JP2004307344A - ラクトフェリンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課 題】種々の生理活性を有し、薬理学的にも重要な乳タンパク質であるラクトフェリンを、それを含有する乳から高純度に分離、精製する方法の提供。
【解決手段】ラクトフェリンを含有する乳質原料を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で処理した濃縮液を、親水性の強酸性カチオン交換樹脂に接触させてラクトフェリンを吸着させた後、塩濃度１Ｍ以上の溶液でラクトフェリンを溶出することを特徴とするラクトフェリンの製造方法。
【選択図】なし
【解決手段】ラクトフェリンを含有する乳質原料を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で処理した濃縮液を、親水性の強酸性カチオン交換樹脂に接触させてラクトフェリンを吸着させた後、塩濃度１Ｍ以上の溶液でラクトフェリンを溶出することを特徴とするラクトフェリンの製造方法。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の生理活性を有し、薬理学的にも重要な乳タンパク質であるラクトフェリンを、それを含有する乳から高純度に分離、精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−２５５２９９号公報
【特許文献２】特開昭６３−２５５３００号公報
【特許文献３】特開平３−１０９４００号公報
【特許文献４】特開昭６３−１５２４００号公報
【特許文献５】米国特許第５５９６０８２号公報
【０００４】
ラクトフェリンは、乳等の外分泌中に存在する塩基性の鉄結合性タンパク質であり、リンパ球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過酸化脂質生成防止効果又は抗ウイルス効果等の種々の生理機能を有する。このため、ラクトフェリンは医薬品としての利用が考えられる他、飼料や食品素材としても重要な乳タンパク質であるといえる。
したがって、乳からラクトフェリンを分離、精製する方法が、従来から検討されてきた。乳中の主なタンパク質であるカゼインとホエータンパク質は、その等電点（ｐＩ）がそれぞれ４．６と５．１〜５．４付近にあり、ラクトフェリンの９．５付近と大きく異なっている。この特性からラクトフェリンの分離には、乳をｐＨ６以上で陽イオン交換体と接触させることで、正に帯電したラクトフェリンを選択的に吸着し、このｐＨで負に帯電した他の乳タンパク質と分離する方法が現在の主流の方法となっている。しかし、牛乳中にはラクトフェリンと分子量及び等電点が近似した塩基性タンパク質であるラクトパーオキシダーゼが共存し、この両者の分離が困難であることから、高純度のラクトフェリンを分離するには、工程が煩雑となり、分離に長時間を要し、加うるにラクトフェリンの回収率も低くなる問題があった。
【０００５】
主なラクトフェリン精製技術として、ラクトフェリンと親和性の強い物質を固定化し、アフィニティクロマトグラフィーにより分離する方法がある。例えば、
リガンドとしてヘパリン（特許文献１）、硫酸エステル化合物（特許文献２）スルフォン基（特許文献３）等を親水性の担体（セルロース、キトサン、シリカ等）に固定化し、ラクトフェリンを含む乳原料と接触させ、吸着したラクトフェリンを０．５〜１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出させる方法である。
【０００６】
また、工業規模で乳からラクトフェリンを分離・精製する方法としては、カルボキシメチル基を有した弱酸性陽イオン交換樹脂と脱脂乳やホエーを接触させた後、吸着していない成分を水洗で除去し、続いて０．４〜１２％の塩溶液で溶出する方法（特許文献４）、あるいは、乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させた後、水洗し、０．３５Ｍの塩化ナトリウム溶液でラクトパーオキシダーゼを溶出し、続いて１．０Ｍの塩化ナトリウムでラクトフェリンを溶出する方法（特許文献５）が報告されている。
これらの方法の特徴は、ラクトフェリンの純度を上げるために、塩基性タンパク質が吸着した樹脂から低濃度塩類溶液によってラクトパーオキシダーゼを除去した後、高濃度の塩類溶液によってラクトフェリンを溶出・回収する２段階溶出処理を行うことである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のラクトフェリンの分離精製法において、アフィニティクロマトグラフィーを利用した分離方法は、リガンドを大量に入手するのが困難であり、かつ、固定化したリガンドが脱落してラクトフェリンに混入する恐れがあること、担体の物理強度が弱いものが多く、カラムの樹脂高や流速の制限が厳しいことから、工業的な実施は事実上きわめて困難であった。さらに、２段階溶出処理法は、タンパク質中のラクトフェリン濃度が９８％以上と高純度のラクトフェリンを得られるものの、溶出液を複数調製する必要がある点や、溶出操作を２回行うため溶出処理時間が長い等の問題点が存在した。
本発明は、上記状況に鑑みなされたものであって、ラクトフェリンの分離精製工程において、塩基性タンパク質のうち、ラクトフェリンのみを選択的に樹脂に吸着させ、１回の溶出によって、高純度のラクトフェリンを効率的、かつ工業的規模で分離精製するための方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンの分離方法に関して鋭意検討したところ、ラクトフェリンを含有する乳質原料を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で処理することで、ラクトパーオキシダーゼを選択的に透過液側に透過し、濃縮液側にラクトフェリンを選択的に濃縮出来ることを見いだした。
また、この膜処理をすることにより、ラクトフェリンが選択的に濃縮されラクトパーオキシダーゼに対してラクトフェリンの濃度が増加した濃縮液を原料として強酸性カチオン交換樹脂処理すると、ラクトフェリンがより選択的に濃縮されて溶出液中のラクトフェリン比率が簡単に高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の基本的方法は、（１）ラクトフェリンを含有する溶液を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で濃縮することで、濃縮液中のラクトフェリン比率を高め、（２）その濃縮液を親水性の強酸性カチオン交換樹脂と接触させることで、選択的にラクトフェリンを吸着させ、（３）１．０Ｍ以上の塩類溶液で、上記強酸性カチオン交換樹脂に吸着されたラクトフェリンを溶出することによってラクトフェリンを製造することを特徴とするものである。
本発明では、上記（１）処理で得た膜濃縮液を酸カゼイン、レンネットカゼイン、又は各種チーズを製造する原料として利用し、その際に生成するホエーを、（２）処理の通液原料として利用することもできる。
【００１０】
本発明の上記基本的方法によれば、回収されたタンパク質中９０重量％以上の純度でラクトフェリンが得られる。しかも、強酸性カチオン交換樹脂処理での原料通液量を調整するとともに、適当な電気伝導度に調整することで、通常の塩溶出のみで回収タンパク質中９８重量％以上の高純度なラクトフェリンを得ることが可能となる。
また、本発明では、上述するような方法の採用によってラクトフェリンの分離のために原料に何も添加することなく、強酸性カチオン交換樹脂で処理するために乳質原料の品質に変化をもたらすことがない。また、乳質原料を膜で濃縮した濃縮液を利用することから、従来法に比して強酸性カチオン交換樹脂に通液する原料の量は少量でよく、強酸性カチオン交換樹脂の処理時間を短縮することができる。
【００１１】
本発明で用いることのできる乳質原料としては、ラクトフェリンを含むヒト、ウシ、水牛、ヒツジ又はヤギ等の哺乳類由来の乳及びホエーを挙げることができるが、熱処理条件のゆるやかなものを用いるのが好ましい。その理由は、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼは、高温処理により大きく変性し、膜分離、吸着特性及び活性が変化する傾向があるからである。
これらの乳質原料は、予めバクトフュージ或いは細孔径１．０〜２．０μｍの精密ろ過（ＭＦ）膜によって沈殿物や微生物を除去しておくことが望ましい。このような処理をすることで、タンパク質のイオン交換体への吸着効率を高めることができる。
【００１２】
本発明で乳質原料中のラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分画するために用いるろ過膜は、試験例１に示したように細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのものであれば十分である。しかし、透過液側へのラクトフェリンの漏れ及びラクトパーオキシダーゼの透過率を考慮すると、細孔径０．１μｍのＭＦ膜を用いるのが好ましい。また、ろ過膜での濃縮倍率は、通常２〜５倍の範囲で行う。この濃縮率によってタンパク質中のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの比率が変化する。また、濃縮液の塩基性タンパク質中のラクトフェリン比率を高めた方が、強酸性カチオン交換樹脂処理でラクトフェリンの吸着効率が上がり、処理時間も短縮されることから３倍以上の濃縮倍率が好ましい。しかも、３倍以上に濃縮した濃縮液から酸カゼインを調製する際に得られる酸カゼインホエーは、電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上となり、後述する理由からラクトフェリン純度を高める最適な乳質原料となる。
また、膜処理の温度は特に限定されないが、通常は、４℃以上、６０℃未満の範囲で行う。４℃未満の温度では、乳質原料の凍結、粘度上昇、脂肪分離等が生じる。６０℃以上の温度では、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼが変性する可能性がある。
【００１３】
本発明でラクトフェリンの吸着に用いる強酸性のカチオン交換樹脂としては、架橋型の多糖類、親水性ビニルポリマー等の親水性の母体にスルフォン基を導入したもの、又は樹脂と交換基の間に何らかのスペーサーを導入したものがある。具体的にはスルフォン基を導入したスルフォン化キトパール（富士紡績社製）やスルフォプロピル基を導入したＳＰ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）等を例示することができる。
乳質原料を強酸性カチオン交換樹脂に接触させる方法としては、タンク内で両者を接触させる方法、強酸性カチオン交換樹脂を充填したカラムに通液する方法がある。特に、高純度のラクトフェリンの調製や多量調製する際にはカラム通液法を用いると効率的である。また、乳質原料と強酸性カチオン交換樹脂を接触させる温度は特に限定されないが、通常は、４℃以上６０℃未満の範囲で行う。４℃未満の温度では、乳質原料の凍結、粘度上昇、脂肪分離等が生じる。６０℃以上の温度では、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼが変性する可能性がある。
なお、１５℃以上の温度では、微生物の繁殖が著しいので、大量処理を行う場合は温度１５℃未満で処理することが望ましい。
【００１４】
強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量は、ラクトフェリンの吸着量及び純度に影響を与える重要な因子となる。最初、ラクトフェリン吸着量は接触量に比例して増加するが、しだいにラクトフェリン吸着量の増加する割合が少なくなり、飽和吸着量に達し、それに伴ってラクトフェリン純度が高くなる傾向がある。この原因は、塩基性タンパク質は、強酸性カチオン交換樹脂に対してそれぞれ個別の選択性を有しており、ラクトフェリンの吸着が飽和に達する付近で、ラクトフェリンが選択性の低い他の塩基性タンパク質と置き換わって強酸性カチオン交換樹脂に吸着するためである。
したがって、効率良く、高純度のラクトフェリンを得るためには、乳質原料と強酸性カチオン樹脂との組み合わせに応じて樹脂あたりの最低接触量を決定すればよい。しかも、この最低接触量は、ろ過膜処理による濃縮倍率に反比例することから、製造効率という点からみても濃縮した乳質原料を用いることがより好ましい。
【００１５】
また、ラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの強酸性カチオン交換樹脂に対する選択性と、乳質原料の電気伝導度の関係を検討した結果、試験例２に示したように乳質原料の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上で、ラクトパーオキシダーゼに対しラクトフェリンの選択性が急激に高くなることを見いだした。つまり、処理する乳質原料の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上の場合、ろ過膜で濃縮した効果に選択性の変化の効果が付加されることで、ラクトフェリン純度をさらに高める効果が得られる。
【００１６】
また、脱脂乳をろ過膜処理により３倍以上濃縮をした濃縮液を原料として酸カゼインを製造する時に生成する酸カゼインホエーは、電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上を示し、塩類を添加して電気伝導度を調節することなしに、希望の電気伝導度を示すことも見いだした。もちろん、希望電気伝導度の乳質原料がこの酸カゼインホエーに限定されるわけではなく、ろ過膜処理され、電気伝導度が１３ｍＳ／ｃｍ以上の乳質原料であればよい。
本発明の工程によれば、乳質原料を無駄にすることなく、機能性を持った乳製品を効果的に製造することができる。
以下に試験例及び実施例を示して本発明を具体的に説明する。
【００１７】
【試験例１】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．５、０．２、０．１及び０．０５μｍの４種類セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）、及び分画分子量１０ ｋＤ（細孔径０．０５μｍ未満に相当）のＵＦセラミック膜（ＮＧＫ社製）の合計５種類のセラミック膜を用いて３倍に濃縮し、５種類の膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム５本に、上記５種類の膜濃縮液３．９ ｌをそれぞれ１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌをそれぞれ１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌをそれぞれ０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、５種類の回収液０．６５ ｌを得た。
得られた５種類の回収液について、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて透析を行った後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いたＦＰＬＣにてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼの濃度を２８０ ｎｍの吸光度から測定した。
そして、ＦＰＬＣクロマトグラムの全ピーク面積に対するラクトフェリンのピーク面積からラクトフェリンの純度を計算した。
その結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
これによると、細孔径が０．５μｍのろ過膜で処理したものは、ラクトフェリンの回収量が極端に少なくなり、しかも純度も低下することがわかった。また、細孔径が０．０５μｍ未満に相当する分画分子量１０ ｋＤのＵＦセラミック膜で処理したものは、ラクトフェリンの回収量は多いもののラクトパーオキシダーゼ含量が多くなり、ラクトフェリンの純度が低下することがわかった。
一方、細孔径が０．０５、０．１及び０．２μｍのろ過膜で処理したものは、満足のいくラクトフェリンの回収量及び純度が得られ、回収量と純度を考慮すると、細孔径０．１μｍのろ過膜で処理したものが最も優れているということがわかった。
【００２０】
【実施例１】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で、細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３倍に濃縮し、ｐＨ６．７、電気伝導度４．３ ｍＳ／ｃｍのＭＦ膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）７００ｍｌを充填した内径１０ｃｍのカラムに、上記ＭＦ膜濃縮液２１ ｌ（リットル）を１０℃、４．２ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水５．６ ｌを８ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水３．５ ｌを４．２ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液３．５ ｌを得た。
なお、カラムを通過したＭＦ膜濃縮液については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色や風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ３，４１０ｍｇ／ｌ、３３０ｍｇ／ｌ、９０％であった。
【００２１】
【比較例１】
実施例１のＭＦ膜濃縮液の代わりに、ろ過膜処理していない脱脂乳（ｐＨ６．６、電気伝導度４．３ｍＳ／ｃｍ）６３ ｌを用いた以外は実施例１と同様にして、回収液３．５ ｌを得た。
なお、カラムを通過した脱脂乳については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ３，４２０ｍｇ／ｌと５８０ｍｇ／ｌ、８２％であった。
実施例１及び比較例１の結果より、脱脂乳をＭＦ膜で濃縮した後に親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなることが示された。
【００２２】
【実施例２】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３．５倍に濃縮し、ｐＨ６．７、電気伝導度４．３ｍＳ／ｃｍのＭＦ膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１，０００ｍｌを充填した内径１０ｃｍのカラムに、上記ＭＦ膜濃縮液５１ ｌを１０℃、４．２ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水８ｌを８ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水５ ｌを４．２ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液５ ｌを得た。
なお、カラムを通過したＭＦ膜濃縮液については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ５，３４０ ｍｇ／ｌと３４０ ｍｇ／ｌ、９２％であった。
【００２３】
【比較例２】
実施例２のＭＦ膜濃縮液の代わりに、ＭＦ膜処理していない脱脂乳（ｐＨ６．６、電気伝導度４．３ ｍＳ／ｃｍ）１８０ ｌを用いた以外は実施例２と同様にして、回収液５ｌを得た。
なお、カラムを通過した脱脂乳については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ５，９５０ ｍｇ／ｌと８１０ ｍｇ／ｌ、８７％であった。
実施例１、実施例２及び比較例２の結果より、単にラクトフェリンの吸着量を増やすよりも、ＭＦ膜処理による濃縮倍率を上げるほうが、得られるラクトフェリンの純度が高くなることが示された。
【００２４】
【試験例２】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３．５倍に濃縮し、脱イオン水で２倍希釈した後、ＮａＣｌを添加して濃縮乳の電気伝導度を３、６、９、１３、１６ ｍＳ／ｃｍに調整して５種類の原料液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム５本に、上記５種類の原料液１０ ｌをそれぞれ１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌをそれぞれ１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌをそれぞれ０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、５種類の回収液０．６５ ｌを得た。
得られた５種類の回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定した。
その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
これによると、すべての回収液についてラクトフェリンの回収量、純度ともに満足のできるものであったが、原料液の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上の場合には、純度が９５％以上となることがわかった。
【００２７】
【実施例３】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で、細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜を用いて３．５倍に濃縮して４４℃まで冷却した後、塩酸を添加してｐＨ４．５に調整し、生成した酸カゼインを分離してホエーを得た。
得られたホエーに水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．８に調整した後遠心分離して沈殿を除去し、ｐＨ６．７、電気伝導度１５ｍＳ／ｃｍのホエーを得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム３本（カラム１〜３）を準備し、カラム１には４．２ ｌ、カラム２には６．８ ｌ、カラム３には１３．３ ｌの上記ホエーを１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌを１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌを０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液１〜３をそれぞれ０．６５ ｌずつ得た。
なお、それぞれのカラムを通過したホエーについては、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、回収液１がそれぞれ２，５６０ｍｇ／ｌ、１６０ｍｇ／ｌ、９３％、回収液２がそれぞれ３，９６０ｍｇ／ｌ、２００ｍｇ／ｌ、９５％、回収液３がそれぞれ７，３５０ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ、９８％であった。
【００２８】
【比較例３】
ｐＨ６．６の脱脂乳を４４℃に加温した後、塩酸を添加してｐＨ４．５に調整し、生成した酸カゼインを分離してホエーを得た。
得られたホエーに水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．８に調整した後遠心分離して沈殿を除去し、ｐＨ６．７、電気伝導度９ｍＳ／ｃｍのホエーを得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラムに、上記ホエー１８ ｌを１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌを１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄して、９％食塩水０．６５ ｌを０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液０．６５ ｌを得た。なお、カラムを通過したホエーについては、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ２，４４０ｍｇ／ｌ、６２０ｍｇ／ｌ、７８％であった。
実施例３及び比較例３の結果より、脱脂乳をＭＦ膜で濃縮した濃縮液より、酸カゼインを調製し、それを除去して得られたホエーを、親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなり、強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量を多くすることで、得られるラクトフェリンの純度がさらに高くなることが示された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、脱脂乳をろ過膜で濃縮した濃縮液を、あるいはその濃縮液からカゼインを除去したホエーを、親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなり、強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量を多くすることで、得られるラクトフェリンの純度がさらに高くなることが示された。
そして、本発明の方法では、強酸性カチオン交換樹脂処理での原料通液量を調整するとともに、適当な電気伝導度の原料を用いることで、通常の塩溶出のみで回収タンパク質中９８重量％以上の高純度なラクトフェリンを得ることが可能である。
また、本発明の分離方法では、ラクトフェリンの分離のために乳質原料に何も添加することなく強酸性カチオン交換樹脂処理するため、乳質原料の品質を変化させることがないという利点がある。さらに、膜で濃縮した乳質原料を利用することから、従来に比べて強酸性カチオン交換樹脂に通液する原料の量は少量となり強酸性カチオン交換樹脂処理時間を短縮することができる効果がある。
本発明で得られたラクトフェリンは、乳等の外分泌中に存在する塩基性の鉄結合性タンパク質であり、リンパ球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過酸化脂質生成防止効果や抗ウイルス効果等の種々の生理機能を有する。このため、本発明で得られたラクトフェリンは医薬品としての利用も考えられる外に、飼料や食品素材としても重要な乳タンパク質として使用できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の生理活性を有し、薬理学的にも重要な乳タンパク質であるラクトフェリンを、それを含有する乳から高純度に分離、精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−２５５２９９号公報
【特許文献２】特開昭６３−２５５３００号公報
【特許文献３】特開平３−１０９４００号公報
【特許文献４】特開昭６３−１５２４００号公報
【特許文献５】米国特許第５５９６０８２号公報
【０００４】
ラクトフェリンは、乳等の外分泌中に存在する塩基性の鉄結合性タンパク質であり、リンパ球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過酸化脂質生成防止効果又は抗ウイルス効果等の種々の生理機能を有する。このため、ラクトフェリンは医薬品としての利用が考えられる他、飼料や食品素材としても重要な乳タンパク質であるといえる。
したがって、乳からラクトフェリンを分離、精製する方法が、従来から検討されてきた。乳中の主なタンパク質であるカゼインとホエータンパク質は、その等電点（ｐＩ）がそれぞれ４．６と５．１〜５．４付近にあり、ラクトフェリンの９．５付近と大きく異なっている。この特性からラクトフェリンの分離には、乳をｐＨ６以上で陽イオン交換体と接触させることで、正に帯電したラクトフェリンを選択的に吸着し、このｐＨで負に帯電した他の乳タンパク質と分離する方法が現在の主流の方法となっている。しかし、牛乳中にはラクトフェリンと分子量及び等電点が近似した塩基性タンパク質であるラクトパーオキシダーゼが共存し、この両者の分離が困難であることから、高純度のラクトフェリンを分離するには、工程が煩雑となり、分離に長時間を要し、加うるにラクトフェリンの回収率も低くなる問題があった。
【０００５】
主なラクトフェリン精製技術として、ラクトフェリンと親和性の強い物質を固定化し、アフィニティクロマトグラフィーにより分離する方法がある。例えば、
リガンドとしてヘパリン（特許文献１）、硫酸エステル化合物（特許文献２）スルフォン基（特許文献３）等を親水性の担体（セルロース、キトサン、シリカ等）に固定化し、ラクトフェリンを含む乳原料と接触させ、吸着したラクトフェリンを０．５〜１．０Ｍ塩化ナトリウムで溶出させる方法である。
【０００６】
また、工業規模で乳からラクトフェリンを分離・精製する方法としては、カルボキシメチル基を有した弱酸性陽イオン交換樹脂と脱脂乳やホエーを接触させた後、吸着していない成分を水洗で除去し、続いて０．４〜１２％の塩溶液で溶出する方法（特許文献４）、あるいは、乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させた後、水洗し、０．３５Ｍの塩化ナトリウム溶液でラクトパーオキシダーゼを溶出し、続いて１．０Ｍの塩化ナトリウムでラクトフェリンを溶出する方法（特許文献５）が報告されている。
これらの方法の特徴は、ラクトフェリンの純度を上げるために、塩基性タンパク質が吸着した樹脂から低濃度塩類溶液によってラクトパーオキシダーゼを除去した後、高濃度の塩類溶液によってラクトフェリンを溶出・回収する２段階溶出処理を行うことである。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記した従来のラクトフェリンの分離精製法において、アフィニティクロマトグラフィーを利用した分離方法は、リガンドを大量に入手するのが困難であり、かつ、固定化したリガンドが脱落してラクトフェリンに混入する恐れがあること、担体の物理強度が弱いものが多く、カラムの樹脂高や流速の制限が厳しいことから、工業的な実施は事実上きわめて困難であった。さらに、２段階溶出処理法は、タンパク質中のラクトフェリン濃度が９８％以上と高純度のラクトフェリンを得られるものの、溶出液を複数調製する必要がある点や、溶出操作を２回行うため溶出処理時間が長い等の問題点が存在した。
本発明は、上記状況に鑑みなされたものであって、ラクトフェリンの分離精製工程において、塩基性タンパク質のうち、ラクトフェリンのみを選択的に樹脂に吸着させ、１回の溶出によって、高純度のラクトフェリンを効率的、かつ工業的規模で分離精製するための方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンの分離方法に関して鋭意検討したところ、ラクトフェリンを含有する乳質原料を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で処理することで、ラクトパーオキシダーゼを選択的に透過液側に透過し、濃縮液側にラクトフェリンを選択的に濃縮出来ることを見いだした。
また、この膜処理をすることにより、ラクトフェリンが選択的に濃縮されラクトパーオキシダーゼに対してラクトフェリンの濃度が増加した濃縮液を原料として強酸性カチオン交換樹脂処理すると、ラクトフェリンがより選択的に濃縮されて溶出液中のラクトフェリン比率が簡単に高まることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の基本的方法は、（１）ラクトフェリンを含有する溶液を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で濃縮することで、濃縮液中のラクトフェリン比率を高め、（２）その濃縮液を親水性の強酸性カチオン交換樹脂と接触させることで、選択的にラクトフェリンを吸着させ、（３）１．０Ｍ以上の塩類溶液で、上記強酸性カチオン交換樹脂に吸着されたラクトフェリンを溶出することによってラクトフェリンを製造することを特徴とするものである。
本発明では、上記（１）処理で得た膜濃縮液を酸カゼイン、レンネットカゼイン、又は各種チーズを製造する原料として利用し、その際に生成するホエーを、（２）処理の通液原料として利用することもできる。
【００１０】
本発明の上記基本的方法によれば、回収されたタンパク質中９０重量％以上の純度でラクトフェリンが得られる。しかも、強酸性カチオン交換樹脂処理での原料通液量を調整するとともに、適当な電気伝導度に調整することで、通常の塩溶出のみで回収タンパク質中９８重量％以上の高純度なラクトフェリンを得ることが可能となる。
また、本発明では、上述するような方法の採用によってラクトフェリンの分離のために原料に何も添加することなく、強酸性カチオン交換樹脂で処理するために乳質原料の品質に変化をもたらすことがない。また、乳質原料を膜で濃縮した濃縮液を利用することから、従来法に比して強酸性カチオン交換樹脂に通液する原料の量は少量でよく、強酸性カチオン交換樹脂の処理時間を短縮することができる。
【００１１】
本発明で用いることのできる乳質原料としては、ラクトフェリンを含むヒト、ウシ、水牛、ヒツジ又はヤギ等の哺乳類由来の乳及びホエーを挙げることができるが、熱処理条件のゆるやかなものを用いるのが好ましい。その理由は、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼは、高温処理により大きく変性し、膜分離、吸着特性及び活性が変化する傾向があるからである。
これらの乳質原料は、予めバクトフュージ或いは細孔径１．０〜２．０μｍの精密ろ過（ＭＦ）膜によって沈殿物や微生物を除去しておくことが望ましい。このような処理をすることで、タンパク質のイオン交換体への吸着効率を高めることができる。
【００１２】
本発明で乳質原料中のラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分画するために用いるろ過膜は、試験例１に示したように細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのものであれば十分である。しかし、透過液側へのラクトフェリンの漏れ及びラクトパーオキシダーゼの透過率を考慮すると、細孔径０．１μｍのＭＦ膜を用いるのが好ましい。また、ろ過膜での濃縮倍率は、通常２〜５倍の範囲で行う。この濃縮率によってタンパク質中のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの比率が変化する。また、濃縮液の塩基性タンパク質中のラクトフェリン比率を高めた方が、強酸性カチオン交換樹脂処理でラクトフェリンの吸着効率が上がり、処理時間も短縮されることから３倍以上の濃縮倍率が好ましい。しかも、３倍以上に濃縮した濃縮液から酸カゼインを調製する際に得られる酸カゼインホエーは、電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上となり、後述する理由からラクトフェリン純度を高める最適な乳質原料となる。
また、膜処理の温度は特に限定されないが、通常は、４℃以上、６０℃未満の範囲で行う。４℃未満の温度では、乳質原料の凍結、粘度上昇、脂肪分離等が生じる。６０℃以上の温度では、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼが変性する可能性がある。
【００１３】
本発明でラクトフェリンの吸着に用いる強酸性のカチオン交換樹脂としては、架橋型の多糖類、親水性ビニルポリマー等の親水性の母体にスルフォン基を導入したもの、又は樹脂と交換基の間に何らかのスペーサーを導入したものがある。具体的にはスルフォン基を導入したスルフォン化キトパール（富士紡績社製）やスルフォプロピル基を導入したＳＰ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製）等を例示することができる。
乳質原料を強酸性カチオン交換樹脂に接触させる方法としては、タンク内で両者を接触させる方法、強酸性カチオン交換樹脂を充填したカラムに通液する方法がある。特に、高純度のラクトフェリンの調製や多量調製する際にはカラム通液法を用いると効率的である。また、乳質原料と強酸性カチオン交換樹脂を接触させる温度は特に限定されないが、通常は、４℃以上６０℃未満の範囲で行う。４℃未満の温度では、乳質原料の凍結、粘度上昇、脂肪分離等が生じる。６０℃以上の温度では、ラクトフェリンやラクトパーオキシダーゼが変性する可能性がある。
なお、１５℃以上の温度では、微生物の繁殖が著しいので、大量処理を行う場合は温度１５℃未満で処理することが望ましい。
【００１４】
強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量は、ラクトフェリンの吸着量及び純度に影響を与える重要な因子となる。最初、ラクトフェリン吸着量は接触量に比例して増加するが、しだいにラクトフェリン吸着量の増加する割合が少なくなり、飽和吸着量に達し、それに伴ってラクトフェリン純度が高くなる傾向がある。この原因は、塩基性タンパク質は、強酸性カチオン交換樹脂に対してそれぞれ個別の選択性を有しており、ラクトフェリンの吸着が飽和に達する付近で、ラクトフェリンが選択性の低い他の塩基性タンパク質と置き換わって強酸性カチオン交換樹脂に吸着するためである。
したがって、効率良く、高純度のラクトフェリンを得るためには、乳質原料と強酸性カチオン樹脂との組み合わせに応じて樹脂あたりの最低接触量を決定すればよい。しかも、この最低接触量は、ろ過膜処理による濃縮倍率に反比例することから、製造効率という点からみても濃縮した乳質原料を用いることがより好ましい。
【００１５】
また、ラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの強酸性カチオン交換樹脂に対する選択性と、乳質原料の電気伝導度の関係を検討した結果、試験例２に示したように乳質原料の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上で、ラクトパーオキシダーゼに対しラクトフェリンの選択性が急激に高くなることを見いだした。つまり、処理する乳質原料の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上の場合、ろ過膜で濃縮した効果に選択性の変化の効果が付加されることで、ラクトフェリン純度をさらに高める効果が得られる。
【００１６】
また、脱脂乳をろ過膜処理により３倍以上濃縮をした濃縮液を原料として酸カゼインを製造する時に生成する酸カゼインホエーは、電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上を示し、塩類を添加して電気伝導度を調節することなしに、希望の電気伝導度を示すことも見いだした。もちろん、希望電気伝導度の乳質原料がこの酸カゼインホエーに限定されるわけではなく、ろ過膜処理され、電気伝導度が１３ｍＳ／ｃｍ以上の乳質原料であればよい。
本発明の工程によれば、乳質原料を無駄にすることなく、機能性を持った乳製品を効果的に製造することができる。
以下に試験例及び実施例を示して本発明を具体的に説明する。
【００１７】
【試験例１】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．５、０．２、０．１及び０．０５μｍの４種類セラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）、及び分画分子量１０ ｋＤ（細孔径０．０５μｍ未満に相当）のＵＦセラミック膜（ＮＧＫ社製）の合計５種類のセラミック膜を用いて３倍に濃縮し、５種類の膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム５本に、上記５種類の膜濃縮液３．９ ｌをそれぞれ１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌをそれぞれ１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌをそれぞれ０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、５種類の回収液０．６５ ｌを得た。
得られた５種類の回収液について、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ １ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて透析を行った後、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓカラム（アマシャム バイオサイエンス社製）を用いたＦＰＬＣにてラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼの濃度を２８０ ｎｍの吸光度から測定した。
そして、ＦＰＬＣクロマトグラムの全ピーク面積に対するラクトフェリンのピーク面積からラクトフェリンの純度を計算した。
その結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
これによると、細孔径が０．５μｍのろ過膜で処理したものは、ラクトフェリンの回収量が極端に少なくなり、しかも純度も低下することがわかった。また、細孔径が０．０５μｍ未満に相当する分画分子量１０ ｋＤのＵＦセラミック膜で処理したものは、ラクトフェリンの回収量は多いもののラクトパーオキシダーゼ含量が多くなり、ラクトフェリンの純度が低下することがわかった。
一方、細孔径が０．０５、０．１及び０．２μｍのろ過膜で処理したものは、満足のいくラクトフェリンの回収量及び純度が得られ、回収量と純度を考慮すると、細孔径０．１μｍのろ過膜で処理したものが最も優れているということがわかった。
【００２０】
【実施例１】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で、細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３倍に濃縮し、ｐＨ６．７、電気伝導度４．３ ｍＳ／ｃｍのＭＦ膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）７００ｍｌを充填した内径１０ｃｍのカラムに、上記ＭＦ膜濃縮液２１ ｌ（リットル）を１０℃、４．２ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水５．６ ｌを８ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水３．５ ｌを４．２ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液３．５ ｌを得た。
なお、カラムを通過したＭＦ膜濃縮液については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色や風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ３，４１０ｍｇ／ｌ、３３０ｍｇ／ｌ、９０％であった。
【００２１】
【比較例１】
実施例１のＭＦ膜濃縮液の代わりに、ろ過膜処理していない脱脂乳（ｐＨ６．６、電気伝導度４．３ｍＳ／ｃｍ）６３ ｌを用いた以外は実施例１と同様にして、回収液３．５ ｌを得た。
なお、カラムを通過した脱脂乳については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ３，４２０ｍｇ／ｌと５８０ｍｇ／ｌ、８２％であった。
実施例１及び比較例１の結果より、脱脂乳をＭＦ膜で濃縮した後に親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなることが示された。
【００２２】
【実施例２】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３．５倍に濃縮し、ｐＨ６．７、電気伝導度４．３ｍＳ／ｃｍのＭＦ膜濃縮液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１，０００ｍｌを充填した内径１０ｃｍのカラムに、上記ＭＦ膜濃縮液５１ ｌを１０℃、４．２ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水８ｌを８ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水５ ｌを４．２ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液５ ｌを得た。
なお、カラムを通過したＭＦ膜濃縮液については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ５，３４０ ｍｇ／ｌと３４０ ｍｇ／ｌ、９２％であった。
【００２３】
【比較例２】
実施例２のＭＦ膜濃縮液の代わりに、ＭＦ膜処理していない脱脂乳（ｐＨ６．６、電気伝導度４．３ ｍＳ／ｃｍ）１８０ ｌを用いた以外は実施例２と同様にして、回収液５ｌを得た。
なお、カラムを通過した脱脂乳については、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ５，９５０ ｍｇ／ｌと８１０ ｍｇ／ｌ、８７％であった。
実施例１、実施例２及び比較例２の結果より、単にラクトフェリンの吸着量を増やすよりも、ＭＦ膜処理による濃縮倍率を上げるほうが、得られるラクトフェリンの純度が高くなることが示された。
【００２４】
【試験例２】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜（Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ社製）を用いて３．５倍に濃縮し、脱イオン水で２倍希釈した後、ＮａＣｌを添加して濃縮乳の電気伝導度を３、６、９、１３、１６ ｍＳ／ｃｍに調整して５種類の原料液を得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム５本に、上記５種類の原料液１０ ｌをそれぞれ１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌをそれぞれ１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌをそれぞれ０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、５種類の回収液０．６５ ｌを得た。
得られた５種類の回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定した。
その結果を表２に示す。
【００２５】
【表２】
これによると、すべての回収液についてラクトフェリンの回収量、純度ともに満足のできるものであったが、原料液の電気伝導度が１３ ｍＳ／ｃｍ以上の場合には、純度が９５％以上となることがわかった。
【００２７】
【実施例３】
ｐＨ６．６の脱脂乳を５０℃で、細孔径０．１μｍのＭＦセラミック膜を用いて３．５倍に濃縮して４４℃まで冷却した後、塩酸を添加してｐＨ４．５に調整し、生成した酸カゼインを分離してホエーを得た。
得られたホエーに水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．８に調整した後遠心分離して沈殿を除去し、ｐＨ６．７、電気伝導度１５ｍＳ／ｃｍのホエーを得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラム３本（カラム１〜３）を準備し、カラム１には４．２ ｌ、カラム２には６．８ ｌ、カラム３には１３．３ ｌの上記ホエーを１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌを１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄し、９％食塩水０．６５ ｌを０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液１〜３をそれぞれ０．６５ ｌずつ得た。
なお、それぞれのカラムを通過したホエーについては、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、回収液１がそれぞれ２，５６０ｍｇ／ｌ、１６０ｍｇ／ｌ、９３％、回収液２がそれぞれ３，９６０ｍｇ／ｌ、２００ｍｇ／ｌ、９５％、回収液３がそれぞれ７，３５０ｍｇ／ｌ、５０ｍｇ／ｌ、９８％であった。
【００２８】
【比較例３】
ｐＨ６．６の脱脂乳を４４℃に加温した後、塩酸を添加してｐＨ４．５に調整し、生成した酸カゼインを分離してホエーを得た。
得られたホエーに水酸化ナトリウムを添加してｐＨ６．８に調整した後遠心分離して沈殿を除去し、ｐＨ６．７、電気伝導度９ｍＳ／ｃｍのホエーを得た。
親水性の強酸性カチオン交換樹脂であるＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０（東ソー社製）１３０ｍｌを充填した内径３ｃｍのカラムに、上記ホエー１８ ｌを１０℃、１．０ ｌ／ｈの流速で通液した後、脱イオン水１．１ ｌを１．６ ｌ／ｈの流速で通液して洗浄して、９％食塩水０．６５ ｌを０．８ ｌ／ｈの流速で通液して吸着成分を溶出し、回収液０．６５ ｌを得た。なお、カラムを通過したホエーについては、通液前と比較してｐＨ、電気伝導度、色、風味等に変化は認められなかった。
得られた回収液のラクトフェリンとラクトパーオキシダーゼの濃度及びラクトフェリンの純度を試験例１と同様の方法で測定したところ、それぞれ２，４４０ｍｇ／ｌ、６２０ｍｇ／ｌ、７８％であった。
実施例３及び比較例３の結果より、脱脂乳をＭＦ膜で濃縮した濃縮液より、酸カゼインを調製し、それを除去して得られたホエーを、親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなり、強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量を多くすることで、得られるラクトフェリンの純度がさらに高くなることが示された。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、脱脂乳をろ過膜で濃縮した濃縮液を、あるいはその濃縮液からカゼインを除去したホエーを、親水性の強酸性カチオン交換樹脂処理をすることで、得られるラクトフェリンの純度が高くなり、強酸性カチオン交換樹脂に対する乳質原料の接触量を多くすることで、得られるラクトフェリンの純度がさらに高くなることが示された。
そして、本発明の方法では、強酸性カチオン交換樹脂処理での原料通液量を調整するとともに、適当な電気伝導度の原料を用いることで、通常の塩溶出のみで回収タンパク質中９８重量％以上の高純度なラクトフェリンを得ることが可能である。
また、本発明の分離方法では、ラクトフェリンの分離のために乳質原料に何も添加することなく強酸性カチオン交換樹脂処理するため、乳質原料の品質を変化させることがないという利点がある。さらに、膜で濃縮した乳質原料を利用することから、従来に比べて強酸性カチオン交換樹脂に通液する原料の量は少量となり強酸性カチオン交換樹脂処理時間を短縮することができる効果がある。
本発明で得られたラクトフェリンは、乳等の外分泌中に存在する塩基性の鉄結合性タンパク質であり、リンパ球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過酸化脂質生成防止効果や抗ウイルス効果等の種々の生理機能を有する。このため、本発明で得られたラクトフェリンは医薬品としての利用も考えられる外に、飼料や食品素材としても重要な乳タンパク質として使用できる。
Claims (5)
- 乳質原料を細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で処理した濃縮液を、親水性の強酸性カチオン交換樹脂に接触させてラクトフェリンを吸着させた後、塩濃度１Ｍ以上の溶液でラクトフェリンを溶出することを特徴とするラクトフェリンの製造方法。
- 乳質原料が、ラクトフェリンを含む脱脂乳及び／又はホエーであることを特徴とする請求項１記載のラクトフェリンの製造方法。
- 細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で濃縮した脱脂乳からカゼイン画分を除去して得られた溶液を、親水性の強酸性カチオン交換樹脂に接触させてラクトフェリンを吸着させた後、塩濃度１Ｍ以上の溶液でラクトフェリンを溶出することを特徴とするラクトフェリンの製造方法。
- 細孔径０．０５μｍ〜０．２μｍのろ過膜で濃縮した脱脂乳からカゼイン画分を除去して得られた溶液が、該濃縮した脱脂乳を原料として酸カゼイン、レンネットカゼイン又は各種チーズを調製した際に生成するホエーであることを特徴とする請求項３記載のラクトフェリンの製造方法。
- 電気伝導度を１３ｍＳ／ｃｍ以上にして、強酸性カチオン交換樹脂に接触させてラクトフェリンを吸着させることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のラクトフェリンの製造方法。
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