CN106834258A - 一种通过去热原纯化降纤酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过去热原纯化降纤酶的方法。利用吸附的特性，在去热原的工序中，通过加入磷酸钾溶液、乙酸钙溶液吸附去除产品中的热原，从而达到去除热原的效果。技术方案是将经过蛇毒干粉溶解、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤纯化和冷冻干燥以得到的降纤酶干粉，进一步加入纯化水、乙醇、乙酸铵等溶解，并加入磷酸钾溶液、乙酸钙液吸附，后用氢氧化钠溶液调节pH 值搅拌后离心，上清液调pH 值后加乙醇离心后脱水、干燥得降纤酶精品。本发明与现有技术相比，优点在于在多次层析有效去除杂质、提高降纤酶的纯度的基础上，有效去除降纤酶中的热原，以获得纯度高、活性好、安全性高的降纤酶干粉，纯度可达98%以上，比活能够达到4000单位/mg以上，细菌内毒素小于0.01EU/U。

Description

一种通过去热原纯化降纤酶的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说涉及一种纯化降纤酶精品的方法。
背景技术
蛇毒中的降纤酶是哺乳动物凝血及纤溶系统的蛋白酶。通过专一性的激活或灭活作用, 该蛋白酶作用于血液凝固、纤溶系统的各个步骤, 产生促凝或抗凝效应。在体外引起血浆纤维蛋白原的凝聚, 起凝血作用; 在体内它不激活凝血因子XIII。所有它有分解血浆纤维蛋白原、溶解血栓、降低血液粘度和血小板聚集力的作用。在临床上蛇毒类凝血酶能用于防治血栓栓塞性疾病、急性脑梗死，以及脑梗死再复发的预防等。
热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。当含有热原的物质进入人体以后，人体会产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此去热原是很多药用生化产品生产工序中不可缺少的一步。细菌内毒素法是常用的控制热原的检测方法之一。
天然蛇毒中提取的类凝血酶绝大多数为酸性蛋白质，经对现有文献的检索发现，从蛇毒种制备降纤酶多采用阴离子交换柱进行分离，并结合凝胶过滤、亲和层析和反相液相色谱等方法进行纯化。虽然在一定程度上实现了规模化生产，取得了单一成分产品,但是比活更高、去除热原的降纤酶单一成品的获得使降纤酶的应用更加安全，同时更能满足临床和科研的需求。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种通过去热原纯化降纤酶的方法。取得比活更高、去除热原的单一成分降纤酶产品，使其能够快速、简便、低成本的纯化降纤酶。
本发明是通过以下技术方案实现的，其步骤如下：
（1）将降纤酶干粉按1:10-30(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。
（2）按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.1-0.4mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.05-0.3mol/L的乙酸钙溶液，搅拌均匀。
（3）用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.0-10.0，搅拌2-3小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。
（4）上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至7.5-8.5，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。
（5）虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟。
（6）沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟。
（7）将沉淀物置五氧化二磷为干燥剂的真空干燥箱中干燥，即得降纤酶成品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
（1）将降纤酶干粉按1:15(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。
（2）按降纤酶干粉1:15(Kg:L)的比例加入0.2mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1：30(Kg:L)的比例加入0.1 mol/L的乙酸钙溶液，搅拌均匀。
（3）用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.2，搅拌2.5小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。
（4）上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至7.8，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。
（5）虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟。
（6）沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟。
（7）将沉淀物置五氧化二磷为干燥剂的真空干燥箱中干燥，即得降纤酶成品。
得到的降纤酶成品检测纯度为98.2%，比活力为4090单位/mg，细菌内毒素小于0.01EU/U。
实施例2
（1）将降纤酶干粉按1:25(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。
（2）按降纤酶干粉1:30(Kg:L)的比例加入0.1-0.4mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1:30(Kg:L)的比例加入0.25mol/L的乙酸钙溶液，搅拌均匀。
（3）用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.5，搅拌3小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。
（4）上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至8.1，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。
（5）虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟。
（6）沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟。
（7）将沉淀物置五氧化二磷为干燥剂的真空干燥箱中干燥，即得降纤酶成品。
得到的降纤酶成品检测纯度为98.1%，比活力为4100单位/mg，细菌内毒素小于0.01EU/U。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种通过去热原纯化降纤酶的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）将降纤酶干粉用水溶解，依次加入乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液，搅拌，调节pH，搅拌，离心，取上清液；
（2）调节上清液pH，搅拌，加入95%乙醇进行沉淀，虹吸，离心，并用无水乙醇洗涤沉淀脱水，离心，干燥，得去除热原的降纤酶精品。
2.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于，步骤(1) 中所述降纤酶干粉是通过蛇毒干粉的溶解、亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤纯化和冷冻干燥以得到的。
3.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中将降纤酶干粉按1:10-30(Kg:L)的比例加入纯化水中搅拌溶解。
4.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中加入纯化水溶解搅拌后，加入等体积的乙醇以及总体积的5％ (L:Kg) 的乙酸铵搅拌。
5.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(1) 中，按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.1-0.4mol/L 磷酸钾溶液，搅拌30分钟后，再按降纤酶干粉1:20-40(Kg:L)的比例加入0.05-0.3mol/L的乙酸钙溶液。
6.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(2) 中用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH 至9.0-10.0，搅拌2-3小时；3000rpm离心30分钟，弃去沉淀物取上清液。
7.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(2) 中上清液用2mol/L的盐酸溶液调节pH 至7.5-8.5，加入10倍量(V/V)95％乙醇，沉淀析出，静置过夜。
8.根据权利要求1 所述的方法，其特征在于：步骤(2) 中虹吸上层废乙醇，收集沉淀，3000rpm离心30分钟，沉淀物用无水乙醇脱水，3000rpm离心30分钟；将沉淀物真空干燥即得降纤酶成品。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115386564A (zh) * 2022-09-20 2022-11-25 河南省尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的纯化方法

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