CN104007206A - 一种蚕沙药材的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药材检测领域，具体涉及一种蚕沙药材的检测方法，该检测方法通过HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量，进而对蚕沙药材进行检测。本发明的检测方法快速、全面、针对性强，有利于对该药材的质量进行有效控制，有助于提高该药材使用的安全性和稳定性。

Description

一种蚕沙药材的检测方法
技术领域
本发明属于中药材检测领域，具体涉及一种蚕沙药材的检测方法。
背景技术
蚕沙又称晚蚕沙、蚕屎、马鸣肝、晚蚕矢、二蚕沙等，为蚕娥科昆虫家蚕的干燥粪便。干燥的蚕沙呈圆柱型小粒，微有青草气，色黑，坚实，均匀。临床上，蚕沙具有祛风除湿、活血定痛之功能，治疗除风湿痹痛、风疹瘙痒、头风头痛、皮肤不仁、关节不遂、急剧吐泻转筋、腰脚冷涌、烂弦风眼等症。研究表明，蚕沙中主要有效部位是总生物碱，其代表成分为1-脱氧野尻霉素，该生物碱是一种天然糖的结构类似物，具有很高的a-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。
然而现有的蚕沙药材的检测方法通常采用茚三酮反应或TLC鉴别或对派可林酸进行检测，不仅检测的指标较为单一，而且不能检测其中的生物碱的含量，不利于从整体上对该药材或者含有该药材的药物的质量进行有效控制。因此，建立一种快速、全面、针对性强的蚕沙药材的质量检测及质量控制的方法具有重要的意义。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有的蚕沙药材的检测方法检测的指标较为单一，不能检测其中的生物碱的含量，不利于从整体上对该药材或者含有该药材的药物的质量进行有效控制，从而提出一种快速、全面、针对性强的蚕沙药材的质量检测及质量控制的方法。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案来实现：
本发明的一种蚕沙药材的检测方法，该检测方法包括如下对1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤：
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品5-15mg，加水稀释制成每mL含0.1-0.5mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为1-3％的NaHCO3溶液1-4mL以及1-3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液1-4mL，混匀并于30-60℃进行水浴反应20-40min，随后以30-60％的乙腈定容至20-30mL，作为对照品溶液；
取待测药材研细，并精密称取0.5-2.0g，加入用浓盐酸调pH值为3-4的水30-60mL，搅拌均匀，超声处理20-30min，并离心取上清液；残渣加pH值为3-4的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至10-20mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理1-5分钟，并加水定容至20-30mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为1-3％的NaHCO3溶液1mL、以及1-3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以30-60％的乙腈定容至20-30mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明上述蚕沙药材的检测方法，所述对1-脱氧野尻霉素的含量进行测定的步骤包括：
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品10mg，加水稀释制成每mL含0.2mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为2％的NaHCO3溶液1mL以及2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以50％的乙腈定容至25mL，作为对照品溶液；
取待测药材研细，并精密称取1g，加入用浓盐酸调pH值为3-4的水50mL，搅拌均匀，超声处理30min，并离心取上清液；残渣加pH值为3-4的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至20mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理2分钟，并加水定容至25mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为2％的NaHCO3溶液1mL、以及1mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以50％的乙腈定容至25mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明上述蚕沙药材的检测方法，上述1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤中，上述阳离子交换树脂柱为D001-CC型阳离子交换树脂柱，树脂体积为50mL，径高比为1：8。
本发明蚕沙药材的检测方法，还包括将上述阳离子交换树脂进行前处理的步骤，上述前处理具体包括如下步骤：用等体积的2M盐酸浸泡D001-CC型离子交换树脂4小时以上；再用4倍树脂体积的2M盐酸冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M NaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M NaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；用3倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性，即可。
本发明上述蚕沙药材的检测方法，上述1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤中，上述超声处理的条件为：功率300W，频率50KHz。
本发明上述蚕沙药材的检测方法，该方法还包括如下鉴别和/或含量测定的步骤中的至少一种：
A、茚三酮反应
取待测药材粉末0.1-0.3g，置具塞试管中，加热水3-7mL，加塞振摇并滤过；取滤液1mL，加茚三酮试液3～4滴，摇匀，放入沸水浴中加热，观察溶液颜色变化；
B、TLC鉴别
取待测药材粗粉约0.5-1.5g，加无水乙醇5-15mL，加热回流半小时，放冷，滤过，滤液用少许活性炭脱色，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液；
另取β-谷甾醇对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为18-19.8:0.2-2.0的三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘干15分钟，鉴别；
C、HPLC法测定派可林酸的含量
精密称定派可林酸对照品3-8mg，加水稀释定容至50mL；精密量取0.5-2.0mL溶液，依次加水0.5-2.0mL、加质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1-3mL以及0.5mol/L的碳酸氢钠溶液1-3mL，于60-90℃水浴反应0.5-2.0小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液；
精密称定待测药材0.3-0.8g，加水振摇后，于60-90℃水浴中加热20-40分钟，放冷后加水定容至10mL，摇匀并离心后，精密量取上清液1-3mL，并依次加入质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1-3mL和0.5mol/L的碳酸氢钠溶液1-3mL，于60-90℃水浴反应0.5-2.0小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为15-25：0.1-1：75-85的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相，检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；
分别精密吸取对照品溶液4-6μL与供试品溶液5-15μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明上述蚕沙药材的检测方法，该方法还包括如下鉴别和/或含量测定的步骤中的至少一种：
A、茚三酮反应
取待测药材粉末0.2g，置具塞试管中，加热水5mL，加塞振摇5分钟，滤过；取滤液1mL，加茚三酮试液3～4滴，摇匀，放入沸水浴中加热，观察溶液颜色变化；
B、TLC鉴别
取待测药材粗粉约1g，加无水乙醇10mL，加热回流半小时，放冷，滤过，滤液用少许活性炭脱色，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液；
另取β-谷甾醇对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19.5:0.5的三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘干15分钟，鉴别；
C、HPLC法测定派可林酸的含量
精密称定派可林酸对照品5mg，加水稀释定容至50mL；精密量取1mL溶液，依次加水1mL、加质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL以及0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液；
精密称定待测药材0.4g，加水振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，放冷后加水定容至10mL，摇匀并离心后，精密量取上清液2mL，并依次加入质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为21：0.5：79的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相，
检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；
分别精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。
本发明的上述蚕沙药材的检测方法，通过HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量对蚕沙进行检测，该检测方法快速、全面、针对性强，有利于对该药材的质量进行有效控制，有助于提高该药材使用的安全性和稳定性。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1的1-脱氧野尻霉对照品色谱图；
图2是本发明实施例1的蚕沙供试品色谱图；
图3是本发明实施例1的试剂空白色谱图；
图4是本发明实施例1的1-脱氧野尻霉素标准曲线图。
具体实施方式
实施例1 HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量
1仪器与试药
Agilent-1200高效液相色谱仪包括：真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，二级管阵列检测器(DAD)，Agilent-Chemistation数据处理系统(Agilent公司)；超纯水器(MilliQ-Gradient型)；超声波发生器(昆山KQ-300E型)。
1-脱氧野尻霉素对照品(购于SIGMA公司)，芴甲氧羰酰氯(购于SIGMA公司)，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备
取1-脱氧野尻霉素对照品约10mg，精密称定，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每mL含0.2mg的对照品溶液。精密量取1mL，至25mL量瓶中，加入2％NaHCO3溶液1mL，振摇10秒，精密加入2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液(FMOC-Cl)4mL，振摇10秒，30℃水浴反应40min，用50％乙腈定容至25mL，即得。
2.1.2 供试品溶液的制备
D001-CC型阳离子交换树脂的前处理：顺次用等体积的2M盐酸浸泡D001-CC型离子交换树脂4小时以上，再用4倍树脂体积的2M盐酸冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M NaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M NaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；再用3倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性，备用。
取待测蚕沙药材研细，取约1g，精密称定，置100mL烧杯中，加用浓盐酸调pH值为3-4的水50mL，搅拌均匀，超声处理(功率300W，频率50KHz)30min，离心10min(4000转/min)，分取上清液，残渣加pH值为3-4的水适量洗涤，离心10min(4000转/min)，合并上清液，浓缩至约20mL。置已处理过的D001-CC型阳离子交换树脂柱(树脂体积50mL，径(2.5cm)高比：1：8，H+)，先用60mL水洗脱，弃去洗脱液，再用0.5M氨水600mL洗脱(洗脱速度为2.5mL/min)，收集氨水洗脱液，浓缩至近干，加水10mL，超声处理(功率300W，频率50KHz)2分钟，转移到25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取1mL，至25mL量瓶中，加入2％NaHCO3溶液1mL，振摇10秒，精密加入1mL/min的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液(FMOC-Cl)4mL，振摇10秒，30℃水浴反应40min，用50％乙腈定容至25mL，即得。
2.1.3 空白样品溶液制备
按照2.1所列供试品溶液的制备方法，制备不含所述供试品的空白样品溶液。
2.1.4 空白试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；选用Agilent Hypersil ODS-C18色谱柱(4.0mm×250mm,5μm)，二级管阵列检测器(检测波长263nm)；流动相：乙睛-0.2％磷酸溶液；流速：1.0mL/min，进样量20μL，理论板数(按1-脱氧野尻霉素峰计算)应不低于6000。
2.2 色谱条件
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：Agilent Hypersil ODS-C18(4.0mm×250mm,5um)，二级管阵列检测器(检测波长263nm)；流动相：乙睛-0.2％磷酸溶液；流速：1.0mL/min，进样量20uL。梯度洗脱如下：
时间 乙腈 0.2％磷酸溶液
0 25 75
8 25 75
40 50 50
45 50 50
46 25 75
75 25 75
理论板数(按1-脱氧野尻霉素峰计算)应不低于6000。
在此色谱条件下，1-脱氧野尻霉素峰与其他杂质峰分离较好，对照品溶液、供试品溶液、试剂空白溶液色谱见图1、图2、图3。
2.3 系统适用性试验
按2.1所列试验条件下方法试验，对样品峰和对照品峰的理论板数、分离度等参数进行了测试，见表1。
表1 系统适用性测定结果
成分 理论板数(Plates) 分离度(Resolution)
1-脱氧野尻霉素样品 17874 8.59
对照品 40192 11.71
2.4 空白试验
分别吸取1-脱氧野尻霉素对照品溶液、蚕沙供试品溶液和试剂空白溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，结果见图1、2、3，结果表明样品在与对照品色谱峰相应的保留时间处出现色谱峰，空白试剂在1-脱氧野尻霉素色谱峰相应的保留时间处无峰。
2.5 线性关系考察
精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量，加水溶解，制成每1mL含0.239mg的对照品溶液。按2.1所列对照品溶液制备方法，制得对照品溶液(Ⅰ)；另取对照品溶液按2.1所列对照品溶液制备方法制备，定容至10mL，制成每1mL含0.598mg的对照品溶液(Ⅱ)。精密吸取对照品溶液(Ⅰ)1μL、5μL、10μL、15μL、20μL，对照品溶液(Ⅱ)20μL，同2.2所列色谱条件进行测定，结果见表2。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值(AUm)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图4。1-脱氧野尻霉素回归方程Y＝186.08X-4.2317,相关系数r＝1.0000，表明1-脱氧野尻霉素在0.239μg～11.960μg范围内呈良好的线性关系。
表2 1-脱氧野尻霉素线性关系考察表
NO. 进样量(μg) 1-脱氧野尻霉素峰面积
1 0.239 43.37804
2 1.195 218.66352
3 2.390 439.17780
4 3.585 661.29566
5 4.780 882.85656
6 11.96 2220.93921
2.6 精密度试验
精密吸取每1mL含1-脱氧野尻霉素0.239mg的对照品溶液1mL，至25mL量瓶中，加入2％NaHCO3溶液1mL，振摇10秒，精密加入2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液(FMOC-Cl)4mL，振摇10秒，30℃水浴反应40min，用50％乙腈定容至25mL，精密吸取10uL，连续重复注入液相色谱仪9次，按2.1所列色谱条件测定峰面积，求相对标准偏差，以1-脱氧野尻霉素峰面积计RSD为0.4％。表明仪器精密度良好，结果见表3。
表3 1-脱氧野尻霉素精密度试验结果
2.7 稳定性试验
取批号为120101的蚕沙样品溶液，分别在制备后18小时、24小时、32小时、37小时、42小时进样，按2.2所列色谱条件进行分析，结果见表4。1-脱氧野尻霉素在0～42小时内峰面积的RSD为1.7％。结果表明，样品放置42小时内稳定。
表4 1-脱氧野尻霉素稳定性试验结果
2.8 重复性试验
取同一批号(120101)蚕沙样品,按2.1所列含量测定方法进行6次平行测定,结果见表5。1-脱氧野尻霉素含量的RSD为1.7％,表明该方法的重复性良好。
表5 1-脱氧野尻霉素重复性试验结果
2.9 回收率试验
取已知含量的同一批蚕沙样品(批号：120101)6份，每份约0.5g，采用加样回收，分别按下表精密加入一定量的1-脱氧野尻霉素对照品，按供试品溶液的制备方法及2.2所列色谱条件进行测定，计算回收率。回收率测定结果见表6。表明本法的回收率符合规定，方法可行。
表6 1-脱氧野尻霉素回收率测定结果
2.10 样品含量测定
分别对以下6批样品按2.1所列蚕沙含量测定方法进行测定，结果见表7。
表7 蚕沙6批样品含量测定结果
NO. 批号 1-脱氧野尻霉素含量(mg/g)
1 090504 0.030
2 111201 0.063
3 111202 0.032
4 120101 0.054
5 130101 0.080
6 130301 0.028
根据拟定的含蚕沙的药物制剂中1-脱氧野尻霉素含量限度，如果将蚕沙药材提取率控制在30％以上，则暂定蚕沙含1-脱氧野尻霉素(C6H13NO4)不得少于0.025％。
实施例2 HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品15mg，加水稀释制成每mL含0.1mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为1％的NaHCO3溶液4mL以及1mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液1mL，混匀并于30℃进行水浴反应20min，随后以30％的乙腈定容至20mL，作为对照品溶液。
取待测药材研细，并精密称取0.5g，加入用浓盐酸调pH值为3的水30mL，搅拌均匀，超声处理20min，并离心取上清液；残渣加pH值为3的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至10mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理1分钟，并加水定容至20mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为1％的NaHCO3溶液1mL、以及1mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以30％的乙腈定容至20mL，作为供试品溶液。
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000。
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
实施例3 HPLC法测定1-脱氧野尻霉素的含量
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品5mg，加水稀释制成每mL含0.5mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为3％的NaHCO3溶液2mL以及3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液2mL，混匀并于60℃进行水浴反应40min，随后以60％的乙腈定容至30mL，作为对照品溶液。
取待测药材研细，并精密称取2.0g，加入用浓盐酸调pH值为4的水60mL，搅拌均匀，超声处理30min，并离心取上清液；残渣加pH值为4的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至20mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理5分钟，并加水定容至30mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为3％的NaHCO3溶液1mL、以及3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以60％的乙腈定容至30mL，作为供试品溶液。
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000。
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
实施例4 茚三酮反应
取待测药材粉末0.2g，置具塞试管中，加热水5mL，加塞振摇5分钟，滤过。取滤液1mL，加茚三酮试液3～4滴，摇匀，放入沸水浴中加热，溶液由橙红色变紫红色。
实施例5 TLC鉴别
取待测药材粗粉约1g，加无水乙醇10mL，加热回流半小时，放冷，滤过，滤液用少许活性炭脱色，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液。
另取β-谷甾醇对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮(体积比19.5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘干15分钟，鉴别。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例6 HPLC法测定派可林酸的含量
精密称定派可林酸对照品5mg，加水稀释定容至50mL；精密量取1mL溶液，依次加水1mL、加质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL以及0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液。
精密称定待测药材0.4g，加水振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，放冷后加水定容至10mL，摇匀并离心后，精密量取上清液2mL，并依次加入质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为供试品溶液。
照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为21：0.5：79的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相，检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500。
分别精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。
待测药材每100g含派可林酸(C6H11NO2)不得少于5.0mg。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种蚕沙药材的检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下对1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤：
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品5-15mg，加水稀释制成每mL含0.1-0.5mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为1-3％的NaHCO3溶液1-4mL以及1-3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液1-4mL，混匀并于30-60℃进行水浴反应20-40min，随后以30-60％的乙腈定容至20-30mL，作为对照品溶液；
取待测蚕沙药材研细，并精密称取0.5-2.0g，加入用浓盐酸调pH值为3-4的水30-60mL，搅拌均匀，超声处理20-30min，并离心取上清液；残渣加pH值为3-4的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至10-20mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理1-5分钟，并加水定容至20-30mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为1-3％的NaHCO3溶液1mL、以及1-3mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以30-60％的乙腈定容至20-30mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
2.根据权利要求1所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，所述对1-脱氧野尻霉素的含量进行测定的步骤包括：
精密称定1-脱氧野尻霉素对照品10mg，加水稀释制成每mL含0.2mg的对照品储备液；精密量取1mL所述对照品储备液，并精密加入质量浓度为2％的NaHCO3溶液1mL以及2mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以50％的乙腈定容至25mL，作为对照品溶液；
取待测药材研细，并精密称取1g，加入用浓盐酸调pH值为3-4的水50mL，搅拌均匀，超声处理30min，并离心取上清液；残渣加pH值为3-4的水适量洗涤，离心合并上清液，并浓缩至20mL；将浓缩液置于阳离子交换树脂柱，先用水洗脱，收集并弃去水洗脱液，再用0.5M氨水洗脱，并收集氨水洗脱液，浓缩至近干，随后加水10mL溶解，超声处理2分钟，并加水定容至25mL，得到供试品储备液；精密量取1mL所述供试品储备液，依次加入质量浓度为2％的NaHCO3溶液1mL、以及1mg/mL的芴甲氧羰酰氯乙腈溶液4mL，混匀并于30℃进行水浴反应40min，随后以50％的乙腈定容至25mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙睛为流动相A、以0.2％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-8min，A：B为25％：75％；8-40min，A：B为25％：75％→50％：50％；40-45min，A：B为50％：50％；45-46min，A：B为50％：50％→25％：75％；46-75min，A：B为25％：75％；控制流速1.0mL/min，柱温25℃，检测波长263nm，理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于6000；
精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定。
3.根据权利要求1或2所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，所述1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤中，所述阳离子交换树脂柱为D001-CC型阳离子交换树脂柱，树脂体积为50mL，径高比为1：8。
4.根据权利要求3所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，还包括将所述阳离子交换树脂进行前处理的步骤，所述前处理具体包括如下步骤：用等体积的2M盐酸浸泡D001-CC型离子交换树脂4小时以上；再用4倍树脂体积的2M盐酸冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2MNaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性；用5倍树脂体积的2M NaOH溶液冲洗树脂，水洗至中性；用3倍树脂体积的2M盐酸溶液冲洗树脂，水洗至中性，即可。
5.根据权利要求1-4任一所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，所述1-脱氧野尻霉素的含量测定步骤中，所述超声处理的条件为：功率300W，频率50KHz。
6.根据权利要求1-5任一所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，该方法还包括如下鉴别和/或含量测定的步骤中的至少一种：
A、茚三酮反应
取待测药材粉末0.1-0.3g，置具塞试管中，加热水3-7mL，加塞振摇并滤过；取滤液1mL，加茚三酮试液3～4滴，摇匀，放入沸水浴中加热，观察溶液颜色变化；
B、TLC鉴别
取待测药材粗粉约0.5-1.5g，加无水乙醇5-15mL，加热回流半小时，放冷，滤过，滤液用少许活性炭脱色，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液；
另取β-谷甾醇对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为18-19.8：0.2-2.0的三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘干15分钟，鉴别；
C、HPLC法测定派可林酸的含量
精密称定派可林酸对照品3-8mg，加水稀释定容至50mL；精密量取0.5-2.0mL溶液，依次加水0.5-2.0mL、加质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1-3mL以及0.5mol/L的碳酸氢钠溶液1-3mL，于60-90℃水浴反应0.5-2.0小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液；
精密称定待测药材0.3-0.8g，加水振摇后，于60-90℃水浴中加热20-40分钟，放冷后加水定容至10mL，摇匀并离心后，精密量取上清液1-3mL，并依次加入质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液1-3mL和0.5mol/L的碳酸氢钠溶液1-3mL，于60-90℃水浴反应0.5-2.0小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为15-25：0.1-1：75-85的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相，检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；
分别精密吸取对照品溶液4-6μL与供试品溶液5-15μL，注入液相色谱仪，测定。
7.根据权利要求6所述的蚕沙药材的检测方法，其特征在于，该方法还包括如下鉴别和/或含量测定的步骤中的至少一种：
A、茚三酮反应
取待测药材粉末0.2g，置具塞试管中，加热水5mL，加塞振摇5分钟，滤过；取滤液1mL，加茚三酮试液3-4滴，摇匀，放入沸水浴中加热，观察溶液颜色变化；
B、TLC鉴别
取待测药材粗粉约1g，加无水乙醇10mL，加热回流半小时，放冷，滤过，滤液用少许活性炭脱色，滤过，滤液浓缩至约1mL，作为供试品溶液；
另取β-谷甾醇对照品，加无水乙醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；
照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为19.5:0.5的三氯甲烷-丙酮为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘干15分钟，鉴别；
C、HPLC法测定派可林酸的含量
精密称定派可林酸对照品5mg，加水稀释定容至50mL；精密量取1mL溶液，依次加水1mL、加质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL以及0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液；
精密称定待测药材0.4g，加水振摇后，于60℃水浴中加热30分钟，放冷后加水定容至10mL，摇匀并离心后，精密量取上清液2mL，并依次加入质量浓度为0.8％的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液2mL和0.5mol/L的碳酸氢钠溶液2mL，于60℃水浴反应1小时，放冷后用pH7.0、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为供试品溶液；
照高效液相色谱法试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为21：0.5：79的乙腈-二甲基甲酰胺-0.025mol/L醋酸钠溶液为流动相，检测波长为390nm；理论板数按派可林酸峰计算应不低于2500；
分别精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定。
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