CN100372544C - 一种蚕沙总生物碱及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚕沙总生物碱及其制备方法，其制备方法为：向蚕沙中加水，加入果胶酶和纤维素酶至少一种，调节溶液的pH，加热保温提取，醇沉，离心，上清液经交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，再经交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，氨水洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，脱色，被脱色的液体经浓缩、干燥制成蚕沙总生物碱，本发明制备的蚕沙总生物碱为α-糖苷酶抑制剂，具有作用机理清晰、疗效确切、成本低，可用于糖尿病、肥胖症、高血脂以等疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物碱及其制备方法，特别是涉及一种蚕沙总生物碱及其制备方法。
背景技术
蚕沙作为传统中药，又称晚蚕沙、蚕屎、马鸣肝、晚蚕矢、二蚕沙等，为蚕蛾科昆虫家蚕蛾(Bombyx mon L.)幼虫的干燥粪便。干燥的蚕沙呈圆柱型小粒，微有青草气，色黑，坚实，均匀。蚕性燥，无毒，燥能胜风去湿，故蚕沙主治风湿之病，因此临床上具有祛风除湿、活血定痛之功能，治风湿痹痛、风疹瘙痒、头风头痛、皮肤不仁、关节不遂、急剧吐泻转筋、腰脚冷涌、烂弦风眼等症。此外，蚕沙还含有单宁和维生素C，在医药上用作收敛剂，对腹泻、鼻血、牙龈出血及痔出血等均有良好的疗效；蚕沙中的果胶活性高于其他植物性果胶(如苹果果胶、柑橘果胶等)，对各种致病菌有较强抑制和杀灭作用，能防治肠道失常症，对便秘有显著的疗效。
经风干后的蚕沙中除含有9.9％的水份，90.1％的干物质(粗蛋白13.6％，粗脂肪3.7％，粗纤维12.5％，无氮浸出物48.7％，灰份12.6％)外，还含有丰富的营养物质，其中铜、铁、磷、锌及其他微量元素含量均较高；含有18种氨基酸，包括人体必需的8种，另外还含有丰富的叶绿素及其衍生物、β—胡萝卜素、植物醇、低甲氧基果胶以及黄酮类化合物。
蚕食桑叶后消耗了桑叶中的部份蛋白质、糖类和脂肪类物质，而大部分有效成份随粪便排泄到体外，因此蚕沙的主要成分来自于桑叶。蚕沙中含有的粗蛋白高于谷类植物，而叶绿素、胡萝卜素为其它绿色植物数倍，甚至数十倍。但蚕食桑叶后桑叶中的一些成份经过生物体内的吸收、代谢和排泻后，其理化性质发生了变化，比如：桑叶中的叶绿素用氯仿或乙酸乙酯提取，蚕沙中的绿色物质用氯仿或乙酸乙酯提取只能除去很少，大部分色素可溶解在水中。中国专利申请号99109111.6公开了一种采用连续或间歇提取法提取蚕沙，经过滤除去不溶物，将滤液合并进一步浓缩成膏状并进行制剂成型的方法，用于治疗和预防糖尿病。此外，桑叶中含有1-脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin，DNJ)，其化学名为2R，3R，4R，5S-2-羟甲基-3，4，5-三羟基哌啶，这种生物碱是一种天然糖的结构类似物，具有很高的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，可用于治疗糖尿病、肥胖症、病毒感染等疾病。中国专利申请号01113191.8公开了“一种具有α-糖苷酶抑制剂活性的中药提取物、其制备方法及用途”，该项发明涉及了由中药桑白皮、桑叶和桑椹制备总生物碱。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚕沙总生物碱的制备方法，本发明通过向提取液中加入果胶酶和纤维素酶，酶解蚕沙中的果胶和纤维素，并通过调节提取温度和pH，使之保持在酶的最佳使用条件，提高总生物碱的提取效率。
本发明的第二个目的是提供一种蚕沙总生物碱。
本发明的技术方案概述如下：
一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
(1)向蚕沙中加入蚕沙重量5～15倍的水，加入果胶酶和纤维素酶至少一种，所述果胶酶的加入量为水重量的1/1000～1/10000，所述纤维素酶的加入量为水重量的1/1000～1/10000，调节溶液的pH为3～8，加热30～70℃，提取1～3次，每次2～5小时，合并提取液，过滤，除去药渣；
(2)加热减压浓缩提取液，至原蚕沙体积的1～2倍；
(3)加入浓缩提取液的3～5倍体积的体积百分含量为75％～100％的甲醇水溶液或乙醇水溶液，4～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；
(4)取醇沉淀浓缩后的上清液经交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，再经交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.2～1N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水，收集生物碱阳性部分洗脱峰；
(5)以用量为蚕沙重量的1/10～1/100的活性炭或硅藻土进行脱色，收集被脱色的液体，经浓缩，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥制成干粉，即得蚕沙总生物碱。
所述步骤(1)中果胶酶的加入量为水重量的1/2000～1/5000。
所述步骤(1)中纤维素酶的加入量为水重量的1/2000～1/5000。
所述步骤(1)中水的重量为蚕沙重量的7～12倍。
所述步骤(1)提取次数为2次。
所述交联聚苯乙烯系的碱性型树脂的型号为D261或D284或D301R或ABS-7或D380或D371或D301T。
所述交联聚苯乙烯系的强酸型树脂的型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225。
一种蚕沙总生物碱，用蚕沙总生物碱的制备方法制成。
利用本发明的一种蚕沙总生物碱的制备方法可以提高总生物碱的提取效率。
本发明的一种蚕沙总生物碱的制备方法所制备的蚕沙总生物碱可以与一种或多种药学上可接受的载体制成口服剂型，可用于制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、高血脂的药物。
上面所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂如乳糖、淀粉、糊精、微晶纤维；填充剂如淀粉；粘合剂如纤维素衍生物、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、羧甲基淀粉钠、海藻酸钠、碳酸氢钠及碳化钙等；矫味剂如乳糖、甜叶菊素、D-木糖、木糖醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙及硬脂酸镁等；防腐剂如苯甲酸、苯甲醇等。
本发明的一种蚕沙总生物碱的制备方法可以通过口服给药的方式施用于需要这种治疗的患者。可将本发明所制备的蚕沙总生物碱和药学上可接受的载体制成常规的固体制剂如片剂、散剂、胶囊、滴丸剂等，制成液体制剂如糖浆剂。
本发明的一种蚕沙总生物碱的的制备方法所制备的蚕沙总生物碱的使用量可根据患者年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度情况，其24小时剂量可以是0.1～5mg/kg体重。
蚕沙总生物碱是从蚕沙中提取的，蚕食桑叶后浓缩了桑叶中的一些有效成份，蚕沙的粒径处于萃取过程最宜粒径范围内、因此，可以方便地对提取原料进行提取、分离及纯化，而得到桑叶中的各种有效成份；蚕沙的价格低廉，其中总生物碱的含量较高，主要为具有α-糖苷酶抑制剂活性的DNJ类生物碱。蚕沙总生物碱及其组合物，全部采用天然成分作为α-糖苷酶抑制剂，具有作用机理清晰、疗效确切、成本低等特点，可用于糖尿病、肥胖症、高血脂以及病毒感染等疾病的预防和治疗。
附图说明
图1为蚕沙总生物碱对α-糖苷酶的抑制曲线图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加果胶酶5克，调节溶液的pH为5，搅拌，50℃保温提取5小时，过滤，滤渣再加水10L，50℃保温3小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液至3L；(3)加入体积百分含量为95％的甲醇水溶液9L，在4～10℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为D284进行脱色，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，调pH为7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，再经10g活性炭吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得5.92g棕黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为72.5％。
生物碱的酸碱滴定法：取上述干粉0.5克，溶于20ml冰乙酸中，以0.1N高氯酸为滴定液，以结晶紫为指示剂，测得其中N原子当量数。再取上述干粉0.5克，溶于20ml水中，以0.1N NaOH为滴定液，测得其中羧酸根当量数。N原子当量数减去羧酸根当量数应为生物碱的摩尔数，生物碱分子量以180计，所算得的生物碱重量应不低于总重量的30％。
公式：生物碱含量＝[高氯酸体积(mL)-NaOH体积(mL)]×0.036×100％
实施例2
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶10克，调节溶液的pH为6，搅拌，45℃保温5小时，过滤，滤渣再加水10L，45℃保温3小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至3L；(3)加入体积百分含量为95％的甲醇水溶液，加入的量9L，在4～10℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为ABS-7进行脱色，收集不吸附部分，调pH7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，再经10g活性炭吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得4.76g棕黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为65.3％。
实施例3
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水15L，加果胶酶10克，加纤维素酶10克，调节溶液的pH为7，搅拌40℃保温5小时，过滤，滤渣再加水10L，40℃保温3小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至3L；(3)加入体积百分含量为95％的甲醇，加入的量9L，在4～10℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为D380进行脱色，收集不吸附部分，调pH7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，再经10g硅藻土吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得5.52g棕黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为70.8％。
实施例4
一种蚕沙总生物碱的制备方：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶10克，调节溶液的pH为3，搅拌，60℃保温3小时，过滤，滤渣再加水10L，60℃保温2小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至3L；(3)加入体积百分含量为95％的乙醇水溶液，加入的量9L，在4～10℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为D284进行脱色，收集不吸附部分，调pH7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.2N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，再经10g硅藻土吸附脱色，减压浓缩，离心，冷冻干燥，得6.72g黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为75.2％。
实施例5
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶5克和果胶酶5克，调节溶液的pH为4，搅拌，45℃保温5小时，过滤，滤渣再加水10L，45℃保温3小时，过滤，合并两次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至3L；(3)加入体积百分含量为95％的乙醇水溶液，加入的量9L，在4～10℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为D301R进行脱色，收集不吸附部分，调pH7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×7进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以0.5N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，减压浓缩再经20g硅藻土吸附脱色，离心，冷冻干燥，得5.39g淡黄色提取物粉末，采用酸碱滴定法测定总生物碱含量为82.6％。
实施例6
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶1克和果胶酶10克，调节溶液的pH为3，搅拌，30℃保温2小时，过滤，滤渣再加水10L，45℃保温2小时，过滤，滤渣再加水10L，45℃保温2小时，合并三次滤液，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至1.5L；(3)加入100％的乙醇，加入的量4.5L，在20～30℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为D261进行脱色，收集不吸附部分，调pH7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×1.1进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以1N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，减压浓缩再经100g硅藻土吸附脱色，离心，将收集液直接喷雾干燥制成干粉，即得蚕沙总生物碱。
实施例7
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶1克和果胶酶1克，调节溶液的pH为7，搅拌，45℃保温5小时，过滤，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至1.5L；(3)加入75％的乙醇水溶，加入的量7.5L，在20～30℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为ABS-7进行脱色，收集不吸附部分，调pH＝7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×4进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以1N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，减压浓缩再经10g硅藻土吸附脱色，离心，将收集液真空干燥制成干粉，即得蚕沙总生物碱。
实施例8
一种蚕沙总生物碱的制备方法：(1)取蚕沙1kg，加水10L，加纤维素酶20克和果胶酶20克，调节溶液的pH为8，搅拌，45℃保温5小时，过滤，离心除去药渣；(2)加热减压浓缩提取液，至2L；(3)加入75％的乙醇水溶，加入的量10L，在20～30℃进行醇沉淀，抽滤，浓缩；(4)取浓缩后的上清液经阴离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的碱性树脂，其型号为ABS-7进行脱色，收集不吸附部分，调pH＝7上阳离子交换树脂柱交联聚苯乙烯系的强酸性树脂，其型号为001×4进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，以1N氨水溶液洗脱，收集生物碱阳性部分洗脱峰，减压浓缩再经10g硅藻土吸附脱色，离心，将收集液真空干燥制成干粉，即得蚕沙总生物碱。
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例7，其中的交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱为D380，交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱为001×14.5。
实施例9
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例7，其中的交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱为D371，交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱为Amberlite IR120。
实施例10
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例7，其中的交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱为D301T，交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱为Dowex 50。
实施例11
一种蚕沙总生物碱的制备方法：实施步骤同实施例7，其中的交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱为D301T，交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱为Zerolit 225。
实施例12
取上述实施例5制备的蚕沙总生物碱，以及DNJ标准品，10倍系列稀释后取200μL，加入α-糖苷酶(6IU/mL α-Glucosidase，20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，含150mmol/LNaCl，1％BSA)100μL，37℃水浴15min，再加10mg/ml麦芽糖溶液100μL，混匀，37℃反应20min。沸水浴2min终止反应，冷却后用葡萄糖体外诊断试剂盒测定葡萄糖生成量。以样品浓度为横坐标，490nm吸光度为纵坐标作图绘制α-糖苷酶的抑制曲线，考察蚕沙总生物对α-糖苷酶的抑制活性。如图1所示，蚕沙总生物碱与DNJ标准品呈现出平行的α-糖苷酶抑制效果。
Claims (8)
1.一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是它包括如下步骤：
(1)向蚕沙中加入蚕沙重量5～15倍的水，加入果胶酶和纤维素酶至少一种，所述果胶酶的加入量为水重量的1/1000～1/10000，所述纤维素酶的加入量为水重量的1/1000～1/10000，调节溶液的pH为3～8，控制温度在30～70℃，提取1～3次，每次2～5小时，合并提取液，过滤，除去药渣；
(2)加热减压浓缩提取液，至原蚕沙体积的1～2倍；
(3)加入浓缩提取液的3～5倍体积的体积百分含量为75％～100％的甲醇水溶液或乙醇水溶液，4～30℃进行醇沉淀；离心或过滤，除去残渣和不溶物；
(4)取醇沉淀浓缩后的上清液经交联聚苯乙烯系的碱性型树脂柱，用去离子水冲洗，收集不吸附部分，再经交联聚苯乙烯系的强酸型树脂柱进行纯化，用去离子水洗去不吸附的杂质，再用0.2～1N氨水洗脱，洗脱液经减压浓缩除去氨水，收集生物碱阳性部分洗脱峰；
(5)以用量为蚕沙重量的1/10～1/100的活性炭或硅藻土进行脱色，收集被脱色的液体，经浓缩，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将收集液直接喷雾干燥成型制成干粉，即得蚕沙总生物碱。
2.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述步骤(1)中果胶酶的加入量为水重量的1/2000～1/5000。
3.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述步骤(1)中纤维素酶的加入量为水重量的1/2000～1/5000。
4.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述步骤(1)中水的重量为蚕沙重量的7～12倍。
5.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述步骤(1)提取次数为2次。
6.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述交联聚苯乙烯系的碱性型树脂的型号为D261或D284或D301R或ABS-7或D380或D371或D301T。
7.根据权利要求1所述的一种蚕沙总生物碱的制备方法，其特征是所述交联聚苯乙烯系的强酸型树脂的型号为001×1.1或001×4或001×7或001×14.5或Amberlite IR120或Dowex 50或Zerolit 225。
8.一种蚕沙总生物碱，其特征是用权利要求1～7之一的方法制成。
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: LONGSHUNRONG PHARMACEUTICAL FACTORY, TIANJIN ZHONG Free format text: FORMER OWNER: NANKAI UNIV. Effective date: 20090911 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20090911 Address after: No. tenth, 21 Avenue, Tianjin economic and Technological Development Zone Patentee after: Longshunrong Pharmaceutical Factory, Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co.,Ltd. Address before: Tianjin City, Wei Jin Road No. 94 Patentee before: Nankai University |
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