CN115386564A - 一种尿激酶的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿激酶的纯化方法，属于生物工程及化学工程领域。所述纯化方法包括以下步骤：取尿激酶粗品，加入乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液搅拌，得到尿激酶料液；在尿激酶料液中加入正丁酸铵溶液，离心过滤，得尿激酶上清液；将尿激酶上清液上吸附柱，用洗脱液Ⅰ洗脱吸附柱，收集洗脱液；洗脱液上吸附柱，用洗脱液Ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；洗脱液上亲和层析柱，用洗脱液Ⅲ洗脱亲和层析柱，收集洗脱液；洗脱液经超滤膜，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液；超滤液加入乙醇醇沉，离心，留取沉淀物、淀物经冷冻干燥得尿激酶。本发明提供的纯化方法原料来源广泛，制备方法简单、生产成本低、可实现工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程及化学工程领域，涉及一种尿激酶的纯化方法。
背景技术
尿激酶，简称UK，是人体肾细胞产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是酶活性中心的必需氨基酸。其主要存在于人及哺乳动物的尿中，人尿源尿激酶主要有天然高分子量尿激酶(54000Dal)和低分子量尿激酶(33000Dal)两种，高分子量尿激酶溶解血栓的临床效果比低分子量的尿激酶约高3倍，国际上把尿激酶的相对分子量作为质量标准的重要指标之一。临床上主要用于治疗急性心肌梗塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞、血栓性闭塞性疾病、肺栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成。
中国专利CN106520739A公开了一种亲和层析纯化尿激酶的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的尿激酶，可以将总收率提高到80％以上，总效价不低于40000IU/mg，但该方法操作比较复杂，其活性收率和纯度依然不能满足需求。
中国专利申请CN105238772A公开了一种利用凝胶柱纯化尿激酶的方法。该方法避免使用强酸强碱，能有效分离内毒素，同时保证尿激酶不被破坏，分离效果能达到药典标准要求，收率在97％以上，但该方法只能除去粗品中的内毒素，但大小分子尿激酶的比不到60％，无法满足临床应用的需要。
中国专利CN106929497B公开了一种尿激酶的分离纯化方法。该方法包括如下步骤：1)尿激酶粗品的制备；2)尿激酶的纯化；所述的步骤2)包括如下步骤：将步骤1)制得的尿激酶粗品溶解后的澄清液经葡聚糖微球柱和/或琼脂糖微球柱进行纯化。该发明提供的分离纯化方法，可同时提高尿激酶比活性达至2万IU/mg蛋白以上，收率达75-87％，大小分子尿激酶的比例大于85％；而且，由于尿激酶的分离纯化过程中避免使用强酸强碱，减少了环境污染。但该发明的分离纯化方法载量较低，流速较低，工艺经济性不好。
因此，有必要探索一种生产成本低、收率高、产品质量高的尿激酶的纯化方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的提供了一种生产成本低、收率高、产品质量高的尿激酶的纯化方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
首先，提供了一种尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：
(1)取尿激酶粗品，加入乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液搅拌，得到尿激酶料液；
(2)在步骤(1)中得到的尿激酶料液中加入正丁酸铵溶液，搅拌后，离心过滤，弃去沉淀，得尿激酶上清液；
(3)先用洗脱液Ⅰ平衡吸附柱，再将步骤(2)中得到的尿激酶上清液上吸附柱，再次用洗脱液Ⅰ洗脱吸附柱，收集洗脱液；
(4)先用洗脱液Ⅱ平衡吸附柱，再将步骤(3)中得到的洗脱液上吸附柱，再次用洗脱液Ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；
(5)先用洗脱液Ⅲ平衡亲和层析柱，再将步骤(4)中得到的洗脱液上亲和层析柱，再次用洗脱液Ⅲ洗脱亲和层析柱，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)中得到的洗脱液经超滤膜，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液；
(7)将步骤(6)中得到超滤液加入乙醇醇沉，离心，留取沉淀物；
(8)将步骤(7)中得到的沉淀物经冷冻干燥得尿激酶。
进一步地，步骤(1)中所述尿激酶粗品、乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液的用量比为1g：6.8-7mL：6-6.5g：2.0-2.5mL：2.0-2.5mL；
进一步地，所述乙醇的体积分数80-90％，所述磷酸钾溶液的浓度为0.1-0.15mol/L，所述乙酸钙溶液的浓度为0.2-0.25mol/L。
进一步地，步骤(2)中所述尿激酶料液、正丁酸铵溶液的体积比为2.5-3.5：1，所述正丁酸铵溶液的浓度为1.5-2mol/L。
进一步地，步骤(3)中所述洗脱液Ⅰ为含氯化钠、磷酸的缓冲液，所述洗脱为梯度洗脱，所述梯度洗脱的过程包括：先用含0.1-0.4mol/L氯化钠、0.1-0.2mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱，再用含0.3-0.5mol/L氯化钠、0.2-0.3mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱。
优选地，步骤(3)中所述洗脱液Ⅰ为含氯化钠、磷酸的缓冲液，所述洗脱的过程包括：先用含0.2-0.3mol/L氯化钠、0.1-0.15mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱，再用含0.4-0.5mol/L氯化钠、0.2-0.25mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱。
进一步地，步骤(4)中所述洗脱液Ⅱ为含0.2-0.5mol/L氯化钠、0.2-0.5mol/L磷酸钠的缓冲液。
优选地，步骤(4)中所述洗脱液Ⅱ为含0.3-0.4mol/L氯化钠、0.3-0.4mol/L磷酸钠的缓冲液。
进一步地，步骤(5)中所述洗脱液Ⅲ为含0.2-0.5mol/L氯化钠、0.1-0.3mol/L磷酸的缓冲液。
优选地，步骤(5)中所述洗脱液Ⅲ为含0.3-0.4mol/L氯化钠、0.15-0.2mol/L磷酸的缓冲液。
进一步地，步骤(6)中所述磷酸钾溶液的浓度为0.05-0.25mol/L，所述超滤的过程包括：先用0.05-0.1mol/L磷酸钾溶液进行超滤，再用0.15-0.2mol/L磷酸钾溶液进行超滤，最后用0.2-0.25mol/L磷酸钾溶液进行超滤。
进一步地，步骤(7)中所述乙醇的体积分数70-90％，优选为80-90％。
进一步地，所述吸附柱为弱阴离子交换柱，所述弱阴离子交换柱的填料包括D201、D301、D311、DEAE的一种或几种，优选为DEAE。
进一步地，所述亲和层析柱填料包括Benzamidine Sepharose 4FF H-sub、Arginine Sepharose 4B的一种或几种，优选为Arginine Sepharose 4B。
以上所述缓冲液的溶剂均为水。
在一些具体的实施方式中，一种尿激酶的纯化方法，包括以下步骤：
(1)取尿激酶粗品(生物效价30000-50000IU/g，比活300-600IU/g·pr)1kg，加入6.8L90％的乙醇、6.5kg乙酸铵、2.5L 0.15mol/L磷酸钾溶液、2.5L 0.25mol/L乙酸钙溶液搅拌1-1.5h，得到尿激酶料液；
(2)在步骤(1)中得到的尿激酶料液中加入4L 2mol/L正丁酸铵溶液，搅拌1-2h后，离心过滤，弃去沉淀，得尿激酶上清液；
(3)吸附柱层析(以DEAE树脂柱为例)
①先用洗脱液Ⅰ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)平衡吸附柱，再将步骤(2)中得到的尿激酶上清液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
②先用洗脱液Ⅰ(含0.5mol/L氯化钠、0.25mol/L的缓冲液)平衡吸附柱，再将①中得到的洗脱液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.5mol/L氯化钠、0.25mol/L的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(4)先用洗脱液Ⅱ(含0.4mol/L氯化钠、0.4mol/L磷酸钠的缓冲液)平衡吸附柱，流速控制在100mL/min，再将②中得到的洗脱液上吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅱ(含0.4mol/L氯化钠、0.4mol/L磷酸钠的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(5)亲合层析柱层析(以Arginine Sepharose 4B为例)
先用洗脱液Ⅲ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸的缓冲液)平衡亲和层析柱，流速控制在100mL/min，再将(4)中得到的洗脱液上亲合层析柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅲ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)中得到的洗脱液经超滤膜(30000道尔顿超滤膜)，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液，具体包括以下步骤：先用0.1mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，再用0.2mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，最后用0.25mol/L磷酸钾溶液进行超滤得超滤液；
(7)将步骤(6)中得到超滤液按体积比1：7-10的比例加入90％乙醇醇沉14-16h，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(8)将步骤(7)中得到的沉淀物经冷冻干燥得尿激酶。
相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明经纯化得到的尿激酶比活可高达3600IU/g·pr；高分子尿激酶相对含量可达到96％；尿激酶的活性收率可高达94％；
(2)本发明提供的纯化方法原料来源广泛，制备方法简单、生产成本低、可实现工业化大规模生产。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。
实施例1
(1)取尿激酶粗品(生物效价30000-50000IU/g，比活300-600IU/g·pr)1kg，加入6.8L90％的乙醇、6.5kg乙酸铵、2.5L 0.15mol/L磷酸钾溶液、2.5L 0.25mol/L乙酸钙溶液搅拌1-1.5h，得到尿激酶料液；
(2)在步骤(1)中得到的尿激酶料液中加入4L 2mol/L正丁酸铵溶液，搅拌1-2h后，离心过滤，弃去沉淀，得尿激酶上清液；
(3)吸附柱层析(以DEAE树脂柱为例)
①先用洗脱液Ⅰ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)平衡吸附柱，再将步骤(2)中得到的尿激酶上清液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
②先用洗脱液Ⅰ(含0.5mol/L氯化钠、0.25mol/L磷酸的缓冲液)平衡吸附柱，再将①中得到的洗脱液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.5mol/L氯化钠、0.25mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(4)先用洗脱液Ⅱ(含0.4mol/L氯化钠、0.4mol/L磷酸钠的缓冲液)平衡吸附柱，流速控制在100mL/min，再将②中得到的洗脱液上吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅱ(含0.4mol/L氯化钠、0.4mol/L磷酸钠的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(5)亲合层析柱层析(以Arginine Sepharose 4B为例)
先用洗脱液Ⅲ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸的缓冲液)平衡亲和层析柱，流速控制在100mL/min，再将(4)中得到的洗脱液上亲合层析柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅲ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)中得到的洗脱液经超滤膜(30000道尔顿超滤膜)，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液，具体包括以下步骤：先用0.1mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，再用0.2mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，最后用0.25mol/L磷酸钾溶液进行超滤得超滤液；
(7)将步骤(6)中得到超滤液按体积比1：7-10的比例加入90％乙醇醇沉14-16h，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(8)将步骤(7)中得到的沉淀物经冷冻干燥得尿激酶。
实施例2
(1)取尿激酶粗品(生物效价30000-50000IU/g，比活300-600IU/g·pr)1kg，加入7.0L80％的乙醇、6kg乙酸铵、2.0L 0.1mol/L磷酸钾溶液、2.5L 0.2mol/L乙酸钙溶液搅拌1-1.5h，得到尿激酶料液；
(2)在步骤(1)中得到的尿激酶料液中加入4L 1.5mol/L正丁酸铵溶液，搅拌1-2h后，离心过滤，弃去沉淀，得尿激酶上清液；
(3)吸附柱层析(以DEAE树脂柱为例)
①先用洗脱液Ⅰ(含0.2mol/L氯化钠、0.1mol/L磷酸的缓冲液)平衡吸附柱，再将步骤(2)中得到的尿激酶上清液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.2mol/L氯化钠、0.1mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
②先用洗脱液Ⅰ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L的缓冲液)平衡吸附柱，再将①中得到的洗脱液过平衡好的吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅰ(含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(4)先用洗脱液Ⅱ(含0.3mol/L氯化钠、0.3mol/L磷酸钠的缓冲液)平衡吸附柱，流速控制在100mL/min，再将②中得到的洗脱液上吸附柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅱ(含0.3mol/L氯化钠、0.3mol/L磷酸钠的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(5)亲合层析柱层析(以Arginine Sepharose 4B为例)
先用洗脱液Ⅲ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)平衡亲和层析柱，流速控制在100mL/min，再将(4)中得到的洗脱液上亲合层析柱，流速控制在100mL/min，再次用洗脱液Ⅲ(含0.3mol/L氯化钠、0.15mol/L磷酸的缓冲液)洗脱吸附柱，流速控制在100mL/min，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)中得到的洗脱液经超滤膜(30000道尔顿超滤膜)，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液，具体包括以下步骤：先用0.05mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，再用0.15mol/L磷酸钾溶液进行超滤，得超滤液，最后用0.2mol/L磷酸钾溶液进行超滤得超滤液；
(7)将步骤(6)中得到超滤液按体积比1：7-10的比例加入90％乙醇醇沉14-16h，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(8)将步骤(7)中得到的沉淀物经冷冻干燥得尿激酶。
实施例3
与实施例1的不同在于，步骤(1)中加入7.5L 90％的乙醇、6.8kg乙酸铵、3.0L0.15mol/L磷酸钾溶液、3.0L 0.25mol/L乙酸钙溶液搅拌1-1.5h，其他步骤均与实施例1相同。
实施例4
与实施例1的不同在于，步骤(2)中加入5L 2mol/L正丁酸铵溶液，其他步骤均与实施例1相同。
实施例5
与实施例1的不同在于，步骤(3)中洗脱液Ⅰ替换为含0.4mol/L氯化钠、0.2mol/L磷酸的缓冲液(所用的洗脱液的量与①、②两次洗脱的总体积量相同)，一次洗脱，收集洗脱液，其他步骤均与实施例1相同。
实施例6
与实施例1的不同在于，步骤(6)的超滤过程包括以下步骤：用0.15mol/L磷酸钾溶液超滤3次，得超滤液，其他步骤均与实施例1相同。
对比例1
与实施例1的不同在于将步骤(1)、步骤(2)的顺序调换，即取尿激酶粗品先进行步骤(2)，得尿激酶上清液；然后，尿激酶上清液再进行步骤(1)，得到尿激酶料液，其他步骤均与实施例1相同。
实验例
计算实施例1-6、对比例1得到尿激酶中高分子尿激酶相对含量，并根据《中国药典》2020版二部正文品种第一部分记载的方法计算各实施例中尿激酶的活性收率、比活。测试结果见表1。
表1
| 实例 | 高分子尿激酶相对含量(％) | 活性收率(％) | 比活(万IU/g·pr) |
| 实施例1 | 96 | 94 | 3600 |
| 实施例2 | 95 | 92 | 3400 |
| 实施例3 | 88 | 85 | 2900 |
| 实施例4 | 87 | 87 | 2800 |
| 实施例5 | 90 | 89 | 3000 |
| 实施例6 | 86 | 84 | 2700 |
| 对比例1 | 72 | 65 | 1700 |
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种尿激酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取尿激酶粗品，加入乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液搅拌，得到尿激酶料液；
(2)在步骤(1)中得到的尿激酶料液中加入正丁酸铵溶液，搅拌后，离心过滤，弃去沉淀，得尿激酶上清液；
(3)先用洗脱液Ⅰ平衡吸附柱，再将步骤(2)中得到的尿激酶上清液上吸附柱，再次用洗脱液Ⅰ洗脱吸附柱，收集洗脱液；
(4)先用洗脱液Ⅱ平衡吸附柱，再将步骤(3)中得到的洗脱液上吸附柱，再次用洗脱液Ⅱ洗脱吸附柱，收集洗脱液；
(5)先用洗脱液Ⅲ平衡亲和层析柱，再将步骤(4)中得到的洗脱液上亲和层析柱，再次用洗脱液Ⅲ洗脱亲和层析柱，收集洗脱液；
(6)将步骤(5)中得到的洗脱液经超滤膜，加入磷酸钾溶液超滤，得超滤液；
(7)将步骤(6)中得到超滤液加入乙醇醇沉，离心，留取沉淀物；
(8)将步骤(7)中得到的沉淀物经冷冻干燥得尿激酶。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中所述尿激酶粗品、乙醇、乙酸铵、磷酸钾溶液、乙酸钙溶液的用量比为1g：6.8-7mL：6-6.5g：2.0-2.5mL：2.0-2.5mL。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述尿激酶料液、正丁酸铵溶液的体积比为2.5-3.5：1，所述正丁酸铵溶液的浓度为1.5-2mol/L。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述洗脱液Ⅰ为含氯化钠、磷酸的缓冲液，所述洗脱为梯度洗脱，所述梯度洗脱的过程包括：先用含0.1-0.4mol/L氯化钠、0.1-0.2mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱，再用含0.3-0.5mol/L氯化钠、0.2-0.3mol/L磷酸的缓冲液进行洗脱。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱液Ⅱ为含0.2-0.5mol/L氯化钠、0.2-0.5mol/L磷酸钠的缓冲液。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)中所述洗脱液Ⅲ为含0.2-0.5mol/L氯化钠、0.1-0.3mol/L磷酸的缓冲液。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(6)中所述磷酸钾溶液的浓度为0.05-0.25mol/L，所述超滤的过程包括：先用0.05-0.1mol/L磷酸钾溶液进行超滤，再用0.15-0.2mol/L磷酸钾溶液进行超滤，最后用0.2-0.25mol/L磷酸钾溶液进行超滤。
8.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(7)中所述乙醇的体积分数70-90％。
9.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述吸附柱为弱阴离子交换柱，所述弱阴离子交换柱的填料包括D201、D301、D311、DEAE的一种或几种。
10.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析柱填料包括Benzamidine Sepharose 4FF H-sub、Arginine Sepharose 4B的一种或几种。
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