JPH01500121A - ヒツジインヒビン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒツジ縛インヒビン 本発明は、ヒツジ類から得られた物質から実質的に均質になるまで単離精製され た、インヒビン活性を有する蛋白質に関する。特異的に脳下垂体レベルで作用し て卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を抑制する生殖腺由来の水溶性物質として のインヒビンの存在は、５０年以上前に、ＭｃＣｕｌｌａｇｈによってサイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　７６、１９−２０　（１９３２）に仮説として発表さ れた。このことは重要な問題でありだので、多（の実験室がこの物質を単離し特 性をしらべようとした。ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　３１８゜６５９−６６ ３．　（１９８５）において、ＭａｓｏｎらはｃＤＮＡの研究から誘導されたブ タインヒビンのサブユニットについての配列を発表した。

Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、１３５，３，９５７−９６４（１９８６年３月２８日）にお いてＭａｓｏｎ　らはｃＤＮＡから同様に誘導されたヒトインヒビンのサブユニ ットについての配列を発表した。インヒビンを使用して哺乳類（雌および特に雄 ）の受精率、ゴナドトロピン分泌すなわち性ホルモン産生を調節できる。

本発明によれば、分子量約３４，５００ダルトン（３４，５ｋＤ）でインヒビン 活性を有する蛋白質が雄羊こう丸網液（ＲＴＥ）からうまく単離された。この蛋 白質はマイクロ配列化方法を使用して部分的に特定化されている。

この蛋白質をＲＴＦから得られた物質から実質的に均一になるまで単離し、その 後ヒツジインヒピンと称した。この蛋白質は約３．４５ｋＤの分子量を有し、各 々約１８．０００ダルトンと約１６．５００ダルトンの分子量を有する２つのポ リペプチド鎖からなり、該鎖は生物活性蛋白質においてジスルフィド結合によっ て結合されしいる。この蛋白質の大きい方の１８ｋＤ鎖のアミノ末端残基配列は 、５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ −５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ　１　ａ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａ ｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓであると信じられている。　１６．５ｋ Ｄ鎖のアミノ末端はＧｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌ ｙｓ−Ｖａ　１−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌ　 ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉ　１ｅ− Ｇｌｙで始まる。

３４．５ｋＤ蛋白質はＦＳＨの基本的分泌を特異的に阻害するが黄体形成ホルモ ン（ＬＨ）の分泌を阻害しないインヒビン活性を示す。

ヒツジインヒビンを実質的均質性（すなわち、フラクション中の全蛋白質の約９ ０重量％）になるまで精製することは、ゲルろ過および逆相、高速液体クロマト グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）などの蛋白質分離方法の組合せによって達成され た。

第１図は、インヒビン蛋白質活性フラクションの最終的ＲＰ−ＨＰＬＣのクロマ トグラムであって、該フラクションは５−粒子サイズおよび３００人孔サイズの ０．４６Ｘ２５ｃｍ　Ｖｙｄａｃ　Ｃ，カラムに直接適用され、４０℃でＴＦＡ ／Ｃ１ｈＣＮ緩衝液の２５％ないし９５％４５分の緩衝液Ｂの勾配で０．７　ｄ ／分の流速で約８９０ｐｓ　ｉの逆圧力で溶出した。

多段階方法を使用して、３４．５ｋＤペプチドを実質的に均質になるまで雄羊こ う丸網液（ＲＴＦ）から単離した。この蛋白質は１８ｋＤと１６．５ｋＤの２つ の鎖からなり、この無きすの分子の鎖はジスルフィド結合によっていっしょに保 持され、これらの鎖の間の結合は生物活性にとって必要である。全蛋白質のアミ ノ酸分析が行なわれ、各鎖のアミノ末端で始まる部分的アミノ酸残基配列も決定 された。これらの鎖はＣｙｓ残基に冨み、間をつなぐジスルフィド結合も存在す ると信じられている。この１８ｋＤ鎖のアミノ末端配列は５ｅｒ−Ｔｈｒ　−Ｐ ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ　−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−５ｅｒ−Ｐｒｏ− Ａｌ　ａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ　１　ｕ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ− Ａｓｐ−Ｃｙｓである。この１８ｋＤｉｉは長さ約１３５残基であり、配糖体で あり、１つ以上のジスルフィド結合により１６．５ｋＤ鎖になっているとみられ ている。この１６．５ｋＤ鎖は約１１５〜約１３０残基を有し、Ｎ−末端は下記 配列を有する：Ｇｌ　ｙ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｌｙ ｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈ ｅ−（ＴｙｒまたはＰｈｅ　）次の残基はＶａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａ ｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙであると信じられている。いずれの鎖のＣ末端もアミド化 されているか遊離の酸である。

最終的なりロマトグラフィーによる精製段階で得られる蛋白質の鋭い溶出ピーク はこの蛋白質が全蛋白質量の少くとも約９０重量％まで精製されていることを示 す、この３４．５ｋＤｌｉ白質は水溶性で、天然の蛋白質のサブユニットの１つ は配糖体となっている０次に単離された分子は１８ｋＤＩＪｌのＮ−末端短縮物 （１５残基短くなっている）とみられているが、同じ１６．５ｋＤ鎖に結合され ている。

上記３４．５ｋＤ蛋白質はラットの脳下垂体前葉単層培養系でＦＳＨの基底の分 泌を特異的に阻害するがＬＨの分泌は阻害しないインヒビン活性を示し、エンド クリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　＋　１１３＋１１２１−３１　 （１９８３）に詳細に記載さている検定法にもとづいて５０％最大有効量（ＥＣ ，。）は約０．３■／　ｔｄｌ　（１０ｐＭ）であることがわかった。

単離された３４．５ｋＤ蛋白質および部分的に精製されたインヒビン製剤は細胞 がゴナドトロピン放出ホルモンによって刺激されているときはインビトロでＬＨ とＦＳ）Ｉの両方の分泌をブロックする。インビボでは、部分的に精製されたイ ンヒビン製剤は、血漿中ＦＳＨレベルを低下させるがＬｌ’ｌレベルを低下させ ないという点で高度に選択的である。インビトロでの基底のゴナドトロピン分泌 に対するインヒビンの作用はインビボの場合をもっとも良く反映しているように 見える。３４．５ｋＤ蛋白質は雄および雌哺乳類のゴナドトロピン分泌を調節し 、したがって受精率および／または性ホルモン産生を調節するのに有用である。

インヒビンは配偶子形成またはステロイド形成に対して直接的なゴナドトロピン の作用を有するかも知れないという可能性が示唆される。

異なる静止相および／または動相を有する逆相−高速液体クロマトグラフィー（ ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含み、ゲルろ過または透過高速蛋白質液体クロマトグラフィ ー（Ｆｌ）ＬＣ）をも含む連続的精製過程を利用する精製方法を使用して粗製Ｒ ＴＦからヒツジインヒビンを単離した。

この方法のための出発材料は約３９５０ｄのＲＴＦであって、これをまず０．０ ２％ジメチルスルフィドを含むミリ（Ｍｉｌｌｉ）　ＱＨｚＯに対して４°Ｃで 、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）約１０００の透析バッグを使用して透析した。

保留物を２つの等分のバッチに分け、凍結乾燥した。凍結乾燥プールの半分ずつ をカラム溶出剤に再懸濁し、１４０　ｃｔａセファロースＣＬ−６８を充填した ５　Ｘ１５０　ｅ１ｍガラスカラムを使用した大規模透過、Ｖｔ＝２７５０ｄに 付した。カラム溶出剤は６Ｍグアニジン・ＢＣＩ、０．１Ｍ酢酸アンモニウム、 ０．０５％ジメチルスルフィドを含むミリＱＨｚＯ１ｐＨ４，７５であった。流 速は５（ｌｄ／時間であった。上記２つのバッチからの活性フラクションをプー ルし、さらに処理した。

半調整相ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製が１３３ｄずつまず５０℃で、その後室温で 行なわれた。各段階に使用される種々のカラムからのインヒビン蛋白質フラクシ ョンを各々の次の段階のためにプールした。各試料を直接Ｉ　Ｘ３０ＣＩＩバイ ダツク（Ｖｙｄａｃ）　５−ｇ粒子サイズ０４カラム（カリフォルニア州、ヘス ペリアのセパレイジョングループ社製）にのせ、ＴＥＡＰ緩衝液の勾配を使用し て溶出した。このＴＥＡＰ系において、緩衝液Ａは０．ＩＮ）リエチルアンモニ ウムホスフェート（ＴＥＡＰ）　ｐＨ５からなり、緩衝液Ｂは緩衝液Ａ中６０％ ＣＨ３ＣＮである。すべてのる液を加えた後、カラムをＵＶ吸収がベースライン に達するまで緩衝液Ａの水溶液で洗った。このカラムを通る流れの流速は２．５ 　ｊｌｅ／分に維持された。カラムに３０％緩衝液Ｂを入れ、流動相の勾配を３ ０分かけて徐々に９５％まで上昇させた。これらのフラクションを、スペクトロ フロー７７３ＵＶ検出器にュージャージー州、ラムゼーのクラトス・アナリティ カル・インストルメンツ社製）およびサーボコーダー５Ｒ６２５３ストリツプチ ヤートレコーダーを備えたアルテックス（Ａｌｔｅｘ）４２０グラデイ工ンド液 体クロマトグラフィー系で分離し、集めて実質的なインヒビン活性について試験 した。

種々の個々のカラムからのインヒビン蛋白質フラクションをあつめ、さらにＩ　 Ｘ３０ＣＩ１１バイダツク（Ｖｙｄａｃ）　５−７７ｍ−粒子サイズ０４カラム およびヘプタフルオル酪酸（ＨＦＢＡ）　緩衝液系を使用し室温で精製した。こ のＨＦＢＡ系において緩衝液Ａは９９９　ｄの水中１戚のＨＦＢＡを含み、緩衝 液Ｂは４００　ｄの水、ｌｌｄのＨＦＢＡおよび５９９　ｄのアセトニトリルか らなる。各カラムに３０％を加え２５分かけて５８％Ｂ液へと勾配をつくった。

逆相ＨＰＬＣからの活性帯域を凍結乾燥し、カラム溶出剤に再懸濁して、２本の ｌＸ３０ＣＩスーパーローズ（ＦＰＬＣ）１２−８．１０　ｔｎｒ　（ファルマ シア・ファイン・ケミカル、ニューシャーシー州、ビス力夕ウエイ）を連続的に 結合されたものを使用することによってファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　 ＦＰＬＣ系で処理した。各カラムを６Ｍグアニジン）ＩＣ１，０，１Ｍ酢酸アン モニウム、　ｐＨ４，７５，および０．５χＤＭＳを含むミリＱ　Ｈｚ　Ｏで０ ．４　ｄ／分の流速で約５０分間溶出した。

カラムからのフラクションをＵＶ吸収および生物検定により監視した。　Ｋａｖ −０，３１０，３６の活性フラクションが溶出された。

種々の個々のカラムからのインヒビン蛋白質フラクションをあつめ、さらに５− ｐ−粒子サイズＣ４カラム（Ｉ　Ｘ３０Ｃ１１）および０．５χＴＦＡ／ＣＨ３ ＣＮ緩衝液系を使用するＲＰ−）ＩＰＬｃで精製した。

そのようなＨＰＬＣ脱塩後脱塩性フラクションを凍結乾燥し、５゜ｌ酢酸ナトリ ウム、４Ｍ尿素、１ａ＋Ｍ　ＣＩＡＰＳ　（３Ｃ（コラミドプロピル）ジメチル アンモニオツー１−プロパンスルホネート）をミリＱ　Ｈｚ　Ｏに溶かしたもの （ｐＨ５，３）である緩衝液Ａに取り込むことによってＦＰＬＣ陽イオン交換し た。緩衝液Ｂは緩衝液Ａ中Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１であった。モノ（Ｍｏｎｏ）ＳＨＲ ５１５カラムを備えたファルマシアＦＰＬＣ系、Ｖ　ｔ　＝　１　ｄを１ｍ／分 の流体速で使用した。

カラムにＢ液を入れ０°％から２５分かけて３０％へ、次いで５分かけて１００ ％へと勾配を形成した。

次に、活性フラクションを、５１粒子サイズおよび３００人孔サイズの逆相物質 でできている０、４６Ｘ２５Ｃ１１バイダツク０８カラムに入れた。緩衝液Ａを ０．５ｚ（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液であり、緩衝液Ｂは１１ｉＴＦＡ、２００　ｍ を水および７９９ｄのアセトニトリルである。

流速は４０℃で０．７　ｄ／分で逆圧９００ｐｓ　ｉであった。緩衝液Ｂを最初 ２５容量％４０℃で加え、次いで２５分かけて５０％になるように加えた。活性 インヒビン蛋白質の２つの帯域を溶出し、その後両方を別々に処理した。

各活性フラクションを５ｐ粒子サイズと３００人孔サイズの逆相物質の０．４６ Ｘ２５ＣｌバイダツクＣ８カラムに通用した。緩衝液Ａは０．１！　（ｖ／ｖ） ＴＦＡ水溶液であり、緩衝液Ｂは１　ｄＴＦＡ、　２００ｄの水および７９９　 ｄのアセトニトリルである。緩衝液Ｂを４０°Ｃで流速１．２　ｄ／分でまず２ ５容量％使用した。次いで流速０．７　ｄ／分４０°Ｃで逆圧８９０ｐｓ　ｉで ４５分かけて９５％とし、２１５ｒ＋＋＋＋、　２．９ＡＵＦＳに検出器をセッ トし、ビ＝り帯域を溶出前に２１４ｎｍに少し変化させた。精製されたインヒビ ン蛋白質は一般的に勾配の出発性的２７．０分ないし約２８．３分で溶出し、こ れは勾配出発性的１８．９ｄおよび約１９．８ｄの溶出物に相当する。前段階か らの活性フラクションを後で溶出するための最終段階のクロマトグラムは第１図 に示した。このクロマトグラムはアルテックス４２０システム、２つのベックマ ンモデル１００Ａポンプ、データマーク（Ｄａｔａ＋ｗａｒｋ）、サーボコーダ ー５Ｒ６２５３ストリツプチヤートレコーダー、クラトス、スペクトロフロー７ ７３波長変換器、ＵＶ／可視検出器および２．０　ｄループ付きレオダイン（Ｒ ｈｅｏｄｙｎｅ）　７１２５注入器を使用してつくられた。

すべてのバッチから蓄積したインヒビン蛋白質フラクションすなわち、各々初め に溶出したフラクションおよび後で溶出したフラクションをあつめ、約１９５　 ｔｔｇのインヒビン蛋白質が得うれた。これは約１２０尾の初めに溶出した活性 インヒビンフラクシテンおよび約７５１４の後から溶出したインヒビンフラクシ ョンからなる。　１９５　ｐｇは約２７０７！のＲＴＦから得られ、残りは精製 の間活性フラクションを同定するために行なわれる生物学的試験に使用された。

実質的に均質の、後で溶出したインヒビン蛋白質のアミノ酸分析は、４Ｍメタン スルホン酸および０．２％トリプタミン１１０℃で２４時間酸化水分解後行なわ れた。ノルロイシンを内部標準として使用し、アミノ酸分析器はニンヒドリンポ スト−カラム誘導器を備えたベックマンモデル１２１Ｍであった。これらの結果 は下表に示した。

一表一 雄羊こう丸網液からの精製インヒビン蛋白質のアミノ酸組成ＬＬ！ＪＬ　土ｌ竺 Ｙヱ蛋亘ｌ Ａｓｘ　２２ Ｇｌｘ　２２ Ｇｕｙ　１６ Ａｌａ　１６ Ｐｈｅ　１０ 大きな蛋白質のアミノ酸分析の結果は正確な組成を示すものではなく、単なる大 体の測定値を示すのみであるが、上記結果は相対的残基組成をかなり正確に示し ている。アミノ酸分析とともにＳＯ５および配列データを併用すれば純粋な化合 物を正確に定義できる。

精製された後で溶出したフラクション最大ピークの１部分を中性ｐＨで沸とう水 浴中２〜３分間５％β−メルカプトエタノールを含むおよび含まない２％ドデシ ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）にさらした。イギリスのラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ ）によってネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２２７．６８０−６８５　（１９７ ０）に記載された如く、両方のアリコツトをスラブゲルに適用し、ＳＤＳポリア クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付した。蛋白質帯域を銀染色によって 検出した。

非還元条件に５Ｏ３−ＰＡＧＥによって、インヒビン蛋白質は約３４．５ｋＤの 単一帯域を示した。還元条件下ではインヒビン蛋白質は２つの帯域に分かれ、１ つは１８ｋＤ、一方は１６．５ｋＤである。電気泳動はこの蛋白質が９０％を越 える純度であることを示した。

３４．５ｋＤインヒビン蛋白質の１８ｋＤおよび１６．５ｋｌｌ鎖のＮ１１．− 末端配列分析は、まず２つの鎖を還元条件下に５Ｏ５−ＰＡＧＥによって分離す ることによって達成された。　ＮＨ！末端で始まる無傷のインヒビン蛋白質のマ イクロ配列決定はスビース（Ｓｐｉｅｓｓ）らがバイオケミストリー、　２０． １９８２−１９８８　（１９８１）に記載したとおりに、すべてのサイクルで約 等濃度の２つの残基を一貫して示した。このことはこの蛋白質が２つの鎖から構 成されていることを示す。

無きすのインヒビン蛋白質および還元さたインヒビン蛋白質の両方を複数の配列 分析にかけて得られた結果にもとづいて、インヒビン蛋白質の１８ｋＤ鎖のＮ［ （ｚ末端残基の配列は５ｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｒ ｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−５ｅｔ−Ｐｒｏ−Ａ　１　ａ−Ａ　Ｉａ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　ｕ−Ｇ　１　ｕ −Ｐｒｏ−Ａ　ｌａ−Ａ　１ａ−Ｈｉｓ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ｃｙｓである。イ ンヒビン蛋白質の１６．５ｋＤ鎖の第１のＮＨ２末端残基はｃｉｙ−Ｌｅｎ−Ｇ ｌｕ−Ｃｙｓであり、次の残基はＡｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃ ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−（Ｔｙｒ−またはＰｈｅ）で あると信じられている。これらの残基の次にはＶａｌ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｌｙなる配列があると考えられている。１６．５ｋＤのＣ −末端部分は次のような配列であると考えられている： 丁ｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−１１ｅ−ＡＩａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ− Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｒｙ −Ｇ　１ｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈ１ｓ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇｌ　ｙ− Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌ　ｙ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−旧５− ３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ− Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｈｉ　５−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ−Ｌ ｅｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｃｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｖａ　ｌ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌ ｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＦＩｅ　ｔ−３ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｔ ｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌ　ｙ−Ｇ　１　ｎ−Ａｓｎ−Ｉ　１ｅ−１ １ｅ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−１１ｅ− Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＯＨ インヒビン蛋白質の両方の鎖の配列の実質的部分は正確に知らされているので、 これらの鎖をコードするｓ＋ＲＮＡは単離でき、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ技術に よって合成できる。メツセンジャーＲＮＡ　（＋ａＲＮＡ）はインヒビンを卵胞 あるいはインヒビンを産生じている雄羊こう丸かち得られ、ｃＤＮＡはそのｏ＋ ＲＮＡから逆転写によって合成される。　ｃＤＮＡはクローニングベクターに挿 入され、これを使用して適当な宿主を形質転換してｃＤＮＡライブラリーをつく る。

インヒビンの鎖の公知の部分的アミノ酸残基配列にもとづいて、標識されたオリ ゴマクレオチドを合成して各鎖に相当するｃＤＮＡを検出した。遺伝子コードが 退化するので、混成ハイブリダイゼーションプローブをつくり、プローブとして 使用する。

次いでこれらのプローブを使用して、ライブリーから上記鎖をコードする遺伝子 配列を含むｃＤＮＡクローンを選択する。ｃＤＮＡライブラリーはまた、インヒ ビンまたはその２つの鎖の１つに対して生じた抗体による免疫学的発現検定によ ってスクリーニングすることもできる。免疫学的発現検定を使用してハイブリダ イゼーションプローブによるスクリーニングを確認することもできる。

選択されたクローンから、ｃＤＮＡを切断し、適当なプロモーター配列のコント ロールのもとに適当なベクターに挿入し、ベクターを組換えインヒビン鎖の発現 のための細胞株に形質転換される０両方の鎖のための遺伝子を含むベクターは同 じ細胞株に形質転換できると考えられるが、簡単のために、各鎖の発現のための ベクターは細胞株に別々に形質転換されるのが好ましい。

次いで２つのインヒビン鎖を細胞物質および／または細胞培養培地より単離でき る。これら２つの鎖を次いでこれらの鎖の間のジスルフィド結合を促進する酸化 条件に付す。上記分子生物学技術を使用して別々のインヒビン鎖をコードする遺 伝子配列を読み、それによって蛋白質鎖を完全に特定できる。

実質的に純粋な３４．５ｋＤインヒビンまたはその無毒塩は医薬として許容され る担体と組合わせて医薬組成物を形成し、ヒトを含む哺乳類に静脈内、皮下、皮 肉、筋肉内または経口投与して受精率の抑制、ゴナドトロピン分泌抑制または性 ホルモン産生抑制のため使用した。

さらに、インヒビンの合成フラグメント、たとえ！；ｔ”１８ｋＤ鎖の６つのＮ −末端残基、つまり５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｅｎ−Ｐｒｏは精製さ れたインヒビンの活性を中和することがわかった。このように受動的（抗体の投 与）あるいは能動的（抗原としての免疫原性インヒビンの投与）免疫方法を使用 して内生インヒビンをブロックし、それによって内生ゴナドトロピン分泌を上昇 せしめ、羊（雌羊と４羊）、ヒトおよび同様のポリペプチド構造のインヒビンを 有する他のを椎動物を繁殖させることができる。インヒビンの投与によって雌の 哺乳類の受精率を低下させ、雄哺乳類の精子形成を低下させ、充分量のインヒビ ンを投与することによって、羊（雌羊と４羊）および他の哺乳類を不妊にするこ とができた。インヒビンはまた、不妊症を診断するテストに有用である。

そのようなペプチドは、しばしば医薬として適当な無毒塩、たとえば酸付加塩ま たは亜鉛、鉄などとの金属錯体（本発明の目的にとって塩と考えられる）の形で 投与される。そのような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、リン酸 塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩 、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。液体の形で投与することが望ましい 場合、甘味剤および／または付香剤を使用でき、等張生理塩水、リン酸塩緩衝液 などと共に静脈内投与することもできる。

インヒビンは内科医や獣医の指導の下に投与されるべきであり、医薬組成物は通 常、有効量のペプチドを従来の医薬用担体と組合せて含有する。投与量はこの蛋 白質を投与する特定の目的に応じて変化され、雄の避妊としての通常の投与量は 体重眩光り約０．１〜約１■の範囲の投与レベルである。

インヒビンの精製の方法は主としてＲＴＦからの単離について記述してきたが、 インヒビンを他の粗抽出物、たとえば卵胞液から同じように精製できる。

本発明は好適具体例（本発明者らに現在公知のベストモードを構成する）に関し て記載されたが、当業者には明らかなとおり、請求の範囲に示された本発明を逸 脱することなく種々の変化と修飾を行い得ることは自明であろう。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．約１８，０００ダルトンの分子量を有する第一のポリペプチド鎖および約１ ６，５００ダルトンの分子量を有する第二のポリペプチド鎖からなる実質的に３ ４，５００ダルトンのヒツジインヒビン蛋白質であって、該第一および第二の鎖 はジスルフィド結合を介して互いに結合しており、該第一の鎖は【配列がありま す】で始まるアミノ末端配列を有し、該第二の鎖は【配列があります】で始まる アミ ノ末端配列を有し、卵胞刺激ホルモンの基本的分泌を阻害するが、黄体形成ホル モンの基本的分泌を阻害しない蛋白質。
2. ２．第二の鎖が【配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有する請求の範囲第１項の蛋白質。
3. ３．第二の鎖が【配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有する請求の範囲第１項の蛋白質。
4. ４．第一の鎖が【配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有している請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか の蛋白質。
5. ５．下記の如き大体の量の相対的アミノ酸組成を有する請求の範囲第１項ないし 第３項のいずれかの蛋白質：【配列があります】 およびＰｒｏ２３
6. ６．第１図に示された大体の領域にＣｓ，ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから溶出する請 求の範囲第１項乃至第３項のいずれかの蛋白質。
7. ７．第一の鎖が【配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有する請求の範囲第１項の蛋白質。
8. ８．第一の鎖が【配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有する請求の範囲第１項の蛋白質。
9. ９．第二の鎖が下記式を有する請求の範囲第１項、第７項および第８項のいずれ かの蛋白質： 【配列があります】
10. １０．第一の鎖が配糖体になっている請求の範囲第１項、第７項及び第８項のい ずれかの蛋白質。
11. １１．（ａ）約１３５アミノ酸残基を有する約１８ｋＤ以下の分子量を有し、【 配列があります】 で始まるアミノ末端配列を有するポリペプチドおよび（ｂ）約１１５ないし約１ ３０個のアミノ酸残基を有する約１６．５ｋＤ以下の分子量を有し、【配列があ ります】 で始まるアミノ末端配列を有するポ リペプチドからなる群より選択されたヒツジインヒビンの蛋白質サブユニット。
12. １２．ヒツジインヒビンの生物学的活性を中和する、【配列があります】に対し て生じた抗体。