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Description
199100 A6 B6 經濟部中央標準局印裂 五、發明説明（i )' 本發明是有關生物上活性之肽類。 許多多肽激素（如生長激素）對於醫藥上或於動物耕 作上均很重要。生長激素可見於所有脊椎動物，且已知可 加強生長（本體發生）及加強産乳（乳生成）。 生長激素（G Η )的控制及釋出依據其他激素或 ''因 子"，如此可造成生長激素於脊椎動物增或減量。生長激 素之釋出是反映生長激素釋出肽之作用，已知為生長激素 釋出因子（GRF)，生長激素釋出激素（GHRH)或 生長激素。 S a 1 k研究室最早的報告描述一種來自人類胰臓 (h P )腫瘤長達4 4個胺基酸的生長激素釋出狀（R i -vier e t a 1 1982； Guillemin e t a 1 1982 ) 0 其以生 理劑量特異地釋出生長激素，且己示出和自下視丘正常分 泌的G Η釋出激素相同，並對腦下垂體生長激素呈現其活 性。咸信生長激素釋放抑制因子Η 5 G R F間之平衡是 對腦下垂體的主要影響而造成哺乳動物具特色的G Η釋出 輪廓。 各種種屬的G R F胺基酸序列已被描述（Fe 1 i X et al ( 1 9 8 5 )。自灸4値肢碁酸的肽類，最高度倕留曼 為1 - 2 7殘基，而在3 1 - 4 4殘基則有最多的變化。 在整個序列有相當多的種屬間交叉活性，如h P G R F -4 4在山羊可誘出良好反應（Hart et al 1 9 8 4) 。再者，分子的活性似乎以1 - 2 7區最為重要，且此區 的許多類似物已在典型種屬中顯示出改進的活性。（La- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) *装· -線· 甲 4 (210X297 公沒） 一 3 - 199100 A6 B6 _ 五、發明説明（2 )· nee et a 1，1984 ) chpGRF在人類及牛頭之投藥均 可改進産乳率（Enright et ai 1 9 8 0 )且經由其G Η釋出活性也增加氮留滯（Moseley et al 1 9 8 7 ) Ο 種屬待異性序列（得自Felix et al 1 9 8 5 )。
1 - 2 7 共同序列：YADAIFINSYRKVLGQLSARKLLQDIM 2 8 - 4 4 人：GRF ： SRQQGESNQERGARARL-NH2 豬：GRF ： SRQQGERNQEQGARVRL-NH2 牛：GRF ： NRQQGERNQEQGAKVRL-NHz 山羊:GRF ： NRQQGERNQEQGAKVRL-NH^ 羊：GRF ： NRQQGERNQEQGAKVRL-NH2 (字母為標準的胺基酸單字碼-見附錄1 ) 已有報告指出，激素的活性可被由其生成之抗體所影 響◊因此，]- 1 3 7 - 2 3 4，將分離出的生長激 素抗體投予至動物可使激素之活性增加。這些抗體也可以 討論中之激素片段適當地免疫接種至宿主動物而於原位生 成，如瓦？人-284-406及人一303-488中 所述。 經濟部中央標準局印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 然而，Armstrong et al (1 9 8 9)已報告，免 疫拮抗所有的G R Γ分子，可抑制此激素的活性。再者， Reynold等人（1 9 8 9 )已示出，免疫拮抗某些親皮質 素釋出因子（CRF)的片段可消除其活性，可由循環中 甲4(210X297公沒） —4 - 199100 A6 B6 五、發明説明（3 } 的糖皮質激素濃度減低而示出。 相反地，已發現G R F的活性可藉著將待殊的G R F 片段（其可産生對完整GRF之抗體）投予至脊椎動物， 而加強脊椎動物中G R F之活性。咸信，G R F此種加強 作用可刺激生長，人體組成，乳産率及G Η於脊椎動物的 其他生物作用。要了解，如此處所用的、、片段〃排除全部 的G R F分子。 依據第一方面，本發明提出加強脊椎動物（增加或強 化）生長激素釋出因子之活性，傺對此脊椎動物投予一 Η 段，其一级結構和G R F 2 8 _ 4 4胺基酸序列區域（恃 別是G R F 3 1 - 4 4胺基酸序列），或其部份或對那之 抗#或免疫相當肽類或分子或鹽類相同。如此處所用的'' 加強〃意看片段直接或間接作用以增加或強化激素的活性 〇 肽可衍自天然蛋白質，化學合成的或利用技藝上已知 方法由適當表現条製成的重組體基因産物。 於 hpGRF，31_44區域包括： Gln-GLy_Glu~Ser"Asn-Gln - 6sL〇^e - Arg-Gly-Ala-Arg^Ala- (請先閱讀背面之注竞事項再填寫本頁) i. •訂· ·" 經濟部中央標準局印製
所謂 ''一级結構相同"意看肽精確地由他種屬複製G r F分子的相當區域，且其他肽具有一個以上胺基酸 ''保 留性置換作用，如此自肽産生的抗體在待性上大體不變（ 甲4(210X297么、发） —5 - 經濟部中央標準局印製 199100 • Μ _ Β6 五、發明説明（4 > ''保留性置換作用"的功能上定義如先前句子）◊在本案 内容中可能具保留性之置換作用例子包括，和原來胺基酸 殘基大體上有相同的疏水性，大小，電荷數及/或芳香性 。這些所有的置換及修飾對於精於肽化學技藝人士通常是 熟知的◊如，候選的置換作用包括：腩胺酸對甘胺酸等； 丙胺酸或纈胺酸對甘胺酸等；異白胺酸對白胺酸或甲硫胺 酸等；色胺酸對酪胺酸等；組胺酸對賴胺酸等；絲胺酸對 天冬醯胺等；蘇胺酸對半胱胺酸等；絲胺酸或丙胺酸對蘇 胺酸等，及穀胺醯胺對天冬醯胺等。 所謂v抗原性相當物"意指肽或其相當物，其可為某 種抗體特異地確認，當此抗體被本發明的肽或其部份生成 時，可於其中或相似的脊椎動物中作用以加強生長激素釋 出因子的生物活性。 待別地，也可使用較該區略短或長，或大體上與之重 昼的抗原性或免疫性相當之肽類◊特別是使用較短的抗原 性相當之肽。在動物本身G R F序列上的變化可造成較大 的免疫反應，但仍可生成可以確認動物本身G R F或標的 G R F (如經移植物引入之外原者）之抗體。因此，可將 來自與欲投藥對象不同種屬的本發明小肽投予至動物而有 益處，（如將羊的肽類投至豬），或將非自然或非保留性 胺基酸置換組合於欲投予的肽中。 此外，肽在合成前或後，其中有一個以上的胺基酸殘 基經化學修飾，只要肽的功能即活體内特異抗體的産製大 體上保持不變也可使用。此種修飾包括與酸或鹼形成鹽， (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· •線· 甲 4 (210X297 公; -6 - 199100 A6 B6 經濟部中央標準局印製 五、發明説明（5 ) 尤其是生理上可接受的有機或無機酸及鹸，形成末端羧基 之酯或醯胺，且粘附胺基酸保護基，如N-第三，丁氧羰 基◊此種修飾可保護肽免受活體内代謝作用。肽可以單套 或多套存在，如縱排重覆如（3 1 — 44) + (31-4 4)或（3 1 - 44) + (44 — 3 1)。此種縱排或多 重重覆子有足夠的抗原性因而避免載體的使用。 肽也可合宜地形成環狀，胺基末端及羧基末端粘接在 一起，或加一個以上的半胱胺酸殘基於尾部以增加抗原性 及/或令雙硫鍵形成。若肽共價鏈結至載體上（最好是一 個多肽），則最好重排如此本發明的肽可形成環帶。合宜 地，肽在羧基末端被醯胺化，且將額外的胺基酸如半胱胺 酸加至胺基末端以助共軛或增進潛在的免疫力。 本發明的第二方面傜提出藥學上抗原性組成物，其中 含一個以上的本發明第一方面的肽類，加上媒介以提供 載體及估劑功能。 依據目前的免疫理論，載體功能應存在於任一種免疫 組成物中以刺激或加強免疫糸。而知載體包含（或加上抗 原而産生）輔助T細胞抗原決定基。肽可與分開的載體聯 合，如經由交叉鏈結，如：血清白蛋白，肌球蛋白，細菌 類毒素及鑰孔嘁血藍。 近來發展的載體可於免疫反應中誘導T輔肋細胞，包 括B型肝炎核心抗原（也稱殼包核酸蛋白質），假設的T 細胞 ί几原決 SSWThr-Ala-Ser-GLy_VaL-Ala-Glu_Thr_ Thr-Asn-Cys，β半乳糖替及間白素-1的1 6 3 — 1 7 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. •訂· .線· 甲 4(210X297 公沒） -7 - 經濟部中央標準局印紫 199100 A6 _ B6 五、發明説明（6 ) 1肽。後-化合物可基於當載體或佐劑或二者而變化◊此 外，本發明相同或不同肽之多重套數可互相交聯，此狀況 下無如此分開的載體，但可由此種交聯提供載體功能。此 種交聯劑包括列於Srgme及Pierce行錄中者，如戊二 醛，碩化二亞胺及4- (N -馬來醯亞胺甲基）環己烷-1 -羧酸琥珀醯亞胺，後者在羧基末端半胱胺酸殘基上（ 若有的若）可露出-SH基圍。 合宜地，交聯或共軛使用Μ B S (間位馬來醯亞胺苄 醯基-Ν -羥基琥珀醯亞胺或戊二醛是至一段多肽；而肽 本身則為Τ細胞抗原決定基，或更合宜地為鑰孔蜮血藍。 若肽是由適當的核苷酸序列於適當宿主中表現而製 備，則肽可以融合産物型式有益地表現，即一段肽序列提 供Τ輔助細胞且可當載體。Kab i q en ' s '、Ecosec ^ 条是 此重排的一個實例。a Eco sec 〃是商品名。 適當的估劑為疫苗領域已知的，如F r e u n d ’ s完全或 不完全佐劑，氫氮化鋁，皂素，D E A E -石旋糖，胞壁 醯基二肽，礦油，天然油脂（如migly〇l )，植物油（ 如花生油），、、I s c 〇 m s 〃，微脂粒，N o v a s o m e s或相似 的技術，P 1 uron i C多元醇或R i b i佐劑糸統。（如見 GB — A - 2189141) 。、、Piuronic "是註册之商 品名。 本發明的肽可鏈結至其他抗原以提供雙重的作用。如 ，肽可鏈結至部份或全部的生長激素釋放抑制因子分子， 而産生抗-生長激素釋放抑制因子抗體及抗G R F抗體而 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) .裝· .訂· •緣. 甲 4(210X 297公发） -8 - A6 B6 199100 五、發明説明（7 )· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可促進生長，或可鏈結至部份或全部的性激素分子以生成 相繼的免疫消除作用，或鏈結至部份或全部的促黃體生長 激素釋放激素（L H H Η )，或其他涉及生長及調控人體 組成之任何肽。 肽類及佐劑及/或載體可以任何適當方式調和，此可 由精於此技藝人士設法，使用已知或尚未被發明的遞送賦 形劑及準則。特言之，調和物可依據生物可降解之聚合物 ，例如丙交酯乙交酯共聚物，如述於ΕΡ- Α-5 8 4 8 1 ( I C I )中者。本發明的肽類（不論是否與其他抗原 鐽結）可與其他免疫方法組合使用（如拮抗細菌，病毒或 寄生蟲感染）以加強其他肽類。 本發明再一方面是提出抗-CRF抗體，直接相對於 GRF28 - 44片段（特別是相對於GRF 31-4 4或3 5 - 4 4片段之抗- G R F抗體）或其抗原性或免 疫性上相當之肽或鹽。合宜地，這些抗-G R F抗體可依 據本發明與GRF或GRF片段絡合。 經濟部中央標準局印裝 本發明再一方面是提出處理正常或不正常脊椎動物的 方法，傜以上述的小肽或抗原性組成物，或抗-GRF抗體（合宜地抗—GRF或GRF片段先絡合）處 理，以改變赞椎動物的生物待性，特別是和G Η相關的生 物作用。例如，脊椎動物的生長可推動或加強在正常水平 之上，或以提出的速率，或將不正常的低水平提高至正常 。同樣地，産乳率可推動或加強，加上其他與G Η相關的 生物作用，如人體組成。以此種方法可加強如氮之滯留及 甲 4 (210X297公发） -9 一 經濟部中.央標準局印製 199100 A6 B6 五、發明説明（8 > 瘦肉對肥肉的比例。所諝V脊椎動物〃包括人類及非人類 Ο 本發明小肽類及抗原組成物投藥方式有：靜脈内，皮 下，或肌肉，同時箅内，穿皮，口服及經直腸路徑也適用 於本發明某些組成物。抗原也可投藥經由以融合蛋白質型 式經遣傳工程的細菌，酵母或病毒複製於宿主脊椎動物表 現而成。特言之，本發明的肽及抗原可利用細菌載體而呈 現，使用技藝上已知的方法，如使用沙門桿菌的雙重 d變子（見國際專利申請案P c T / GB8 8/0 1 1 4 3，在國際刊物第W08 9/ 0 5 8 5 6號中公告）。調和物通常是無菌的且（於腸外 使用時）大體上無熱原的，且1個單位劑量通常言本發明 的小肽1至1 0 0 0微克，典型是1 0 - 5 0 0微克，較 好是約5 0微克以下◊以一次以上的免疫為較佳，如免疫 藝上已知的◊調和物之製備及/或投藥通常是醫師或獸醫 依據其技術及經驗而執行。 本發明再一方面是提出製備上述肽類之一的方法，傜 以已知的肽合成方法，或適當地解離天然GR F分子而成 。肽合成可依據Stewart et al (1 9 6 9)的一般方 法，或 Marglin 及 Mervifield ( 1 9 7 0 )所述的方 法，及接下來的文獻而達成。 以固相及相似技術之已確立的肽合成法，通常不適合 大量産製（雖然在將來可能可如此），且因此肽類之商業 化産製正常方式是培養適當的有機體，其已用編碼欲求肽 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) .裝· _訂· •綠· 甲 4 (210X297 公发） -10 - A6 B6 199100 五、發明説明（9 ) 之聚核苷酸序列轉形。因此，本發明再一方面包括此種多 核旮酸酸，轉形及帶有此種聚核苷酸之表現載體，以之轉 形之有機體及培養此有機體之方法。 本發明再一方面包括非人類的脊椎動物，其特徽在於 已用本發明方法改變。 將說明依據本發明的實例，並參考隨附的圖中其中： 圖1示出羊中經減弱的G R F反應，傺以抗-G R F 1 -1 4抗血清免疫； 圖2示出羊中GRF —加強的反應，係以抗—GRF3 1 - 4 4抗血清免疫； 圖3示出羊中GRF —加強的反應，係以抗—GRF 3 5 - 4 4抗血清免疫； 圖4是滴定曲線示出於經免疫動物中抗- G R F反應之發 展， 圖5綜合抗體對GRF1-14，31 - 44或35_4 4之作用，傺羊對G R F經4小時期間之生物反應；及 圖6強調於最初6 0分鐘期間，抗體對G R F 1 — 1 4， 3 1 - 44，或35 — 44之作用。 一般方法 1 .壯之製備 除非另有所示，所有肽之合成均採固相肽合成的Fm_ 〇c —聚醒胺模式。 暫時的Ν - α胺基保護作用由9 -氟基甲氧羰基（ 甲 4(210X297 公发） -11 - ........................................一............装..............................打…：..：·.>二.........：…線 (請先閱讀背面之注竞事項再瑱寫本页·) 經濟部中.央標準局印裝 199100 A6 B6 五、發明説明（1〇 )
Fmoc )提供◊此高度鹼性不安定保護基利用2 0 %哌啶 於N，N —二甲替甲醯胺中達成。 側鏈官能性之保護係以其丁基醚（於絲胺酸，蘇胺酸 及酪胺酸），丁基酯（於穀胺酸及天冬胺酸時），丁氣毅 基衍生物（於賴胺酸及組胺酸），三苯甲基衍生物（於半 胱胺酸）及4 -甲氧基-2，3，6 -三甲基苯磺醯衍生 物（於精胺酸）。當穀胺醯胺或天冬醯胺為羧基末端殘基 時，則使用4，4 ’ -二甲氧基二苯甲基保護側鏈醯胺基 官能度。 固相載體傺基於聚二甲丙烯醯胺聚合物，由二甲基丙 烯醯胺（骨架單體），雙丙烯醯基乙二胺（交叉鏈結）及 丙烯醯基肌胺酸甲酯（官能化作用物）三個單體構成。所 使用的肽-對-樹脂之可解離鏈結作用物為酸不安定的4 -羥甲基-苯氣基乙酸衍生物。 所加入的所有胺基酸衍生物，均以其預先形成的對稱 酐衍生物型式，除了天冬醯胺及穀胺醯胺為例外，二者傺 以相反的N，N -二環己基碳化二亞胺/1 -羥基-苯並 三唑調介之偶合方法。 欲追踪所有的組合及脱保護作用，利用水合第三酮， 三硝基苯，礎酸，或i s 〇 t i η測試方法。 經濟部中央標準局印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .線· 合成完全後，肽以9 5 %三氟乙酸含5 %清除用混合 物自樹脂載體解離，同時除去側鍵保護基。常使用之清除 劑有乙烷二硫醇，酚，茴香醚及水，確定的選擇依欲合成 之肽，其胺基酸組成而定。三氣乙酸可以真空中蒸發而除 甲 4(210X297 公層） 12 - 199100 A6 B6 經濟部中.央標準局印裂
五、發明説明（ll ') 去，接下來以二乙醚研磨而生成粗製的肽。任何清除劑之 除去可以單純的步驟步驟，其將水相冷凍乾燥生成不含清 劑的粗製肽。 純化作用之達成可利用層析技術的組合或任一種，如 大小排阻層析，離子交換層析，親和力層析（如使用適當 的單株抗體）及逆相高性能液相層析。肽的分析可利用薄 層層析，逆相高性能液相層析，酸水解後的胺基酸分析及 快原子撞繫（fab)質量分光分析。 2 . fl太之共舨作用 (i )共師:牵卵清蛋白 3 . 0毫克的肽溶於3 0 0微升的二甲替甲醯胺中。 加入1 5 0徹升於Dulbeuo's磷酸鹽缓衝食鹽水（P B S )中的1 〇毫克/毫升卵清蛋白，並充份混合。緩慢地 且以攪拌方式加入2 5 0微升新鮮製備的 〇. 04M戊二醛，經10分鐘後再置室溫下以連續混合 (SPIRAMIX. Danley Instruments )置 6 0 分鐘。加入 1. 0毫升PBS，再來是上述的100微升 0 . 〇 4 Μ戊二醛。經室溫下靜置6 0分鐘後以4 °C下對 P B S透析一夜。 (i i )共舨革鑰孔_ rfn転 5毫克的肽共軛至鑰孔蜮血藍，利用間位-馬來醯亞 胺苄醯基-N -羥基琥珀醯亞胺技術-Μ B S ( Lerner， R . A · e t a 1 1 9 8 1 )由 Pierce and Warriner ( UK (請先閲讀背面之注竟事項再填寫本頁) .¾. .訂· ·" 甲 4(21〇X 297公发) -13 - 199100 A6 B6 經濟部中.央標準局印製 A、發明説明（12 ) )Ltd.，Chester，England，提供，或利用任意的戊二醒 方法◊後者之完成如下：5毫克的hpGRF肽溶於25 0微升的P B S ( Dulbecco )中，再與於PBS中之5 〇 〇微升KLH (1 0毫克/毫升）混合。將5 0 0微升 的〇 . 0 4 Μ戊二醛（sigma )以攪拌逐滴加入。此在 室溫下轉動6 0分鐘。再加入1 . 5毫升PBS，5 0 0 微升0 . 0 4 Μ戊二醛，並將混合物旋轉3 0分鐘。反應 混合物透析，利用具1 K D a截去值的Sp ectropor 透析 膜，對1 0 0倍髏積P B S透析一夜。 3 .交聯 將1 . 4毫克的肽溶於1 4 0微升二甲替甲醯胺中， 再加入如上述的1 7 0微升0 . 0 4 Μ戊二醛。其他則如 上。若勿須交聯或共軛，則肽溶於二甲替甲醯胺中，分散 於P B S但不透析。 負對照紐 相對於上述的負對照組使用無肽下的卵清蛋白（或Κ L Μ )，或使用多賴胺酸（分子量1 0 0 0 — 2 0 0 0P a )，依上述交聯。 4 .佐劑及投藥—。Freunds " 經透析後，上述製劑的體積以p B S使成4 . 5毫升 ，並使用2倍體積的Freunds完全佐劑（Di fco或Sigma FCA ) 製成、、水油 〃乳劑 。此 傜於 冷處超 音波震 或 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· *訂· •線· 甲 4(210X297 公尨） -14 - 199100 A6 B6
經濟部中央標準局印$L 五、發明説明（13 ) 使用Polter-Elvehjen勻漿機。乳劑分散（或不存在） 於水表面以進行測試。 注射方式為皮下注射至cheviot羊（9 - 1 2個月. 大，經閱剖的公羊，3 0 - 3 5公斤）二部位（在每測腹 各一）。毎部位注射1毫升。第二劑，相似的免疫在2 8 - 4 2天後完成，使用新鮮製備的肽以相同方式共軛但乳 化於Freunds不完全佐劑（FIA，Difco或Sigma )。 任何接續的免疫均相似，但間隔2 8天。老鼠接受〇 . 1 毫升製劑之腹膜内注射。相同的間隔。 5 .佐劑及枵藥-其他 D E A E -右旋糖（完全水化於二次蒸餾水中一夜： (Pharmercia )，岩素（sigma )及氣氧化錦（'、Aj? -水凝膠〃）可單獨使用及組合使用。經透析後，加入3 .1毫升PRS加7毫升5%DEAE —右旋糖（Dd) 加2. 8毫升5毫克/毫升皂素；或5. 9毫升PBS加 7毫升5%Pd;或10. 1毫升PBS加2. 8毫升5 毫克/毫升皂素。使用1. 〇毫克/毫升的氫氣化鋁 A又Ο Η ")(終濃度）。勿須乳化但要小心保持組份於 均勻懸液中。依上述將1毫升投予至羊身上以相同間隔時 間進行免疫。 6 . 血樣（羊） 以頸靜脈穿刺採1 0毫升血，係在受測驗羊投予任何 (請先閲讀背面之注竞事項再填寫本頁) •裝. •線· 甲 4(210X 297 公沒） 15 - A6 B6 199100 五、發明説明（I4 ) 藥之前及其後一定間隔時間。待於室溫下令凝塊形成後（ 約3 - 5小時），血清以離心法取出以行偵測抗體的放射 免疫分析。以相同方式自約1 5 0 - 2 0 0毫升血中採較 大量的血清檢品，冰凍於-2 0 °C下再做 IgG之分段分離以供分析之用。 rfn樣（老鼠,） 以眶後路徑或尾靜脈部份採少量的血（〇 . 25-0 .5毫升），並依上述羊的測試進行分析。不採大量血樣 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .装· 7 .放射免疫分析 •訂· 除非另有所示，偵測肽之抗體且其也可與生長激素釋 出因子結合的方法，傜依前述的液相直接結合而決定（ Aston e t a 1 ，1985； chard . 1987 ) ° 奮驗 .:…線· 杭[fit清的發展 I A .笄痔老鼠及羊桔杭h D G R F 3 1 - 4 4目偵制 h d G R F抗體 經濟部中央標準局印裝 由 Cambridge Research Biochemicals. Cambridge. England合成以下序列，並經Η P L C純化得8 0 %以上 純度之肽 30 35 40 甲 4(210X297 公沒） 16 - 199100 A6 B6 經濟部中.央標準局印製 五、發明説明（15 ) Cys-Gln-GLy-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-GLy-Ala-Arg- 44 Ala-Arg-Len-NH^ 注意，此肽在4 4位置上被醯胺化，並加3 0位置上加半 胱胺酸殘基以助於使用Μ B S之共軛作用（見下文）或增 加潛在的免疫力。 5毫克的肽共軛至鑰孔蜮血藍，使用間位馬來醯亞胺 苄醯基-Ν =羥基琥珀醯亞胺技術及任意戊二醛方法。二 種共扼的體積均調至5毫升。加入1 0毫升Freurd完全 佐劑（FCA-S i gma )。冷卻於0 °C，再利用預冷卻的探 針超音波震盪乳化之。 完全的製劑用於免疫二組老鼠及羊。後者於測腹接受 1毫升的皮下2部位注射，總共給6 6 7微克/羊之肽劑 量。每種製劑使用5隻cheviot北方1 8個月大的閹羊 。每種製劑使用6隻鼠（Ba 1 b/c )每隻於腹膜内給予1 〇 〇微克於F C A之肽。 所有動物於4週後採血，且立即接受相似（追加）劑 量，和先前所述相似但總共的肽量則減半，且利用Freunds 不完 全佐劑 （ F I A - Sigma )製備 乳劑。 所有動物於之後1 5天採血，且（只有羊）每週後再 採血。於第一次追加後2 8天，所有的動物再給追加劑量 (於 F I A ) ° 以競爭性放射免疫分析法1對血樣中之血清進行抗一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. •訂· •線· 甲 4(210X 297公沒） -17 一 經濟部中央標準局印裂 199100 Α6 _ Β6 五、發明説明（16 ) G R F抗體之測試，使用3 —〔 2 2 5 I〕碘酪胺醯基1 〇 生長激素釋出因子1 - 4 4酸胺（Amersham，Bucks，UK )，及抗-老鼠或+几_羊8 3<： — 〇6 1(111111111110<1丨&811031：-ics Ltd )。在此糸統中使用兔子抗-GRF抗體（Meta-chem Diagnostics Ltd. Northampton , UK )及抗鼠子 S a c - C e 1為初步正面對照組。依所需進行大量羊檢品 中I g G之製備及接續的特性分析。 結果 結果示於下表顯示存活動物之百分率，其有至少2個 受試血樣可得正面的抗體反應。 共扼方法 Balb/c老鼠 Cheviot羊 (存活） （存活） MBS 33% 40% (6 / 6 ) ( 5 / 5 ) 戊二醛 4 0% 60% (5 / 6 ) ( 5 / 5 ) I B .免疫羊以拮抗某範園的G R F -衍生之胺甚醅序列 方法 ambr i dge，Eng 1 j nd合成，並以Η P L C純化至肽純度在 8 0 %以上。 .....................................................裝..............................訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 甲 4(210X297公沒） 18 - 199100 A6B6 五、發明説明（17〉
Cys +1-14: (I) Cys-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu η ο 15-27+Cys : (II) Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-lie-Met-Cys 21
Cys +22-35: (III) Cys-Leu-Leu-Gin-Asp -lie-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn 30
Cys +31-44NH2： (IV) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-
Leu-NH^ 30
Cys +31-39: (V) Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 31-39: (VI) Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly 34
Cys +35-44NH2： ^VII) Cys-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 29 44
Cys +30-43+Lys NH2: . * (VIII)Cys-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Arg-Val-
Arg-Lys-NH . Z \ (請先閱讀背面之注竟事項再填"本頁) •裝· -綠· 經 滴· 部 中 標 準 局 印 甲 4(210X297 公沒） —19 一 199100 A6 __B6 五、發明説明（18 ) 這些肽均溶於5 0 m Μ磷酸鹽緩衝食鹽水（p Η 7 . 2 , PBS)，並使用上述的任意戊二醛方法，與在相等重量 基礎下之鑰孔嘁血藍（KLH; Sigma Poole，England ) 共軛。此製劑乳化於Freunds完全沛劑，並皮下投藥至 羊身上（South Down X Kent )，將1毫升分於每隻羊 側腹的二位置上。最初之總劑量為約每隻羊5 0 0微克肽 。每種處理使用5隻羊，包括只有K L Η之負對照組。於 最初給藥後第2 8及7 0天給相似的免疫作用。每隻羊分 別有約5 0及5微克的肽。 每隻動物於第-5，+1 4，+ 27，+ 35，+ 42，+ 56，+ 63，+ 70，+ 84，+ 98 及 1 1 2天時（相對於第一次免疫）採血置於血清A Mono-vette "試管中。接著於適當時機時採較大量（高達2 0 〇毫升）的血樣，以為接下來抗體之製備。分出所有檢品 中之血清，貯於_ 2 0 Ό下，再前述的競爭性放射免疫偵 測抗-（人類）G R F抗體之測試。 結果 所有的羊在免疫中均存活。表述可在至少2個測試血 樣中産生正面抗體反應之動物數目。 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. .訂· .線. 經濟部中央標準局印製 肀 4(210X297 公沒） 一 20 - 199100 A6 B6 五、發明説明（19 )' 肽 陽件反膜老必: I 4 0 Π 2 0 I 4 0 IV 6 0 V 4 0 VI 2 0 VD 6 0 Vi 0 負對照組 0 (請先閲讀背面之注意事項再填駕本頁) 第Μ的狀和人類G R F序列相當不同，且更相近於羊/牛 /¾之G R F序列。由點吸漬分析（Harlow and Lane， 1 9 8 8 )顯示已在6 0 %的動物上可生成相對於此抗原 之抗體，且似乎也可確認羊及其他動物的G R F ' s。 結論 抗體可自某範圍的肽（G R F序列）生成，且其可確 認其所衍生及/或原有免疫原之完整分子。 經濟部中失標準局印裝 2 ,抗血清之活體外G R. F加強活性 方法 利用活體外糸統（依Machlin et al ( 1 9 7 4 ) 所述），但使用羊的腦下垂體檢視G R F之作用，（在不 甲4(210X 297公廣） -21 - 199100 Α6 Β6 五、發明説明（20 j 同型式的羊抗血清存在下或無之下）。於測試介質中之 G Η依Hart et al ( 1 9 7 5 )的方法分析，除了將標 準品溶於適當的活體外介質，且使用抗天竺鼠、、Sac-Ce i 1 (‘ WellCOme Diagnostics)取代上述的載體/雙重抗體 糸統。 將含1 0 0 0微克/毫升以下（依所需）或無h pG R F的抗血清（5微升）加至一組四個孔洞中，其中含有 匯合的腦下垂髏細胞及1毫升新鮮的培養基，且已將牛胚 胎血清略去。經3 7 -C 4小時後除去培養基，冷凍於-2 0 °c下以做G Η分析。 (請先閱讀背面之注竞事項再填寫本頁 雀.. 經濟部中央標準局印裂 甲 4(210X297 公廣） -22 - 經濟部中央標準局印裝 i99100 A6 B6 五、發明説明（21 )' 結果 此表示出利用放射免疫分析，於活體外介質中偵測到 的G Η量。其以微克G Η /毫升/ 5小時介質加標準偏差 表示 羊抗血清 GRF 1-44加至抗血清（微克/毫升） 至 〇 1.0 10.0 100.0 1000.0 hpGRF 1-29 戊二醛 共軛至 <1.〇 <1.0 <1.0 14·9±11·0 25·6±9.4 卵清蛋白 只有戊 二醛載 <1.0 30.2 ±7.9 61·7± 8.6 82_9±16 103.4 體交聯 卵清蛋白 hpGRF Cys+3〇-44- NH2MBS <1.0 63.1+9.1 79.2+10.9 101.3±10.1 99-7 共軛至 卵清蛋白 結論 結果顯示，相對於G R F分子3 0 - 4 4區之抗體可 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •訂· .線· 甲 4(210X 297 公廣） -23 - 1991 ⑼ A6 B6 經濟部中央標準局印裝 五、發明説明（22)' 加強其活體外活性，而由1 - 2 9區生成之抗體則減弱加 入之G R F活性。由這些數據所顯示的加強作用約7至1 〇倍。 3 .自抗rfn清中純化抗體 將由將挑選时羊中大量血液檢品中獲得的血清純化， 使主要的抗體部份可應用於接績的活體外實驗。此傺基於 Harlow及Lane ( 1 9 8 8 )年所述：二階段的硫酸銨 分段分離可得半純化的流份，其利用D E A E基質行批次 純化前先以5 m Μ的磷酸鈉（p Η 6 . 5 )透析。終製品 經活性再分析後，冷凍貯存於-2 0 °C，P B S不加保藏 劑之中。 4 .杭—G R F杭體之活體肉G R F -加強活件 方法 1 5隻羊（簡格蘭雜種母羊）平均重4 8公斤，在第 一次實驗期間2 4小時，準備單邊沈入之頸動脈及頸靜脈 導管。其已經做2週之食物調整，係1 6 %粗製蛋白質， 完金成九粒狀食物，餵食比率為體重的3 . 5 %。在實驗 前1 8小時及採樣過程中禁食。 基本設計是一種針對治療醫囑的拉丁規矩（對每隻羊 )，其中有三種基本處理方法，傜： (1)〇111'〔人類1 — 4 4醋胺，Cambridge Resear-ch Biochemicals〕單獨地1微克/公斤； {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· .訂. .線. 甲 4(210X297 公簷） -24 - 199100 A6 B6 經濟部中.央標準局印裝 23 五、發明説明（）' (2 )只有抗體〔相當於較G R F劑量多1 0倍〕； (3 ) G R F 1微克/公斤，預先與抗體絡合〔如上述多 1 〇倍〕傜緩和混合1小時（於室溫下）。 有由三種不同抗血清生成之抗體，傜直接相對於G R F1 — 14，31 — 44及35-44序列，其任意分配 於受試動物，每組5隻動物。 於G R F抗藥前（及沖入前）以1 0分鐘間隔自靜脈 導管中採血及/或於〇時間時經由頸動脈導管製備抗血清 。以5分鐘間隔再採6組靜脈血樣（至++ 3 0分）；以 1 〇分鐘間隔直到++ 6 0分及最後8組血樣於3 0分鐘 間隔（至++ 2 4 0分）。在將5毫升靜脈血保留於經肝 素化的試管前，將最初的2毫升丢棄。離心檢品並分出血 漿，貯於—2 0 °C直到以放射免疫分析（Hart et a 1 .， 1 9 7 5 )分析生長激素水平為止。接下來設計中之處理 ，於再7及1 4天後完成。 統計:在每一時間點上計算個別G Η水平之平均，並做差 異及F -保護性t -測試之分析。使用S i m p s ο η ' s法則 以插入準計算每一曲線下之區域（或其部份），並類似地 比較（S A S，1 9 8 5 )。 結果 每一處理組對於投予由GRF 1 — 1 4，3 1 — 4 4 及3 5 - 4 4生成的抗體之平均反應，分別示於圖1至3 。已省略統計指數以明化。 甲 4 (210X297 父尨） -25 - {請先K1讀背面之注竞事項再填寫本頁) •裝· .訂. ...…綠. A6 B6 99100 五、發明説明（24)' 可看出於投藥數分鐘内，GRF可得GH的反應曲線 ，而在測試期間内幾乎回復至對照組水平。G R F 1 ~ 1 4抗體於經絡合的製劑中已消除此反應，且與單獨給予時 GH釋出之主要圖示似乎無關偽◊在極相反方面，GR F 及3 1 - 4 4或3 5 - 4 4序列之抗體絡合則所提高（堅 實地）的血漿中G Η水平和G R F單獨時還高◊此外，這 些提高的G Η水平持續期更持久，見圖3，約9 0 -2 1 0分鐘。 抗-G R F反應之發展以經免疫動物之滴定曲線示出 ，見圖4。 圖5綜合這些活性型式，利用得自毎隻受測試動物於 圖1 — 3曲線下之面積。此圖也強調GRF3 5 — 4 4抗 體固有地起始G Η傳動之能力。圖6強調於處理後前6 0 分鐘時的活性，說明1 - 1 4及3 1 - 4 4抗血清間平均 血漿中G Η水平有意義的差異（Ρ < 〇 . 01)，以及 G R F + 1 5，3 1 — 4 4及3 5 - 4 4抗體絡合後相似 的強化作用，其也具有高度統計上之意義（Ρ < 〇 . 〇 1 ί請先聞鋒背面之注专事Jii再填寫本頁) •装· •綠. 經濟部中央標準局印裝 -26 - f部結論 f G R F序列中1 - 1 4區之抗髏可抑制G R F之作用 ，用，但有十分顯著相反性質的則是在G R F分子3 1及 4 4殘基間區域所生之抗體不但不會抑制反而可加強G R F之生物活性。這些抗體可用來增加G R F之生長激素釋 甲 4(210X 297 公发） 199100 A6 B6 五、發明説明（Γ 出能力，不論採内源性或外在投藥，包括用於持續釋出裝 置等其他方面，或於可表現額外的GRF或GH基因之導 入外來基因動物上。 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. •訂. ，線. 經濟部中央標準局印製 甲 4(210X 297公发） 199100 經濟部中央標準局印製
A6 B6 5·、發明説明（26 ) 胺甚酸 附錄I 胺基酸符號 三字碼符號 一字碼符 丙胺酸 Ala A 精胺酸 A r g R 天冬醯胺 A s η N 天冬胺酸 Asp D 半胱胺酸 C y s C 穀胺醯胺 Gin Q 穀胺酸 G1 u E 甘胺酸 GLy G 組胺酸 His H 異白胺酸 ILe I 白胺酸 Leu L 賴胺酸 Ly s K 甲硫胺酸 Met M 苯丙胺酸 Phe F 脯胺酸 Pro P 絲胺酸 S e r s 蘇胺酸 Thr T 色胺酸 T r p w 酪胺酸 Tyr Y 纈胺酸 Va 1 V (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本百) ，蛑. .訂· 線_ 甲 4(210X297公发） -28 - 199100 A6B6
Ling, N., and 五、發明説明（27 )· 參者文獻
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Claims (1)
19910 公告本 修正 !補充 9 附件一 b :第79104500號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國81年11月呈 10 16 1 . 一種用以加強生長激素釋出因子於脊椎動物之作用 之藥學組成物，其偽包含一天然的或合成的脊椎動物生長 激素釋出因子（GRF)之片段，該片段偽來自位於萁釋 出因子第2 8—44位置之區域，E卩 (Ser/Asn) — Arg—G 1 n—G 1 n—C 1 u- (SersSi Arg) -Asn—G ln-Glu-(Arg或GIn)-Gly-Ala-(Arg或Lys>- (A 1a或Va1)-Arg-Leu-NH2,或其疸類，以及用以提供佐劑和載體功能之媒介。 2. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該肽偽 交聯至卵清蛋白或鑰孔血藍（KLH)。 3. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該肽無 論是否與一載體連结，係和一佐劑混合。 4. 如申請專利範圍第1項之藥學組成物，其中該狀額 外地包含一終端半胱胺酸或離胺酸醒胺殘基，以加強/有 肋於共扼作用及/或增進潛在的免疫力。 5. —種增進健康脊椎動物（人除外）本體生長，乳生 成或增進瘦肉對脂肪比例之方法，該方法偽包含投服至該 赞椎動物如申請專利範圍第1項之組成物。 ▼ 4 (21AX297公釐） 20
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