PL205149B1 - Sposób przygotowania rekombinowanej hCG - Google Patents
Sposób przygotowania rekombinowanej hCGInfo
- Publication number
- PL205149B1 PL205149B1 PL357508A PL35750801A PL205149B1 PL 205149 B1 PL205149 B1 PL 205149B1 PL 357508 A PL357508 A PL 357508A PL 35750801 A PL35750801 A PL 35750801A PL 205149 B1 PL205149 B1 PL 205149B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hcg
- column
- eluting
- sample
- ion exchange
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 12
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims abstract description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 13
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 12
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 10
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 6
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 5
- JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N tris phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OCC(N)(CO)CO JLEXUIVKURIPFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 4
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 abstract description 32
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 abstract description 32
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 abstract description 29
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 2
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 7
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 6
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 2-[4-[(z)-2-chloro-1,2-diphenylethenyl]phenoxy]-n,n-diethylethanamine;hydron;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(/Cl)C1=CC=CC=C1 PYTMYKVIJXPNBD-OQKDUQJOSA-N 0.000 description 1
- CBUWTGCATVNMJE-UHFFFAOYSA-N 6,6-dimethylheptanal Chemical compound CC(C)(C)CCCCC=O CBUWTGCATVNMJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000167854 Bourreria succulenta Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010011498 Cryptorchism Diseases 0.000 description 1
- 206010012205 Delayed puberty Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010059594 Secondary hypogonadism Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 206010003883 azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000019693 cherries Nutrition 0.000 description 1
- 229940046989 clomiphene citrate Drugs 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 201000000160 cryptorchidism Diseases 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical class BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229940090343 human menopausal gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000008634 oligospermia Diseases 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002281 placental hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000002294 pubertal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu przygotowania rekombinowanej ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) z próbek surowej rekombinowanej hCG. Sposób obejmuje wykorzystanie chromatografii jonowymiennej oraz HPLC w odwróconym układzie faz.
Gonadotropina kosmówkowa jest hormonem wydzielanym przez łożysko, tradycyjnie otrzymywanym z moczu ciężarnych kobiet.
Hormon ten jest heterodimerem składającym się ze związanych ze sobą niekonwalenyjnie dwóch podjednostek α i β. Pełni on zasadniczo taką samą rolę, co luteinizujący hormon gonadotropowy.
Gonadotropina kosmówkowa jest podawana kobietom w leczeniu czynnościowej niepłodności jajnikowej, wynikającej z braku lub niskiego stężenia gonadotropin, w celu wywołania owulacji po wywołaniu rozwoju pęcherzyków hormonem folikulotropowym, lub ludzką gonadotropiną menopauzalną. Pojedyncza dawka od 5000 do 10000 jednostek jest podawana w postaci domięśniowego zastrzyku tak, aby naśladować wyrzut hormonu luteinizującego w środku cyklu miesiączkowego naturalnie stymulującego jajeczkowanie. Gonadotropina kosmówkowa podawana jest również wraz z menotropin, a czasami także z cytrynianem klomifenu, jako środkiem wspomagającym właściwe zapłodnienie pozaustrojowe (in vitro) oraz wraz z innymi procedurami wspomaganego zapłodnienia obejmującymi jajeczkowanie mnogie i pobranie komórki jajowej. U mężczyzn wykorzystywana jest w leczeniu przedpokwitaniowego wnętrostwa. Zakres dawek jest bardzo szeroki, zazwyczaj jednak dawki wynoszą od 500 do 4000 jednostek podawanych w zastrzyku domięśniowym trzy razy w tygodniu.
Jest ona podawana także w leczeniu bezpłodności u mężczyzn związanej z hipogonadyzmem hipogonadotropowym. I tu ponownie istnieje istotne zróżnicowanie w trybie dawkowania, dawki wahają się od 500 do 4000 jednostek podawanych dwa lub trzy razy w tygodniu. Często dodawany jest lek o aktywnoś ci folikulotropowej taki, jak menotropina, w celu zapewnienia prawidł owej spermatogenezy. W oligospermii dawki gonadotropiny kosmówkowej przekraczające 3000 jednostek na tydzień mogą być stosowane wraz z menotropiną lub innym folikulotropowym preparatem. W leczeniu opóźnionego dojrzewania płciowego chłopców związanego z hipogonadyzmem dawka od 500 do 1500 jednostek jest podawana dwa razy w tygodniu; dawka powinna być dostosowana do stężenia testosteronu w osoczu.
W procesie izolacji i oczyszczania hCG z próbek surowego moczu wykorzystywane były różne sposoby (Birken et al., Endocrinology, 133(3): 1390-7, 1993; Sakakibara et al., Chem. Pharm. Bull., 35(5): 1414-6, 1990; Donini et al., Acta Endocrinol., 73(1): 133-45, 1973). Ostatnio opracowano odmienną metodę chromatografii powinowactwa, określaną jako filtracyjna chromatografia powinowactwa, którą stosowano do oczyszczania hCG z moczu (Xu et al., Protein expression and purification, 16: 221-3, 1999). Sposób ten pozwala uniknąć wykorzystania aktywowanej BrCN kolumny Sepharose jako fazy stałej w kolumnie chromatografii powinowactwa i stanowi wariant tradycyjnie wykorzystywanych metod oczyszczania hCG z próbek moczu przez chromatografię powinowactwa. Aktywność immunologiczna oczyszczonej tym sposobem hCG wynosi 8554 IU/mg.
Rekombinowana hCG posiada tę przewagę, że jest wolna od innych hormonów gonadotropowych i zanieczyszczeń pochodzenia ludzkiego, w szczególności tych obecnych w ludzkim moczu. Surowy preparat rekombinowanej hCG zawiera jednak wszystkie inne białka i zanieczyszczenia pochodzące z komórek wykorzystywanych podczas rekombinacyjengo procesu wytwarzania, wobec czego sposób prowadzący do uzyskania absolutnej czystości rekombinowanej gonadotropiny kosmówkowej jest szczególnie pożądany.
Twórcy wynalazku ujawnili, że surowy preparat hCG pochodzący z próbki pożywki hodowli otrzymanej po procesie rekombinacji lub z surowego koncentratu moczu ciężarnych kobiet może być oczyszczony w takim stopniu, iż otrzymana hCG jest praktycznie wolna od innych białek lub innych zanieczyszczeń zawartych w surowym preparacie hCG.
Sposób oczyszczania jest oparty na wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej i HPLC w odwróconym układzie faz. Możliwość dalszego wykorzystania kolumny do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek pozwala na usunięcie wszelkich pozostałych śladowych zanieczyszczeń. Optymalne rezultaty uzyskano, gdy przeprowadzono minimum dwa etapy oczyszczania z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej.
Sposób przygotowania z próbki rekombinowanej hCG według wynalazku obejmuje etapy:
(a) wymywania próbki z kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym;
(b) wymywania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej;
(c) wymywania z drugiej jonowymiennej kolumny chromatograficznej;
PL 205 149 B1 (d) wymywania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz; i (e) poddania eluatu chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, przy czym otrzymywany rekombinowany hCG wykazuje swoistą bioaktywność w zakresie 23000-28000 IU/mg.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje etapy:
(a) wymywania próbki z kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym;
(b) wymywania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej DEAE Sepharose;
(c) wymywania z jonowymiennej kolumny chromatograficznej CM-Sepharose;
(d) wymywania z kolumny HPLC Silica C18 w odwróconym układzie faz; i (e) poddania eluatu chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Sephacryl.
Korzystnie wymywanie z jonowymiennej żywicy DEAE Sepharose prowadzi się stosując roztwór buforowy fosforanu sodu o pH 7,5. Również korzystnie wymywanie z jonowymiennej żywicy CM-Sepharose prowadzi się stosując roztwór buforowy fosforanu sodu o pH 6.
Ponadto korzystnie etap (d) sposobu według wynalazku - HPLC w odwróconym układzie faz prowadzi się stosując jako fazę ruchomą układ 2-propanol/roztwór buforowy tris-fosforanowy. Również korzystnie etap (e) - chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek - prowadzi się stosując jako fazę ruchomą roztwór buforowy wodorowęglanu amonu.
Najkorzystniej próbką stosowaną w sposobie według wynalazku jest pożywka hodowlana komórek CHO.
Sposób według wynalazku może być zatem wykorzystany do oczyszczania rekombinowanej hCG z próbek pochodzących z pożywki hodowlanej, otrzymanych po procesie rekombinacji. Otrzymana r-hCG o wysokim stopniu czystości i wysokim stopniu bioaktywności (w przedziale od 23000-28000 IU/mg) jest praktycznie wolna od białek płodowej surowicy bydlęcej (FBS), jeżeli jest ona obecna w pożywce hodowli, od kwasów nukleinowych oraz od innych zanieczyszczeń obecnych w komórkach gospodarza wykorzystanych w procesie rekombinacyjnym.
Sposób według wynalazku może być też wykorzystywany do oczyszczania zarówno moczowego hCG, pochodzącego z surowego koncentratu moczu ciężarnych, jak też do oczyszczania CG pochodzącego od innych gatunków ssaków, obejmujących na przykład krowy, konie, świnie, owce i małpy.
Niniejszym opisano także kompozycję farmaceutyczną zawierającą terapeutycznie skuteczną ilość oczyszczonej rekombinowanej hCG, otrzymanej w procesie rekombinacji, jak opisano powyżej, wraz z odpowiednimi zaróbkami. Przykładem takiej zaróbki jest sacharoza wspomagająca stabilizację liofilizowanego produktu. Kompozycja farmaceutyczna rekombinowanej hCG jest szczególnie odpowiednia do podawania podskórnego.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek dostarcza sposobu przygotowania rekombinowanej hCG (r-hCG) z surowego preparatu pochodzącego z pożywki hodowlanej procesu rekombinacyjnego. Otrzymana r-hCG charakteryzuje się wysokim stopniem czystości i wysoką bioaktywnością właściwą (w zakresie od 23000-28000 IU/mg). Jest ona praktycznie wolna od białek płodowej surowicy bydlęcej (FBS), które są obecne w pożywce hodowlanej, i od kwasów nukleinowych oraz innych zanieczyszczeń znajdujących się w komórkach gospodarza wykorzystywanych w procesie rekombinacji.
Wynalazek jest przeznaczony do stosowania z materiałami biologicznymi, w szczególności z surowymi mieszaninami zawierającymi hCG oraz inne zanieczyszczające białka, określanymi tutaj jako próbki substancji wyjściowej. Szczegółowo opisane poniżej przykłady wykorzystują próbki substancji wyjściowej zawierające r-hCG otrzymane ze stanowiącego pożywkę supernatantu hodowli komórkowej z bioreaktora. Alternatywnie, próbką może być surowy koncentrat moczu kobiet ciężarnych.
Próbkę stanowi świeżo zebrany supernatant hodowli komórkowej poddawany przez dwa dni perfuzji w bioreaktorze. Korzystnie supernatant jest klarowany przez filtrację. Jeśli jest to konieczne nieoczyszczony roztwór jest zatężany i poddawany chromatografii na żelu krzemionkowym C4, w celu usunięcia zanieczyszczeń pochodzących z hodowli komórkowej.
Półoczyszczony zbiór, po ultrafiltracji, jest następnie poddawany chromatografii jonowymiennej, która jest korzystnie przeprowadzana dwukrotnie i korzystnie prowadzona w różnych warunkach, oraz chromatografii HPLC w odwróconym układzie faz. Pierwszy może być prowadzony etap wymiany jonowej na kolumnie DEAE Sepharose, zasadniczo jako etap „przepływu hCG, w którym znaczna większość białek niebędących hCG i DNA zostaje wyeliminowana. Drugi etap wymiany jonowej, korzystnie prowadzony z wykorzystaniem kolumny CM-Sepharose, działa jako etap wiązania hCG i eliminuje resztkowe DNA oraz komórki gospodarza lub zanieczyszczenia białkowe średniej wielkości.
PL 205 149 B1
W korzystnym wykonaniu etap ten jest prowadzony w temperaturze 5°C z wykorzystaniem roztworu buforowego fosforanu sodu o pH 6 jako eluentu.
Etap HPLC w odwróconym układzie faz na kolumnie Silica C18 jest skuteczny w usuwaniu śladowych ilości kwasów nukleinowych oraz zanieczyszczeń pochodzących z hodowli komórkowej. Kolumna jest korzystnie eluowana układem 2-propanol/roztwór buforowy Tris-fosforanowy, jako fazą ruchomą. Korzystnie, retentat jest wówczas poddawany ultrafiltracji o wartości odcięcia 10kD, zatężaniu i może być odzyskiwany wodorowęglanem amonu o pH 8. Korzystnie, zatężony produkt jest poddawany chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Sephacryl S200 HR. W tym etapie, rozdział oparty na różnicy rozmiarów cząsteczek uzyskiwany na skutek wymywania wodorowęglanem amonu o pH 8 prowadzi do usunięcia śladowych ilości zanieczyszczeń pochodzących z hodowli komórkowej, oraz ewentualnych agregatów i wolnych podjednostek hCG. Eluat może wówczas zostać poddany dializie przez ultrafiltrację na membranie o wartości odcięcia wynoszącej 10 kD, korzystnie w roztworze buforowym fosforanu sodu o pH 7. Korzystnie, po przefiltrowaniu hCG jest przechowywana w jałowych butelkach w niskiej temperaturze.
P r z y k ł a d 1
Odczynniki:
Amoniak, czystość analityczna
Wodorowęglan amonu, czystość analityczna (B.P.)
Wodorfosforan dwusodowy, czystość analityczna
Skażony etanol absolutny,
Kwas fosforowy, czystość analityczna (Ph.Eur.)
2-propanol, czystość analityczna (Ph.Eur.)
Chlorek sodu, czystość analityczna (Ph.Eur.)
Dwuwodorofosforan sodu, czystość analityczna
Pastylki wodorotlenku sodu, czystość analityczna (Ph.Eur.)
Kwas trifluorooctowy (TFA), czystość HPLC
Tris-(hydroksymetylo)aminometan, czystość analityczna
Schemat technologiczny podsumowujący proces oczyszczania
Zebrany materiał pochodzący z procesu hodowli komórkowej jest oczyszczany i zatężany w serii pięciu etapów chromatograficznych.
Następujący schemat technologiczny (Tabela 1) podsumowuje korzystne wykonanie oczyszczania r-hCG przedstawiając w zarysie zasady postępowania oraz żywice wykorzystywane w każdym z etapów poś rednich.
T a b e l a 1
Schemat technologiczny podsumowujący proces oczyszczania r-hCG
| Etap I | POŻYWKA HODOWLANA Z BIOREAKTORA | chromatografia na kolumnie C4 Silica (Eluat zawiera r-hCG) | Ultrafiltracja na membranie o przepuszczalności do 10 kDa (Retentat zawiera r-hCG) | Zbiór zatężonego surowego r-hCG | |
| 1 | 2 |
| Etap II | DEAE SEPHAROSE FF (Niezwiązana frakcja zawiera r-hCG | |
| Etap III | CM SEPHAROSE FF (Eluat zawiera r-hCG) | |
| Etap IV | RP-HPLC na kolumnie SILICA C18 (Eluat zawiera r-hCG) | Ultrafiltracja (10 kD) |
PL 205 149 B1
c.d. tabeli 1
| 1 | 2 |
| Etap V | SEPHACRYL S-200 HR (Eluat zawiera r-hCG) | roztwór r-hCG |
Szczegółowy schemat technologiczny oraz opis sposobu dostarczono poniżej. Podane warunki prowadzenia etapu wychwytu (etap I) są takie same, jak te stosowane zazwyczaj, gdy surowy materiał pochodzi z procesu rekombinacji.
Etap I (Etap wychwytu)
W tym etapie (Etap I) dokonano wstępnego zatężania oraz zmiany roztworu buforowego na roztwór o kontrolowanym składzie. Etap ten rozpoczęto w temperaturze pokojowej (chromatografia na kolumnie Silica C4) i kontynuowano następnie w temperaturze około +5°C. Korzystnym zakresem temperatur jest 5 ± 3°C. Etap ten powtórzono oddzielnie dla każdego zbioru cyklu produkcyjnego z bioreaktora.
(i) Klarowanie zbiorów
Świeżo zebrany z hodowli komórkowej z bioreaktora materiał jest zazwyczaj klarowany przez filtrację.
(ii) Chromatografia na kolumnie Silica C4
Po sklarowaniu zbiór umieszczono na kolumnie chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym C4, uprzednio skalibrowanym 25 mM fosforanem sodu o pH 7. Korzystnym zakresem pH jest zakres od 6,6 do 7,7. Kolumnę przemywano 25 mM fosforanem sodu do czasu, gdy sygnał na monitorze UV wrócił do wartości linii podstawowej. Wówczas produkt wymywano 34,2% (w/w) 2-propanolem w 25 mM fosforanie sodu.
(iii) Traktowanie amoniakiem
Wówczas do roztworu dodano roztwór amoniaku do momentu osiągnięcia końcowego stężenia wynoszącego 1M. Mieszaninę tę inkubowano przez 6 godzin. Następnie roztwór rozcieńczono wodą, a pH doprowadzono do pH 7,5 z zastosowaniem 85% kwasu fosforowego. Korzystnym zakresem pH jest 7,5 ± 0,2.
(iv) Zatężanie i dializa
Membrany o wartości odcięcia wynoszącej 10 kD, przechowywane pomiędzy partiami w 0,05 M wodorotlenku sodu, płukano czystą wodą do czasu obniżenia wartości pH do około pH 8.
Produkt zatężono i poddano dializie (przez ultrafiltrację na membranie 10 kD), aby usunąć substancje o ciężarze cząsteczkowym mniejszym niż 10 kD i śladowe ilości 2-propanolu, oraz zastąpić roztwór amoniaku 40 mM roztworem fosforanu sodu o pH 7,5. Korzystnie pH jest w zakresie 7,5 ± 0,2.
Końcowy retentat odzyskano z membran 40 mM fosforanem sodu w celu uzyskania pożądanego stężenia docelowego białka wynoszącego od 3 do 15 mg/ml.
Roztwór wówczas przesączono i przechowywano w temperaturze około -15°C.
Etap II (Sączenie i chromatografia jonowymienna na DECE Sepharose FF)
Ten etap chromatograficzny jest etapem „przepływowym dla r-hCG, w którym znaczna część białek niebędących r-hCG i kwasów nukleinowych zostaje usunięta. Podczas, gdy sączenie jest prowadzone w temperaturze pokojowej, etapy chromatografii, podczas których produkt przepływa przez kolumnę prowadzono w zimnym pokoju.
(i) Rozmrażanie i łączenie zatężonych surowych zbiorów r-hCG.
Zamrożone koncentraty rozmrożono i połączono. Porcja oczyszczonego r-hCG jest otrzymywana z różnej liczby połączonych surowych koncentratów r-hCG wytworzonych z tego samego banku wykorzystywanych komórek. Kryterium łączenia różnej liczby surowych koncentratów r-hCG jest oparte na maksymalnej zdolności wiążącej białka w następnym etapie chromatograficznym procesu oczyszczania (4 mg całkowitego białka/mg żywicy).
(ii) Klarownie przez sączenie
Korzystnie, roztwór r-hCG jest przepuszczany przez urządzenie filtrujące, a filtry przemywane 40 mM fosforanem sodu o pH 7,5.
Przefiltrowany roztwór jest łączony z porcjami przemywającymi.
(iii) Chromatografia jonowymienna na DEAE Sepharose FF
Kolumnę upakowano słabo naładowaną żywicą anionowymienną, DEAE(dietyloamionetano)Sepharose Fast Flow, i skalibrowano 40 mM fosforanem sodu (pH 7,5).
Roztwór zawierający r-hCG naniesiono na kolumnę.
PL 205 149 B1
Kolumnę zasilano 40 mM fosforanem sodu o pH 7,5. Proces chromatograficzny monitorowano z wykorzystaniem spektrofotometru przy d ł ugoś ci fali 280 nm. Gł ówny wyciek odrzucano do momentu pojawienia się piku. Wówczas zbierano niezwiązaną frakcję zawierającą r-hCG.
Etap III (Chromatografia na kolumnie CM Sepharose FF)
W tym etapie chromatograficznym usunię ta zostaje znaczna większość zanieczyszczeń pochodzących z komórek gospodarza. Ten etap chromatograficzny prowadzono w temperaturze około +5°C. Korzystnym zakresem temperatur jest 5 ± 3°C.
(i) Rozcieńczanie eluatu z kolumny DEAE Sepharose FF
Do eluatu z kolumny DEAE Sepharose FF dodano wodę do zastrzyków, a pH doprowadzono do 6 stosując 85% roztwór kwasu fosforanowego. Korzystny zakres pH wynosi 6 ± 0,1.
(ii) Chromatografia jonowymienna na kolumnie CM Sepharose FF
Kolumnę, upakowaną słabo naładowaną żywicą kationowymienną, CM (karboksymetylo) Sepharose Fast Flow, skalibrowano 20 mM roztworem buforowym fosforanu sodu (pH 6). Korzystnym zakresem pH jest 6 ± 0,1.
Roztwór zawierający r-hCG naniesiono na kolumnę.
Kolumnę przemyto 20 mM roztworem buforowym fosforanu sodu o pH 6. Proces chromatograficzny monitorowano z wykorzystaniem spektrofotometrii przy długości fali 280 nm.
Produkt wymywano 130 mM roztworem buforowym fosforanu sodu o pH 6. Główny wyciek odrzucano do momentu pojawienia się piku. Zbierano całą frakcję piku zawierającą r-hCG. Produkt ten może być ewentualnie w tym etapie przesączony, w celu usunięcia zanieczyszczeń wirusowych.
Etap IV (RP-HPLC na Silica C18)
Ten etap chromatografii RP-HPLC jest skuteczny w usuwaniu śladowych ilości zanieczyszczeń hodowli komórkowych, pozostałości kwasów nukleinowych oraz endotoksyn. Następnie prowadzono ultrafiltrację na membranach o wartości odcięcia wynoszącej 10 kD i ewentualnie sączenie, (i) Przygotowanie porcji pH poszczególnych porcji doprowadzono do 5 oraz dodano 2-propanol do nomentu osiągnięcia stężenia 15% (v/v).
(ii) Chromatografia RP-HPLC na żelu Silica C18
Kolumnę upakowaną żywicą Silica C18 skalibrowano najpierw 15% (v/v) 2-propanolem, a następnie 0,5 M roztworem buforowym Tris-fosforanu.
Pierwszą porcję naniesiono na kolumnę, a proces chromatograficzny monitorowano wykorzystując spektroskopię UV.
Kolumnę wymywano tym samym roztworem buforowym, jaki wykorzystano w procesie kalibracji.
Następnie prowadzono wymywanie r-hCG w gradiencie liniowym fazy ruchomej 2-propanol/0,5 M roztwór buforowy Tris-fosforanu w zakresie od 15% do 25% (v/v).
Frakcję zawierającą r-hCG zbierano wówczas, gdy metodą spektrofotometrii zarejestrowano odpowiadający pik (A280). Łączono frakcje, których absorbancja w fazie wzrostowej była wyższa niż 65% maksymalnej wysokości piku oraz wyższa niż 20% maksymalnej wysokości piku w fazie malejącej.
Cztery zawierające r-hCG frakcje połączono i rozcieńczono równoważną objętością wody do zastrzyków (WFI).
Następnie produkt zatężono i poddano dializie (przez ultrafiltrację na membranach 10 kD) wobec WFI, w celu usunięcia materiału o ciężarze cząsteczkowym mniejszym niż 10 kD oraz wyeliminowania 2-propanolu.
Wówczas produkt poddano dializie przez ultrafiltrację wobec roztworu buforowego 0,1 M wodorowęglanu amonu o pH 8.
Otrzymany produkt pośredni przechowywano w temperaturze około +5°C albo, jeśli to wymagane, mrożono. Korzystnymi temperaturami przechowywania są 5 ± 3°C, bądź temperatury odpowiednio równe lub niższe niż -15°C.
Etap V (Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Sephacryl S-200 HR)
Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek jest skuteczna w usuwaniu śladowych ilości zanieczyszczeń pochodzących z hodowli komórkowej, ewentualnych agregatów i/lub wolnych podjednostek. Następnie prowadzona jest ultrafiltracja na membranie o wartości odcięcia 10 kD. Etapy chromatografii na kolumnie Sephacryl S-200 HR oraz ultrafiltracji na membranie o wartości odcięcia wynoszącej 10 kD prowadzono w temperaturze +5°C. Korzystnym zakresem temperatur jest 5 ± 3°C.
(i) Chromatografia wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Sephacryl S-200 HR.
PL 205 149 B1
Kolumnę upakowaną żywicą Sephacryl S-200 HR skalibrowano 0,5 M wodorowęglanem amonu (pH 8). Korzystne pH jest w zakresie 8 ± 0,2.
Roztwór r-hCG naniesiono na kolumnę i rozpoczęto wymywanie 0,5 M wodorowęglanem amonu, pH 8. Korzystne pH jest w zakresie 8 ± 0,2.
Zbieranie frakcji zapoczątkowano na początku piku i kontynuowano do wartości 50% maksymalnej wysokości piku na jego malejącym odcinku.
(ii) ultrafiltracja przy wartości odcięcia wynoszącej 10 kD
Membrany o wartości odcięcia wynoszącej 10 kD przechowywane w 0,05 M wodorotlenku sodu są przemywane WFI do momentu zmniejszenia pH do około 8.
Produkt zatężono i poddano dializie (przez ultrafiltrację) wobec WFI.
Wówczas produkt poddano dializie (przez ultrafiltrację) wobec roztworu buforowego 0,01 M foforanu sodu, pH 7, i ostatecznie stężenie białka doprowadzono do końcowego stężenia produktu wynoszącego 3,5 mg/ml.
Końcowy roztwór zawierający r-hCG jest korzystnie przechowywany zamrożony w temperaturze około -15°C.
Żywice chromatograficzne
Przedstawione niżej żywice mogą być wykorzystane w procesie oczyszczania:
Etap I: Silica C4, 250 angstremów - 50 μm
Etap II: DEAE Sepharose FF
Etap III: CM Sepharose FF
Etap IV: Silica C18, 300 angstremów - 15 - 20 μm
Etap V: Sephacryl S-200 HR
Obecnie dostawcami są:
Amersham Pharmacia Biotech,
Bjorkgatan 30
S-751 84, Uppsala
Sweden
Vydac, The Separations Group,
17434 Mojave St.
Hesperia, CA 92345
USA
Mogą być także wykorzystane odpowiedniki żywic. Wyniki
Masa cząsteczkowa i rozmiar
SDS-PAGE (Matrex®, Millipore) (Pharmacia) (Pharmacia) (Vydac) (Pharmacia)
Millipore Corporation 17 Cherry Hill Drive Danvers, MA 01923
USA
Względną masę cząsteczkową r-hCG otrzymanego sposobem według niniejszego wynalazku określono metodą SDS-PAGE wobec standardowych białek o znanej masie cząsteczkowej.
Po nieredukującym SDS-PAGE barwnik Coomassie Brilliant Blue ujawnił pojedyncze szerokie pasmo heterodimeru r-hCG o masie cząsteczkowej wynoszącej w przybliżeniu 70 kD (w przedziale między 65-75 kD). Charakter pasma potwierdzono metodą Western blot.
Aktywność biologiczna
Aktywność biologiczną różnych partii r-hCG oczyszczonych zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku przedstawiono w Tabeli 2. Stężenie białka określono metodą spektrofotometryczną przy długości fali 276,5 nm, a=0,616.
Średnia aktywność właściwa preparatu r-hCG jest szczególnie wysoka i wynosi około 25000 IU/mg.
T a b e l a 2
| partia r-hCG | Bioaktywność właściwa (IU/mg) |
| BCEA 9901 | 24427 |
| BCEA 9902 | 26868 |
| BCEA 9903 | 25636 |
| BCEA 9904 | 27152 |
| BCEA 9905 | 23729 |
PL 205 149 B1
Preparaty
Otrzymano zarówno ciekłe, jak i liofilizowane preparaty zawierające wysoce oczyszczoną rekombinowaną hCG uzyskaną sposobem według niniejszego wynalazku.
Preparat ciekły
Przygotowano dwa ciekłe preparaty zawierające 10000 IU/ml w fiolkach DIN 2R wykorzystując jako zaróbki mannitol i sacharozę i poddano testowi trwałości w temperaturach 50, 40, 25 i 4°C.
Skład zaprezentowano w Tabelach 3 i 4.
T a b e l a 3
| Składniki | jednostki | |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| Sacharoza | mg/ml | 102,6 |
| Kwas o-fosforowy | mg/ml | 0,98 |
| Wodorotlenek sodu | dodano do pH 7,0 |
objętość dopełniona do 0,5 ml
T a b e l a 4
| Składniki | jednostki | |
| r-hCG | IU/ml | 10000 |
| mannitol | mg/ml | 54,6 |
| Kwas o-fosforowy | mg/ml | 0,98 |
| Wodorotlenek sodu | dodano do pH 7,0 |
objętość dopełniona do 0,5 ml
Wyniki testu trwałości, prowadzonego metodami testu biologicznego, SE/HPLC oraz RP-HPLC ukazują, że preparat zawierający mannitol jest trwalszy niż preparat zawierający sacharozę. Przechowywanie próbek w lodówce jest korzystnie wymagane, w celu zminimalizowania utleniania białek oraz powstawania wolnych podjednostek. Preparat liofilizowany
Liofilizowany preparat o mocy 5000 IU przygotowano w fiolkach DIN 2R wykorzystując jako zaróbkę sacharozę i poddano testowi trwałości w temperaturach 50, 40, 25 oraz 4°C.
Skład przedstawiono w Tabeli 5.
T a b e l a 5
| Składniki | jednostki | |
| r-hCG | IU | 5000 |
| sacharoza | mg | 30 |
| Kwas o-fosforowy | mg | 0,98 |
| Wodorotlenek sodu | dodano do pH 7,0 |
Wyniki testu trwałości, przeprowadzonego metodami testu biologicznego, SE/HPLC oraz RP-HPLC, wykazują, że liofilizowany preparat jest trwały w temperaturze 40 oraz 50°C przez minimum 19 tygodni.
Testy trwałości przeprowadzone w temperaturach 25 oraz 4°C po okresie 6 miesięcy wykazują niewystępowanie degradacji substancji czynnej.
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób przygotowania rekombinowanej hCG z próbki, znamienny tym, że obejmuje etapy:(a) wymywania próbki z kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym;(b) wymywania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej;(c) wymywania z drugiej jonowymiennej kolumny chromatograficznej;(d) wymywania z kolumny HPLC w odwróconym układzie faz; iPL 205 149 B1 (e) poddania eluatu chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, przy czym otrzymywany rekombinowany hCG wykazuje swoistą bioaktywność w zakresie 23000-28000 IU/mg.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etapy:(a) wymywania próbki z kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym;(b) wymywania próbki z jonowymiennej kolumny chromatograficznej DEAE Sepharose;(c) wymywania z jonowymiennej kolumny chromatograficznej CM-Sepharose;(d) wymywania z kolumny HPLC Silica C18 w odwróconym układzie faz; i (e) poddania eluatu chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek na kolumnie Sephacryl.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wymywanie z jonowymiennej żywicy DEAE Sepharose prowadzi się stosując roztwór buforowy fosforanu sodu o pH 7,5.
- 4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że wymywanie z jonowymiennej żywicy CM-Sepharose prowadzi się stosując roztwór buforowy fosforanu sodu o pH 6.
- 5. Sposób według zastrz. 1-4, znamienny tym, że etap (d) HPLC w odwróconym układzie faz prowadzi się stosując jako fazę ruchomą układ 2-propanol/roztwór buforowy tris-fosforanowy.
- 6. Sposób według zastrz. 1-5, znamienny tym, że etap (e) chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek prowadzi się stosując jako fazę ruchomą roztwór buforowy wodorowęglanu amonu.
- 7. Sposób według zastrz. 1-6, znamienny tym, że próbka jest pożywką hodowlaną komórek CHO.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00103690 | 2000-02-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL357508A1 PL357508A1 (pl) | 2004-07-26 |
| PL205149B1 true PL205149B1 (pl) | 2010-03-31 |
Family
ID=8167925
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL357508A PL205149B1 (pl) | 2000-02-22 | 2001-01-22 | Sposób przygotowania rekombinowanej hCG |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7297777B2 (pl) |
| EP (2) | EP1752466A3 (pl) |
| JP (1) | JP4588960B2 (pl) |
| KR (1) | KR100806911B1 (pl) |
| CN (1) | CN100482679C (pl) |
| AT (1) | ATE406378T1 (pl) |
| AU (2) | AU783320B2 (pl) |
| BG (1) | BG65807B1 (pl) |
| BR (1) | BRPI0108556B8 (pl) |
| CA (1) | CA2399020A1 (pl) |
| CY (1) | CY1108460T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ303144B6 (pl) |
| DE (1) | DE60135541D1 (pl) |
| DK (1) | DK1257564T3 (pl) |
| EA (1) | EA006605B1 (pl) |
| EE (1) | EE05644B1 (pl) |
| ES (1) | ES2307585T3 (pl) |
| HK (1) | HK1052016A1 (pl) |
| HR (1) | HRP20020650B1 (pl) |
| HU (2) | HU228935B1 (pl) |
| IL (2) | IL151308A0 (pl) |
| ME (1) | ME00296B (pl) |
| MX (1) | MXPA02007871A (pl) |
| NO (1) | NO328694B1 (pl) |
| PL (1) | PL205149B1 (pl) |
| PT (1) | PT1257564E (pl) |
| RS (1) | RS50741B (pl) |
| SI (1) | SI1257564T1 (pl) |
| SK (1) | SK287146B6 (pl) |
| UA (2) | UA78488C2 (pl) |
| WO (1) | WO2001062773A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA200206109B (pl) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
| CA2582083A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
| CN1958603B (zh) * | 2005-11-04 | 2010-05-05 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法 |
| EA200802426A1 (ru) * | 2006-07-11 | 2009-04-28 | Коваль, Антон Александрович | Применение хорионического или лютеинизирующего гормона для профилактики или лечения возрастного гипогонадизма |
| CN101397339B (zh) * | 2008-09-24 | 2012-07-25 | 上海天伟生物制药有限公司 | 糖蛋白中去除/灭活病毒的方法 |
| TWI532495B (zh) | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
| CN101792481B (zh) * | 2010-03-12 | 2012-05-30 | 丽珠医药集团股份有限公司 | 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法 |
| WO2012120535A2 (en) * | 2011-02-03 | 2012-09-13 | Sanzyme Limited | A composition comprising highly purified chorionic gonadotropin, it's formulation and uses of the same |
| EP2691119B1 (en) | 2011-03-31 | 2018-08-01 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation |
| WO2013102921A2 (en) * | 2011-11-17 | 2013-07-11 | Sanzyme Limited | Hcg - newer treatment modality for type 2 diabetes mellitus (t2dm) |
| CN103288950A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-09-11 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法 |
| CN104101656A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-15 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种促性腺激素的纯度测定方法 |
| US20150065426A1 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Professional Compounding Centers Of America | Testosterone Booster Transdermal Compositions |
| CN105968185A (zh) * | 2016-07-20 | 2016-09-28 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种绒促性素纯化方法 |
| CN111233999B (zh) * | 2020-03-21 | 2024-02-23 | 上海浦东明炎生物技术有限公司 | 一种从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法 |
| CN113398251B (zh) * | 2021-07-30 | 2022-08-05 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3045539B2 (ja) * | 1989-02-21 | 2000-05-29 | ワシントン ユニバーシティ | 改変型生殖ホルモン |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
| IT1254370B (it) * | 1992-05-22 | 1995-09-14 | Sorin Biomedica Spa | Procedimento per la purificazione di proteine da sistemi cellulari. |
| EP0814841B1 (en) | 1995-03-21 | 2001-12-05 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Hcg liquid formulations |
| HUP9900619A3 (en) * | 1996-02-20 | 2001-11-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins which form heterodimers |
| IT1287138B1 (it) * | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| AU8142198A (en) | 1997-06-12 | 1998-12-30 | Regents Of The University Of California, The | A transcription factor coactivator protein, p/cip |
| CA2289665C (en) * | 1997-06-13 | 2005-08-09 | Genentech, Inc. | Protein recovery by chromatography followed by filtration upon a charged layer |
| US6583109B1 (en) * | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
-
2001
- 2001-01-22 EA EA200200892A patent/EA006605B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 ME MEP-2008-389A patent/ME00296B/me unknown
- 2001-01-22 RS YUP-602/02A patent/RS50741B/sr unknown
- 2001-01-22 UA UA2002086890A patent/UA78488C2/uk unknown
- 2001-01-22 AU AU26804/01A patent/AU783320B2/en not_active Expired
- 2001-01-22 EE EEP200200469A patent/EE05644B1/xx unknown
- 2001-01-22 DE DE60135541T patent/DE60135541D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 HU HU0204231A patent/HU228935B1/hu unknown
- 2001-01-22 JP JP2001562554A patent/JP4588960B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 EP EP06024050A patent/EP1752466A3/en not_active Withdrawn
- 2001-01-22 US US10/204,630 patent/US7297777B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 SK SK1206-2002A patent/SK287146B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 EP EP01901188A patent/EP1257564B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 MX MXPA02007871A patent/MXPA02007871A/es active IP Right Grant
- 2001-01-22 DK DK01901188T patent/DK1257564T3/da active
- 2001-01-22 HU HUP1300063 patent/HU1300063D0/hu unknown
- 2001-01-22 CA CA002399020A patent/CA2399020A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-22 UA UAA200511832A patent/UA86938C2/uk unknown
- 2001-01-22 ES ES01901188T patent/ES2307585T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 WO PCT/EP2001/000665 patent/WO2001062773A1/en active IP Right Grant
- 2001-01-22 CN CNB018053637A patent/CN100482679C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-22 SI SI200130858T patent/SI1257564T1/sl unknown
- 2001-01-22 IL IL15130801A patent/IL151308A0/xx unknown
- 2001-01-22 KR KR1020027010625A patent/KR100806911B1/ko active IP Right Grant
- 2001-01-22 AT AT01901188T patent/ATE406378T1/de active
- 2001-01-22 CZ CZ20022855A patent/CZ303144B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 BR BRPI0108556A patent/BRPI0108556B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-01-22 PT PT01901188T patent/PT1257564E/pt unknown
- 2001-01-22 PL PL357508A patent/PL205149B1/pl unknown
-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206109A patent/ZA200206109B/en unknown
- 2002-08-01 HR HR20020650A patent/HRP20020650B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-08-14 BG BG107000A patent/BG65807B1/bg unknown
- 2002-08-18 IL IL151308A patent/IL151308A/en active IP Right Grant
- 2002-08-21 NO NO20023985A patent/NO328694B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-17 HK HK03104314.8A patent/HK1052016A1/xx unknown
-
2006
- 2006-01-06 AU AU2006200059A patent/AU2006200059A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-08-28 US US11/846,118 patent/US20070299001A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-27 CY CY20081101218T patent/CY1108460T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070299001A1 (en) | PURIFIED hCG | |
| KR101173717B1 (ko) | Ｆｓｈ를 정제하는 방법 | |
| US20060079460A1 (en) | Purified LH |