CN100482679C - 人绒毛膜促性腺激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上清液的原重组人绒毛膜促性腺激素(hCG)样本纯化重组人绒毛膜促性腺激素的方法，其包括联合使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。用离子交换色谱法洗脱两次，最后用粒度排斥色谱法使人绒毛膜促性腺激素纯化至完全不含任何污染物。由这种方法可制成高纯人绒毛膜促性腺激素，其比生物活度非常高，约为25，000IU/mg。
Description
技术领域
本发明涉及一种绒毛膜促性腺激素(CG)的纯化方法，具体地说，涉及从原始重组人绒毛膜促性腺激素样本纯化重组人绒毛膜促性腺激素的方法。该方法包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。
背景技术
绒毛膜促性腺激素(CG)是一种由胎盘产生的激素，一般从孕妇的尿液提取出来。
这种激素是一种由以非共价键结合的α和β亚基组成的异二聚物。
它主要影响促性腺激素中的黄体生成激素。
在治疗由于没有促性腺激素或促性腺激素浓度过低而导致无排卵性不孕症时，可给妇女施用绒毛膜促性腺激素诱导以促卵泡激素或人体绝经期促性腺激素刺激卵泡的发育后排卵。通过肌肉注射施以5000至10000单位一次剂量以仿真正常刺激排卵的黄体生成激素的半峰值。对于体外受精作业以及其它包括超排卵和卵母细胞收集的助孕技术，也会将绒毛膜促性腺激素和月经激素一起施用，有时还加上辅助剂枸橼酸氯芪酚胺。绒毛膜促性腺激素业已用于治疗男性青春前期的隐睾病。服用的方法有多种，但通常每周进行三次肌肉注射，每次的剂量从500至4000单位。
绒毛膜促性腺激素也用于治疗男性因促性腺激素不足性腺机能减退而导致不育的疾病。另外，服用的剂量也很不同，每周二次或三次，每次的剂量从500至4000单位。而且往往会加入一种具有促卵泡活性的药剂，如月经激素以产生正常精子。对于精子减少，每周可施以高达3000单位剂量的绒毛膜促性腺激素，配以月经激素或另一种促卵泡制剂。在治疗男性与性腺机能减退相关的滞后青春期时，每周施用二次500至1500单位的剂量；将剂量对血浆睾血激素浓度进行滴定。
目前，从原尿液样本分离和纯化人绒毛膜促性腺激素可采用各种不同的方法[Birken等人，”Endocrinology”，133(3)：1390-7页，(1993)；Sakakibara等人，”Chem. Pharm.Bull.”，35(5)：1414-6页，(1990)；Donini等人，”Acta Endocrinol.”，73(1)：133-45页，(1973)；]。最近，有人业已研究出一种亲合色谱法，也称膜过滤亲合色谱法，用于从尿液纯化人绒毛膜促性腺激素[Xu等人，”Protein expression and purification”，16：221-3页，(1999)]。这种方法不用溴化氰激活亲合色谱柱中的琼脂糖固相，这代表以亲合色谱法从尿液样本纯化人绒毛膜促性腺激素的常规方法的一种改进。根据该方法纯化的人绒毛膜促性腺激素的免疫活性为8554IU/mg。
重组人绒毛膜促性腺激素的优点是不含有其它促性腺激素和来源于人体的污染物，特别是人体尿液中的污染物。但是，重组人绒毛膜促性腺激素的原制剂含有其重组生产中所用的细胞中的所有其它蛋白质及污染物，因此迫切需要一种能使重组绒毛膜促性腺激素完全纯化的方法。
发明内容
我们已经发现，可以使一种从重组后得到的培养基浓缩样本或孕妇尿液原浓缩液衍生的人绒毛膜促性腺激素原制剂纯化到这样一种程度，所得的人绒毛膜促性腺激素基本上不含蛋白质或人绒毛膜促性腺激素原制剂中的其它污染物。
纯化过程是以离子交换色谱法和反相高效液相色谱法为基础进行的。可进一步使用尺寸排阻色谱柱使残留污染物完全除去。用离子交换色谱法至少洗脱两次所得的结果为最好。
本发明的方法可以用于纯化从重组后得到的培养基原制剂的重组人绒毛膜促性腺激素。所得的重组人绒毛膜促性腺激素的纯度和比生物活度(比生物活度在23,000和28,000IU/mg之间)非常高，基本上不含在培养基中常有的胎牛血清蛋白质、供重组过程用的宿主细胞所含有的核酸或其它污染物。
本发明的方法也可用于纯化孕妇尿液原浓缩液中的尿液人绒毛膜促性腺激素，以及纯化其它哺乳动物的绒毛膜促性腺激素，例如，牛、马、猪、羊、和猴。
本发明的目的在于提供一种将样本的人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，其包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。该方法包括以下步骤：用离子交换色谱法使样本洗脱，再用反相高效液相色谱法使洗脱液洗脱。以及一进一步的步骤是使洗脱液通过尺寸排阻色谱柱。
为了得到最好的纯化结果，在不同条件下优选用离子交换色谱法洗脱两次。本发明方法的优选实施例包括如下步骤：
(a)样本用硅胶色谱柱洗脱；
(b)用二乙氨基乙基(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；
(c)用羧甲基(CM)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；
(d)用硅胶C18反相高效液相色谱柱洗脱；以及
(e)用Sepharcyl尺寸排阻色谱柱洗脱。
在本发明的优选实施例中，用DEAE琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时采用pH值约等于7.5的磷酸钠缓冲液。
用CM琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时优选采用pH值约等于6的磷酸钠缓冲液。
反相高效液相色谱柱步骤(d)优选以异丙醇/Tris-磷酸盐(三(羟甲基)氨基甲烷-磷酸盐)缓冲液作为流动相。
本发明的绒毛膜促性腺激素优选是人绒毛膜促性腺激素，最好是重组人绒毛膜促性腺激素，其由重组过程用的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的培养基衍生。
本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物，它包括一由上述重组过程制备的有效治疗量的纯重组人绒毛膜促性腺激素，以及适当赋形剂。其中一种适当赋形剂是有助冻干产品稳定的蔗糖。重组人绒毛膜促性腺激素的药物组合物特别适合在皮下施用。
具体实施方式
本发明提供一种人绒毛膜促性腺激素的纯化方法，尤其是纯化重组过程培养基中原制剂的重组人绒毛膜促性腺激素。所得到的重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的纯度和比生物活度(比生物活度在23,000和28,000IU/mg之间)非常高，基本上没有培养基常有的胎牛血清(FBS)蛋白质以及供重组过程用的宿主细胞所含有的核酸或其它污染物。
本发明使用生物原料，特别是含有人绒毛膜促性腺激素和其它污染蛋白质的混合物，本文称之原料样本。下面详细叙述的实施例均采用含有重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的原料样本，其由一生物反应器的细胞上清液培养基制成。另一个样本是孕妇的原浓缩尿液。
样本是新鲜采集并在生物反应器灌流超过二天的细胞上清液培养基。最好将上清液过滤澄清。若需要，浓缩原溶液，并用C4硅胶色谱法洗脱以去除来自细胞培养基中的污染物。
然后，用离子交换色谱法洗脱过滤后的半纯化收集液，优选在不同条件下洗脱两次，再用反相高效液相色谱柱洗脱。第一次离子交换步骤优选采用DEAE琼脂糖，这是人绒毛膜促性腺激素”直通”必需步骤，该步骤可除去大部分非人绒毛膜促性腺激素蛋白质和脱氧核糖核酸(DNA)。第二次离子交换步骤优选采用CM琼脂糖柱，这是人绒毛膜促性腺激素的”结合”步骤，用于除去残留的DNA和宿主细胞或培养基蛋白质污染物。在一优选实施例中，该步骤是以pH值为6的磷酸钠缓冲液在5℃下进行洗脱。
硅胶C18反相高效液相色谱法可有效除去残留的核酸和由细胞培养基衍生的污染物。色谱柱优选以异丙醇/Tris-磷酸盐缓冲液作为流动相。存留液优选在截留分子量为10KD的滤膜上进行超滤，然后浓缩，并用pH值等于8的碳酸氢铵回收。浓缩的产品再用Sephacryl S200HR尺寸排阻色谱柱洗脱。在该步骤中，用pH值等于8的碳酸氢铵洗脱，按分子大小进行分离以除去仍可能存在的微量由细胞培养基衍生的污染物、潜在的原子团和游离的人绒毛膜促性腺激素亚基。然后，洗脱液要经透析，最好在pH值等于7的磷酸钠缓冲液中用截留分子量为10KD的滤膜进行超滤。过滤后的纯人绒毛膜促性腺激素本体溶液最好低温冷藏于消毒瓶中。
实施例1
试剂
氨，分析级
碳酸氢铵，分析级(英国药典)
磷酸氢二钠，分析级
绝对变性乙醇
磷酸，分析级(欧洲药典)
异丙醇，分析级(欧洲药典)
氯化钠，分析级(欧洲药典)
磷酸二氢钠，分析级
氢氧化钠颗粒，分析级(欧洲药典)
三氟乙酸(TFA)，高效液相色谱级
三-(羟甲基)氨基甲烷，分析级
纯化过程的流程简图
通过连续5步色谱步骤使从细胞培养过程得到的收集液纯化和浓缩。
下面的流程简图(表1)是重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)纯化过程的一优选实施例，简要列出色谱柱树脂和中间各步骤操作的要点。
表1：重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)纯化过程的流程简图
下面详细叙述流程图和纯化过程。收集步骤(步骤1)的条件就是当原料是重组来源时正常所采用的条件。
第一步：收集步骤
在这一步(步骤1)中，先要进行初步浓缩，并把缓冲液变成可控制组分。该步骤要先在室温下进行(硅胶C4色谱法)，然后降至约5℃。优选温度范围是5±3℃。在生物反应器生产周期的过程中各收集液重复步骤1。
(i)收集液的澄清
先将从生物反应器新鲜收集的培养基过滤澄清。
(ii)硅胶C4色谱法
把澄清的收集液装入预先用0.025M pH7的磷酸钠溶液平衡过的硅胶C4色谱柱。优选pH值范围是在6.6和7.7之间。用0.025M的磷酸钠溶液清洗色谱柱，直至紫外线显示器的信号回到基线。然后用含有34.2％(重量)异丙醇的0.025M的磷酸钠溶液对产品进行洗脱。
(iii)氨处理
把氨加入溶液中直至最后浓度达到1M。该混合物培养6小时。然后用2倍水稀释，并用85％的磷酸将pH值调至7.5。优选pH值范围是7.5±0.2。
(iv)浓缩和透析
在0.05M氢氧化钠溶液中储存的一些截留分子量为10KD的滤膜，在两批料之间要用注射水冲洗直至pH值下降到约等于8。
将产品浓缩和透析(通过在截留分子量为10KD的滤膜上进行超滤)以除去分子量小于10KD的物质和残余的异丙醇以及把氨溶液换成0.04M pH7.5的磷酸钠溶液。优选pH值范围是7.5±0.2。
为了使目标蛋白质浓度达到3-15mg/ml，用0.04M的磷酸钠溶液从滤膜上回收最后的存留液。
将溶液过滤，所得的浓缩液于-15℃冻存。
第二步：过滤及DEAE琼脂糖快速流动的离子交换色谱法
本色谱步骤是重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的”直通”步骤，其中大部分非重组人绒毛膜促性腺激素蛋白质和核酸被除去。过滤是在室温下进行，而产品流经色谱柱的色谱法步骤则在冷冻环境下进行。
(i)重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)原收集液的解冻和合并
把冷冻浓缩液解冻和合并。将同一群细胞产生的r-hCG原浓缩液合并成一批纯r-hCG来进行处理。根据纯化过程中下一色谱步骤的最大蛋白质结合能力(4毫克总蛋白质/毫克树脂)决定参加合并的r-hCG原浓缩液份数。
(ii)过滤澄清
r-hCG溶液优选通过过滤装置进行过滤，用0.04M pH7.5的磷酸钠溶液清洗过滤器。
将滤液和清洗液合并。
(iii)DEAE琼脂糖快速流动的离子交换色谱法
用0.04M pH7.5的磷酸钠溶液平衡以弱电性阴离子交换树脂DEAE琼脂糖FF填充的色谱柱。
将r-hCG溶液装入色谱柱。
向色谱柱通入0.04M pH7.5的磷酸钠溶液。层析的过程由280nm分光光度计监控。
排出主要废液，直至峰值开始洗脱。收集含有r-hCG的游离馏分。
第三步：羧甲基(CM)琼脂糖快速流动(FF)的离子交换色谱法
本色谱步骤可去除大部分宿主细胞污染物。该步骤在5℃下进行。优选温度范围是5±3℃。
(i)DEAE琼脂糖FF洗脱液的稀释
将注射水加入到DEAE琼脂糖FF洗脱液中，用85％的磷酸将pH值调至6。优选pH值范围是6±0.1。
(ii)羧甲基(CM)琼脂糖快速流动的离子交换色谱法
用0.02M pH6的磷酸钠缓冲液平衡以弱电性阳离子交换树脂羧甲基(CM)琼脂糖FF填充的色谱柱。优选pH值范围是6±0.1。
将r-hCG溶液装入色谱柱。
用0.02M pH6的磷酸钠缓冲液冲洗色谱柱。层析的过程由280nm分光光度计监控。
用0.13M pH6的磷酸钠缓冲液对产品进行洗脱。排出主要废液，直至峰值开始洗脱。
收集含有r-hCG的全部峰值馏分。在本步骤可选择将所得的产品过滤以去除病毒性污染物。
第四步：硅胶C18反相高效液相色谱法
本反相高效液相色谱法步骤有效除去残留的细胞培养基污染物、核酸残余和内毒素。然后进行截留分子量为10KD的超滤及选择性过滤。
(i)等分试样的制备
将等分试样的pH值调至5，并加入异丙醇至终浓度为15％(体积)。
(ii)硅胶C18反相高效液相色谱法
先用含有15％(体积)异丙醇的0.5M的三磷酸盐缓冲液平衡以硅胶C18填充的色谱柱。
将第一等分试样装入色谱柱，层析的过程由紫外线分光光度计监控。
用等量缓冲液清洗色谱柱。
然后，以0.5M异丙醇/三磷酸盐缓冲液为流动相，其异丙醇的浓度呈线性梯度由15％至25％(体积)，对r-hCG溶液进行洗脱。
当分光光度计(A280)检测到相应波峰，重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)就开始分离。将吸收率大于上升部分最大峰值高度65％的馏分和吸收率大于下降部分最大峰值高度20％的馏分合并。
再将4份含有合并馏分的r-hCG合并，并用等体积注射水(WFI)稀释。
将产品浓缩和对注射水透析(通过在截留分子量为10KD的滤膜上进行超滤)以滤去分子量小于10KD的物质和异丙醇。
通过超滤将产品对0.1M pH8的碳酸氢铵缓冲液透析。
所得的溶液约于+5℃储存，或者需要时也可冷冻储存。优选的储存温度分别是5±3℃和等于或低于-15℃。
第五步：Sepharcyl S-200HR尺寸排阻色谱法
本尺寸排阻色谱法步骤有效除去残留的由细胞培养基衍生的污染物、潜在的原子团和/或游离亚基。然后在截留分子量为10KD的滤膜上进行超滤。上述两步骤均需在约+5℃下进行。优选温度范围是5±3℃。
(i)尺寸排阻色谱法
用0.5M pH8的碳酸氢铵溶液平衡以Sepharcyl S-200HR树脂填充的色谱柱。优选pH值范围是8±0.2。
将r-hCG溶液装入色谱柱，开始用0.5M pH8的碳酸氢铵溶液洗脱。优选pH值范围是8±0.2。
在峰值起点开始收集r-hCG馏分，直到到达峰值下降部分的最大峰值高度50％的刻度。
(ii)在截留分子量为10KD的滤膜上超滤
在0.05M氢氧化钠溶液中储存的一些截留分子量为10KD的滤膜，在两批料之间要用注射水冲洗直至pH值下降到约等于8。
将产品浓缩和对注射水透析(通过超滤)。
再将产品对0.01M pH7的磷酸钠缓冲液透析(通过超滤)，并使蛋白质的最终浓度调至目标值3.5mg/ml。
所得的r-hCG本体溶液优选大约于-15℃冻存。
色谱树脂
纯化过程选用下列色谱树脂及平衡树脂。
步骤1：硅胶C4，250
ngstrom—50μm(
Millipore，美国)
步骤2：DEAE琼脂糖FF(Pharmacia，瑞典)
步骤3：CM琼脂糖快速流动(Pharmacia，瑞典)
步骤4：硅胶C18，300angstr
m—15-50μm(Vydac，美国)
步骤5：Sephacryl S-200HR(Pharmacia，瑞典)
供货商：
Amersham Pharmacia Biotech， Millipore Corporation
Bjrkgatan 30 17Cherry Hill Drive
S-75184，Uppsala Danvers，MA01923
Sweden USA
Vydac，The Separations Group，
17434Mojave St.
Hesperia，CA 92345
USA
结果
分子量和分子大小
SDS-PAGE
由SDS-PAGE相对已知分子量的标准蛋白质测定根据本发明的纯化方法制备的重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的相对分子量。
在非还原SDS-PAGE出现了一条分子量大约为70KD(在65-75KD之间)的r-hCG异二聚物的单宽带后，染上考马斯亮蓝。用蛋白质印迹法识别谱带。
生物活性
表2列出采用本发明的方法纯化之后，重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的不同批料的生物活性。由276.5nm，a＝0.812的分光光度计测量蛋白质浓度。
重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)制剂的平均比活度特别高，约等于25.000IU/mg。
表2
| r-Hcg批料 | 比活度[IU/mg] |
| BCEA 9901 | 24427 |
| BCEA 9902 | 26868 |
| BCEA 9903 | 25636 |
| BCEA 9904 | 27152 |
| BCEA 9905 | 23729 |
制剂
业已研制成两种具有本发明的高纯度重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG)的液体和冻干制剂。
液体制剂
在DIN 2R瓶内以甘露糖醇或蔗糖为赋形剂制成了两种1000IU/ml的液体制剂，并将这些制剂分别在50℃、40℃、25℃和4℃进行稳定性测试。
两种液体制剂的成分列于表3和表4中。
表3
| 成分 | 单位 | |
| 重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG) | IU/ml | 10000 |
| 蔗糖 | mg/ml | 102.6 |
| 磷酸 | mg/ml | 0.98 |
| 氢氧化钠 | 适量，至溶液的pH值为7.0 |
填充体积：0.5ml
表4
| 成分 | 单位 | |
| 重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG) | IU/ml | 10000 |
| 蔗糖 | mg/ml | 54.6 |
| 磷酸 | mg/ml | 0.98 |
| 氢氧化钠 | 适量，至溶液的pH值为7.0 |
填充体积：0.5ml
稳定性测试是通过生物分析、尺寸排阻/高效液相色谱法和反相高效液相色谱法进行的，所得结果显示甘露糖醇制剂比蔗糖制剂更稳定。所需要的冻存条件最好使蛋白质氧化和游离亚基的形成减至最低。
冻干制剂
在DIN 2R瓶内以蔗糖为赋形剂制成了强度为5000 IU的冻干制剂，分别于50℃、40℃、25℃和4℃对其稳定性进行测试。
制剂的成分列于表5中。
表5
| 成分 | 单位 | |
| 重组人绒毛膜促性腺激素(r-hCG) | IU/ml | 5000 |
| 蔗糖 | mg/ml | 30 |
| 磷酸 | mg/ml | 0.98 |
| 氢氧化钠 | 适量，至溶液的pH值为7.0 |
稳定性测试是通过生物分析、尺寸排阻/高效液相色谱法和反相高效液相色谱法进行的，所得结果显示这种冻干制剂的稳定性好，于40℃和50℃至少可储存19个星期。
在25℃和4℃进行了长达6个月的稳定性测试，结果显示有效成分没有出现降解的现象。
Claims (6)
1.一种从样本纯化重组人绒毛膜促性腺激素的方法，其特征在于：所述方法依次包括如下步骤：
(a)收集样本经硅胶色谱柱后的洗脱液；
(b)收集经DEAE琼脂糖离子交换色谱柱后的游离馏份；
(c)收集经CM琼脂糖离子交换色谱柱后的洗脱液；
(d)收集经硅胶C18反相高效液相色谱柱后的洗脱液；以及
(e)收集经Sephacryl尺寸排阻色谱后的洗脱液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述收集经DEAE琼脂糖离子交换色谱柱后的游离馏份用pH值等于7.5的磷酸钠缓冲液进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述收集经CM琼脂糖离子交换色谱柱后的洗脱液用pH值等于6的磷酸钠缓冲液进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(d)是以异丙醇/Tris-磷酸盐缓冲液作为流动相。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(e)是以碳酸氢铵缓冲液作为流动相。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样本来源于中国仓鼠卵巢细胞培养基。
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Cited By (1)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
| CA2582083A1 (en) * | 2004-10-04 | 2006-04-20 | Novetide, Ltd. | A counterion exchange process for peptides |
| CN1958603B (zh) * | 2005-11-04 | 2010-05-05 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种人绒毛膜促性腺素的纯化方法 |
| EA200802426A1 (ru) * | 2006-07-11 | 2009-04-28 | Коваль, Антон Александрович | Применение хорионического или лютеинизирующего гормона для профилактики или лечения возрастного гипогонадизма |
| CN101397339B (zh) * | 2008-09-24 | 2012-07-25 | 上海天伟生物制药有限公司 | 糖蛋白中去除/灭活病毒的方法 |
| TWI532495B (zh) | 2009-10-05 | 2016-05-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
| WO2012120535A2 (en) * | 2011-02-03 | 2012-09-13 | Sanzyme Limited | A composition comprising highly purified chorionic gonadotropin, it's formulation and uses of the same |
| EP2691119B1 (en) | 2011-03-31 | 2018-08-01 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation |
| WO2013102921A2 (en) * | 2011-11-17 | 2013-07-11 | Sanzyme Limited | Hcg - newer treatment modality for type 2 diabetes mellitus (t2dm) |
| CN103288950A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-09-11 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 改进柱分离工序洗涤液和洗脱液配比去除杂质的方法 |
| CN104101656A (zh) * | 2013-04-01 | 2014-10-15 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种促性腺激素的纯度测定方法 |
| US20150065426A1 (en) * | 2013-08-27 | 2015-03-05 | Professional Compounding Centers Of America | Testosterone Booster Transdermal Compositions |
| CN105968185A (zh) * | 2016-07-20 | 2016-09-28 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种绒促性素纯化方法 |
| CN111233999B (zh) * | 2020-03-21 | 2024-02-23 | 上海浦东明炎生物技术有限公司 | 一种从人尿中提取人绒毛膜促性腺激素的方法 |
| CN113398251B (zh) * | 2021-07-30 | 2022-08-05 | 宁波人健药业集团股份有限公司 | 一种重组人绒毛膜促性腺激素冻干粉针剂及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3045539B2 (ja) * | 1989-02-21 | 2000-05-29 | ワシントン ユニバーシティ | 改変型生殖ホルモン |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
| IT1254370B (it) * | 1992-05-22 | 1995-09-14 | Sorin Biomedica Spa | Procedimento per la purificazione di proteine da sistemi cellulari. |
| EP0814841B1 (en) | 1995-03-21 | 2001-12-05 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Hcg liquid formulations |
| HUP9900619A3 (en) * | 1996-02-20 | 2001-11-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins which form heterodimers |
| IT1287138B1 (it) * | 1996-11-07 | 1998-08-04 | Ibsa Inst Biochimique Sa | Procedimento per la separazione e purificazione di fsh e lh |
| AU8142198A (en) | 1997-06-12 | 1998-12-30 | Regents Of The University Of California, The | A transcription factor coactivator protein, p/cip |
| CA2289665C (en) * | 1997-06-13 | 2005-08-09 | Genentech, Inc. | Protein recovery by chromatography followed by filtration upon a charged layer |
| US6583109B1 (en) * | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
-
2001
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-
2002
- 2002-07-31 ZA ZA200206109A patent/ZA200206109B/en unknown
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- 2002-08-18 IL IL151308A patent/IL151308A/en active IP Right Grant
- 2002-08-21 NO NO20023985A patent/NO328694B1/no not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-06-17 HK HK03104314.8A patent/HK1052016A1/xx unknown
-
2006
- 2006-01-06 AU AU2006200059A patent/AU2006200059A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-08-28 US US11/846,118 patent/US20070299001A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-27 CY CY20081101218T patent/CY1108460T1/el unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Recombinant luteinizing hormone as a surivivaland differentiation factor increases oocyte maturationinrecombinant follicle stimulating hormone-supplementedmousepreantral follicle culture. Cortvrindt R等.Human Reproduction,Vol.13 No.5. 1998 |
| Recombinant luteinizing hormone as a surivivaland differentiation factor increases oocyte maturationinrecombinant follicle stimulating hormone-supplementedmousepreantral follicle culture. Cortvrindt R等.Human Reproduction,Vol.13 No.5. 1998 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101792481A (zh) * | 2010-03-12 | 2010-08-04 | 丽珠医药集团股份有限公司 | 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法 |
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| US20060079460A1 (en) | Purified LH | |
| Sinegubova et al. | Purification process of a recombinant human follicle stimulating hormone biosimilar (Primapur®) to yield a pharmaceutical product with high batch-to-batch consistency. Pharmaceutics. 2022; 14 (1): 96 |
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