CN110894495A - 一种尿激酶的制备方法及其冻干粉 - Google Patents

一种尿激酶的制备方法及其冻干粉 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高纯度大分子尿激酶的制备方法及其冻干粉，属于生物化学工程技术领域。具体包括步骤：(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯；所述步骤(3)中将步骤(2)得到的尿激酶精品溶解后，将尿激酶精品溶液加入阳离子交换层析柱进行提纯；将提纯后的尿激酶进行冻干即得到尿激酶冻干粉。所述阳离子交换层析柱中充填的填料为Capto S impAct、SP sepharose HP、source 30S中的一种。本发明选择高分辨率离子交换层析，在保证纯度和活性收率的前提下，大大降低了生产成本，使得高纯度大分子量尿激酶的规模化生产成为可能。

Description

一种尿激酶的制备方法及其冻干粉
技术领域
本发明属于生物化学工程技术领域，具体涉及一种尿激酶的制备方法及其冻干粉。
背景技术
尿激酶是从新鲜人尿里提取的一种溶血栓药物，它能激活纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶，纤溶酶能使不溶性的纤维蛋白转变为可溶性的肽，从而使血栓溶解。因此，临床上多用于治疗血栓形成、血栓栓塞等症。尿激酶与抗癌剂合用时，由于它能溶解癌细胞周围的纤维蛋白，使得抗癌剂能更有效地穿入癌细胞，从而提高抗癌剂杀伤癌细胞的能力。所以尿激酶也是一种很好的癌症辅助治疗剂，而且它是无抗原性问题，可长时间使用。
尿激酶是由人肾小管上皮细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，是一种碱性蛋白，等电点在pH8.7左右，为白色非结晶状粉末，易溶于水；稀溶液性状不稳定，必须新鲜配用，且不得用酸性溶液稀释，冻干状态可稳定数年。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也有酯酶的活力，无抗原性，不使体内产生抗体，体内半衰期为(14±6)min。
尿激酶主要有大分子尿激酶(H-UK)、分子量为54000，和小分子尿激酶(L-UK)、分子量为34000两种，前者为天然存在形式，后者为H-UK的降解产物。这两种UK均有生物活性，但从体外进行的酶动力学试验和临床表明，H-UK比L-UK更有效、副作用更低，因此现阶段临床使用的尿激酶产品对小分子量尿激酶含量的控制有着严格要求。
自20世纪70年代以来，高纯度大分子量尿激酶的制取方兴未艾，精制方法多有报道，但大多数方法都存在回收率偏低的问题，经济效益差，无法实行量产。
中国发明专利申请CN105238772A(一种尿激酶分离纯化方法)中，将尿激酶进行分离和纯化，得到了去除内毒素的尿激酶溶液，具体为对男性尿液进行酸化，用硅藻土柱进行吸附，再用氨水和氯化钠溶液进行洗脱，然后对洗脱液进行盐析，得到尿激酶粗品，随后将尿激酶粗品加入氨水中解离，得到了尿激酶溶液；纯化过程中，将尿激酶溶液通过装有纤维素、离子交换树脂等凝胶填料的凝胶柱中，进行洗脱处理，即得到产品，这种方法避免了强酸强碱的使用，能够有效分离内毒素，得到收率在97％以上的尿激酶。然而这种方法不能实现对大分子尿激酶和小分子尿激酶的分离。中国发明专利申请CN101701215A(一种制备尿激酶的方法)采用D160阳离子树脂交换法、亲和膜色谱法及亲和层析法相结合，以尿激酶粗品出发，制备尿激酶，最终得到的尿激酶比活性可达15万IU/mg.pr以上，高分子尿激酶的相对含量可达96％以上，然而生物活性收率仅为65％，因此并不能满足当前阶段临床的实际需求，同时该方法中利用到的亲和膜色谱法生产成本较高，无法进行大规模生产。中国发明专利申请CN106929497A(一种尿激酶的分离纯化方法)中，将尿激酶粗品溶解后加入葡聚糖微球柱或琼脂糖微球柱中进行纯化，最终可将尿激酶比活性提高至2万IU/mg蛋白以上，得到的尿激酶的收率为75-87％，然而这种方法并未区分大小分子尿激酶，且活性收率较低，因此并不能满足当前阶段临床的实际需求。
发明内容
本发明欲解决的技术问题是现有技术的尿激酶生产和纯化方法中，生产成本高，并且不能确保得到的大分子量尿激酶同时具有高纯度和高活性收率等技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种尿激酶的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯；
所述步骤(3)中将步骤(2)得到的尿激酶精品溶解后，将尿激酶精品溶液加入阳离子交换层析柱中进行提纯；可用水作为溶剂溶解尿激酶精品。
所述阳离子交换层析柱中充填的填料为高分辨率离子色谱填料，可选自Capto SimpAct、SP sepharose HP、source 30S中的一种。
进一步地，所述尿激酶精品溶液在阳离子交换层析柱中进行提纯时，首先用平衡缓冲液进行冲洗，当用平衡缓冲液冲洗层析柱后的溶液UV280nm<0.1时，再用洗脱缓冲液进行洗脱。
进一步地，所述平衡缓冲液选自：醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种；且所述平衡缓冲液中含有150-500mM氯化钠。
进一步地，所述洗脱缓冲液为含有500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液。
氯化钠含量较低的平衡缓冲液可将小分子尿激酶提前洗脱出来，然后用氯化钠含量较高的洗脱缓冲液将层析柱中的大分子尿激酶洗脱出来，实现大小分子尿激酶的分离和提纯。
进一步地，所述步骤(3)中提纯之前，调节尿激酶精品溶液的电导率为15-90ms/cm。用平衡缓冲液来调节尿激酶精品溶液的电导率，具体为在尿激酶精品溶液中加入平衡缓冲液，待电导率符合要求后，将混合溶液上柱子，随后用平衡缓冲液和洗脱缓冲液依次对柱子进行洗脱。
进一步地，所述步骤(3)中提纯之前，调节尿激酶精品溶液的pH为4.5-7.5；更进一步地，pH为4.5-6.5。
进一步地，所述步骤(1)包括如下步骤：首先将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，硅胶装柱用自来水冲洗，氨水洗脱，收集洗脱液；然后将洗脱液加入固体硫酸铵中沉淀，过滤，收集滤渣，即为尿激酶粗品。在固体硫酸铵中沉淀时，沉淀温度为0-10℃，更进一步地，沉淀温度为4-8℃。
进一步地，所述步骤(2)包括如下步骤：将尿激酶粗品经过溶解、过滤后，得尿激酶精品。
本发明同时还要求保护一种尿激酶冻干粉，其中所述尿激酶冻干粉是利用上述制备方法得到的尿激酶经冻干得到的。
进一步地，所述尿激酶冻干粉中，大分子尿激酶含量≧95％，大分子尿激酶活性收率≧90％。
本发明在现有尿激酶生产工艺的基础上，采用高分辨率阳离子交换层析，结合其他工艺条件的优化，制备得到了大分子尿激酶含量≧95％，即小分子尿激酶含量<5％的高纯度大分子尿激酶制品。此发明的原理是根据大小分子尿激酶的分子量不同，所带电荷的微弱差别，用离子交换和梯度洗脱的方法得到的：在提纯过程中，首先用加入氯化钠含量为150-500mM的平衡缓冲液对高分辨率阳离子交换层析柱进行冲洗，可首先将小分子尿激酶冲洗下去，用紫外分光光度计监测冲洗后平衡缓冲液的吸光度，当UV280nm<0.1时，换氯化钠含量为500-1000mM的洗脱缓冲液进行洗脱，此时得到的是大分子尿激酶含量较高的尿激酶产品，可对大小分子尿激酶进行分离，即实现大分子尿激酶产品的提纯。
这种高纯度大分子尿激酶在临床使用时副作用更小，同时由于收率有保证(活性回收率90％以上)，能够有效保障生产厂家的经济效益。
本发明采用高分辨率离子色谱填料，具体为Capto S impAct、SP sepharose HP或source 30S，均购自美国GE公司，通过优化各项工艺参数如平衡缓冲液配方、洗脱缓冲液配方、洗脱方法、pH、电导率等，实现了大分子尿激酶和小分子尿激酶的有效分离，并采用冻干工艺，得到了大分子尿激酶含量≧95％，且活性收率>90％的尿激酶冻干粉制品，能够满足量产经济效益的要求。
尿激酶作为一种从新鲜男性尿液中提取的蛋白质药物在临床上有着广泛应用。为保证疗效，同时降低副作用，人尿激酶产成品对于小分子量尿激酶的含量有着严格的控制要求。以往报告的尿激酶精制方法多采用凝胶色谱法，该方法可以满足大分子尿激酶的纯度及收率要求，但由于生产成本较高，无法进行大规模生产。本发明选择高分辨率离子交换层析，在保证纯度和活性收率的前提下，大大降低了生产成本，使得高纯度大分子量尿激酶的规模化生产成为可能。
与现有技术相比，本发明的尿激酶制备方法具有如下优点：
(1)本发明使用高分辨率阳离子色谱填料作为层析柱填料，并先用平衡缓冲液进行清洗，先将小分子尿激酶洗脱出来，然后用洗脱缓冲液对柱子进行冲洗，可洗脱除大分子尿激酶，首次实现了大小分子尿激酶的分离提纯。
(2)采用本发明的尿激酶制备方法得到的尿激酶冻干粉制品，大分子尿激酶含量高，且活性收率高，临床使用效果更好。
(3)本发明的尿激酶制备方法是在现有生产工艺的基础上做出的改进，无需重建新的生产线。
(4)本发明的尿激酶制备方法简单，能够实现工业量产。
附图说明
图1：实施例1中所得尿激酶产品的SDS-PAGE电泳图。
图2：实施例2中所得尿激酶产品的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
下面通过说明书附图和具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
(1)制备尿激酶粗品：将新鲜男性尿液加入硅胶搅拌吸附，将硅胶装柱，用自来水冲洗硅胶柱，浓度为3％的氨水洗脱，收集洗脱液。洗脱液加入固体硫酸铵于4-8℃沉淀，用食品级硅藻土为滤层底部，滤网为150目尼龙滤布，过滤收集棕色的滤渣，即为尿激酶粗品。
(2)制备尿激酶精品：取上述尿激酶粗品，经水溶解制成浓度为3000iu/ml-5000iu/ml浓度的溶液、用食品级硅藻土为滤层底部，滤网为150目尼龙滤布进行过滤，得到尿激酶精品。
(3)提纯：
(a)取尿激酶精品，加水溶解，得尿激酶精品水溶液，用磷酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH4.5-6.5，用平衡缓冲液调节电导18-25ms/cm，加入高分辨率阳离子交换层析柱(Capto S impAct，购自美国GE公司)，用平衡缓冲液(含150-500mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)冲洗柱子，直至UV280nm<0.1，再用洗脱缓冲液(含500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)洗脱柱子，收集洗脱溶液2升。
(b)取上述洗脱液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩，洗滤更换冻干缓冲液，收集浓缩液500ml。
(c)取上述浓缩液，冻干，即得高纯度大分子尿激酶冻干粉。
对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为96％，活性收率为92％。
如图1所示，为实施例1各步骤中得到的尿激酶产品的电泳图，各泳道从左至右，分别为Marker、70％大分子含量的尿激酶精品、小分子洗脱液1、2、3，大分子洗脱液4。其中70％大分子含量的尿激酶精品由步骤(2)得到，小分子洗脱液1、2、3是指用平衡缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液，共收集了3次，分别加入3个泳道中；大分子洗脱液4是指用洗脱缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液。
可以看出，70％大分子含量的尿激酶精品S在分子量为54000处出现了较粗且明显的特异性条带，分子量在34000处出现了较洗且不清晰的特异性条带，可见70％大分子含量的尿激酶精品含有大小分子尿激酶，但是大分子尿激酶的含量更多；而仅用平衡缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液1、2、3仅在分子量为34000处出现了特异性条带，说明平衡缓冲液成功地将小分子尿激酶分离出来；用洗脱缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液仅在分子量为54000处出现了粗且明显的特异性条带，说明洗脱缓冲液冲洗柱子时成功地将大分子尿激酶冲洗了出来。综上，可看出采用本发明的技术方案能够实现大小分子尿激酶的分离，达到了提纯大分子尿激酶产品的技术效果。
实施例2
(1)制备尿激酶粗品：将新鲜男性尿液加入硅胶搅拌吸附，将硅胶装柱，用自来水冲洗硅胶柱，浓度为3％的氨水洗脱，收集洗脱液。洗脱液加入固体硫酸铵于4-8℃沉淀，用食品级硅藻土为滤层底部，滤网为150目尼龙滤布，过滤收集棕色的滤渣，即为尿激酶粗品。
(2)制备尿激酶精品：取上述尿激酶粗品，经水溶解制成浓度为3000iu/ml-5000iu/ml浓度的溶液、用食品级硅藻土为滤层底部，滤网为150目尼龙滤布进行过滤，得到尿激酶精品。
(3)提纯：
(a)取尿激酶精品，加水溶解，得尿激酶精品水溶液，使用磷酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH4.5-6.5，用平衡缓冲液调节电导18-25ms/cm，加入高分辨率阳离子交换层析柱(SP sepharose HP，购自美国GE公司)，用平衡缓冲液(含150-500mM氯化钠的磷酸盐缓冲液)冲洗柱子，直至UV280nm<0.1，用洗脱缓冲液(含500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)洗脱柱子，收集洗脱溶液2升。
(b)取上述洗脱液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩，洗滤更换冻干缓冲液，收集浓缩液500ml。
(c)取上述浓缩液，冻干，即得高纯度大分子尿激酶冻干粉。
对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为97％，活性收率为91％。
如图2所示，为实施例2各步骤中得到的尿激酶产品的电泳图，各泳道从左至右，分别为Marker、70％大分子含量的尿激酶精品、小分子洗脱液1、2，大分子洗脱液3、4、5。其中70％大分子含量的尿激酶精品由步骤(2)得到，小分子洗脱液1、2是指用平衡缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液，共收集了2次，分别加入2个泳道中；大分子洗脱液4是指用洗脱缓冲液冲洗柱子后得到的洗脱液，共收集了3次，分别加入3个泳道中。
与实施例1中的分析过程相同，同样也可以看出平衡缓冲液成功地将小分子尿激酶分离出来，并且洗脱缓冲液冲洗柱子时也成功地将大分子尿激酶冲洗了出来，即实现了大小分子尿激酶的分离。
实施例3
尿激酶制备过程与实施例1类似，不同之处仅在步骤(3)提纯：
(a)取尿激酶精品，加水溶解，得尿激酶精品水溶液，用磷酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH7.5，用平衡缓冲液调节电导18-25ms/cm，加入高分辨率阳离子交换层析柱(Capto SimpAct，购自美国GE公司)，用平衡缓冲液(含150-500mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)冲洗柱子，直至UV280nm<0.1，再用洗脱缓冲液(含500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)洗脱柱子，收集洗脱溶液2升。
(b)取上述洗脱液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩，洗滤更换冻干缓冲液，收集浓缩液500ml。
(c)取上述浓缩液，冻干，即得高纯度大分子尿激酶冻干粉。
对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为90％，活性收率为82％。可看出，改变尿激酶精品溶液的pH，降低了产品中大分子尿激酶的含量及其活性收率，因此可见pH变化后不能更好地提纯大分子尿激酶。
实施例4
尿激酶制备过程与实施例1类似，不同之处仅在步骤(3)提纯：
(a)取尿激酶精品，加水溶解，得尿激酶精品水溶液，用磷酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH4.5-6.5，用平衡缓冲液调节电导18-25ms/cm，加入高分辨率阳离子交换层析柱(Capto S impAct，购自美国GE公司)，仅用洗脱缓冲液(含500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液)洗脱柱子，收集洗脱溶液2升。
(b)取上述洗脱液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩，洗滤更换冻干缓冲液，收集浓缩液500ml。
(c)取上述浓缩液，冻干，即得高纯度大分子尿激酶冻干粉。
对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为73％，活性收率为93％。可见，仅用洗脱缓冲液，而不用平衡缓冲液时，无法实现大小分子尿激酶的分离。
对比例1
尿激酶制备过程与实施例1类似，不同之处仅在于步骤(3)提纯过程(a)步骤中，用平衡缓冲液调节电导为100ms/cm，对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为94％，活性收率为83％。
对比例2
尿激酶制备过程与实施例1类似，不同之处仅在于步骤(3)提纯过程(a)步骤中，用磷酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH10，对得到的高纯度大分子尿激酶冻干粉样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为0，活性收率为0。即无法洗脱出尿激酶产品，也不能实现大小分子尿激酶的分离。
由对比例1和2可看出，改变洗脱过程的工艺参数，具体为改变溶液电导和pH，大小分子尿激酶的分离效果变差。
对比例3
尿激酶制备过程与实施例1类似，不同之处仅在于步骤(3)提纯过程(a)步骤中，层析柱中填料为D160阳离子交换树脂，对得到的样品，按【中国药典】2015版标准检验活性和大小分子比例的测试方法进行检测和计算，所得的样品中大分子尿激酶含量为70％，活性收率为60％。可见，采用传统的D160阳离子交换树脂并不能实现大小分子尿激酶的分离，并且得到的尿激酶产品中活性收率也较低，无法满足实际需求。
上述实施例和对比例中的冻干过程使用常规技术手段。虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进。尤其是，只要不存在冲突，各个实施例中所提到的各项技术特征均可以任意方式组合起来。本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (10)

1.一种尿激酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备尿激酶粗品；(2)制备尿激酶精品；(3)提纯；
所述步骤(3)中将步骤(2)得到的尿激酶精品溶解后，将尿激酶精品溶液加入阳离子交换层析柱中进行提纯；
所述阳离子交换层析柱中充填的填料为Capto S impAct、SP sepharose HP、source30S中的一种。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述尿激酶精品溶液在阳离子交换层析柱中进行提纯时，首先用平衡缓冲液进行冲洗，再用洗脱缓冲液进行洗脱。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述平衡缓冲液选自：醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的一种；且所述平衡缓冲液中含有150-500mM氯化钠。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液为含有500-1000mM氯化钠的醋酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中提纯之前，调节尿激酶精品溶液的电导率为15-90ms/cm。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中提纯之前，调节尿激酶精品溶液的pH为4.5-7.5。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：首先将新鲜男性尿液加入硅胶吸附，硅胶装柱用自来水冲洗，氨水洗脱，收集洗脱液；然后将洗脱液加入固体硫酸铵中沉淀，过滤，收集滤渣，即为尿激酶粗品。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)包括如下步骤：将尿激酶粗品经过溶解、过滤后，得尿激酶精品。
9.一种尿激酶冻干粉，其特征在于：所述尿激酶冻干粉是利用权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的尿激酶经冻干得到的。
10.如权利要求9所述的尿激酶冻干粉，其特征在于：所述尿激酶冻干粉中大分子尿激酶的含量≧95％。
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