CN101496829A - 一种治疗消渴病的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

一种治疗消渴病的药物组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种治疗消渴病的药物组合物，本发明药物组合物主要由蚕沙和甘草组成。本发明还公开该药物组合物的制备方法和质量控制方法。本发明药物组合物除有降血糖作用外，尚有改善肠胀气的作用。

Description

一种治疗消渴病的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法，特别涉及一种治疗消渴病的药物组合物及其制备方法和质量控制方法。
背景技术
消渴病(糖尿病)的发病率在国内外日益增加，它严重地危害人们的健康甚至生命。据了解，目前全世界糖尿病患者2亿多人，其中85％是老年糖尿病患者；我国有3千万糖尿病患者，仅次于美国，而且正以每年75万新患者的速度递增。因此，糖尿病早已被国家列为“九五”重大疑难病之一，而目前中药降糖药的疗效不尽如人意，而治疗消渴病常用的拜唐苹等药能够导致肠胃胀气，肠鸣等副作用，因此，开展对消渴病的防治研究很有必要。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种治疗消渴病的药物组合物；本发明的另一个目的在于公开该药物组合物的制备方法和质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明药物组合物的原料组成为：
蚕沙6000-8000重量份     甘草100-200重量份。
本发明药物组合物的原料组成优选为：
蚕沙7150重量份          甘草137.5重量份。
本发明药物组合物的原料组成优选为：
蚕沙6150重量份          甘草187.5重量份。
本发明药物组合物的原料组成优选为：
蚕沙7850重量份          甘草117.5重量份。
本发明药物组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
本发明药物组合物的制备方法还可以包括：
取蚕沙，加入蚕沙2-6倍量的50％-70％乙醇，浸渍过夜，缓慢加热至沸，回流1-3次，每次0.5-1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，将除去乙醇后的滤液加热浓缩或在温度80℃以下减压浓缩至相对密度为0.95-1.10(在温度55℃时测)，得浓缩液，加入水继续加热至沸，冷却，放置过夜，取上清液A，上清液加热浓缩或在温度80℃下减压浓缩至相对密度为1.00-1.15(在温度55℃时测)的稠膏A，备用；另取甘草，用甘草8-15倍量水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液B浓缩至相对密度为1.00-1.15(在温度55℃测)的稠膏B，备用；合并稠膏A与稠膏B，按常规方法加入常规辅料制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
本发明药物组合物的制备方法优选为：
取蚕沙，加入蚕沙4倍量的60％乙醇，浸渍过夜，缓慢加热至沸，回流2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，将除去乙醇后的滤液加热浓缩或在温度80℃以下减压浓缩至相对密度为1.01～1.06(在温度55℃时测)的浓缩液，加入浓缩液1倍量的水继续加热至沸，冷却，放置过夜，取上清液A，浓缩至相对密度为1.06-1.15(在温度55℃时测)的稠膏A，备用；另取甘草，用甘草10倍量水煎煮2次，每次2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液B浓缩至相对密度为1.04-1.15(在温度55℃时测)的稠膏B，备用；合并稠膏A与稠膏B，按常规方法加入常规辅料制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
本发明药物组合物的质量控制方法包括如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：
A、取本发明药物组合物0.4-0.6重量份，加无水乙醇4-6体积份，40-80℃水浴回流20-40分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至0.5-1.5体积份，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.0005-0.0015重量份/体积份的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.001-0.003体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以18-21：0.3-0.7的三氯甲烷：丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％-15％磷钼酸溶液，于100-110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸＝50-70：30-50：0.5-1.5为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.005-0.015重量份，置50体积份量瓶中，用上述流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1体积份含甘草酸单铵盐0.0001-0.0003重量份，折合甘草酸为0.00019-0.00020重量份，制成对照品溶液；取本发明药物组合物1.0-3.0重量份，置25体积份的量瓶中，加上述流动相18-22体积份，以功率250W，频率50KHz进行超声处理20-40分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液，；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液0.005-0.015体积份，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。
含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠＝15-25:0.1-1:75-85的溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.004-0.006重量份，置50体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5-1.5体积份，置10体积份具塞试管中，加水0.5-1.5体积份，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1-3体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液1-3体积份，于60℃水浴中0.5-1.5小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定本发明药物组合物0.3-0.5重量份，置10体积份具塞试管中，加水充分振摇后，于50-70℃水浴中加热20-40分钟，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心5-15分钟，精密量取上清液1-3体积份，置10体积份具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1-3体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液1-3体积份，于50-70℃水浴中0.5-1.5小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.004-0.006体积份与供试品溶液0.005-0.015体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；本药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0001-0.0003重量份。
本发明药物组合物的质量控制方法优选如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：
A、取本发明药物组合物0.5重量份，加无水乙醇5体积份，60℃水浴回流30分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至1体积份，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.001重量份/体积份的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以19.5：0.5的三氯甲烷∶丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60：40：1的甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.01重量份，置50体积份量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1体积份含甘草酸单铵盐0.0002重量份，折合甘草酸为0.0001959重量份，制成对照品溶液；取本发明药物组合物2重量份，置25体积份的量瓶中，加上述流动相20体积份，以功率250W，频率50KHz进行超声处理30分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.01体积份，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。
含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21：0.5:79的乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.01重量份，置100体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取1体积份，置10体积份具塞试管中，加水1体积份，加0.8％ 2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2体积份，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定本发明药物组合物0.4重量份，置10体积份具塞试管中，加水5体积份，充分振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用水分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心10分钟，精密量取上清液2体积份，置10体积份具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2体积份，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.005体积份与供试品溶液0.01体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0002重量份。
本发明所述的重量份与体积份的比例为克/毫升。
本发明药物组合物除有降血糖作用外，尚有改善肠胀气的作用。长期给药(4周)后，能明显改善四氧嘧啶高血糖大鼠多食多饮等一般状况；能使血糖、血清果糖胺明显下降；使血清胆固醇含量明显下降，血清甘油三酯水平也有所降低；使血清NAG酶活性明显下降，说明对微血管并发症有改善作用；使坐骨神经中山梨醇含量明显减少，提示对糖尿病的慢性神经病变有改善作用；增加红细胞GSH含量，增强机体的抗氧化能力；还可明显降低肾重、体重指数，减少血清肌酐水平，缓解肾小管上皮细胞内的糖原沉积。
附图说明
图1MC正常小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响
图2MC对正常小鼠淀粉负荷后血糖曲线的影响
图3MC对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖曲线的影响
图4MC对四氧嘧啶高血糖小鼠淀粉负荷后血糖曲线的影响
图5MC对健康志愿受试者馒头实验后血糖曲线的影响
图6MC对四氧嘧啶高血糖大鼠尿糖的影响
图7MC对四氧嘧啶高血糖大鼠肾重体重指数的影响
图8正常大鼠肾脏、肾小球及肾曲管均未见病变×50
图9四氧嘧啶高血糖大鼠组部分肾曲管上皮细胞肿大呈空泡状×50
图10MC组大鼠肾曲管未见明显病变×50
下面实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
下述实验例均采用以下受试药物及实验动物：
受试药物：1、采用实施例1制备的本发明药物组合物浸膏粉，简称MC，中国医学科学院药物研究所提供，批号：96102，每克浸膏粉相当于16.7g生药；用水将MC浸膏粉溶解；2、拜唐苹(Acarbose)：德国Bayer药厂出品，批号为 264086D。
动物：昆明种小鼠，京动管质字(1994)第029号；wistar大鼠，京动管质字(1994)第030号，均购自中国医学科学院动物研究所繁育厂，小鼠22—25g，大鼠180—250g，性别：雄性，每组动物数：10只。
四氧嘧啶高血糖小鼠、大鼠模型：给正常动物静脉注射四氧嘧啶(小鼠90-100mg/kg，大鼠45-50mg/kg)，给药72小时后预测血糖(葡萄糖氧化酶法)，选用血糖值在11.1mmol/L以上者进行实验。
实验例1  MC对正常小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响
正常小鼠5组，每组10只，实验前禁食过夜，以一组4.0g/kg的口服蔗糖溶液作为对照组，一组口服蔗糖与拜唐苹Acarbose 10mg/kg作为阳性对照药组，其余三组分别口服蔗糖与不同剂量的MCO.45g/kg、0.9g/kg、1.8g/kg；测定0min及给药后30min、60min、120min时的血糖值，见图1，表1：
表1.MC对正常小鼠蔗糖负荷后血糖峰值、峰值时间和曲线面积的影响(mean±SD，n＝10)
AUC为血糖曲线下面积；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001；MC剂量为g/kg。
实验表明，MC能减少正常小鼠口服蔗糖后的血糖曲线下面积，使血糖峰值明显下降并后移，与拜唐苹的作用基本一致，且呈一定量效关系。
实验例2  MC对正常小鼠淀粉负荷后血糖升高的影响
正常小鼠50只，均分为5组，禁食过夜，一组以可溶性淀粉3.0g/kg灌胃作为对照组，一组口服淀粉与拜唐苹10mg/kg作为阳性药对照，另三组分别口服淀粉与不同剂量的MC(0.45g/kg，0.9g/kg，1.8g/kg)，测定0min及给药后30min、60min、120min时的血糖值，结果见图2，表2：
表2.MC对正常小鼠淀粉负荷后血糖峰值、峰值时间和曲线面积的影响(mean±SD，n＝10)
AUC为血糖曲线下面积；与对照组比较**P<0.01，***p<0.001；MC剂量为g/kg。
结果说明，MC能使正常小鼠口服淀粉负荷后血糖峰值明显降低并后移，使血糖曲线下面积明显减少，呈一定量效关系。
实验例3  MC对正常小鼠葡萄糖负荷后血糖升高的影响
正常小鼠4组，每组10只，禁食过夜，一组以葡萄糖4.0g/kg灌胃作为对照组，一组以葡萄糖与拜唐苹(10mg/kg)灌胃作为阳性药对照组，其余两组分别灌胃葡萄糖与不同剂量的MC(0.45g/kg，1.8g/kg)，测定0min及给药后30min、60min、120min时的血糖值，见表3：
表3.MC对正常小鼠葡萄糖负荷后血糖峰值、峰值时间和曲线下面积的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00141
AUC为血糖曲线下面积；MC剂量为g/kg。
结果表明，MC和拜唐苹类似，对正常小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖升高无明显影响。说明该药物不直接影响葡萄糖自肠道的吸收。
实验例4  MC对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖升高的影响
四氧嘧啶高血糖小鼠5组，每组10只，禁食过夜，一组以蔗糖4.0g/kg灌胃作为对照组，一组以蔗糖与拜唐苹(10mg/kg)灌胃作为阳性药对照，其余组分别灌胃蔗糖与不同剂量的MC(0.6g/kg，1.2g/kg，1.8g/kg)，测定0min及给药后30min、60min、120min时的血糖值，见图3，表4。
表4.MC对四氧嘧啶高血糖小鼠蔗糖负荷后血糖峰值、峰值时间和曲线下面积的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00142
AUC为血糖曲线下面积；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001；MC剂量为g/kg。
实验表明，不同剂量的MC，可明显减少四氧嘧啶高血糖小鼠口服蔗糖负荷后血糖的升高，明显减少血糖曲线下面积，使血糖峰值后移，其作用与拜唐苹类似。
实验例5  MC对四氧嘧啶高血糖小鼠淀粉负荷后血糖升高的影响
四氧嘧啶高血糖小鼠5组，每组10只，禁食过夜，一组以淀粉(3.0g/kg)灌胃作为对照组，一组给淀粉和拜唐苹(10mg/kg)，其余组给淀粉和不同剂量的MC(0.6g/kg，1.2g/kg，1.8g/kg)，测定0min及给药后30min、60min、120min时的血糖值，见图4，表5。
表5.MC对四氧嘧啶高血糖小鼠淀粉负荷后血糖峰值、峰值时间和曲线下面积的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00151
AUC为血糖曲线下面积；与对照组比较*P<0.05，**P<0.01，***p<0.001；MC剂量为g/kg。
结果说明，不同剂量的MC，能抑制四氧嘧啶高血糖小鼠口服淀粉负荷后血糖的升高，减少血糖曲线下面积，使血糖峰值后移。
实验例6  MC对健康自愿受试者馒头试验后血糖升高的影响
自愿受试者7名(本研究所工作人员)，男性2名，女性5名，年龄为25—62岁。第一次试验，清晨空腹，每人吃100g馒头(本所食堂提供)作为自身对照；第二次试验随机服用MC1.5g/人(4人)，3.0g/人(3人)与100g馒头同服，并测定空腹(0min)及食馒头后30min、60min、120min时的血糖值。两次实验间隔1周，结果见图5和表6。
表6.MC对健康志愿受试者馒头试验后血糖峰值、峰值时间和曲线下面积的影响(mean±SD)
AUC为血糖曲线下面积；自身前后比较*P<0.05，
Figure A200810057130D0015083644QIETU
P≈0.05
初步结果说明，MC能使正常人馒头试验后血糖峰值降低，并减少血糖曲线下面积，使峰值后移，并呈量效关系。
实验例7  MC对四氧嘧啶高血糖大鼠尿糖的影响：
三组四氧嘧啶高血糖大鼠，每组10只，一组进食高蔗糖饲料作为高血糖对照，第二、三组分别进食含不同剂量MC的高蔗糖饲料(折合剂量为0.6g/kg，1.2g/kg)，第四组为正常大鼠(10只)进食正常饲料作为正常对照组。两周后用代谢笼收集尿液测6小时尿糖含量，同时也收集第四组正常大鼠尿液进行测定，作为比较，结果见图6。
结果表明：正常大鼠尿中未测出葡萄糖，MC能明显降低四氧嘧啶高血糖大鼠的尿糖含量，并呈一定量效关系。
实验例8  MC对四氧嘧啶高血糖大鼠一般状况、血糖、血脂、果糖胺、血N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(简称NAG酶)活性、组织山梨醇含量、红细胞GSH含量、血清尿素氮及肌酐含量以及肾脏病理变化等的影响
三组四氧嘧啶高血糖大鼠，每组10只，第一组进食高蔗糖饲料作为高血糖对照，第二、三组分别进食含不同剂量MC的高蔗糖饲料(折合剂量为0.6g/kg，1.2g/kg)，第四组为正常大鼠(10只)进食正常饲料作为正常对照组。每天观察动物一般状况，记录进食量和进水量，4周后处死动物取血、晶状体、坐骨神经等组织，测定血糖、血脂、果糖胺、血NAG酶活性、组织山梨醇含量、红细胞GSH含量、血清尿素氮及肌酐含量等生化指标，并观察肾脏病理变化，结果如下：
1.摄食量和饮水量的变化，表7：
表7.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠摄食量、饮水量的影响(mean±SD)
Figure A200810057130D00161
与高血糖大鼠组比较**P<0.01，***P<0.001；MC剂量为g/kg
2.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血糖、果糖胺的影响，表8：
果糖胺是血浆蛋白质(以白蛋白为主)与葡萄糖分子在非酶糖化过程中经过分子重排形成的醛酮缩合物。由于白蛋白浓度在体内的稳定性，故血清果糖胺水平亦比较稳定。它反映1—2周内的血糖水平。
表8.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血糖、果糖胺的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00171
与高血糖大鼠组比较***P<0.001；MC剂量为g/kg
3.MC对血脂的影响，表9：
高血糖动物常伴有高血脂，降低血糖可使高血脂有所改善。血脂用酶方法测定，试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司。
表9.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血脂的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00172
与高血糖大鼠组比较，*P<0.05，
Figure A200810057130D0017083722QIETU
P≈0.05MC；剂量为g/kg
4.MC对血清NAG酶活性的影响，表10：
NAG酶是广泛存在于肾实质的一种溶酶体酶，与尿液白蛋白排量和视网膜微血管病变程度关系密切，是反映微血管病变的敏感指标。随着微血管病变加重，NAG酶活性增加。
表10.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血清NAG酶活性的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00173
与高血糖大鼠组比较**P<0.01；MC剂量为g/kg
5.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠晶状体和坐骨神经中山梨醇含量的影响，表11：
山梨醇途径与糖尿病的慢性并发症的发生和发展有着密切的关系。组织中山梨醇含量的升高程度，可直接反映山梨醇途径代谢的活跃程度。测定用亚砷酸钠-变色酸方法。
表11.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠晶状体、坐骨神经中山梨醇含量的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00181
与高血糖大鼠组比较***P<0.001；MC剂量为g/kg
6.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠红细胞中还原型谷光甘肽(GSH)含量的影响，表12：
自由基学说是从分子生物学水平来解释某些糖尿病慢性并发症的发生和发展的重要理论之一。高血糖状态下，红细胞的GSH常处于较低水平，因此测定组织细胞中的GSH，可了解机体抵御自由基损害能力的强弱。
表12.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠红细胞GSH含量的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00182
P值为与高血糖大鼠组比较；MC剂量为g/kg
7.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠的肾重、体重指数的影响，图7：
糖尿病肾脏肥大及高滤过现象是其出现最早的肾脏病理生理改变。能否控制糖尿病肾脏肥大常是本病治疗有无成效的标志之一。
8.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血清尿素氮、肌酐含量的影响(表13)：
测定血中尿素氮、肌酐水平可推测肾功能的变化。血清尿素氮、肌酐含量升高，则表示肾功能异常。方法用北京中生生物工程高技术公司的试剂盒法。
表13.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠血清尿素氮、肌酐含量的影响(mean±SD，n＝10)
Figure A200810057130D00191
与高血糖大鼠组比较*P<0.01；MC剂量为g/kg
9.MC对四氧嘧啶高血糖大鼠肾脏病理变化的影响：
实验各组大鼠肾脏用10％福尔马林固定，常规切片，苏木素伊红染色，光镜观察。正常大鼠肾脏结构正常(见图8)，未见任何病变；高血糖组大鼠部分肾脏的肾曲管上皮细胞肿大呈空泡状，细胞内糖原在制片过程中被溶解后，细胞膜清晰可见(见图9)；MC组大鼠肾曲管见不到此种改变(见图10)。糖原性肾病变系由增多的血糖通过肾小球后被肾曲管上皮细胞吸收所致，血糖及尿糖减少后，病变可以减轻。实验说明，MC在降低血糖及尿糖的同时，对肾曲管病变亦有所改善。
上述实验结果说明，MC长期给药(4周)后，能明显改善四氧嘧啶高血糖大鼠多食多饮等一般状况；能使血糖、血清果糖胺明显下降；使血清胆固醇含量明显下降，血清甘油三酯水平也有所降低；使血清NAG酶活性明显下降，说明对微血管并发症有改善作用；使坐骨神经中山梨醇含量明显减少，提示对糖尿病的慢性神经病变有改善作用；增加红细胞GSH含量，增强机体的抗氧化能力；还可明显降低肾重、体重指数，减少血清肌酐水平，缓解肾小管上皮细胞内的糖原沉积。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：胶囊剂的制备
蚕沙7.15kg    甘草0.1375kg
取蚕沙，加入蚕沙4倍量的60％乙醇，浸渍过夜，缓慢加热至沸，回流2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，浓缩至温度55℃、相对密度为1.01～1.06的浓缩液，加入1倍量的水继续加热至沸，冷却，放置过夜，取上清液A，浓缩至温度55℃、相对密度为1.06-1.15的稠膏A，备用；另取甘草，用甘草10倍量水煎煮2次，每次2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液B浓缩至温度55℃、相对密度为1.04-1.15的稠膏B，备用；合并稠膏A与稠膏B，加入常规辅料，按常规方法混匀，制粒，整粒，装入胶囊，即得1000粒，每次2-4粒，每日三次。
实施例2：片剂的制备
蚕沙7.15kg    甘草0.1375kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成片剂。
实施例3：颗粒剂的制备
蚕沙6.15kg    甘草0.1875kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成颗粒剂。
实施例4：丸剂的制备
蚕沙7.85kg    甘草0.1175kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成丸剂。
实施例5：蜜炼膏剂的制备
蚕沙7.15kg    甘草0.1375kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成蜜炼膏剂。
实施例6：口服液体制剂的制备
蚕沙6.15kg    甘草0.1875kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成口服液体制剂。
实施例7：注射制剂的制备
蚕沙7.85kg     甘草0.1175kg
取上述两味药材，按照常规方法，加入常规辅料，制成注射制剂。
实施例8：本发明药物组合物胶囊剂的含量测定方法和鉴别方法
鉴别：A、取实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂内容物0.5g，加无水乙醇5ml，60℃水浴回流30分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至1ml，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.001g/ml的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.002ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以19.5：0.5的三氯甲烷∶丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60：40：1的甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.01mg，置50ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含甘草酸单铵盐0.0002mg，折合甘草酸为0.0001959g，制成对照品溶液；取实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂内容物2g，置25ml的量瓶中，加上述流动相20ml，以功率250W，频率50KHz进行超声处理30分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.005ml，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21：0.5:79的乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.001g，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml具塞试管中，加水1ml，加0.8％ 2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定实施例1制备的本发明药物组合物胶囊剂内容物0.4g，置10ml具塞试管中，加水5ml，充分振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用水分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心10分钟，精密量取上清液2ml，置10ml具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.005ml与供试品溶液0.01ml，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0002g。
实施例9：本发明药物组合物散剂的鉴别方法
A、取本发明药物组合物散剂0.4g，加无水乙醇6ml，40℃水浴回流40分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至0.5ml，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.0015g/ml的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.001ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以21：0.3的三氯甲烷∶丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以15％磷钼酸溶液，于100℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸＝50：50：0.5为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.005g，置50ml量瓶中，用上述流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含甘草酸单铵盐0.0003g，折合甘草酸为0.00019g，制成对照品溶液；取本发明药物组合物散剂3.0g，置25ml的量瓶中，加上述流动相18ml，以功率250W，频率50KHz进行超声处理20分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液，；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液0.015ml，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰。
实施例10：本发明药物组合物颗粒剂的含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠＝15:1:75的溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.006g，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml，置10ml具塞试管中，加水1.5ml，加0.8％ 2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液3ml，于60℃水浴中0.5小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定本发明药物组合物颗粒剂0.5g，置10ml具塞试管中，加水适量，充分振摇后，于50℃水浴中加热40分钟，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心5分钟，精密量取上清液3ml，置10ml具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液3ml，于50℃水浴中1.5小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.004ml与供试品溶液0.015ml，注入液相色谱仪，测定，即得；本药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0001g。
实施例11：本发明药物组合物片剂的含量测定方法和鉴别方法
鉴别：A、取实施例2制备的本发明药物组合物片剂0.5g，加无水乙醇5g，60℃水浴回流30分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至1ml，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.001g/ml的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.002ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以19.5：0.5的三氯甲烷：丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21：0.5:79的乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mo1/L醋酸钠溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.005g，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置10ml具塞试管中，加水1ml，加0.8％ 2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2体积份，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定实施例2制备的本发明药物组合物片剂0.4g，置10ml具塞试管中，加水适量，充分振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心10分钟，精密量取上清液2ml，置10ml具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2ml和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2ml，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10ml量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.005ml与供试品溶液0.01ml，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0002g。

Claims (9)

1、一种药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：
蚕沙6000-8000重量份    甘草100-200重量份。
2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：
蚕沙7150重量份      甘草137.5重量份。
3、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：
蚕沙6150重量份       甘草187.5重量份。
4、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物的原料组成为：
蚕沙7850重量份       甘草117.5重量份。
5、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物加入常规辅料，按照常规工艺，制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
6、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取蚕沙，加入蚕沙2-6倍量的50％-70％乙醇，浸渍过夜，缓慢加热至沸，回流1-3次，每次0.5-1.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，将除去乙醇后的滤液加热浓缩或在温度80℃以下减压浓缩至相对密度为0.95-1.10，得浓缩液，加入水继续加热至沸，冷却，放置过夜，取上清液A，上清液加热浓缩或在温度80℃以下减压浓缩至55℃时测相对密度为1.00-1.15的稠膏A，备用；另取甘草，用甘草8-15倍量水煎煮1-3次，每次1-3小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液B浓缩至55℃时测相对密度为1.00-1.15的稠膏B，备用；合并稠膏A与稠膏B，按常规方法加入常规辅料制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
7、如权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
取蚕沙，加入蚕沙4倍量的60％乙醇，浸渍过夜，缓慢加热至沸，回流2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇，将除去乙醇后的滤液加热浓缩或在温度80℃以下减压浓缩至相对密度为1.01～1.06的浓缩液，加入浓缩液1倍量的水继续加热至沸，冷却，放置过夜，取上清液A，浓缩至55℃时测相对密度为1.06-1.15的稠膏A，备用；另取甘草，用甘草10倍量水煎煮2次，每次2小时，合并煎液，放置过夜使沉淀，取上清液B浓缩至55℃时测相对密度为1.04-1.15的稠膏B，备用；合并稠膏A与稠膏B，按常规方法加入常规辅料制成片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
8、如权利要求1、2、3或4所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：
A、取本发明药物组合物0.4-0.6重量份，加无水乙醇4-6体积份，40-80℃水浴回流20-40分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至0.5-1.5体积份，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.0005-0.0015重量份/体积份的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.001-0.003体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以18-21：0.3-0.7的三氯甲烷∶丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％-15％磷钼酸溶液，于100-110℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸＝50-70：30-50：0.5-1.5为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.005-0.015重量份，置50体积份量瓶中，用上述流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1体积份含甘草酸单铵盐0.0001-0.0003重量份，折合甘草酸为0.00019-0.00020重量份，制成对照品溶液；取本发明药物组合物1.0-3.0重量份，置25体积份的量瓶中，加上述流动相18-22体积份，以功率250W，频率50KHz进行超声处理20-40分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液，；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液0.005-0.015体积份，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；
含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠＝15-25：0.1-1：75-85的溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.004-0.006重量份，置50体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5-1.5体积份，置10体积份具塞试管中，加水0.5-1.5体积份，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1-3体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液1-3体积份，于60℃水浴中0.5-1.5小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定本发明药物组合物0.3-0.5重量份，置10体积份具塞试管中，加水充分振摇后，于50-70℃水浴中加热20-40分钟，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用水分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心5-15分钟，精密量取上清液1-3体积份，置10体积份具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液1-3体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液1-3体积份，于50-70℃水浴中0.5-1.5小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分数次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.004-0.006体积份与供试品溶液0.005-0.015体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；本药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0001-0.0003重量份。
9、如权利要求8所述的药物组合物的质量控制方法，其特征在于该方法包括如下鉴别和/或含量测定中的一种或几种：
鉴别：
A、取本发明药物组合物0.5重量份，加无水乙醇5体积份，60℃水浴回流30分钟，放置，取上清液，置水浴上蒸至1体积份，作为供试品溶液；另取β-谷甾醇作对照品，加无水乙醇制成0.001重量份/体积份的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各0.002体积份，分别点于同一硅胶G薄层板上，以19.5：0.5的三氯甲烷∶丙酮为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
B、用高效液相色谱法进行鉴别，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60：40：1的甲醇-0.2mol/L醋酸铵-冰醋酸为流动相；检测波长为250nm；理论板数按甘草酸铵峰计算应不低于2000；精密称定甘草酸单铵盐对照品0.01重量份，置50体积份量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，每1体积份含甘草酸单铵盐0.0002重量份，折合甘草酸为0.0001959重量份，制成对照品溶液；取本发明药物组合物2重量份，置25体积份的量瓶中，加上述流动相20体积份，以功率250W，频率50KHz进行超声处理30分钟，取出，放冷，加流动相至刻度，摇匀，离心，取上清液，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.005体积份，注入液相色谱仪，供试品应呈现与对照品保留时间相同的色谱峰；
含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21：0.5：79的乙腈—二甲基甲酰胺—0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相；检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；精密称定派可林酸对照品0.01重量份，置100体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取1体积份，置10体积份具塞试管中，加水1体积份，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2体积份，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；精密称定本发明药物组合物0.4重量份，置10体积份具塞试管中，加水5体积份，充分振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用水分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；以每分钟12000转离心10分钟，精密量取上清液2体积份，置10体积份具塞试管中，加0.8％2，4—二硝基氟苯乙腈溶液2体积份和0.5mol/L碳酸氢钠溶液2体积份，于60℃水浴中1小时，取出，放冷，移至10体积份量瓶中，用0.2mol/L、pH7.0磷酸盐缓冲液分3次洗涤容器，洗液并入量瓶中，加上述磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，制成供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.005体积份与供试品溶液0.01体积份，注入液相色谱仪，测定，即得；本发明药物组合物按日服用剂量计含蚕沙以派可林酸C6H11NO2计，不得少于0.0002重量份。
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