JP2003524015A - hCGの精製方法及び本法により精製した組換えhCG - Google Patents
hCGの精製方法及び本法により精製した組換えhCGInfo
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Abstract
Description
ドトロピン(hCG)からの組換えhCGの精製に関する。前記方法はイオン交
換クロマトグラフィー及び逆相HPLCの使用を含む。
妊娠している女性の尿から得ていた。
ある。その作用は主にゴナドトロピン黄体形成ホルモンのそれである。
性不妊症の治療において、卵胞の発達を卵胞刺激ホルモン又は閉経期尿性腺刺激
ホルモンにより刺激した後の排卵の誘発を女性に与える。5000〜10000
単位の単回投与が筋中注射により与えられ、通常排卵を刺激する黄体形成ホルモ
ンの月経中期のピークを模倣する。絨毛性ゴナドトロピンはメノトロピンと、そ
して時々クエン酸クロミフェンとも連結した状態で、インビトロ受精手順、並び
に過剰排卵及び卵母細胞収集を含めた他の補助的な受胎技術のための添加物とし
て与えられもする。男性において、それは思春期前の停留睾丸の治療に使用され
ている。投与計画は大きく変化するが、筋中注射により用量は通常500〜40
00単位の範囲で週3回である。
もする。同様に、その投与計画において相当なばらつきがあり、そして用量は5
00〜4000単位、週2〜3回まで変化する。卵胞刺激活性を有する作用物質
、例えばメノトロピンが正常な精子形成を可能にするためによく加えられる。精
子減少症のために、メノトロピン又は他の卵胞刺激製剤と一緒に3000単位ま
での用量の絨毛性ゴナドトロピンが適用されうる。男性の性腺機能低下症に関係
した思春期遅延の治療において、500〜1500単位の用量が週2回与えられ
る;その用量は血漿テストステロン濃度に対して滴定されるべきである。
用されている(Birken et al., Endocrinology, 133 (3) : 1390-7, 1993 ; Sak
akibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35 (5) : 1414-6, 1990 ; Donini et al
., Acta Endocrinol., 73 (1) : 133-45, 1973)。最近、膜ろ過アフィニティー
・クロマトグラフィーと称する、アフィニティー・クロマトグラフィーのさまざ
まな方法が開発され、そして尿からのhCG精製に適用されている(Xu et al.,
Protein expression and purification, 16 : 221-3, 1999)。前記方法はアフ
ィニティー・クロマトグラフィーのカラムの固相としてBrCN活性化セファロ
ースの使用を避け、そしてアフィニティー・クロマトグラフィーによる尿サンプ
ルからのhCGの通常の精製方法の変化を示す。この方法に伴う精製hCGの免
疫活性は8554IU/mgである。
、そしてヒトの尿中に存在するものより特異的であるという利点を有する。しか
しながら、組換えhCGの未精製標本はその組換え物産生に用いた細胞の他のタ
ンパク質及び夾雑物の全てを含むので、組換え絨毛性ゴナドトロピンの絶対的な
純度を達成するための方法には大きな価値がある。
いる女性の尿の未精製濃縮物由来のhCGの未精製標本を、得られたhCGが未
精製hCG標本中に含まれるタンパク質又は他の夾雑物を含まないように精製し
うることをここで発見した。
く。サイズ排除カラムのさらなる使用の可能性はあらゆる残余の微量な夾雑物の
除去をもたらす。最適な結果は少なくとも2ステップのイオン交換クロマトグラ
フィーが実施される場合に得られる。
精製に使用される。そのr−hCGは、高純度及び高い特定の生理活性(23,
000〜28,000IU/mgの範囲)を手に入れ、培地中に存在した場合、ウシ
胎児血清(FBS)タンパク質を、そして組換え処理に使用した宿主細胞に含ま
れる核酸及び他の夾雑物を実質的に含まない。
の精製、及び例えばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含む他の哺乳動物か
らのCGの精製に良好に使用される。
hCGの精製方法の提供は本発明の目的である。前記方法はサンプルをイオン交
換クロマトグラフィーに供し、そしてその溶出物を逆相HPLCに供するステッ
プを含む。前記溶出物をサイズ排除カラムに注ぐさらなるステップを場合により
実施しうる。前記精製方法から最適な結果を得るために異なる条件下で2のイオ
ン交換クロマトグラフィー・ステップを好ましくは実施する。本発明の方法の好
ましい態様は以下の: (a)サンプルをシリカ・クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出し; (b)DEAEセファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通し
て、溶出し; (c)CM−セファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して
、溶出し; (d)シリカC18逆相HPLCカラムに通して、溶出し;そして (e)セファクリル・サイズ排除クロマトグラフィー・カラムに通して、溶出
する、 のステップを含む。
通した後の溶出は約pH7.5のリン酸ナトリウム・バッファーにより行われる。
トリウム・バッファーにより好ましくは行われる。
ン酸バッファーを用いて好ましくは行われる。
用したCHO細胞の培地由来の組換えhCGである。
精製組換えhCGを含む医薬組成物の提供は本発明のさらなる目的である。好適
な賦形剤の一例は凍結乾燥製品の安定化を助けるショ糖である。組換えhCGの
医薬組成物は皮下投与に特に好適である。
CGの精製方法を提供する。そのr−hCGは高い純度及び高い特定の生理活性
(23,000〜28,000IU/mgの範囲)を手に入れ、培地中に存在する場
合、ウシ胎児血清を、そして組換え処理に用いられた宿主細胞に含まれる核酸又
は他の夾雑物を実質的に含まない。本発明は、出発材料サンプルとして生物材料
、特にhCG及び本明細書中に言及される他の夾雑物を含む未精製材料への使用
を意図する。以下に詳細に記載される実施例は、バイオリアクターからの細胞培
養上清培地から得られたr−hCGを含む出発材料サンプルを使用する。あるい
は、サンプルは、妊娠した女性からの未精製濃縮尿である。
新たな採取により与えられる。好ましくは前記上清はろ過により不純物を除かれ
る。必要であれば、前記未精製溶液は濃縮され、そして細胞培養由来の夾雑物を
除去するためにC4シリカ・クロマトグラフィーに供される。
異なる条件で実施されるイオン交換クロマトグラフィー及び逆相HPLCに供さ
れる。最初のDEAEセファロース・イオン交換ステップは、基本的に大部分の
非hCGタンパク質及びDNAを除去するhCG「貫流」ステップとしての機能
を果たすために実施される。好ましくはCM−セファロース・カラムを通す第2
のイオン交換ステップはhCG結合ステップとしての機能を果たし、そして残留
DNA及び宿主細胞又は培地のタンパク質夾雑物を除去する。好ましい態様にお
いて、このステップは、約pH6のリン酸ナトリウム・バッファーにより溶出し、
約5℃で実施される。
養由来の夾雑物の除去に効果的である。好ましくは前記カラムが移動相としての
2−プロパノール/トリス−リン酸バッファーにより溶出される。好ましくは次
にその保持物溶液を10kDカットオフ限外ろ過に供し、濃縮し、そしてpH8の炭
酸水素アンモニウムにより回収される。次に前記濃縮物をセファクリルS200
HRによるサイズ排除クロマトグラフィー・カラムに注ぐ。このステップにおい
て、分子サイズに基づく分離は、pH8の炭酸水素アンモニウムによる溶出でなお
も存在しうる微量の細胞培養由来の夾雑物、可能性のある集合体、及び遊離のh
CGサブユニットの除去を達成する。次にその溶出物を好ましくはpH7のリン酸
ナトリウム・バッファー中、10kDカットオフの膜による限外ろ過により透析す
る。ろ過後、精製hCGバルクを好ましくは滅菌瓶中、低温で保存する。
り精製及び濃縮する。
マトグラフィーのカラムの樹脂及び各中間ステップの操作の原理の要点をまとめ
る。
提供される条件は未精製材料が組換え起源である時、普通に適用されるものであ
る。
ァーを制御された組成物に変更する。このステップを室温で始め(シリカC4ク
ロマトグラフィー)そして次に約+5℃で続ける。好ましい温度範囲は5±3℃
である。これをバイオリアクターの産生サイクルの間、個別にそれぞれの産物に
対して続ける。
除く。
C4シリカ・クロマトグラフィー・カラムに流す。好ましいpH範囲は6.6〜7
.7である。前記カラムをUVモニターのシグナルがベースラインに戻るまで2
5mMリン酸ナトリウムにより洗浄する。次に前記産物を25mMリン酸ナトリウム
中、34.2%(w/w)2−プロパノールにより溶出する。
6時間インキュベートする。次にこの溶液を水により2倍希釈し、そして85%
リン酸を用いてpHを7.5に調整する。好ましいpH範囲は7.5±0.2である
。
のpHが約8に下がるまで精製水でリンスする。
な分子量をもつ物質を除去し、微量の2−プロパノールを除き、そしてアンモニ
ア溶液をpH7.5の40mMリン酸ナトリウムに変える。好ましいpH範囲は7.5
±0.2である。
リン酸ナトリウムにより膜から回収する。
る。
オン交換) このクロマトグラフィー・ステップは大部分の非r−hCGタンパク質及び核
酸を除去するr−hCG「貫流」ステップである。前記ろ過を室温で実施するの
に対して、産物をカラムに通すクロマトグラフィーの段階を低温室内で実施する
。
を、同様に機能する細胞バンクから産生された変更可能な数のr−hCG未精製
濃縮物のプールから調製する。r−hCG未精製濃縮プールの数に対する判断基
準は精製工程における次のクロマトグラフィー・ステップの最大タンパク質結合
容量に依存する(4mg総タンパク質/mg樹脂)。
7.5の40mMリン酸ナトリウムにより洗浄する。
ス・ファースト・フロー(Sepharose Fast Flow)を充填し
たカラムを40mMリン酸ナトリウム(pH7.5)により平衡化する。
ィー工程を280nmでの分光測定により観察する。
を回収する。
去される。このクロマトグラフィー・ステップを約+5℃で実施する。好ましい
温度範囲は5±3℃である。
ン酸を用いて6に調整する。好ましいpH範囲は6±0.1である。
ト・フローを充填したカラムを20mMリン酸ナトリウム(pH6)により平衡化す
る。好ましいpH範囲は6±0.1である。
ロマトグラフィー工程を280nmでの分光測定により観察する。
始めのピークまで初めの廃液を捨てる。
産物を場合によりこの段階でろ過しうる。
核酸残留物、及びエンドトキシンの除去に効果的である。それに10kDカットオ
フ限外ろ過及び補足的なろ過が続く。
終濃度まで加える。
15%(v/v)2−プロパノールによりまず平衡化する。
測定により観察する。
リン酸バッファーによりr−hCGの溶出を続けて実施する。対応のピークが分
光測定(A280 )により検出された時r−hCGが分画される。その吸光度が、
ピークが高くなる時点で最大のピーク高の65%超、そしてピークが低くなる時
点で最大ピーク高の20%超である画分をプールする。
)により希釈する。
0kDを下回る分子量をもつ物質を除去し、そして2−プロパノールを除く。
外ろ過により透析する。
温度はそれぞれ5±3℃及び−15℃以下である。
ー) このサイズ排除クロマトグラフィーは微量の細胞培養由来の夾雑物、予想しう
る集合体、及び/又は遊離サブユニットの除去に効果的である。これに10kDカ
ットオフ限外ろ過が続く。セファクリルS−200HR及び10kDカットオフ限
外ろ過ステップを約+5℃で実施する。好ましい温度範囲は5±3℃である。
ニウム(pH8)により平衡化する。好ましいpH範囲は8±0.2である。前記r
−hCG溶液をそのカラムに流し、そしてpH8の0.5M炭酸水素アンモニウム
を用いて溶出を始めた。好ましいpH範囲は8±0.2である。r−hCG画分の
回収をピークの始まりから開始し、そしてピークが低下する場面で最大ピーク高
の50%水準となるまで続けた。
が約8に下がるまでWFIによりリンスした。
外ろ過により)透析し、そして3.5mg/mlの標的の終濃度を達成するために最
終タンパク質濃度を調整する。
る。
することもできる。
標準タンパク質に対してSDS−PAGEにより決定した。クーマシー・ブリリ
アント・ブルー染色後、非還元SDS−PAGEは、約分子量70kD(65〜7
5kDの範囲)にr−hCGヘテロダイマーの幅広い単独のバンドを示した。その
バンドの正体をウェスタン・ブロッティングにより確かめた。
告する。そのタンパク質濃度は276.5nmでの分光測定により決定したa=0
.616。
mgにのぼる。
作製した。
製剤をDIN 2Rバイアル中に作製し、そして50、40、25、及び4℃で
の安定性試験に供した。
験の結果は、マンニトール製剤がショ糖製剤に関してより安定であることを示し
た。タンパク質の酸化及び遊離サブユニットの形成を最小化するために好ましく
は冷蔵保存条件が要求される。
25、及び4℃での安定性試験のためにDIN 2Rバイアル中に作製した。
験の結果は、この凍結乾燥製剤が40℃及び50℃で少なくとも19週間安定で
あることを示した。
とを示した。
Claims (15)
- 【請求項1】 イオン交換クロマトグラフィー及び逆相HPLCの使用を含
むサンプルからのhCGの精製方法。 - 【請求項2】 以下のステップ: (a)サンプルをイオン交換クロマトグラフィーに供して1次溶出液を得; (b)1次溶出液を逆相HPLCに供して2次溶出液を得;そして (c)2次溶出液をサイズ排除クロマトグラフィーに供する、 を含む、請求項1に記載の方法。
- 【請求項3】 前記ステップ(a)が、2つの別個のイオン交換クロマトグ
ラフィーの通過を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記イオン交換クロマトグラフィーの通過が異なる条件下で
実施される、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 以下のステップ: (a)サンプルをシリカ・クロマトグラフィー・カラムに通して溶出し; (b)DEAEセファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通し
て溶出し; (c)CM−セファロース・イオン交換クロマトグラフィー・カラムに通して
溶出し; (d)シリカC18逆相HPLCカラムに通して溶出し;そして (e)その溶出液をセファクリル(Sephacryl)サイズ排除クロマト
グラフィーに適用する、 を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項6】 DEAEセファロース・イオン交換樹脂を通しての溶出がpH
7.5のリン酸ナトリウム・バッファー中で行われる、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 CM−セファロース・イオン交換樹脂を通しての溶出がpH6
のリン酸ナトリウム・バッファー中で行われる、請求項5又は6に記載の方法。 - 【請求項8】 ステップ(c)が、移動相として2−プロパノール/トリス
−リン酸・バッファーを用いて行われる、請求項5〜7のいずれか1項に記載の
方法。 - 【請求項9】 ステップ(d)が、移動相として炭酸水素アンモニウムを用
いて行われる、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項10】 前記hCGが組換えhCGである、請求項1〜9のいずれ
か1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記サンプルがCHO細胞からの培地である、請求項1〜
10のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項12】 請求項10又は11の方法により調製された、治療として
の有効量の組換えhCG及びその好適な賦形剤を含む医薬組成物。 - 【請求項13】 前記賦形剤がショ糖である、請求項12に記載の医薬組成
物。 - 【請求項14】 前記賦形剤がマンニトールである、請求項12に記載の医
薬組成物。 - 【請求項15】 皮下投与用のための、請求項12〜14のいずれか1項に
記載の医薬組成物。
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