hormonu radioimunologicky ( Hart a další, Hormoneand Metabolic Research 7(1), 35-40 (1975)« Další zkoušky byly provedeny po 7 a po 14 dnech.

Statistické vyhodnocení:

Průměr jednotlivých koncentrací růstového hormonubyl vypočítán pro každý časový usek a analyzován analýzouvariance a F-chráněným t-testem. Plocha pod křivkou (nebojají část) byla vypočítána při použití Simpsonova pravidlapro integraci a hodnoty byly porovnány (SAS Users Guide:Statistics, Version 5. SAS Institute lne., Cary, N.C.,USA). Výsledky:

Na obr. 1 až 3 jsou znázorněny průměrné odpovědi prokaždou skupinu po podání každé protilátky proti GRF 1-14,31-44 a 35-44. Pro srozumitelnost byly vynechány statistic-ké parametry.

Je zřejmé, že GRF poskytuje odpověd ve formě GH jako křivku několik minut po podání, tato křivka se vrací na hod noty v blízkosti normálních hodnot v průběhu pokusu. Proti- látky proti GRF 1-14 způsobily vymizení této odpovědi v komplexním přípravku a je zřejmé, že nejsou spojeny s hlav- 25 ní fází odpovědi na GRF, jsou-li podány samotné. Na rozdíl od tohoto jevu je možno pozorovat po podání protilátek pro- ti řetězcům 31-44 nebo 35-44 zvýšené hodnoty GH v plasmě ve srovnání s podáním samotného GRF. Mimoto je trvání tohoto učinku delší, například na obr. 3 jde o 90 až 210 minut. Vývoj odpovědi na protilátky proti GRF je znázorněnna obr. 4 titračními křivkami.

Na obr. 5 jsou shrnuty tyto typy účinku jako průměryploch pod křivkami z obr. 1 až 3 pro každé pokusné zvíře.

Na obr. 4 je také zřejmá schopnost protilátek proti GRF35-44 dát vznik vlně uvolněného GH. Na obr, 6 je zvýrazněna z účinnost v prvních 60 minutách po' podání. Je zřejmý podstat-ný rozdíl ( ¢¢0,01 mezi průměrnými hodnotami GH v plasmě popodání antiséra 1-14 a 31-44 a podobný účinek GRF ve forměkomplexu s protilátkou proti řetězci 31-44 a 35-44, tentorozdíl je opět statisticky vysoce významný ( p<0,01).

Celkové závěry

Protilátky proti oblasti 1-14 řetězce GRF způsobí in-hibici účinku GRF, avšak protilátky, proti oblasti mezi ami-nokyselinami 31 až 44 nejen nepůsobí inhibici tohoto účin-ku, avšak zvyšují biologickou účinnost GRF. Tyto protilátkyje možno použít ke zvýšení schopnosti GRF uvolnit růstovýhormon, z endogenních zdrojů nebo po jeho podání včetně pou-žití prostředků, z nichž se tato látka pomalu uvolňuje apod.nebo u transgenních zvířat, u nichž dochází k expresi pří-datných genů pro GRF nebo GH0 26

Příloha I

Symboly pro aminokyseliny

Aminokyselina

Symbol ve formětří písmen

Symbol ve forměíednoho písmene

Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Kyselina asparagová Asp D Cystein Cys C Glutamin Gin Q Kyselina glutamová Glu E G1 y c i n Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Fenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptofan Trp w Tyrosin Tyr Y Valin Val v

Claims (20)

1. . C/r\ JUDr. Ivan KOREČEXAdvokát T.5C4 PRAHA 1, *iiná 25 27 P A T E N T 0 V K NAROK/ γ

   1. Peptid, vy značující se t í m , ž eobsahuje přírodní nebo synthetický fragment hormonu, uvol-ňujícího růstový hormon (GRF) obratlovců z oblasti, obsa- * hující usek 28-44 nebo antigenně nebo imunologicky ekviva-lentní peptid nebo jeho sůl.
2. 2. Peptid podle nároku 1, vyznačující setím, že má primární strukturní homologii s řetězcemzbytků aminokyselin faktoru, uvolňujícího růstový hormon voblasti 28-44 nebo antigenně nebo imunologicky ekvivalentnípeptidy nebo jejich soli.
3. 3. Peptid, který odpovídá fragmentu GRF: a) GRF 31-44 nebo b) GRF 35-44 přičemž jde o GRF člověka, Skotu, ovce, vepře, kozy, koně,psa, kočky, ptáka nebo lososa nebo o antigenně nebo imu-nologicky ekvivalentní peptid nebo jeho sůl.
4. 4. Peptid s primární homologii struktury s peptidempodle nároku 3 něho jehu sůl.
5. 5. Peptid podle nároků 1 až 4, vyznačuj íc ís e t í m , ž e mimoto obsahuje ještě další zbytek,který usnadňuje nebo podporuje konjugaci a/nebo zlepšujepotenciální imunogenitu.
6. 6. Peptid podle nároku 6, vyznačující setím, že dalším obsaženým zbytkem je cysteinový zby-tek. 28
7. 7. Peptid podle nároků 1 až 6, vyznačujícíse tím, že je konjugován s antigenera,
8. 8. Peptid podle nároků 1 až 7,v y z n a ču j í cí s tím, že je konjugován a) s druhou molekulou téhožpeptidu, b) s jiným peptidem podle nároků 1 až 7, c) s e-pitopem pro T-bunku nebo d) s částí nebo celou molekulousomatostatinu nebo růstového hormonu.
9. 9. Polynukleotidůvý řetězec,v y z n a ču j í cí s e z tím, že je kódem pro peptid podle nároků 1 až 6. Z
10. 10. Farmaceuti cký antigenně účinný prostředek,v y -značující se tím, že ohsahujepeptidDodle nároků 1 až S a pomocné složky a nosič.
11. 11. Prostředek podle nároku 10,v y z n a ču j í císe t í m , že peptid je vázán na nosič.
12. 12. Prostředek podle nároku 10 nebo 11, v y z n a č ující se tím, že peptid, popřípadě vázaný nanosič je smísen s pomocným činidlem.
13. 13. Prostředek podle nároku 10, vyznačují-cí se tím, že obsahuje peptid podle nároků 1až 8, vázaný na bílkovinu, pro niž je kódem gen mikroorga-nismu.
14. 14. Protilátka proti GRF,v y z n a ču j í cí s etím, že je zaměřena proti oblasti 28-44 této látkynebo antigenně nebo imunologicky ekvivalentnímu peptidunebo jeho soli.
15. 15. Protilátka proti GRF, vyznačující set í m > že je zaměřena proti fragmentu 31-44 nebo35-44 nebo antigenně nebo imunologicky ekvivalentnímu pep-tidu nebo jeho soli. 29
16. 16. Protilátka proti GRF, vyznačující setím, že vytváří komplex s GRF nebo fragmenty GRFpodle nároků 1, 2, 3 nebo 4.
17. 17. Způsob úpravy biologických vlastností obratlov-ce, vyznačují c- í se tím, že se obrat-lovci podá prostředek podle nároků 10 až 16.
18. 18. Způsob podle nároku 17 pro podporu somatogeneze,laktogeneze nebo složení karkasu. 19 o Obratlovec, který obsahuje protilátky podle ná-roků 14, 15 nebo 16.
19. 20. Obratlovec, jehož biologické vlaslnosti byly po-změněny způsobem podle nároků 17 nebo 18.
20. 21. Způsob výroby peptidu podle nároků 1 až 6 chemicikou syntézou peptidů nebo kultivací vhodně transformovanéhomikroorganismu. Zastupuje: JUDr. řyai1 KO&amp;EČEX A cJvokít