CN102166243B

CN102166243B - 新疆一枝蒿制剂及制备治疗糖尿病药物中的应用

Info

Publication number: CN102166243B
Application number: CN 201110073133
Authority: CN
Inventors: 晁群芳; 方美珠; 刘小宁; 樊永红; 王咏星; 徐鑫
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2031-03-25
Also published as: CN102166243A

Abstract

本发明公开一种用于治疗糖尿病药物中应用的新疆一枝蒿制剂及制备。通过将新疆一枝蒿全草粉碎，称重加3倍体积的乙醚放置8h后过滤，沉淀物用80％乙醇在35℃下超声提取，每次30-40min，过滤得到乙醇提取液，用95％乙醇沉淀、离心取上清液，乙酸乙酯萃取，过滤得乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和80％的乙醇洗脱物，减压浓缩成浸膏与黄芪浸膏按重量比(5-10)∶1比例配伍，配置一定量的纯水制备获得成品制剂。制备获得新疆一枝蒿制剂具有降血糖活性，使用剂量为67.5mg/kg，在治疗糖尿病药物中具有广泛的应用领域。

Description

新疆一枝蒿制剂及制备治疗糖尿病药物中的应用

发明领域

本发明涉及中草药制剂技术领域。具体的说，本发明涉及一种用于治疗糖尿病药物中应用的新疆一枝蒿制剂及制备技术领域。

背景技术

近年来，由于生活水平的提高、饮食结构的改变、日趋紧张的生活节奏以及少动多坐的生活方式等诸多因素，全球糖尿病发病率增长迅速，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。对于糖尿病的治疗，西医多采用饮食、口服降糖药物及胰岛素替代等方法，它们的优点是降糖作用肯定，起效快，但不足之处是副作用多。天然药物具有来源丰富，毒副作用小、易于接受和长期服用的优点，因此，近年来国内外有关植物中天然降糖物质的研究和开发十分活跃。

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是一种于遗传因素和多种环境因素相关联的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合症，目前虽然有一些不同作用靶点的药物用于治疗糖尿病，但有时并不能达到预期治疗效果。因此，能够开发高效的治疗糖尿病的药物是治疗糖尿病的核心问题。近年来研究发现，中药的降血糖作用温和持久，副作用小，且作用机制具有多效应、多位点及多功能等特点。所以，开发高效低毒的抗糖尿病中药将是一个具有发展前景的研究领域，而新疆一枝蒿的药效作用近年来成为研究的热点，研究开发新疆一枝蒿在治疗糖尿病药物的相关产品具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术中未见报道有关新疆一枝蒿在治疗糖尿病药物中的应用的技术现状，本发明旨在提供新疆一枝蒿制剂及用于治疗糖尿病药物中应用。

本发明的技术方案：

通过以新疆一枝蒿为原料，将新疆一枝蒿全草粉碎、置于乙醚溶液中浸泡，过滤旋转蒸发除去乙醚溶液后用乙醇超声提取、提取液用乙醇沉淀、离心，经乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱层析、最后浓缩制成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比配伍溶于水中制成液体制剂。该制剂用于治疗糖尿病药物中应用，使用剂量小，疗效高，经检测具有良好的降血糖活性作用。

具体的，本发明提供了一种在治疗糖尿病药物中应用的新疆一枝蒿制剂，通过将新疆一枝蒿全草粉碎，称重加3倍体积的乙醚放置8h后过滤，沉淀物用80％乙醇在35℃下超声提取，每次30-40min，过滤得到新疆一枝蒿乙醇提取液，用95％乙醇沉淀过夜，离心取上清液，乙酸乙酯萃取，萃取温度为常温，过滤得乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和80％的乙醇洗脱物，减压浓缩成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比(5-10)∶1比例配伍，按照中草药液体药剂通常做法，配置一定量的纯水制备获得成品制剂。

进一步，本发明提供了一种在治疗糖尿病药物中应用的一枝蒿制剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)、首先将新疆一枝蒿全草粉碎成粉末，称重加3倍体积的乙醚放置8小时后过滤，沉淀物用80％乙醇在35℃下超声提取，每次30-40min，过滤得到新疆一枝蒿乙醇提取液；

(2)、将新疆一枝蒿提取液用95％乙醇沉淀过夜，过滤，旋转蒸发除去乙醇，乙酸乙酯萃取，萃取温度为常温，得乙酸乙酯部位，将乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和 80％的乙醇洗脱物减压浓缩成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比(5-10)∶1比例配伍，按照中草药液体药剂通常做法，配置一定量的纯水制备获得成品制剂。

新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L.)，别名岩蒿，菊科蒿属，是新疆哈萨克族和维吾尔族民间传统用药，该药材记载于我国清代赵学敏的《本草纲目拾遗》，已收《药品标准》维吾尔药分册和《维吾尔药志(上册)》。新疆一枝蒿为多年生草本，高20-50cm，全株具特异芳香。茎呈圆柱形，直径1mm～4mm，有紫茎和淡黄绿茎.表面略有纵棱，质脆，断面淡黄、中空，气香特异，味淡。叶绿色，枯时淡黄色，裂片呈狭披针形，长2mm～8mm，宽0.5mm～1mm，两面具有疏短柔毛，无柄或具短柄，基部有假托叶。头状花序半球形，黄紫色，径为5mm～8mm，梗长3mm～5mm，总苞3～4列，外层草质条形。多于5月下旬至6月上旬萌发，生长较缓慢，7月上，中旬现蕾，8月开始开花，一直可开放到9月上，中旬，首批开放的花则在此时进入果期，果期可延至10月上旬，很快枯萎，进入休眠期。国内临床资料表明，作为民族药，它具有清热解毒、健胃消食、镇静止吐、抗过敏等功效，用于治疗毒蛇咬伤、荨麻疹、消化不良、感冒、肝炎、过敏性疾病等。

本发明选用的黄芪浸膏可通过本领域熟知常见的技术手段所获得。

本发明通过用四氧嘧啶诱导建立小鼠糖尿病模型，研究了制备获得的新疆一枝蒿制剂的降血糖作用，最佳的使用剂量为67.5mg/kg。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：

1.本发明通过对制备获得的新疆一枝蒿制剂进行提取，分析给药后四氧嘧啶糖尿病KM小鼠体重、血糖、SOD以及MDA变化，并对其组织形态进行观察，来探究新疆一枝蒿提取液对糖尿病KM小鼠的影响。结果表明：本发明提供的新疆一枝蒿制剂具有良好的降血糖活性，在制备治疗糖尿病药物中具有广阔的应用前景。

2.本发明所需试剂均为分析纯，制备方法为超声波提取技术，操作简便快捷、无需加热、提出率高、速度快、提取物的结构未被破坏、效果好，显示出明显的优势，可直接进行放大生产。

附图说明

图1所示为新疆一枝蒿制剂的制备工艺流程图。

图2所示为新疆一枝蒿制剂对实验性高血糖小鼠肝脏的影响图，图中a代表糖尿病小鼠肝脏(HE染色，×10)、b代表新疆一枝蒿制剂治疗肝脏(HE染色，×10)、c代表药物治疗小鼠肝脏(HE染色，×10)、d代表正常小鼠肝脏(HE染色，×10)。

图3所示为新疆一枝蒿制剂对实验性高血糖小鼠肾脏的影响图，图中a代表糖尿病小鼠肾脏(HE染色，×10)、b代表新疆一枝蒿制剂治疗肾脏(HE染色，×10)、c代表药物治疗小鼠肾脏(HE染色，×10)、d代表正常小鼠肾脏(HE染色，×10)。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要原料及选用试剂：新疆一枝蒿，采自天山支脉---天格尔山北路，采回后置阴凉处自然干燥、粉碎装袋后备用。黄芪浸膏可通过本领域熟知常见的技术手段所获得。

昆明种小白鼠，雄性，购自新疆医科大学医学实验动物中心(动物许可证号：SYXK(新)2003-0001)。

四氧嘧啶，购自美国Sigma公司；SOD，南京建成生物工程研究所产品；MDA，南京建成生物工程研究所产品：石油醚，分析纯试剂，天津市富宇精细化工有限公司；无水乙醇，分析纯试剂，天津市富宇精细化工有限公司；乙酸乙酯，分析纯试剂，天津市富宇精细化工有限公司。盐酸二甲基胍，北京中慧药业有限公司。

主要仪器：

超声波细胞粉碎机隔音箱，宁波新芝生物科技股份有限公司；JFSD-70型实验室万能粉碎机，上海嘉定粮油检测仪器有限公司；RE-5299型旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；AL104-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；乐康全血糖测定仪，罗氏诊断公司产品(批号2005-06 22381501)。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：新疆一枝蒿制剂的制备

参见附图1，具体描述新疆一枝蒿制剂的制备如下：

通过将上述技术手段获得新疆一枝蒿制剂，分析给药后四氧嘧啶糖尿病KM小鼠体重、血糖、SOD以及MDA变化，并对其组织形态进行观察，来探究新疆一枝蒿提取液对糖尿病KM小鼠的影响。结果表明：通过用四氧嘧啶诱导建立小鼠糖尿病模型，本发明提供的新疆一枝蒿制剂具有良好的降血糖活性功效，在制备治疗糖尿病药物中具有广阔的应用前景。

实施例二：新疆一枝蒿制剂的制备

参见附图1，按照实施例一所述的技术方案，通过将新疆一枝蒿全草粉碎，称重加3倍体积的乙醚放置8h后过滤，沉淀物用80％乙醇在35℃下超声提取，每次30-40min，过滤得到新疆一枝蒿乙醇提取液，用95％乙醇沉淀过夜，离心取上清液，乙酸乙酯萃取，萃取温度为常温，过滤得乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和80％的乙醇洗脱物，减压浓缩成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比5∶1比例配伍，按照中草药液体药剂通常做法，配置一定量的纯水制备获得成品制剂。

通过分析给药后四氧嘧啶糖尿病KM小鼠体重、血糖、SOD以及MDA变化，并对其组织形态进行观察，来探究新疆一枝蒿提取液对糖尿病KM小鼠的影响。结果表明：本发明提供的新疆一枝蒿制剂制备中，采用上述技术工艺获得的新疆一枝蒿制剂，具有显著的降血糖活性，使用剂量为67.5mg/kg。

实施例三：实验性四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立

取体重18-22g的昆明种雄性小鼠120只，适应性喂养一周，随机选取10 只为正常对照组(Nomal control group，NC)，其余腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg(四氧嘧啶用生理盐水配置)，注射前禁食不禁水12h，造成实验性高血糖模型，造模型后48h内给与10％葡萄糖水，防止动物发生低血糖性死亡，72h后，小鼠尾端取血测血糖(取血前小鼠禁食12h)。观察动物的饮水、饲料摄入情况，是否出现糖尿病典型“三多”症状。最后选取血糖值≥11.1mmol/L的小鼠为实验性糖尿病动物模型。

四氧嘧啶可对胰岛β细胞造成损伤，从而影响了胰岛素的分泌，使动物血糖升高。昆明种小鼠注射四氧嘧啶造模，3d后各组出现多饮、多食、多尿、体重减轻的“三多一少”症状，并逐渐加重。给药后，采用新疆一枝蒿制剂高、中、低剂量组昆明种小鼠的症状减轻，且随实验进程症状得到缓解；而模型对照组的症状随实验进程加重。

实施例四：新疆一枝蒿制剂对实验性高血糖小鼠的降血糖作用

将造模成功的糖尿病模型小鼠50只，正常小鼠10只进行分组，共分为6组，包括正常对照组、糖尿病模型对照组、药物治疗组和3个实验组：

糖尿病模型对照组(Diabetic control group，DC)，每天灌胃0.9％生理盐水；

新疆一枝蒿制剂低剂量组(Low dose，L)，每天灌胃33.75mg/kg；

新疆一枝蒿制剂中剂量组(Middle dose，M)，每天灌胃67.5mg/kg；

新疆一枝蒿制剂高剂量组(High dose，H)，每天灌胃135mg/kg；

正常对照组(Nomal control group，NC)，每天灌胃0.9％生理盐水；

药物治疗组(Cure group，CG)，每天灌胃1.0g/kg。

连续给药14d，每周测一次体重、尾静脉取血测一次空腹血糖浓度，见表1、表2。

表1：实验期间小鼠体重(g)变化情况

注：##p＜0.01，#p＜0.05与正常对照组相比**p＜0.01，*p＜0.05与模型对照组相比

前期实验证明，注射四氧嘧啶后小鼠体重明显下降，注射四氧嘧啶72h后，小鼠体重间无明显差异。随着实验进程的进行，3个实验组糖尿病小鼠的体重变化与糖尿病模型组相比有统计学差异(t检验，P＜0.05)，模型对照组小鼠体重增长比较缓慢，其余各组动物体重均稳定增长，表明新疆一枝蒿制剂能够改善由于四氧嘧啶化学损伤而导致的小鼠体重下降。

表2：新疆一枝蒿制剂对糖尿病小鼠血糖(mmo l/L)水平的影响

注：##p p＜0.01，#p＜0.05与正常对照组相比

**p p＜0.01，*p＜0.05与模型对照组相比

由表2中数据可知，模型组的血糖值明显高于正常组，说明实验造模是成功的。不同剂量的新疆一枝蒿制剂对糖尿病小鼠降血糖作用存在着显著差异(p＜0.01)。一枝蒿制剂高剂量组和中剂量组可使糖尿病KM小鼠的高血糖降低，而一枝蒿制剂低剂量组与模型组相比具有差异不显著(p＞0.05)，与正常对照组相比差异极显著(p＜0.01)，说明新疆一枝蒿制剂低剂量组无明显的降血糖作用。当剂量为67.5mg/kg时，降血搪作用最强(P＜0.01)，继续增加剂量，血糖下降不明显。本实验选用67.5mg/kg作为治疗糖尿病的最佳剂量。

实施例五：新疆一枝蒿制剂对实验性高血糖小鼠SOD、MDA酶活的影响

末次给药前禁食12h，给药2h后眼眶静脉采血，0.5h内6000r/min离心15min分离血清，按试剂盒方法测定空腹血清超氧化物歧化酶(SOD)、(MDA)指标。

(1)血清SOD活性测定

测定方法：取血清，超氧化物歧化酶的测定使用超氧化物歧化酶测定试剂盒，按说明书进行操作。

公式：总SOD活力(U/ml)＝[(对照管吸光度-测定管吸光度)/对照管吸光度吸光度]/50％*反应体系的稀释倍数*样本测试前的稀释倍数

操作步骤

注：a *代表样本取样量和蒸馏水取样量

混匀，室温放置10min，于酶标仪中测定血清中的SOD活力，结果见表3。

(2)血清MDA含量测定

测定方法：取血清，脂质过氧化物的测定使用脂质过氧化物测定试剂盒，按说明书进行操作。

操作步骤

	标准管	标准空白管	测定管	测定空白管**
					10nmol/ml标准品(ml)	a*	-	-
无水乙醇(ml)	-	a*	-
					测试样品(ml)	-	-	a*
混合试剂(ml)	4	4	4

注：a*表不所需的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量四者均相等。

**表示测定空白管可省略不做用标准空白管来代替。

漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后用流水冷却，然后3500-4000r/min，离心10min(3000r/min以下离心需延长，目的使沉淀完全)取上清，至于酶标板中用酶标仪测定其活力。

公式：血清中MDA含量(nmol/ml)＝(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)*标准品浓度(10nmol/ml)*样品测试前稀释倍数

表3：新疆一枝蒿制剂对糖尿病小鼠SOD和MDA的影响

注：##p＜0.01，#p＜0.05与正常对照组相比 **p＜0.01，*p＜0.05与模型对照组相比

SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。MDA是机体内不饱和脂肪酸在自由基的作用下产生的脂质过氧化产物。由表3可以看出，胰岛细胞经Alloxan作用后，其SOD的活性有所降低，而MDA明显升高(p＜0.05)，说明胰岛细胞受到一定程度的损伤。而给予新疆一枝蒿制剂后，其SOD的值明显升高，一枝蒿制剂(高、中、低)三个剂量组和模型组相比具有显著性差异(p＜0.05)，同时MDA的含量明显降低，三个剂量组和模型组相比具有显著性差异(p＜0.05)，说明新疆一枝蒿制剂的抗氧化能力也有所提高。

实施例六：新疆一枝蒿制剂对实验性高血糖小鼠肝脏和肾脏的影响

将小鼠脱颈椎处死，立即解剖取肝脏、肾脏组织，制作其石蜡切片：

通过采用10％的甲醛溶液固定、不同浓度乙醇脱水、石蜡包埋、切片机切片、HE染色、观察拍照。通过显微镜观察结果显示：

参见附图2中a、b、c、d。正常组小鼠肝小叶结构正常，未见纤维增生及纤维间隔形成，肝索、窦比例正常，无炎细胞浸润；对照组小鼠肝细胞肿胀，肝小叶结构模糊，由大小不等的圆形、椭圆形或不规则形肝细胞结节(假小叶)所取代，结节内肝细胞索排列紊乱，肝细胞核增大，染色加深；而采用本发明提供的新疆一枝蒿制剂中、高剂量组小鼠肝小叶多数结构清晰，少量结构模糊，肝细胞索排列基本清晰，部分细胞肿胀。表明采用本发明提供的新疆一枝蒿制剂具有很好的保肝作用。

参见附图3中a、b、c、d。小鼠处死后解剖取出其肾脏发现对照组小鼠肾脏肿胀，肾小球弥漫性增大，毛细血管腔变窄；正常组小鼠的毛细血管正常；而采用本发明提供的新疆一枝蒿制剂中、高剂量组小鼠肾脏的损伤状况有一定的改善作用。表明采用本发明提供的新疆一枝蒿制剂对于肾脏的损伤具有很好的改善作用。

Claims

1.一种在治疗糖尿病药物中应用的新疆一枝蒿制剂，其特征在于，通过将新疆一枝蒿全草粉碎，称重加3倍体积的乙醚放置8h后过滤，沉淀物用80％乙醇在35℃下超声提取，每次30-40min，过滤得到新疆一枝蒿乙醇提取液，用95％乙醇沉淀过夜，离心取上清液，乙酸乙酯萃取，萃取温度为常温，过滤得乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和80％的乙醇洗脱物，减压浓缩成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比(5-10)∶1比例配伍，按照中草药液体药剂通常做法，配置一定量的纯水制备获得成品制剂；所述的黄芪浸膏是通过本领域常规技术手段获得。

2.一种如权利要求1所述的新疆一枝蒿制剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(2)、将新疆一枝蒿提取液用95％乙醇沉淀过夜，过滤，旋转蒸发除去乙醇，乙酸乙酯萃取，萃取温度为常温，得乙酸乙酯部位，将乙酸乙酯部位聚酰胺柱层析依次采用20％、40％、60％、80％不同浓度的乙醇溶液洗脱，收集60％和80％的乙醇洗脱物减压浓缩成浸膏，浓缩后的浸膏与黄芪浸膏按重量比(5-10)∶1比例配伍，按照中草药液体药剂通常做法，配置一定量的纯水制备获得成品制剂；所述的黄芪浸膏是通过本领域常规技术手段获得。

3.如权利要求1所述的新疆一枝蒿制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用，其特征在于，所述的使用剂量为67.5mg/kg。