CN106699876A - 一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法 - Google Patents

一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种从人尿中收集尿蛋白的方法，特别适合于大规模使用，它是采用阴离子交换剂制作尿液过滤装置，将其置放于尿斗或小便槽内，用以承接尿液从过滤装置流过；尿液过滤装置的形状、大小与尿斗或小便槽相适应；定时回收尿液过滤装置，对其中的阴离子交换剂作集中解吸提取，提取收集含尿蛋白的组份，并对阴离子交换剂作再生处理备作再用。经后续的纯化处理，可制得各种指标均达到药典要求的尿蛋白，在多种领域作为人血浆来源白蛋白的替代品应用。更为重要的是该方法在吸附有尿蛋白的吸附剂处理之前，进行了相应的预处理，保证了尿蛋白的活性，减少了尿蛋白的降解和微生物的滋生，提高了尿蛋白产品的质量。

Description

一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法
技术领或
本发明涉及一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法，主要适用于人尿蛋白、人尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶、人尿激酶等尿蛋白原料粗制品的生产。
背景技术
人尿液中的人体蛋白与人血白蛋白的分子结构和生物学性质相同，是同一物质(Poortmars,J.etal.,Biochemica et Biophysica Acta,43(1966),380-389)。尽管尿液中白蛋白浓度很低，只有约10-20mg/L，但巨量的尿液来源，使其中的白蛋白含量也成为一个巨量。
医药界从人尿液中提取蛋白质的做法由来已久，最有代表性的尿蛋白产品是尿激酶和人尿激肽原酶。提取尿激酶等尿蛋白的传统方法是，在男性成人排尿处设置容器收集原尿液，运输到加工点机构集中进行后续处理。在人口密度较高的城市的公共厕所收集尿液，收集与运输成本相对高，面且在收集、运输过程中很难避免尿液抛洒，对城市卫生造成一定的影响。
目前，国内外生产尿蛋白，均需先收集尿液，再提取尿蛋白，成本高、对环境有影响，再加上创建文明卫生城市和城市卫生化改造，尿液收集的难度越来越大，这严重影响了尿蛋白产品的市场发展。因此，尿蛋白原料的制备方法亟待突破，克服目前的限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法，该方法适合规模化，产业化生产尿蛋白，提高尿蛋白的处理批量，在吸附有尿蛋白的吸附剂处理之前，进行了相应的预处理，保证了尿蛋白的活性，减少了尿蛋白的降解和微生物的滋生，提高了尿蛋白产品的质量。
由于尿蛋白不稳定，容易变性失活、甚至降解，且吸附尿蛋白的树脂，也很容易出现微生物的大量滋生，所以，树脂必须在收集后尽快解吸，而时间对处理的批量有极大的相关性。从收集到处理的时间短，就需要将刚收集的吸附剂及时运输到加工厂，运输的批量小，单次处理批量小，蛋白变性或降解较少、微生物滋生较轻，但运输成本和生产成本极高，规模也严重受限；从收集到处理的时间跨度长，需要将收集后的吸附剂积累到一定数量后运输到加工厂，单次处理批量大，运输成本和生产成本低，但蛋白变性或降解严重、微生物滋生严重，难以生产出合格的产品。
未解决上述问题，本发明具体技术方案是：
一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法，包括以下步骤：
a)将分装好用于吸附尿蛋白的吸附剂装置放置在尿液流经处，使尿液流经吸附剂使尿蛋白被吸附；
b)收集和更换吸附尿蛋白的吸附剂；
c)对吸附有尿蛋白的吸附剂进行预处理，防止吸附剂内的尿蛋白失活或降解，减少微生物的滋生；
d)预处理后的吸附剂冷藏储存；
e)将吸附有尿蛋白的吸附剂大批量冷藏运至工厂进行尿蛋白解吸处理，生产加工相应的尿蛋白原料或尿蛋白制品。
步骤a)所述吸附剂装置采用离子交换剂作为尿液流经过滤装置，将分装好的用于吸附尿蛋白的吸附剂放置在尿液流经部位，用于吸附收集尿蛋白；该尿液过滤装置为通透性较好的尼龙滤布制作，置放于尿斗内或小便槽内，用以承接尿液从过滤装置流过；尿液过滤装置的形状、大小与小便尿斗或小便槽相适应；定时回收和更换尿液过滤装置，对其中的离子交换剂作集中提前解吸，收集含尿蛋白的组份，并对离子交换剂作再生处理备作再用。
该方法在大量冲水的环境中也能有效吸附尿蛋白，收集过程对周围环境没有明显影响，因此，在对环境卫生要求较高的场所也可以进行尿蛋白的收集，因此，尿蛋白可收集范围大幅度扩大。
所述的吸附剂为树脂，为阴离子交换树脂、阳离子交换树脂，阴阳离子混合树脂或者同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的两性树脂。作为优选采用大孔型树脂。
树脂骨架为聚苯乙烯、聚丙烯酸、酚醛树脂、琼脂糖任意一种或几种：配基为磺酸基、羧酸基、磷酸基阳离子交换基团和伯胺、仲胺、叔胺和季胺基离子基团。作为优选采用大孔型树脂。
在吸附等电点低于6.0的蛋白时，采用配基为季胺基的大孔型聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂；在吸附等电点高于7.0的蛋白时，采用配基为-SO3 -的大孔型聚丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂；同时吸附等电点低于6.0的蛋白和等电点高于7.0的蛋白时可采用阴阳离子混合型树脂或者同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的两性树脂。如人尿胰蛋白酶抑制剂、人尿激肽原酶为等电点低于6.0的蛋白，在尿液中容易与季胺基结合；尿激酶为等电点高于7.0的蛋白在尿液中容易与-SO3 -结合。
选用50-300目的尼龙滤布制作的袋子作为分装树脂的滤袋。
作为优选，60目的尼龙滤布制作的滤袋，透水性好且保证了树脂不流失。
树脂在厕所的放置时间如果较短，吸附的蛋白量较少，如果放置时间较长，蛋白可能变性、降解等，作为优选，放置在厕所中的时间为24小时。
步骤c)在将吸附有尿蛋白的吸附剂处理或储存之前，对吸附剂进行相应的预处理，防止尿蛋白变性失活、降解，减少了微生物的滋生，便于将吸附剂积累到足够数量时再运往加工厂，降低了运输成本，同时也也提高了生产设备的单次生产批量，降低了生产成本，提高了生产效率，实现从人尿中生产尿蛋白的规模化产业，解决尿蛋白无法规模化生产和生产成本较高的难题。
步骤c)吸附尿蛋白的吸附剂预处理方法为：用大量清水对吸附剂进行冲洗、浸泡和脱水，用于去除吸附剂表面和内部的残留尿液、微生物、尿垢。清水冲洗和浸泡可以使清水进入吸附剂的内部，脱水可以将吸附剂内部的残留尿液、微生物、尿垢等有可能破坏尿蛋白产品质量的物质甩出，对吸附剂可以采用离心机或者脱水机进行脱水；脱水后的吸附剂冷藏储存，在低温环境中防止尿蛋白变性降解，减少了微生物的滋生，增长了吸附剂内的存储时间，便于收集足够多的吸附有尿蛋白的吸附剂运至加工厂，降低了运输成本，保证尿蛋白质量。
步骤c)在清水浸泡之前进行高压水流冲洗，主要是去除尿垢，一般的水流冲洗，很难去除附着在树脂表面的尿垢，更难去除大孔型树脂内部网状结构中残留的尿液，高压水流冲洗，可以对吸附剂上的尿垢产生足够多的冲击和震动力，提高了尿垢的清除，有利于将残留尿液、微生物和尿垢的去除。
步骤c)的预处理方法还可以是低温下，采用预处理液浸泡，然后清水清洗，再脱水。
其中，所述预处理液可以是缓冲液，所述缓冲液为磷酸、磷酸钠、磷酸氢钠或磷酸二氢钠中的一种或两种以上的混合物；浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干。
其中所述预处理液还可以是尿素溶液，优选浓度为20％的尿素溶液，加入方式为低温下加入，浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干。
其中所述预处理液还可以是稀碱液，所述稀碱溶液为氢氧化钠或碳酸钠中的一种或两种组成的溶液，浓度为0.01～0.02g/L；加入方式为低温下加入，浸入稀碱溶液中3～30s后，清洗，晾干。
收集的吸附尿蛋白的树脂预处理后放置在0～5℃的冷库中冷藏，积累到一定数量后再冷藏运输到尿蛋白生产工厂进行后续的加工处理，生产相应的尿蛋白产品，如人尿胰蛋白酶抑制剂原料、尿激酶原料、人尿激肽酶原料等产品。
步骤d)的冷藏温度不高于5℃，优选为0～5℃。
步骤e)在运输吸附剂时采用冷藏运输，运输温度不高于10℃，优选为0～10℃。采用冷藏运输可以抑制微生物的生长，抑制尿蛋白的变性失活和降解，保证了尿蛋白的质量。
在环境温度高于20℃时加冰冷却。加冰冷却可以抑制微生物的生长，抑制尿蛋白的变性失活和降解，保证质量。树脂从收集、高压水流冲洗、清水浸泡清洗到脱水这一阶段，需要全程温度控制，控制在20℃以下，在气温高于20℃时，可以使用冰块加入清水中来降低树脂的温度。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
较以尿液收集为核心的传统尿蛋白生产工艺，本发明可实现规模化尿蛋白的在线吸附，无需收集尿液，直接吸附尿蛋白。对收集环境无明显影响，可大规模扩展尿蛋白的收集范围。
在将吸附有尿蛋白的吸附剂储存之前，对吸附剂进行预处理，防止尿蛋白变性失活、降解，减少了微生物的滋生，保证了最后生产出来的尿蛋白的质量，便于将吸附剂积累到足够数量时再运往加工厂，减少了运输成本，同时也提高了生产设备的单次生产批量，降低了生产成本，提高了生产效率，实现了从人尿中生产尿蛋白的规模化和产业化，解决了尿蛋白无法规模化生产和生产成本较高的难题，为尿蛋白药品的售价降低提供有力的基础。
采取高压水流清洗，结合清洗水浸泡、脱水，实现离子交换树脂内位有效的清洁，可更好的抑制微生物的生长。
全程的温度控制，尿蛋白处于低温存储的状态，抑制微生物的活性和生长，避免了尿蛋白的变形和活性丧失。
整个过程以较低的成本，实现了尿蛋白活性的有效保存和微生物生长的有效抑制，工艺容易放大，为规模化收集奠定了基础；由于实现了规模化操作，质量可控制更强，产品质量更稳定。
发明人分别使用多种阴离子交换剂对不同稀释度尿液进行白蛋白吸附实验，表明，本发明方法对尿液原液和稀释倍数低于20倍的尿液都可以得到良好的尿蛋白吸附，吸附率可达到70％以上。每公斤树脂吸附的人尿白蛋白通过解吸、硫酸铵沉淀等步骤所能制备的尿蛋白粗制约1.6克，尿蛋白含量大于60％。经过后续的层析纯化与病毒灭活过程，可得到约0.65克纯度达到98％以上的尿蛋白，各种指标均可达到中国药典要求，可在多种领域作为人血浆来源白蛋白的替代品应用。
虽然尿液白蛋白浓度仅及血浆的1/2000-4000，约10-20mg/L，但尿液来源较血浆广泛得多。如果每天收集1000吨尿液，其中的白蛋白约10-15公斤。按40％收率计算，可年产2吨白蛋白制品，为替代人血浆来源白蛋白展示了良好前景。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
规模化收集人尿蛋白的方法：
a)将分装好的用于吸附尿蛋白的吸附剂放置在尿液流经处，用于吸附尿液中的尿蛋白；
b)收集吸附尿蛋白的吸附剂，在收集吸附剂的过程中，环境温度大于20℃时加冰冷却；
c)在对吸附尿蛋白的吸附剂储存之前，进行预处理，预处理方法是对吸附剂进行高压水流冲洗、清水浸泡清洗和脱水，离心机或者脱水机进行脱水；脱水后的吸附剂冷藏储存；用于去除吸附剂中残留的尿液、微生物以及尿垢。用于防止吸附剂内的尿蛋白变性失活，甚至降解，减少微生物的滋生，根据情况可以对高压水流冲洗后的吸附剂进行多次清水浸泡清洗和脱水，在预处理的过程中，环境温度大于20℃时加冰冷却；
d)预处理后的吸附剂冷藏储存，用于积累吸附剂的数量，冷藏温度不高于0～5℃；
e)将预处理后的吸附剂批量运至加工厂进行尿蛋白解吸处理，生产相应的尿蛋白原料或尿蛋白制品，在运输吸附剂时采用冷藏运输，运输温度0～10℃。
实施例2
在实施例1基础上，优选吸附剂装置为阴离子交换树脂时，制作尿液过滤滤垫。尿液过滤垫由通透性良好，又能防水的尼龙滤布缝制布袋和布袋内的阴离子交换树脂构成。其制作方法为，滤布适宜的筛号为300目以下，50目以上孔径，优选筛号60目孔径。过滤垫的形状和大小与尿斗或尿槽的底部相适应，可以为方形、圆形、多边形等形状；用于尿斗使用的过滤垫其边长或直径在20-30cm为宜；用于尿槽使用的过滤垫是平铺于小尿槽的底部，其大小应能全面覆盖尿槽底部；使尿液在流出小便槽前流经过滤垫。
取大孔型阴离子交换树脂，例如配基为{-N+(CH3)3}的烯酸树脂、配基为-N(CH3)3OH的苯乙烯一二乙烯苯共聚体等，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
过滤垫中阴离子交换树脂的装料量根据安置过滤垫处一置换周期内尿消夜流量多少决定。该处单位时间尿液流量由测量或估算获得。优选的阴离子交换树脂装量为每24小时尿液流量100L-200L使用1公斤树脂。
使用上述方法制作的尿液过滤垫，过滤垫大小为20cmX40cm，制作过滤垫的滤布孔径为60目；阴离子交换树脂使用配基为{-N+(CH3)3}的大孔型阴离子交换树脂丙烯配树脂2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中。制成尿液过滤垫，放置在尿斗中，以倾倒方式，将备好的男性尿液原液200L，以大体均匀的流速，在30分钟倒入尿斗中，尿液流经尿液过滤垫。之后，从过滤垫取出树脂，用自来水冲洗后，装入层析柱，再用含1MNaCL的醋酸缓冲液(50mM，pH4.5)进行解吸；收集洗脱峰5200ml,测定尿液、残尿、解吸液的尿蛋白含量和总蛋白量，尿蛋白测定应用Raybio尿微量尿蛋白测定试剂盒进行，总蛋白含量应用Lowry法测定。
结果：尿液中白蛋白含量为15mg/L，残尿中约2mg/L，洗脱溶液中尿蛋白400mg/L，得到2.25克尿蛋白。
实施例3
在实施例1基础上，以孔径为80目的滤布缝制30cmX30cm大小滤袋，取用配基为-N(CH3)3OH的大孔型阴离子交换树脂苯乙烯一二乙烯共聚体2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时置换过滤垫，收集树脂，按照实例1所述方法解吸。洗脱溶液中含尿蛋白1.28克。
实施例4
在实施例1基础上，以孔径为150目的滤布缝制30cmX30cm大小滤袋,取用同时具有伯胺、仲胺、叔胺、委胺配基的弱碱性环氧树脂2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时后置换过滤垫，收集树脂，按照实施例1所述方法解吸。洗脱溶液中含尿蛋白0.68克。
取用大孔型阴离子交换树脂丙烯酸树脂2公斤，其配基为-N+(CH3)3，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入孔径为100目，直径20cm的圆形滤布袋中，制成过滤垫，置放于卫生间的尿斗中，24小时后收集树脂，按照实施例3所述方法解吸，洗脱液中含尿蛋白1.77克。
实施例5
在实施例1基础上，尿液收集处为大型厕所的三个小便池。据测算，每个小便池一昼夜尿液流量约1500L。
选取孔径为60目的滤布缝制大小为30cmX30cm的滤布袋15个；取配基为{-N+(CH3)3}的大孔型阴离子交换树脂丙烯酸树脂30公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，分别装入滤布袋中，每个滤布袋装填2kg，制成15个尿液过滤垫。按照相当于“每24小时流过约150L尿液/1公斤树脂”比例，每个小便池置放5个尿液过滤垫，特别覆盖小便池出水口附近。
24小时后收集树脂，用水冲洗，再用含1MNaCL的醋酸缓部液(50mM，pH4.5)进行解吸，将洗脱液(解吸)超滤浓缩60倍，加硫酸铵粉末至饱和，静置2小时，加硅藻土过滤收集沉淀，得到尿蛋白粗制品230克，其中尿蛋白含量为36克，总蛋白含量为48克。其中，尿蛋白测定利用尿微量尿蛋白测定试剂盒进行，总尿蛋白含量利用凯氏定氮法测定。
实施例6
对按实施例1与实施例2-5结合方法制取的尿蛋白粗制品后续纯化步骤：将尿蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上样和冲洗峰，超滤后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸缓冲，pH5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60℃加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0.5MNaCL。超滤浓缩，过0.22μm的滤膜除菌，冷冻干燥，得到18克尿蛋白冻干粉。
对该冻干粉分析：SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4.8两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
实施例6产品中尿蛋白成分未降解，峰形无拖尾。预处理方法处理后的吸附剂，进行菌落检查，菌落总数小于330CFU/g。因此，预处理方法能够有效的降低微生物数量，有利于较长时间的储存。
实施例7
在实施例1基础上，配基为季胺基的大孔型聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂，以孔径为80目的滤布缝制30cmX30cm大小滤袋，取用配基为季胺基的大孔型聚苯乙烯树脂和聚丙烯酸树脂2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时置换过滤垫，收集树脂，按照实例1所述方法解吸。洗脱溶液中含尿蛋白1.10克。
实施例8
在实施例1基础上，配基为-SO3 -的大孔型聚丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂，以孔径为150目的滤布缝制30cmX30cm大小滤袋,取用同时具有伯胺、仲胺、叔胺、委胺配基的弱碱性环氧树脂2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时后置换过滤垫，收集树脂，按照实施例1所述方法解吸。洗脱溶液中含尿蛋白0.69克。
取用配基为-SO3 -的大孔型聚丙烯酸树脂和聚苯乙烯树脂2公斤，经过2％NaOH处理，水冲至中性，装入孔径为100目，直径20cm的圆形滤布袋中，制成过滤垫，置放于卫生间的尿斗中，24小时后收集树脂，按照实施例3所述方法解吸，洗脱液中含尿蛋白1.79克。
实施例9
对按实施例1和实施例7-8方法制取的白蛋白粗制品后续纯化步骤：将白蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上样和冲洗峰，超滤后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸缓冲，pH5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60℃加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0.5MNaCL。超滤浓缩，过0.22μm的滤膜除菌，冷冻干燥，得到19克尿蛋白冻干粉。
对该冻干粉分析：SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4.8两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
实施例9产品中尿蛋白成分未降解，峰形无拖尾。预处理方法处理后的吸附剂，进行菌落检查，菌落总数小于330CFU/g。因此，预处理方法能够有效的降低微生物数量，有利于较长时间的储存。
实施例10
按照实施例1的步骤，将预处理步骤进行优化。
步骤c)的预处理方法是低温下，采用预处理液浸泡，然后清水清洗，再脱水。
其中，所述预处理液是缓冲液，所述缓冲液为磷酸、磷酸钠、磷酸氢钠或磷酸二氢钠中的一种或两种以上的混合物；浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干。
对按实施例10的预处理方法和实施例2-5、7-8方法制取的尿蛋白粗制品后续纯化步骤：将尿蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上样和冲洗峰，超滤后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸缓冲，pH5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60℃加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0.5MNaCL。超滤浓缩，过0.22μm的滤膜除菌，冷冻干燥，得到22克尿蛋白冻干粉。
对该冻干粉分析：SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4.8两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
实施例11
按照实施例1的步骤，将预处理步骤进行优化。
步骤c)的预处理方法是低温下，采用预处理液浸泡，然后清水清洗，再脱水。
其中所述预处理液是浓度为20％的尿素溶液，加入方式为低温下加入，浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干。
对按实施例11的预处理方法和实施例2-5、7-8方法制取的尿蛋白粗制品后续纯化步骤：将尿蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上样和冲洗峰，超滤后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸缓冲，pH5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60℃加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0.5MNaCL。超滤浓缩，过0.22μm的滤膜除菌，冷冻干燥，得到24克尿蛋白冻干粉。
对该冻干粉分析：SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4.8两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
实施例12
按照实施例1的步骤，将预处理步骤进行优化。
步骤c)的预处理方法是低温下，采用预处理液浸泡，然后清水清洗，再脱水。
其中所述预处理液是浓度为0.01～0.02g/L的碳酸钠溶液；加入方式为低温下加入，浸入稀碱溶液中3～30s后，清洗，晾干。
对按实施例12的预处理方法和实施例2-5、7-8方法制取的白蛋白粗制品后续纯化步骤：将白蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上样和冲洗峰，超滤后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸缓冲，pH5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60℃加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0.5MNaCL。超滤浓缩，过0.22μm的滤膜除菌，冷冻干燥，得到24克尿蛋白冻干粉。
对该冻干粉分析：SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4.8两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
实施例10-12产品中尿蛋白成分未降解，峰形无拖尾。预处理方法处理后的吸附剂，进行菌落检查，菌落总数小于120CFU/g。因此，预处理方法能够有效的降低微生物数量，有利于较长时间的储存。
本发明的预处理方式明显减少了产品中微生物的数量，对尿蛋白的降解有明显的抑制，能够提高吸附尿蛋白树脂的保存时间。经加大规模后依然能保持很好的收集效果。

Claims (10)

1.一种从人尿中大规模收集尿蛋白的方法，包括以下步骤：
a)将分装好用于吸附尿蛋白的吸附剂装置放置在尿液流经处，使尿液流经吸附剂使尿蛋白被吸附；
b)收集和更换吸附尿蛋白的吸附剂；
c)对吸附有尿蛋白的吸附剂进行预处理；
d)预处理后的吸附剂冷藏储存；
e)将吸附有尿蛋白的吸附剂大批量冷藏运至工厂进行尿蛋白解吸处理，生产加工相应的尿蛋白原料或尿蛋白制品。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤a)所述吸附剂装置采用离子交换剂作为尿液流经过滤装置，将分装好的用于吸附尿蛋白的吸附剂放置在尿液流经部位，用于吸附收集尿蛋白；该尿液过滤装置为通透性较好的尼龙滤布制作，置放于尿斗内或小便槽内，用以承接尿液从过滤装置流过；尿液过滤装置的形状、大小与小便尿斗或小便槽相适应；定时回收和更换尿液过滤装置，对其中的离子交换剂作集中提前解吸，收集含尿蛋白的组份，并对离子交换剂作再生处理备作再用；所述的吸附剂为树脂，包括阴离子交换树脂、阳离子交换树脂，阴阳离子混合树脂或者同时具有阳离子交换基团和阴离子交换基团的两性树脂。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述树脂，其骨架为聚苯乙烯、聚丙烯酸、酚醛树脂、琼脂糖中任意一种或几种，配基为磺酸基、羧酸基、磷酸基阳离子交换基团和伯胺、仲胺、叔胺和季胺基离子基团；作为优选采用大孔型树脂。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c)所述吸附尿蛋白的吸附剂预处理方法为：用大量清水对吸附剂进行冲洗、浸泡和脱水。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述脱水步骤中对吸附剂可以采用离心机或者脱水机进行脱水；脱水后的吸附剂冷藏储存。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述冲洗步骤为在清水浸泡之前进行高压水流冲洗。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，树脂从收集、高压水流冲洗、清水浸泡清洗到脱水这一阶段，需要全程温度控制在20℃以下。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤d)冷藏温度不高于5℃，优选为0～5℃。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤e)在运输吸附剂时采用冷藏运输，运输温度不高于10℃，优选为0～10℃。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤c)所述吸附尿蛋白的吸附剂预处理方法为：低温下，采用预处理液浸泡，然后清水清洗，再脱水；其中，所述预处理液可以是缓冲液，所述缓冲液为磷酸、磷酸钠、磷酸氢钠或磷酸二氢钠中的一种或两种以上的混合物，浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干；其中所述预处理液还可以是尿素溶液，优选浓度为20％的尿素溶液，加入方式为低温下加入，浸入缓冲液1～3分钟后，清洗，晾干；其中所述预处理液还可以是稀碱液，所述稀碱溶液为氢氧化钠或碳酸钠中的一种或两种组成的溶液，浓度为0.01～0.02g/L，加入方式为低温下加入，浸入稀碱溶液中3～30s后，清洗，晾干。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110894495A (zh) * 2019-12-24 2020-03-20 江苏尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的制备方法及其冻干粉
CN111087443A (zh) * 2018-10-23 2020-05-01 北京聚德方辉科技有限公司 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法
CN111569467A (zh) * 2020-05-18 2020-08-25 台湾多胺股份有限公司 尿液生理活性物质的萃取系统及其使用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101863974A (zh) * 2009-07-13 2010-10-20 广东天普生化医药股份有限公司 一种直接富集尿蛋白的方法
CN103509104A (zh) * 2013-08-23 2014-01-15 扬州艾迪生物科技有限公司 一种规模化收集人尿蛋白的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101863974A (zh) * 2009-07-13 2010-10-20 广东天普生化医药股份有限公司 一种直接富集尿蛋白的方法
CN103509104A (zh) * 2013-08-23 2014-01-15 扬州艾迪生物科技有限公司 一种规模化收集人尿蛋白的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘旺: "扬州企业尿液中提取救命药", 《扬州晚报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111087443A (zh) * 2018-10-23 2020-05-01 北京聚德方辉科技有限公司 一种从尿液中提取多种尿蛋白的方法
CN110894495A (zh) * 2019-12-24 2020-03-20 江苏尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的制备方法及其冻干粉
CN110894495B (zh) * 2019-12-24 2020-07-31 江苏尤里卡生物科技有限公司 一种尿激酶的制备方法及其冻干粉
CN111569467A (zh) * 2020-05-18 2020-08-25 台湾多胺股份有限公司 尿液生理活性物质的萃取系统及其使用方法

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