CN103865909B - 一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法。本发明的技术方法是将尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品。该技术的优点在于在生产过程中采用60℃水浴灭菌处理使病毒失活以及用磷酸三钠和醋酸钙吸附去除产品中的热原，保证产品的质量。该方法得到的尿激酶无病毒无热原，且精品的比活能够达到13万单位/mg以上。

Description

一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种制备尿激酶精品的方法。
背景技术
尿激酶是人血液中的尿激酶原在部分降解后从尿液中排出的一种丝氨酸蛋白酶，为血纤蛋白溶酶原激活剂，可将纤溶酶原转化为纤溶酶，临床上主要用于治疗急性心肌梗塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞、血栓性闭塞性疾病、肺栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成等疾病。
《中国药典》2005版和2010版，明确规定“本品在生产过程中需经60℃加热10小时，以使病毒灭活”；且质量标准要求尿激酶的细菌内毒素小于1.0EU/万单位。
目前，国内不少专家针对尿激酶的制备工艺进行了深入的试验研究，如一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用（杨华英等专利号CN101693748A）、一种尿激酶制备方法（张志武等专利号CN101701215A）等，都结合使用离子交换层析法、凝胶分子筛法、免疫亲和层析、对氨基苯甲脒-Sepharose亲和层析技术，纯化精制得到尿激酶。使产品的比活、高分子尿激酶相对含量以及尿激酶生物活性的回收率不断提高。
但是针对尿激酶产品中病毒及热原的去除研究，发表的文献较少。
细菌内毒素属于热原的一种，而热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。当含有热原的物质进入人体以后，人体会产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此去热原是本品生产工序中不可缺少的一步。
发明内容
本发明的目的是提供了一种能够去除病毒及热原的尿激酶制备方法。
本发明的技术方案是：将尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品，包括如下步骤：
（1）粗品提取：取尿激酶粗品，加磷酸盐缓冲液进行溶解，尿激酶粗品与磷酸缓冲液的比例为：1g:10~14ml；搅拌；过滤，将滤饼再加磷酸缓冲液进行溶解，滤饼与磷酸缓冲液按的比例为：1g:2~5ml；搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至7.0~8.0；
（2）超滤：将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15；加0.025mol∕LPBS平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的1/2至1/5；
（3）DEAE-纤维素层析：取经0.025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加入上一次量1/2的0.025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；合并二次滤液；
（4）CMC层析：调节滤液pH至3.0~5.0，调整电导率至15~20μS/cm。CMC柱先用0.05~0.2mol/L醋酸缓冲液平衡，再将滤液上CMC柱，用0.05％~0.2％氨水溶液洗脱，得洗脱液。将洗脱液在60℃水浴灭菌10小时；
（5）亲和层析：将Trypsin-inhibitor-Sepharose装柱，用含1mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤平衡；将已灭菌的洗脱液进行上柱；用含1mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤1~3个床体积，再用含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤0.1~1个床体积；最后用0.01mol/LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液。
（6）沉淀、干燥：调节洗脱液pH至6.0~7.0，用乙醇进行沉淀，洗脱液与乙醇的体积比为1:3~8；再用乙醇洗涤沉淀，重复2~4次；干燥，得干燥品。
（7）去热原Ⅰ：将干燥品加水，按1g:60~75ml的比例进行溶解，在搅拌下加入等体积-20~0℃的乙醇，再按溶液总体积1ml:5~10g的比例加入醋酸铵，然后缓慢加入0.1~0.3mol/L磷酸钠溶液，其用量与干燥品的比例为：1ml:10~14g，搅拌，最后加入0.1~0.5mol/L醋酸钙溶液，其用量与干燥品重量的比例为：1ml:10~14g；调节pH至8.5，搅拌，离心，取上清液。
（8）去热原Ⅱ：上清液调pH至6.0~7.0，在搅拌时，加入乙醇进行沉淀，上清液与加入乙醇的体积比为：1：4~6，离心。再用乙醇洗涤沉淀物，离心，反复2~4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例
所述的利用尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品，包括如下步骤：
1.DEAE-纤维素层析
1.1粗品提取：
取粗品420g，溶解于12倍量1mol/L磷酸缓冲液中，搅拌提取2小时后，过滤得滤液。滤饼再次溶解于4倍量1mol/L磷酸缓冲液中，搅拌，过滤得滤液。合并二次滤液，用5mol/LHCl调pH至7.5。
1.2超滤：
将已调pH至7.5的粗提液用Cut-off10000MW的超滤膜超滤至原体积的1/12时，加水至原体积，继续超滤至原体积的1/10，然后加0.025mol/LPBS平衡液至原体积，继续超滤至原体积的1/3。
1.3DEAE-纤维素层析
1.3.1取经0.025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，按超滤液30个OD（280nm）加一克的比例加入超滤液中，搅拌，过滤得滤液。
1.3.2用0.025mol/LPBS平衡液洗涤DEAE-纤维素。
1.3.3在滤液中加入1.3.1中一半量的DEAE-纤维素，搅拌，过滤得滤液。
1.3.4合并二次滤液。
2.CMC层析
2.1将滤液调节pH至4.2，并加氯化钠调整滤液使电导在17处。
2.2滤液上经0.1mol/L醋酸缓冲液平衡过夜的CMC柱，流速控制在125ml/min；用0.1%氨水溶液洗脱，得洗脱液。
2.3将洗脱液在60℃水浴灭菌10小时。
3.亲和层析
3.1将Trypsin-inhibitor-Sepharose装柱，用25倍床体积的含1mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤平衡12小时。
3.2将已灭菌的洗脱液上柱，流速控制在42ml/min。
3.3上柱结束后，用含1mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤2个床体积，再用含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤1个床体积。
3.4洗脱：
用0.01mol/LPBS洗脱液洗脱，流速控制在40ml/min，收集流出液。
3.5沉淀
用NaOH溶液调节pH至6.51，再用乙醇进行沉淀，加入的乙醇与洗脱液的体积比为5:1，搅拌，静置沉淀12小时。
3.6干燥
沉淀结束后，离心，用乙醇洗涤沉淀，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得干燥品11.5g。
4.去热原
4.1将上述干燥品加入788ml水搅拌溶解；在搅拌下加入等体积乙醇，然后再加入醋酸铵，醋酸铵的用量与溶液总体积的比例为：8g:1ml，溶液澄清；
4.2再缓慢加入0.2mol/L磷酸钠溶液189ml，搅拌15分钟后，加入0.3mol/L醋酸钙溶液189ml；
4.3然后，用5mol/LNaOH调节pH至8.5，搅拌1小时，离心，弃去沉淀物；
4.4最后用5mol/LHCl调节上清液pH至6.68，在搅拌下，加入9860ml乙醇，沉淀析出，置冰箱静置12小时；
4.5沉淀结束后，离心，用乙醇洗涤沉淀，反复2次；
4.6最后，将沉淀物干燥，得干燥品29.6g，即为成品。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)粗品提取：取尿激酶粗品，加磷酸盐缓冲液进行溶解，尿激酶粗品与磷酸缓冲液的比例为：1g∶10～14ml；搅拌；过滤，将滤饼再加磷酸缓冲液进行溶解，滤饼与磷酸缓冲液按的比例为：1g∶2～5ml；搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至7.5；
(2)超滤：将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20；加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15；加0.025mol/LPBS平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的1/2至1/5；
(3)DEAE-纤维素层析：取经0.025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加入上一次量1/2的0.025mol/LPBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；合并二次滤液；
(4)CMC层析：调节滤液pH至4.2，调整电导率至17μs/cm；CMC柱先用0.05～0.2mol/L醋酸缓冲液平衡，再将滤液上CMC柱，用0.05％～0.2％氨水溶液洗脱，得洗脱液；将洗脱液在60℃水浴灭菌10小时；
(5)亲和层析：将Trypsin-inhibitor-Sepharose装柱，用含1mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤平衡；将已灭菌的洗脱液进行上柱；用含lmol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤1～3个床体积，再用含0.5mol/LNaCl的0.01mol/LPBS平衡液洗涤0.1～1个床体积；最后用0.01mol/LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液；
(6)沉淀、干燥：调节洗脱液pH至6.0～7.0，用乙醇进行沉淀，洗脱液与乙醇的体积比为1∶3～8；再用乙醇洗涤沉淀，重复2～4次；干燥，得干燥品；
(7)去热原I：将干燥品加水，按1g∶60～75ml的比例进行溶解，在搅拌下加入等体积-20～0℃的乙醇，再按溶液总体积1ml∶5～10g的比例加入醋酸铵，然后缓慢加入0.1～0.3mol/L磷酸钠溶液，其用量与干燥品的比例为：1ml∶10～14g，搅拌，最后加入0.1～0.5mol/L醋酸钙溶液，其用量与干燥品重量的比例为：1ml∶10～14g；调节pH至8.5，搅拌，离心，取上清液；
(8)去热原II：上清液调pH至6.0～7.0，在搅拌时，加入乙醇进行沉淀，上清液与加入乙醇的体积比为：1∶4～6，离心；再用乙醇洗涤沉淀物，离心，反复2～4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103724423A (zh) * 2013-11-28 2014-04-16 青岛康原药业有限公司 一种通过去热原提纯尿促性素的方法
CN104031901B (zh) * 2014-05-21 2016-08-24 丽珠集团丽珠制药厂 一种纯化尿激酶的方法
CN104031900A (zh) * 2014-06-26 2014-09-10 上海第一生化药业有限公司 一种去除多肽中的内毒素的方法
CN105238772B (zh) * 2015-11-16 2016-07-13 江苏尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶分离纯化方法
CN105399813A (zh) * 2015-11-26 2016-03-16 青岛康原药业有限公司 一种高效价尿促性素的提取及纯化方法
CN115386564A (zh) * 2022-09-20 2022-11-25 河南省尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的纯化方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1488753A (zh) * 2002-10-11 2004-04-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法
CN101294148A (zh) * 2008-06-06 2008-10-29 南京师范大学 从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法
CN101693748A (zh) * 2009-10-15 2010-04-14 南昌市浩然生物医药有限公司 一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用
CN101701215A (zh) * 2009-12-07 2010-05-05 南昌市万华生化药业有限公司 一种制备尿激酶的方法
CN101792481A (zh) * 2010-03-12 2010-08-04 丽珠医药集团股份有限公司 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法
CN101831417A (zh) * 2010-05-11 2010-09-15 广州市微生物研究所 一种l-门冬酰胺酶的制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1488753A (zh) * 2002-10-11 2004-04-14 中国科学院大连化学物理研究所 一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法
CN101294148A (zh) * 2008-06-06 2008-10-29 南京师范大学 从心肌中提取纯化高铁肌红蛋白还原酶的方法
CN101693748A (zh) * 2009-10-15 2010-04-14 南昌市浩然生物医药有限公司 一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用
CN101701215A (zh) * 2009-12-07 2010-05-05 南昌市万华生化药业有限公司 一种制备尿激酶的方法
CN101792481A (zh) * 2010-03-12 2010-08-04 丽珠医药集团股份有限公司 一种绒毛膜促性腺激素的纯化方法
CN101831417A (zh) * 2010-05-11 2010-09-15 广州市微生物研究所 一种l-门冬酰胺酶的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人绒毛膜促性腺激素的精制、去热原工艺;徐桢琦等;《沈阳药科大学学报》;19980430;第15卷(第2期);第154-156页 *
人绒毛膜促性腺激素的精制及去热原工艺;徐桢琦等;《中国生化药物杂志》;19981231;第19卷(第1期);第35-37页 *

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