CN109575127A - 一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种配体修饰的磁性纳米粒子快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法,具体顺序为制备磁性纳米粒子,将配体连接到磁性纳米粒子上制成修饰的磁性纳米粒子;将修饰后的磁性纳米粒子与乳清混合后,经过几分钟的吸附和洗脱后,即可快速高效地获得乳铁蛋白,并回收磁性纳米粒子。本发明磁性纳米粒子回收率高大于99.99%、回收简单、可将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存,使之可多次重复使用,经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%,该磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、每克磁性纳米粒子可以使35mL含乳铁蛋白为0.35mg/mL乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%以上、获得的乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4‑7 min、获得一种高效提取效率的方法,本方法特点是可操作性强,提取一步完成,适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于食品蛋白改性回收技术领域,本发明涉及一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法。该方法同时提高乳清蛋白的回收率和缩短提取时间,并且所使用的介质具有极高的回收率以及很高的吸附稳定性。
背景技术
乳清是干酪生产的副产物,其生物需氧量(BOD)为30000-40000ppm,而且全世界由于制作干酪而产生的乳清达到11000万吨,不仅处理麻烦而且费用高。因此,乳清被认为是干酪生产过程中的废水,然而其含有许多有价值的蛋白。包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、牛血清白蛋白、免疫球蛋白和乳铁蛋白等。研究发现,乳铁蛋白是一种多功能性的糖蛋白,其生物学性质包括抗微生物性、抗炎性、抗癌性、免疫调节性、酶活性和促进骨骼健康等。因此,乳铁蛋白被广泛应用于保健食品、配方奶粉、医药等领域中,需求量越来越多大,从乳清中高效分离纯化和降低生产成本提取乳铁蛋白,可以解决了从低浓度原料中高效获得乳铁蛋白的限制瓶颈。
提高乳铁蛋白回收率,减少反应步骤及时间受到广泛关注,目前回收乳铁蛋白的方法有很多,但每种方法存在的问题也很多,致使了每种方法的效率都不是很高。诸如,费用高和相对产量低是阳离子交换色谱的主要问题、专一性低和膜污染是限制压力驱动膜的主要因素、相对低的专一性和步骤多是胶质气体所面临的问题以及使用电分离技术时遇到的蛋白相互作用引起的纯度低都在一定程度上限制了其在回收乳铁蛋白上的应用。关于乳清中回收乳铁蛋白的报道,CN102898516A公开了一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法,该方法中需要用NaOH以及磷酸盐缓冲液使收集用的阳离子介质再生,加大了生产成本,以及产生了强碱废液。
利用一种单一技术来解决回收步骤多、专一性差并且具有快速高效方法的研究已经成为一个新的方向。如何获得一种工艺简单、易于操作、提高回收率、缩短时间以及延长介质使用寿命的方法是本领域急需解决的技术问题。
发明内容
发明目的:提供一种快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法及介质。
技术问题:本发明提高了蛋白回收率、缩短了提取时间、保持乳清中乳铁蛋白原有生物活性、同时介质配体修饰的磁性纳米粒子回收简单,几乎没有残留,清水清晰即可反复使用不需要特殊再生处理,在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存。
技术方案:一种配体修饰的磁性纳米粒子快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法,该方法工艺简单、易于操作、回收率高、提取时间短以及延长使用寿命的方法,按照以下步骤进行:
(1)磁性纳米粒子制备:
将一定量的FeCl3•6H2O和FeCl2•4H2O用去离子水溶解,通入N25-15分钟后,在搅拌的条件下用氨水或者盐酸调节溶液的pH值至6.0-12.0,然后将该溶液置于水浴锅中,于70-95℃反应20-40 min,反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后,将洗涤后的沉淀在50-85 ℃的真空干燥箱内烘干,烘干后研磨。
(2)磁性纳米粒子配体的修饰:
0.02-0.1g磁性纳米粒子溶解于15-25 mL pH 5-7.5磷酸缓冲液中,超声20-35 min后加入3-7 mL浓度为15-30 mg/mL的腈胺溶液继续超声20-35 min,加入0.5-1.0 mL浓度为0.7-1.5 mg/mL的刀豆蛋白A后超声20-35 min后,用双蒸水洗涤3-5次后收集磁性纳米粒子。
(3)磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白与洗脱:
每克修饰配体后的磁性纳米粒子与35 mL乳清混合进行吸附与洗脱,该磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7 min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99%、将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存,多次重复使用,经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%。
其中所述的磁性纳米粒子直径为12.00±1.00-15.00±1.50 nm,修饰过配体以后的磁性纳米粒子直径为17.00±1.50-23.00±1.50 nm。
在反应所需的pH6.0磷酸盐缓冲液中加入NaCl,使之终浓度为0.001-0.005M,其作用是在超声结束后可以加速磁性纳米粒子的沉降。
其中[07]具体方案中的步骤(1)磁性纳米粒子制备,摩尔浓度比为4:1-2:1的FeCl3•6H2O和FeCl2•4H2O用去离子水溶解,通入N25-20 min后,在搅拌的条件下用浓度为25%氨水和/或1M盐酸调节pH值至6.0-12.0,然后将其置于70-95 ℃的水浴锅中反应20-40min,反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后,将其在50-85 ℃的真空干燥箱内烘干;步骤(2)磁性纳米粒子配体的修饰,0.02-0.1g磁性纳米粒子溶解于15-25 mL pH5-7.5磷酸缓冲液中,超声20-35 min后加入3-7 mL浓度为15-30 mg/mL的腈胺溶液继续超声20-35 min,加入0.5-1.0 mL浓度为0.7-1.5 mg/mL的刀豆蛋白A后超声20-35 min后,用双蒸水洗涤3-5次后收集磁性纳米粒子。
磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、每克磁性纳米粒子可以使35mL含乳铁蛋白为0.35mg/mL乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7 min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99 %、经过100次吸附后磁性纳米粒子的稳定性高于89%。
使用完毕后,磁性纳米粒子有三种保存方式,其中一种可以有效的确保其吸附稳定性。
该方法可以获得纯度较高、无变性的乳铁蛋白。
技术效果:
(1)本发明提供了一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法,并且吸附率高、吸附洗脱时间短、磁性纳米粒子的回收率高,吸附稳定性好。且该方法可以一步对乳清中的乳铁蛋白进行回收,乳铁蛋白的吸附和洗脱均在数分钟内完成。洗脱液为常见的NaCl,洗脱后的磁性介质不需要酸碱的再生即可重复使用;磁性介质在使用后保存在一定的环境及条件下,可很好的维持其吸附稳定性和分散性,再次使用时无需超声即可使磁性纳米粒子恢复分散性。
(2)本发明所获得的磁性纳米粒子的直径为12.00±1.00-15.00±1.50 nm,修饰过配体以后的磁性纳米粒子直径为17.00±1.50-23.00±1.50 nm。
(3)本发明所获得的磁性纳米粒子在乳清中吸附乳铁蛋白所需的时间短,在5-7min之内完成、洗脱时间在3-5 min之内完成,整个吸附洗脱过程在20 min之内完成。
(4)本发明所获得的目标产品仅需一步即可从原料中获得,而且吸附介质使用后无需再生,极大了降低了成分。
本发明所获得的乳铁蛋白各项指标均符合食品安全国家标准食品营养强化剂乳铁蛋白国家标准GB 1903.17-2016中理化标准。
吸附率测定:吸附率是反应单位介质吸附目的蛋白能力的重要指标。
吸附率=Qs/Qn
其中:Qs代表洗脱液中蛋白质的质量(ug);Qn代表吸附所用的磁性纳米粒子的质量(mg)
磁性纳米粒子回收率=(1-(Xs-Xc)/X)×100%
其中:Xs代表样品中铁离子质量(mg);Xc代表对照溶剂中铁离子质量(mg);X代表磁性纳米粒子的质量(mg)。
试验1:不同保存方式对活性影响的对比
在最优的吸附/洗脱条件下,使用磁性纳米粒子从酸性乳清中吸附乳铁蛋白,进行十次重复。试验结束后,将磁性纳米粒子以A、B和C三种形式保存过夜,次日重复吸附/洗脱过程十次,连续进行十天,共100次吸附/洗脱过程。进行了对比试验,测定了蛋白吸附率和磁性纳米粒子残留率,结果见图1,其中▇代表A组、●代表B组、▲代表C组
A组:采用本申请实施的方案,其中磁性纳米粒子在使用完后浸没在磷酸缓冲液里,保存于4 ℃冰箱中。
组:采用本申请实施的方案,其中磁性纳米粒子在使用完后浸没在磷酸缓冲液里,保存于室温下。
组:采用本申请实施的方案,其中磁性纳米粒子在使用完后直接保存于室温下。
图1. 不同保存方式磁性纳米粒子的吸附稳定性
结果显示:由图1可知,浸没在磷酸缓冲液里保存于4 ℃冰箱中的磁性纳米粒子的吸附稳定性要高于其他两组,在重复使用100次以后,其吸附乳铁蛋白的活性轻微下降,为最开始时的89.33%;而保存于室温下的两组磁性纳米粒子的吸附稳定性变化明显,尤其是直接裸露于空气中的磁性纳米粒子。保存于缓冲液中和直接裸露于空气中的磁性纳米粒子的乳铁蛋白吸附活性分别下降了47.56%和100%,裸露于空气中的磁性纳米粒子储存第6天时,完全失去活性。此外,裸露与空气中的磁性纳米粒子在下次使用前需要进行超声处理,使磁性纳米粒子重新分散,而储存于磷酸缓冲液中的磁性纳米粒子在下次使用前只需要搅拌即可使之均匀分散,没有结块。
试验2:吸附时间与吸附率之间的关系
实验意外发现,磁性纳米粒子对酸性乳清进行较短时间的吸附,可以大大降低杂蛋白的吸附,明显提高目的蛋白的纯度。因此,对不同吸附时间的洗脱液冻干,得到的蛋白粉末溶于少量双蒸水中提浓度,对吸附时间和吸附率之间进行了一个双重比较,用于确定最佳的吸附/洗脱工艺,其结果见图2及表1。
第1组:采用最佳吸附条件进行,其中吸附时间7 min,洗脱时间4 min。
第2组:采用最佳吸附条件进行,其中吸附时间6 min,洗脱时间4 min。
第3组:采用最佳吸附条件进行,其中吸附时间5 min,洗脱时间4 min。
第4组:采用最佳吸附条件进行,其中吸附时间4 min,洗脱时间4 min。
图2.磁性纳米粒子不同吸附时间对乳清中乳铁蛋白吸附的电泳图谱
注:M为marker,S为乳铁蛋白标准品,W为乳清液,
4-7分别为吸附4、5、6和7分钟的洗脱液。
图3.不同用量磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白的电泳图谱
注:M为marker,S为乳铁蛋白标准品,W为乳清液,E为洗脱液;
A图为磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白后乳清中剩余乳铁蛋白的电泳图,
B图为洗脱液中乳铁蛋白含量。
结果显示:由图2可知,吸附时间为5 min时乳铁蛋白吸附率明显高于其他蛋白,乳铁蛋白的纯度为93.38%。吸附时间为5 min的洗脱液中蛋白浓度高且乳铁蛋白含量的比例高。由图3A中的W1-W5可知,乳清中剩余乳铁蛋白减少,其他蛋白不变;而图3B中的E1-E5可知,洗脱液中乳铁蛋白含量增多。
具体实施方式
实施例1:一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速地回收乳铁蛋白的方法,并且吸附率高、吸附洗脱时间短、磁性纳米粒子的回收率极高,吸附稳定性好,按照以下步骤进行:
(1)磁性纳米粒子制备:
将一定量的FeCl3•6H2O和FeCl2•4H2O用去离子水溶解,通入N25-15分钟后,在搅拌的条件下用氨水或者盐酸调节溶液的pH值至6.0-12.0,然后将该溶液置于水浴锅中,于70-95℃反应20-40 min,反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后,将洗涤后的沉淀在50-85 ℃的真空干燥箱内烘干,烘干后研磨。
(2)磁性纳米粒子配体的修饰:
0.02-0.1g磁性纳米粒子溶解于15-25 mL pH 5-7.5磷酸缓冲液中,超声20-35 min后加入3-7 mL浓度为15-30 mg/mL的腈胺溶液继续超声20-35 min,加入0.5-1.0 mL浓度为0.7-1.5 mg/mL的刀豆蛋白A后超声20-35 min后,用双蒸水洗涤3-5次后收集磁性纳米粒子。
(3)磁性纳米粒子吸附酸性乳清中乳铁蛋白:
每克修饰配体后的磁性纳米粒子与35 mL乳清混合进行吸附与洗脱,磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7 min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99 %、将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存,多次重复使用,经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%。
实施例2:一种配体修饰的磁性纳米粒子能够快速地回收乳铁蛋白的方法,并且吸附率高、吸附洗脱时间短、磁性纳米粒子的回收率极高,吸附稳定性好,按照以下步骤进行:
(1)磁性纳米粒子制备:
将一定量的FeCl3•6H2O和FeCl2•4H2O用去离子水溶解,通入N25-15分钟后,在搅拌的条件下用氨水或者盐酸调节溶液的pH值至6.0-12.0,然后将该溶液置于水浴锅中,于70-95℃反应20-40 min,反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后,将洗涤后的沉淀在50-85 ℃的真空干燥箱内烘干,烘干后研磨。
磁性纳米粒子溶液于6000 r/min 离心5 min,然后用15-25 mL pH 5-7.5磷酸缓冲液将沉淀悬浮后超声0-35 min,加入3-7 mL浓度为15-30 mg/mL 的腈胺溶液超声20-35min,加入0.5-1.0 mL浓度为0.7-1.5 mg/mL的配体后超声0-35 min后,收集。使用完毕后,将磁性纳米粒子分别保存于(1)4℃磷酸盐缓冲液中、(2)室温下磷酸盐缓冲液中以及(3)室温下暴露于空气中。
Claims (5)
1.一种配体修饰的磁性纳米粒子制备及其快速高效地从乳清中回收乳铁蛋白的方法,其特征在于,该方法只需将配体修饰的磁性纳米粒子与乳清混合经过几分钟的吸附和洗脱即可快速高效地获得乳铁蛋白,且磁性纳米粒子回收率高、回收方法简单、磁性纳米粒子可多次重复使用、保存简单,本方法按照以下步骤进行:(1)磁性纳米粒子制备:将一定量的FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O用去离子水溶解,通入N25-15分钟后,在搅拌的条件下用氨水或者盐酸调节溶液的pH值至6.0-12.0,然后将该溶液置于水浴锅中,于70-95 ℃反应20-40min,反应结束后用去离子水和/或无水乙醇各洗涤3-5次后,将洗涤后的沉淀在50-85 ℃的真空干燥箱内烘干,烘干后研磨;(2)磁性纳米粒子配体的修饰:0.02-0.1g磁性纳米粒子溶解于15-25 mL pH 5-7.5磷酸缓冲液中,超声20-35 min后加入3-7 mL浓度为15-30 mg/mL的腈胺溶液继续超声20-35 min,加入0.5-1.0 mL浓度为0.7-1.5 mg/mL的刀豆蛋白A后超声20-35 min后,用双蒸水洗涤3-5次后收集磁性纳米粒子;(3)磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白与洗脱:每克修饰配体后的磁性纳米粒子与35 mL乳清混合进行吸附与洗脱,磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7 min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99 %;将使用后的磁性纳米粒子在pH6.0磷酸盐缓冲液中4℃保存,多次重复使用,经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于所述的磁性纳米粒子直径为13.83±1.26nm,经配体修饰后的磁性纳米粒子直径为20.33±1.53 nm。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,在pH6.0磷酸盐缓冲液中加入终浓度为0.001-0.005 M的NaCl,可在超声制备磁性纳米粒子后加速其沉降收集。
4.根据权利要求1-3所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述磁性纳米粒子吸附乳清中乳铁蛋白与洗脱就是磁性纳米粒子与乳清混合,在120 r/min的条件下吸附1-10 min,吸附结束后,用磁铁吸附磁性纳米粒子后,倾倒出液体用双蒸水清洗剩余物(沉淀物)2次,每次清洗沉淀以后都用磁性吸附磁性纳米粒子,小心地去除双蒸水,然后加入洗脱液进行120r/min洗脱5 min,用磁铁吸附磁性纳米粒子后,收集洗脱液,所得到的洗脱液通过BCA蛋白测定试剂盒测定其蛋白浓度,同时将洗脱液进行12%的SDS-PAGE凝胶电泳,电泳结束后分析各洗脱液中乳铁蛋白占总蛋白的比例,结合总蛋白量和乳铁蛋白所占的比例来确定最佳吸附时间;以最佳的吸附时间为准,以同样的方式来确定最佳洗脱时间;将10 mL在最佳吸附和洗脱时间条件下得到的洗脱液与10 mL硝酸混合后进行消化,以双蒸水和10 mL为空白对照,消化结束后将所剩的灰分容10 mL后用电感耦合等离子体发射光谱仪测定溶液中的铁离子浓度来确定磁铁对乳清中磁性纳米粒子的回收率;磁性纳米粒子使用后,将磁性纳米粒子分别保存于①pH6.0磷酸盐缓冲液(室温)、②pH6.0磷酸盐缓冲液(4℃)和③不含任何缓冲液(室温),次日用三种不同保存方式的磁性纳米粒子分别在最佳的吸附条件下吸附乳清中的乳铁蛋白,以吸附率为指标来确定最佳的保存方式;以最佳保存方式保存的磁性纳米粒子在最佳的吸附和洗脱条件下吸附乳清中的乳铁蛋白,以吸附率的变化情况来确定吸附稳定性。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法:该磁性纳米粒子对乳清中的乳铁蛋白最大吸附能力为11.5 mg/g、每克磁性纳米粒子可以使35mL含乳铁蛋白为0.35mg/mL乳清中乳铁蛋白的回收率达到90%以上、乳铁蛋白的纯度高于93%、最佳吸附和洗脱时间为4-7 min、磁性纳米粒子的回收率大于99.99 %、经过100次吸附后磁性纳米粒子的吸附稳定性高于89%。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190405 |
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