CN101792481A

CN101792481A - 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法

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Publication number: CN101792481A
Application number: CN 201010132780
Authority: CN
Inventors: 万龙岩; 陈辉; 阮振兴
Original assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Livzon Pharmaceutical Group Inc
Current assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Livzon Pharmaceutical Group Inc
Priority date: 2010-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2030-03-12
Also published as: CN101792481B

Abstract

本发明提供一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化方法。与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法具有收率更高的优点，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

Description

一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种促性腺激素的纯化方法，特别是涉及一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化方法。

背景技术

促性腺激素(gonadotropin，gonadotropic hormone)是指能够促进雌雄两种性腺的发育，增加性激素分泌的一类激素，如脑垂体前叶分泌的黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，人胎盘绒毛膜分泌的绒毛膜促性腺激素(HCG)。其中HCG能刺激女性或男性的性腺活力，有促进体内性腺发育的作用，使性机能得到维持或兴奋，适量服用HCG后能使已衰退的或已出现病理性障碍的性分泌机能逐渐恢复正常。HCG由人类胎盘绒毛膜的合胞体滋层细胞合成和分泌，其大量存在于孕妇的尿液中。HCG的制备方法多以孕妇尿液作为原料，通过苯甲酸钠吸附、酒精抽提等过程得到大于120单位/mg的HCG粗品。而国内多采用一步阳离子交换树脂进行纯化得到单位效价大于2500iu/mg的精品，这些方法收率一般都小于80％，同时精品的效价在3000iu/mg左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化方法。与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

本发明提出的从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)用溶液A对HCG粗品进行提取，提取液流经阴离子交换树脂进行吸附，再用溶液B洗脱，得到洗脱液即为中间体I。

(2)中间体I经阴离子交换凝胶层析，用溶液C洗脱，向洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II。

(3)将中间体II用溶液D溶解，先后加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品。

其中所述溶液A为0.05-0.08mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液B为0.08-0.12mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸钠和0.05-0.15mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液D为含有8-12重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇溶液；溶液E为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.2-0.4mol/L醋酸钙溶液。

例如，在本发明的一种优选的实施方式中，所述溶液A为0.06mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至5.0；溶液B为0.1mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.8；溶液C含有0.1mol/L醋酸钠和0.1mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至5；溶液D为含有10％乙酸铵的40％乙醇溶液；溶液E为0.2mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.3mol/L醋酸钙溶液。

下面对步骤(1)中的操作进行详细的说明：所述提取的方式优选采用搅拌提取；优选情况下，提取液在吸附前先用3-8mol/L氢氧化钠调pH至4.5-5.0；所述阴离子交换树脂优选为DE-23阴离子交换树脂和/或DEAE阴离子交换树脂。

下面对步骤(2)的操作进行详细的说明：所述阴离子交换凝胶优选为CM·sephadax c-50；优选情况下，所述中间体I在经阴离子交换凝胶层析前调节其电导值，使中间体I的电导值比溶液B的电导值略低，pH值与溶液B相同；沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在干燥前先用无水乙醇对沉淀进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。

下面对步骤(3)中的操作进行详细的说明：除热原操作可以为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.5，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-12mol/L氢氧化钠调pH至7.5-8.0，离心后上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5；例如，在本发明的一种优选的实施方式中，除热原操作为在中速搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0，离心得到的上清液用冰醋酸调整pH至7.0；所述沉淀用乙醇可以为浓度为75-100体积％的乙醇，优选使用为95体积％的药用级乙醇；优选情况下，为了节约干燥时间，可以在干燥前先用无水乙醇对沉淀进行脱水；干燥操作优选采用真空干燥，进一步优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。优选地，所述除热原和分装均在十万级精烘包区域内进行。

本发明提供的纯化方法与现有技术中已有的HCG的提取纯化方法相比，本方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1本发明提供的从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例

工艺操作过程：

实施例使用的纯化工艺流程图如图1所示，具体的操作方法如下：

1混合、提取、吸附、洗脱：

1.1混合、提取：

精确称取绒毛膜促性腺激素粗品加入不锈钢桶内，再加入20倍量体积的溶液A搅拌提取，搅拌速度200-400转/分，控制温度0-15℃，提取1-1.5小时。在4000转/分、机内温度2-6℃条件下离心30分钟，取上清液，渣子再用10倍量体积溶液A搅拌提取1小时，在离心4000转/分、机内温度2-6℃条件下离心30分钟，取上清液。合并两部分上清液，用5mol/L氢氧化钠调pH值至4.5-5.0。

1.2吸附洗脱：

将上述溶液放置高位，流经一根DEAE填料柱(10L)，流速为80-100ml/min。控制温度0-15℃，用溶液B洗脱，洗脱速率为80-100ml/min，OD280明显上升时开始收集，OD280明显下降时停止收集，收集洗脱液(即中间体I)。调节洗脱液电导值比溶液B的电导值略低，pH值与B溶液一致，待上样。

2层析、洗脱、沉淀、干燥

2.1层析：

将上样液放置高位，温度0-10℃，流入一根CM·sephadax c-50柱，流速50-100ml/分钟，柱体积10L，上样完毕用B溶液洗涤(流速50-100ml/分钟)至流出液OD值在280nm处小于0.1/ml，同步观察色带是否均衡、平整，洗涤体积约2-3柱体积。

2.2洗脱：

洗涤完毕即用溶液C进行洗脱，流速50-100ml/分，用相应容器收集活性部分(紫外分光度计测定OD值，当OD值升至0.3/ml时开始收集，当OD值明显下移即停止收集)，收集液合并，量取体积，测定计算并记录其总OD值，得洗脱液。

2.3沉淀：

将洗脱液放置于不锈钢桶内，在搅拌下缓慢地加入5倍体积的-10-0℃的95％药用级乙醇，继续搅拌至沉淀物出现，移入冷库0-10℃高位存放过夜。

2.4干燥：

次日在冷库内虹吸去除上清液，沉淀部分移入离心室，用广口离心杯在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)10分钟，将上清液倾入规定收集桶内(回收)，沉淀物加入4-8倍量的-10℃的无水乙醇，用油画笔充分搅碎、搅匀，洗涤、脱水后，再在天平上平衡离心(4-6℃、4000转/分钟)10分钟，反复三次，弃去上清液后，沉淀连离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷)，真空度控制在-0.1Mpa，干燥24小时，其间更换5次五氧化二磷，得中间体II。将其保存于洁净的玻璃药瓶内，4℃冰箱内保存，并取样20mg置于洁净西林瓶内，加盖后贴上标签、测定生物效价。

3混和、除热原、沉淀、干燥、分装

3.1混和：

精确称取14g中间体II(约2000万单位)放入相应不锈钢容器内，加入200ml的0-15℃的溶液D，以台式无级调速搅拌机，中速搅拌至完全溶解。将溶解液倒入洁净广口离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)30-45分钟，弃渣，上清液倒入相应不锈钢容器内，补加溶液D至400ml，环境温度4-10℃。

3.2除热原：

在机械搅拌器中速搅拌下，向上述上清液中缓慢加入40ml溶液E，搅拌1小时，再滴加40ml溶液F，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0(用精密试纸测定)，搅拌30分钟，倒入洁净无热原带盖离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)1小时，弃渣，上清液中再缓慢加入40ml溶液E，搅拌1小时，再滴加40ml溶液F，搅拌30分钟，用10mol/L氢氧化钠调pH至8.0(用精密试纸测定)，倒入洁净无热原带盖离心杯内，在天平上平衡后离心(4-6℃、4000转/分钟)1小时，弃渣，上清液用冰醋酸调整pH至7.0。

3.3沉淀：

根据上清液体积放入相应不锈钢桶内，加4倍量-10-0℃的95％药用乙醇沉淀过夜。

3.4干燥：

次日倾去上清液，沉淀部分连同不锈钢桶移入离心室，沉淀部分倾入带盖无热原离心杯中，经天平平衡后，离心(4-6℃，4000转/分钟)10分钟，上清液倾入规定收集桶内(回收)。向沉淀中加入4-8倍量-10℃无水乙醇，用不锈钢药勺搅匀、搅拌研碎。洗涤脱水后再在天平上平衡，离心(4-6℃，4000转/分钟)10分钟，反复三次，弃去上清液后，装有沉淀物的离心杯用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内室温减压干燥(在不锈钢盘内放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更换4-5次五氧化二磷，干燥时间约30小时后，得无热原干燥品，在精密天平上称量后，保存于玻璃药瓶内，4℃冰箱保存。

3.5分装

将无热原块状成品放入无热原60目不锈钢筛网中，用玻璃研头研碎，放入相应无热原玻璃药瓶中，用洁净多孔滤纸加盖后，在真空干燥箱内，室温减压干燥(在放有五氧化二磷的条件下)，真空度控制在-0.1Mpa，更换1-2次五氧化二磷，干燥时间约10小时，取样150mg，根据药典标准作全项测定。成品加盖、密闭封口后保存于4℃冰箱内，待化验合格，办理入库手续。

以上除热原，分装操作均在10万级精烘包区域内进行。

其中在不同的实施例中使用的溶液的配方如表1所示：

表1

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	溶液A	0.06mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.07mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.05mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2
溶液B	0.1mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.09mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.11mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2	溶液A	0.06mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.07mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.05mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2
溶液B	0.1mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.8	0.09mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5	0.08mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至4.9	0.11mol/L醋酸钠，用冰醋酸调节pH至5.2	溶液C	含有0.1mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.8	含有0.08mol/L醋酸钠、0.11mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5	含有0.12mol/L醋酸钠、0.07mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.9	含有0.09mol/L醋酸钠、0.13mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5.2
溶液D	40体积％乙醇水溶液，含8重量％乙酸铵	30体积％乙醇水溶液，含10重量％乙酸铵	50体积％乙醇水溶液，含11重量％乙酸铵	45体积％乙醇水溶液，含9重量％乙酸铵	溶液C	含有0.1mol/L醋酸钠、0.1mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.8	含有0.08mol/L醋酸钠、0.11mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5	含有0.12mol/L醋酸钠、0.07mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至4.9	含有0.09mol/L醋酸钠、0.13mol/L氯化钠，用冰醋酸调节pH至5.2

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	溶液E	0.2mol/L磷酸钠	0.15mol/L磷酸钠	0.25mol/L磷酸钠	0.2mol/L磷酸钠
溶液F	0.3mol/L醋酸钙	0.25mol/L醋酸钙	0.35mol/L醋酸钙	0.3mol/L醋酸钙	溶液E	0.2mol/L磷酸钠	0.15mol/L磷酸钠	0.25mol/L磷酸钠	0.2mol/L磷酸钠

二、质量标准与检验方法

1.质量标准：

尿促性素粗品：每mg HCG效价3.7-5.0单位，干燥失重≤10％；

成品：每mg HCG效价≥150单位；

粗品→成品收率：＞90％。

2.检验方法

a.用溶媒(pH7.0±0.2的每1ml含有1mg牛血清蛋白的生理盐水溶液)将标准品和待测品分别配制成含HCG高、中、低三种浓度的溶液，相邻两个剂量的比值(r)为0.5，所有标准品和待测品溶液的高剂量浓度相同。

b.每次实验(同时安排2个标准品和8个待测品进行实验)将41-60g雌性大鼠按体重随机分成31组，每组8只，第1-30组为给药组，按顺序在每日基本相同的时间内，每鼠背部皮下注射HCG溶液0.5ml，连续给药3日，低、中、高剂量组每鼠接受的HCG剂量分别为1.0、2.0、4.0IU，第31组为空白对照组，仅注射溶媒，注射体积与给药组相同。

c.第4日上午按上述给药顺序处死动物，称取每鼠体重，解剖，取出卵巢，小心剥离随着的脂肪等组织，用滤纸吸干卵巢周围的水分并立即称重(精确到0.1mg)，计算每只大鼠的卵巢重(mg)与体重(g)的比值。用bs2000生物统计软件中量反应平等线3.3法计算生物效价。

参考“尿促性素第三批国家标准品的标定”，中国药品标准，2007年第8卷第4期第50-52页；《中国药典》[S]二部，2005，附录XII N。

三、检验结果：

检验结果如表2所示。

表2

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	每mg粗品的HCG效价	4.1	4.5	4.8	4.9
每mg成品的HCG效价	159	174	168	182	每mg粗品的HCG效价	4.1	4.5	4.8	4.9
每mg成品的HCG效价	159	174	168	182	粗品→成品收率	90.5％	94％	92％	95％

通过表2中的数据可以看出，本发明提供的绒毛膜促性腺激素的纯化方法收率可以达到90％以上，同时单位效价可以达到5000iu/mg以上。

Claims

1.一种从孕妇尿液中提取的绒毛膜促性腺激素的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)用溶液A对绒毛膜促性腺激素粗品进行提取，提取液流经阴离子交换树脂柱进行吸附，再用溶液B洗脱，得到洗脱液即为中间体I；

(2)中间体I经阴离子交换凝胶层析，用溶液C洗脱，向洗脱液中加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀得中间体II；

(3)将中间体II用溶液D溶解，加入溶液E和溶液F除热原，再加入乙醇进行沉淀，干燥沉淀，分装得成品；

其中所述溶液A为0.05-0.08mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液B为0.08-0.12mol/L醋酸钠溶液，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液C含有0.05-0.15mol/L醋酸钠和0.05-0.15mol/L氯化钠，以冰醋酸调节pH至4.5-5.5；溶液D为含有8-10重量％乙酸铵的20-60体积％乙醇溶液；溶液E为0.1-0.3mol/L磷酸钠溶液；溶液F为0.2-0.4mol/L醋酸钙溶液。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述提取操作采用搅拌提取。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在步骤(1)中，所述提取液在吸附前用4-5mol/L氢氧化钠调pH至4.5-5.0。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(2)中，在经阴离子交换凝胶柱层析前用调节所述中间体I的电导值，使中间体I的电导值比溶液B的电导值略低，pH值与溶液B相同。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的纯化方法，其中，步骤(1)中所述阴离子交换树脂为DE-23阴离子交换树脂和/或DEAE阴离子交换树脂；步骤(2)中所述阴离子交换凝胶为CM·sephadax c-50。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述除热原操作为在搅拌下，缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，用5-12mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5-8.5，搅拌后离心，上清液再缓慢加入溶液E，搅拌后再滴加溶液F，搅拌后用5-12mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.5-8.5，离心得到的上清液用冰醋酸调整pH至6.5-7.5。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(3)中，所述除热原和分装均在十万级精烘包区域内进行。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，所述沉淀用乙醇为95体积％的药用级乙醇。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，所述干燥前以无水乙醇对沉淀进行脱水。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的纯化方法，其中，在步骤(1)至(3)中，所述干燥操作采用真空干燥，优选在五氧化二磷存在条件下的真空干燥。