CN102898516A - 一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。包括以下步骤：1）甜乳清粉加水溶解制成乳清溶液或采用市售液态乳清液,用NaOH调节pH；2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，用磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床；3）通入步骤1）的溶液进行吸附，再用含NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；4）最后用NaOH清洗，并用缓冲液再生介质。本发明以扩张床吸附为核心分离方法，一步分离得到乳铁蛋白的纯度能达到88～93%之间，回收率在47%～86%之间，工艺简便高效，设备投资低，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。
背景技术
牛奶分离出酪蛋白制备奶酪后，剩余溶液即为乳清液。乳清液作为副产物，其水含量高，运输不便，经常通过喷雾干燥等方法制成乳清粉。乳清粉中的主要成分为乳糖和乳清蛋白。
乳清蛋白中主要有β-乳球蛋白（β-Lg）、α-乳白蛋白（α-La）、牛血清白蛋白（BSA）、免疫球蛋白（IgG），以及乳铁蛋白（Lf）、乳过氧化酶、生长因子和许多生物活性因子及酶，这些物质均具有一定的生物活性，尤其是乳铁蛋白因其特有的功能备受关注。
乳铁蛋白等电点为8.0,分子质量８０kDa，在乳清中含量约为0.5 g/L。乳铁蛋白具有抗菌、抗病毒、免疫调节等多种生物活性功能。
中国专利CN 1486989 A公开了一种从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，首先对牛初乳进行脱脂处理，并除去酪蛋白和球蛋白，将清液透析6小时后，采用肝素-琼脂糖树脂进行亲和层析，提纯乳铁蛋白。中国专利CN 101362792 A中也是采用亲和层析分离乳铁蛋白。由于亲和层析介质成本较高以及洗脱比较困难，不太适宜工业化大规模应用。
中国专利CN 101724013 A和美国专利US 5,149,647均利用阳离子交换树脂提纯乳铁蛋白，首先制备乳清，然后对乳清进行微滤处理，再用阳离子交换层析从微滤的透过液中提纯乳铁蛋白。
上面所述的亲和层析和阳离子交换层析，都采用固定床的方式，由于固定床填充密度高，在进料前，必须对其进行微滤或者透析等预处理，以除去不溶性颗粒，否则会造成层析柱堵塞。预处理过程增加设备投入，操作时间长，还会造成乳铁蛋白的损失，降低生产率。同时，固定床层析操作中，流速不能太高，否则柱压太大，使介质变形，影响层析的顺利进行。
中国专利CN 1663961A提供了一种无需预处理料液的乳铁蛋白提取方法，把阳离子交换树脂在搅拌下直接与乳清溶液混合吸附，吸附完全后，再用滤布将树脂分离，并转移至NaCl溶液中浸泡以洗脱乳铁蛋白。该方法是典型的单级吸附，分离效率非常低，很难得到高纯度的乳铁蛋白，也难以进行工业化大规模生产。
欧洲专利EP1480524 (A1)采用混合模式扩张床介质FastLine SALTO 从牛乳中分离乳铁蛋白。先预处理除去牛乳中的酪蛋白，再把料液调节至pH4.5后上样；洗脱分为两步，先用50 mN 硼酸洗脱其他蛋白，再用0.02 M NaOH洗脱得到乳铁蛋白。由于FastLine SALTO介质同时具有阳离子交换和疏水作用基团，乳铁蛋白的吸附选择性较差，而牛乳中蛋白组分复杂，免疫球蛋白和牛血清白蛋白等都能吸附，所以需要比较复杂的洗脱步骤才能得到纯度大于90%的乳铁蛋白，操作相对繁琐，耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种操作简便、分离效率高、成本较低的用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。
用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法包括以下步骤：
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20～80 g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液,用NaOH调节pH至7.0 ～8.0；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Streamline SP，Streamline SP XL或Fastline SP；用pH7.0 ～8.0的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于1.8～2.6；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.1～1 M NaCl的pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88～93%，乳铁蛋白回收率为47%～86%；
4）最后用0.2～0.5 M NaOH在位清洗，并用pH7.0的磷酸盐缓冲液使介质再生。
所述的步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。
本发明的有益效果如下：
（1）扩张床允许料液中含有不溶颗粒，无需微滤等预处理，节省固液分离设备投入，简化流程，减少乳铁蛋白的损失，提高收率。
（2）扩张床的操作流速比固定床方式要高得多，可提高生产效率。
（3）阳离子交换介质的选择性好，特异吸附乳铁蛋白，洗脱条件温和，步骤简单易行。
（4）仅需一步吸附洗脱就可从粗乳清中提纯得到纯度基本大于90%的乳铁蛋白，工艺简单，适于工业化生产。
（5）从廉价的乳清中高效提取高附加值的乳铁蛋白，具有较大的经济效益。
附图说明
图1是用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法的流程图；
图2是实施例1中收集组分的SDS-PAGE电泳图谱，其中泳道1为蛋白Marker ProteinRuler IV；2为20 g/L甜乳清粉（原料）；3为穿透液；4为浓缩后的洗脱液；5为1 mg/mL标准乳铁蛋白（购自sigma）；6为LMW-SDS Marker Kit（GE Healthcare）；
图3是实施例5中梯度洗脱谱图；
图4是实施例6中梯度洗脱谱图。
具体实施方式
本发明采用扩张床阳离子交换吸附技术，只需一步层析，就能提纯乳铁蛋白，得到纯度在90%以上的乳铁蛋白。该方法无需对料液进行微滤等预处理，可直接上样至扩张床；介质的选择性好，能特异性吸附乳铁蛋白；洗脱条件温和，步骤简便。利用本发明的方法，一步分离就能直接从乳清中提纯乳铁蛋白，工艺简单，设备投资低，适合工业化生产，具有一定的经济效益。
用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法包括以下步骤：
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20～80 g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液,用NaOH调节pH至7.0 ～8.0；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Streamline SP，Streamline SP XL或Fastline SP；用pH7.0 ～8.0的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于1.8～2.6；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.1～1 M NaCl的pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88～93%，乳铁蛋白回收率为47%～86%；
4）最后用0.2～0.5 M NaOH在位清洗，并用pH7.0的磷酸盐缓冲液使介质再生。
所述的步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。
实施例1
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为50g/L的乳清溶液1 L,用NaOH调节pH至7.0；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Fastline SP；用pH7.0的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2.0；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.5 M NaCl的pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为90%，乳铁蛋白回收率为83%；
4）用0.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7.0的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。
步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。
步骤3）得到的洗脱液经超滤浓缩后与其他组分一起进行SDS-PAGE电泳检测，谱图结果如图2。
实施例2
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20g/L的乳清溶液1 L,用NaOH调节pH至8.0；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Fastline SP；用pH8.0的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2.6；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含1 M NaCl的pH8.0的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为93%，乳铁蛋白回收率为47%；
4）用0.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7.0的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。
步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。
实施例3
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为80g/L的乳清溶液1 L,用NaOH调节pH至7.5；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Streamline SP；用pH7.5的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为1.8；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.5 M NaCl的pH10.0的碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88%，乳铁蛋白回收率为86%；
4）用0.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7.0的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。
步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。
实施例4
1）市售液态乳清液2 L,用NaOH调节pH至7.5；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Streamline SP XL；用pH7.5的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2.0；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.5 M NaCl的pH7.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为91%，乳铁蛋白回收率为85%；
4）用0.5 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7.0的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。
所述的步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持膨胀率与平衡扩张床时膨胀率相同
实施例5
实施步骤同实施例1，不同的是洗脱条件改为含0.1～1 M NaCl的pH7.0磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，洗脱谱图如图3。洗脱液中乳铁蛋白纯度89%，回收率为84%。
实施例6
实施步骤同实施例1，不同的是洗脱条件改为含0.1～1 M NaCl的0.02 mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.0）线性梯度洗脱，洗脱谱图如图4。洗脱液中乳铁蛋白纯度89%，回收率为85%。
Claims (2)
1.一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20～80 g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液,用NaOH调节pH至7.0 ～8.0；
2）扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为Streamline SP，Streamline SP XL或Fastline SP；用pH7.0 ～8.0的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于1.8～2.6；
3）通入步骤1）的溶液进行吸附，然后通入步骤2）所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含0.1～1 M NaCl的pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88～93%，乳铁蛋白回收率为47%～86%；
4）最后用0.2～0.5 M NaOH在位清洗，并用pH7.0的磷酸盐缓冲液使介质再生。
2.根据权利要求1所述的一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法，其特征在于：所述的步骤3）中，通入步骤1）的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102898516A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015009400A1 (en) * | 2013-07-16 | 2015-01-22 | Mjn U.S. Holdings Llc | Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin |
| CN104710505A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-06-17 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种蛋白质分离回收扩张床吸附系统 |
| CN106749623A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 浙江大学 | 一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法 |
| CN106793797A (zh) * | 2014-08-15 | 2017-05-31 | 预层析股份有限公司 | 分离α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白的方法 |
| EP3225114A1 (de) * | 2016-03-30 | 2017-10-04 | DMK Deutsches Milchkontor GmbH | Demineralisierte molkepulver |
| CN109575127A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国海洋大学 | 一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1629183A (zh) * | 2004-09-03 | 2005-06-22 | 王秀英 | 从牦牛奶中提取的活性乳蛋白及其方法和应用 |
| CN1663961A (zh) * | 2004-09-29 | 2005-09-07 | 天津商学院 | 牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术 |
| CN1800200A (zh) * | 2006-03-06 | 2006-07-12 | 方雅悯 | 一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法 |
| CN101117351A (zh) * | 2007-04-30 | 2008-02-06 | 北京济普霖生物技术有限公司 | 一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法 |
-
2012
- 2012-10-26 CN CN2012104162063A patent/CN102898516A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1629183A (zh) * | 2004-09-03 | 2005-06-22 | 王秀英 | 从牦牛奶中提取的活性乳蛋白及其方法和应用 |
| CN1663961A (zh) * | 2004-09-29 | 2005-09-07 | 天津商学院 | 牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化技术 |
| CN1800200A (zh) * | 2006-03-06 | 2006-07-12 | 方雅悯 | 一种从牛奶或乳清水中提取高纯度蛋白的方法 |
| CN101117351A (zh) * | 2007-04-30 | 2008-02-06 | 北京济普霖生物技术有限公司 | 一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 《浙江大学学报(工学版)》 20090331 林东强等 混合模式扩张床吸附从牛乳清中分离乳铁蛋白 第472-476页 1-2 第43卷, 第3期 * |
| ETZEL MR, LITEN AD, MOORE PM.: "Chromatographic capture of proteins from milk", 《2ND INTERNATIONAL CONFERENCE ON EXPANDED BED ADSORPTION》 * |
| JORGE DOS SANTOS CAVALCANTI: "《TESE DE DOUTORADO(PhD Thesis)》", 31 December 2010 * |
| MASAMI SHIOZAWA ET AL.: "Purification of Lactoferrin by Expanded-bed Column Chromatography", 《KAGAKU KOGAKU RONBUNSHU》 * |
| 林东强等: "混合模式扩张床吸附从牛乳清中分离乳铁蛋白", 《浙江大学学报(工学版)》 * |
| 武元春: "混合模式扩张床吸附从牛乳清中分离乳铁蛋白研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
| 白倩: "磺酸基（SP）阳离子交换介质的制备及其对重组人乳铁蛋白的纯化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015009400A1 (en) * | 2013-07-16 | 2015-01-22 | Mjn U.S. Holdings Llc | Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin |
| CN105357974A (zh) * | 2013-07-16 | 2016-02-24 | Mjn美国控股有限责任公司 | 用于分离包括乳铁蛋白的碱性乳蛋白的膨胀床吸附方法 |
| AU2014290760B2 (en) * | 2013-07-16 | 2017-04-20 | Mjn U.S. Holdings Llc | Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin |
| US9661868B2 (en) | 2013-07-16 | 2017-05-30 | Mead Johnson Nutrition Company | Expanded bed adsorption methods for isolation of basic milk proteins including lactoferrin |
| CN106793797A (zh) * | 2014-08-15 | 2017-05-31 | 预层析股份有限公司 | 分离α‑乳白蛋白和β‑乳球蛋白的方法 |
| CN104710505A (zh) * | 2015-03-13 | 2015-06-17 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种蛋白质分离回收扩张床吸附系统 |
| EP3225114A1 (de) * | 2016-03-30 | 2017-10-04 | DMK Deutsches Milchkontor GmbH | Demineralisierte molkepulver |
| US20170280738A1 (en) * | 2016-03-30 | 2017-10-05 | Dmk Deutsches Milchkontor Gmbh | Demineralized whey powders |
| US10638772B2 (en) | 2016-03-30 | 2020-05-05 | Dmk Deutsches Milchkontor Gmbh | Demineralized whey powders |
| CN106749623A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 浙江大学 | 一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法 |
| CN106749623B (zh) * | 2016-12-09 | 2020-04-10 | 浙江大学 | 一种基于混合模式的扩张床吸附分离人血白蛋白方法 |
| CN109575127A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国海洋大学 | 一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法 |
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