KR20210091206A - 우유, 초유 및 산 또는 스위트 유청으로부터 고도로 정제된 락토페린 및 락토퍼옥시다제를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제 단백질 중 적어도 하나를 함유하는 공급원으로부터 단백질 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 분획을 제조하는 방법으로서, 여기서, 상기 공급원은 양이온 교환기 성질을 갖는 모놀리식 컬럼을 사용한 크로마토그래피 분리 공정 수단에 의해 우유, 초유, 산 또는 스위트 유청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 분리 공정에서, pH 구배 또는 결합된 pH 및 염 구배 용출은 상기 공급원을 상기 컬럼에 로딩한 후 사용된다. 추가로 C 값이 > 60%인 락토페린 및 A 값이 > 1%인 락토퍼옥시다제를 포함하는 물질의 조성물이 개시된다.

Description

우유, 초유 및 산 또는 스위트 유청으로부터 고도로 정제된 락토페린 및 락토퍼옥시다제를 제조하는 방법

본 발명은 락토페린 및 락토퍼옥시다아제 단백질 중 적어도 하나 및 고도로 정제된 단백질 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 함유하는 공급원으로부터 락토페린 또는 락토퍼옥시다제 단백질을 포함하는 분획을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도입

락토페린 (LF) 및 락토퍼옥시다제 (LPO)는 우유, 유청 및 초유에 존재하는 기능성 미량 단백질이다. LF는 다양한 생리적 및 환경적 변화에 반응할 수 있는 80 kDa의 글리코실화된 단백질이며, 따라서 숙주의 제1 방어선에서 핵심 구성요소로 간주된다. LF의 구조적 특성은 모든 트랜스페린에 공통적인 Fe³⁺ 항상성 기능 외의 기능성을 제공한다: 광범위한 박테리아, 곰팡이, 효모, 바이러스 및 기생충에 대한 강력한 항균 활성; 항염 및 항암 활성; 및 여러 효소 기능 [1]. LPO는 수유 유선을 보호하는 데 중요한 역할을 하며, 새로 태어난 영아의 장관(intestinal tract)은 병원성 미생물에 대해 다양한 발암원의 분해와 과산화 효과에 대한 동물 세포 보호에 관여한다 [2].

LF는 철을 결합할 수 있다. 천연의 LF는 철을 함유하는, 홀로 (holo) LF를 15 내지 20% 포함한다. 나머지 부분은 철을 함유하지 않는, 아포 (apo) LF이다 [32]. 이론적으로, 아포 LF는 철 포화 수준이 다소 낮다 (이미 결합된 철 - A 값). 아포 LF의 이론적 A 값은 약 < 3% (3% 미만)이다. 또한, 아포 LF는 철 결합 가능성이 높다 (철 용량 - C 값). 아포 LF의 C 값은 약 > 50% (50% 초과)이다. 순도가 높고 변성되지 않은 아포 LF는 > 70%의 더 높은 C 값을 가질 가능성이 있다. 반면, 홀로 LF는 높은 A 값 (> 50%)과 낮은 C 값 (< 10%)을 보유한다. 단리된 LF의 C 값이 높을수록 LF의 철 결합 가능성이 높아진다. 철의 결합 가능성이 높으면 활성 LF가 미생물 성장에 필요한 필수 철을 제거하기 때문에 더 높은 수준의 항균 활성을 유발한다.

오늘날, LF 및 LPO는 다음과 같은 다수의 상이한 기술에 의해 우유 및 우유가공 부산물 (예를 들어, 유청)로부터 단리된다: (I) 헤파린 리간드를 갖는 폴리(글리시딜-메타크릴레이트)를 갖는 상자성 입자에 의한 단리 [3], (II) 양이온성 계면활성제 (예를 들어, 세틸디메틸암모늄 브로마이드)를 사용함에 의해) [4], (III) 상이한 크로마토그래피 기술 (예를 들어, 양이온 교환 또는 친화성 크로마토그래피) [1,2,5-10] 및 (IV) 기타 기술 (예를 들어, 소수성 이온성 액체 [11]). 일반적으로, 대부분의 이온 교환 크로마토그래피인 크로마토그래피 기술은 비교적 저렴한 비용으로 LF를 신속하게 분리하는 방법을 나타낸다 [12]. 크로마토그래피 접근법은 또한 견고함과 반복성으로 인해 다른 접근법보다 우수하다. LF 및 LPO의 크로마토그래피 정제에서 가장 통상적인 기술은 강한 양이온 교환 수지 입자와 멤브레인 또는 모노리스 컬럼(monolith column)을 사용하는 것이다 [13-15].

현재의 크로마토그래피는 몇 가지 단점이 있다: (I) 기공(pores)에서의 확산 물질 전달로 인해 유속이 증가함에 따라 피크가 넓어져서 유속이 증가하면 동일한 분리도를 얻기 위해 경사 기울기(gradient slope)가 더 낮아야 하고, (II) 증가된 유동은 크로마토그래피 단계의 시간을 감소시키지만 동시에 용출 체적을 증가시키고, (III) 높은 컬럼 압력 강하를 초래하기 때문에, 컬럼 길이는 유속에 대한 제한 요소이다.

크로마토그래피 정제 단계에서, 우유 또는 유청에 존재하는 LF 및 LPO는 특정 조건하에 강한 양이온 교환기의 표면에 결합되고 이후 pH가 높거나 염 농도가 높은 완충액을 사용하여 용출 분획에 수집된다. 분리 공정을 단순화하기 위해, LF 및 LPO는 단계 모드(step mode)에서 이온 강도가 높거나 pH > 9 (9 초과)인 여러 완충 용액을 사용하여 주로용출된다. 그러한 접근법은 종종 하나의 크로마토그래피 단계에서 원하는 단백질의 분획을 상대적으로 높은 순도 (60 내지 95%)로 생성한다. 탈염, 농축 및 순도 증가를 위해, 종종 한외 여과 공정을 도입하여 소량의 저분자량 불순물을 제거한다. 얻어진 단백질 농축물은 일반적으로 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 건조된다. Wang 등 [18]은 동결 건조된 LF가 분무 건조 (

5%)보다 적은 양 (대략 2 내지 3%)의 물을 함유하고 있는 반면, 분무 건조된 LF는 약간 낮은 변성도와 6 내지 7% 더 높은 항산화 활성을 보여 신선한 액체 LF에 가깝다는 것을 보여주었다. 분무 건조 [1]는 분자 구성이 손상되지 않고 높은 항산화 능력을 가진 무정형 LF 분말을 생산하는 데 사용된다.

EP 0418704 A1 [19]는 표면 설폰 그룹을 가진 수지 입자를 함유하는 이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 철과 결합할 수 있는 우유 단백질을 분리, 정제 및 회수하는 과정을 기술한다. LF는 pH/전도성 단계 용출 모드를 통해 단리되고 있으며 최종 제품 순도는 > 90%라고 주장된다. 또한 소량의 저분자량 불순물을 제거하여 궁극적으로 LPO 및 LF가 90% 이상의 순도가 되도록 하기 위해 한외여과 공정이 필요하다.

EP 1466923 A1 [20]에 설명된 공정은 단리된 LF의 순도가 79 내지 91% 범위인 강산 양이온 교환 수지 (입자)를 사용한 크로마토그래피 단계를 포함한다.

WO 2006/119644 A1 [21]은 LF를 정제하고 용액에서 이를 안정화시키고 이의 활성을 개선하는 방법을 설명한다. 상기 공정은 이미 단리된 더 낮은 순도의 LF를 추가로 정제하기 위한 것이다. 정제는 하전된 배제된 용질 농도를 포함하는 산성 수용액의 존재하에 소수성 흡착제 (입자)를 사용하여 수행된다. 달성된 LF의 최종 순도는 > 95%였다.

US 5,861,491 A [13]는 재조합 인간 LF (rhLF)를 암호화하는 이식 유전자(transgene)뿐만 아니라 전형적으로 소 우유로부터 다른 관련된 LF 종의 발현에 의해 생성된 인간 LF를 포함하는 인간 LF를 단리하는 방법을 개시한다. 일반적으로, 우유 또는 hLF를 함유하는 우유 분획은 상대적으로 높은 이온 강도의 존재하에 강한 양이온 교환 수지와 접촉하여 비-LF 단백질 및 기타 물질이 강한 양이온 교환 수지에 결합하는 것을 방지한다. 수지 입자는 이후 원심 분리에 의해 우유로부터 분리되고 양이온 교환 수지에 결합된 LF는 단계 모드에서 상이한 염 농도를 가진 몇 가지 완충 용액을 사용하여 용출된다. hLF 및 bLF의 최고 분획 순도는 대략 95%를 초과한다.

EP 0348508 B1 [22]는 설포네이트 가교된 폴리사카라이드 수지 (입자)를 사용한 원유(raw milk)로부터 LF 단리를 개시한다.

컬럼에 흡착된 LF는 NaCl 농도가 증가된 완충액을 사용하여 단계 모드에서 용출된다. 소 LF의 순도는 95%로 측정되었고 탈지된 인간의 초유로부터 얻은 LF는 98% 순도를 나타내었다.

US 6,096,870 A [23]에 기재된 방법은 유청 단백질 (면역글로불린, β락토글로불린, α-락트알부민, 소 혈청 알부민, LF)의 분리, 특히 강한 양이온 교환 수지 입자를 갖는 미리 패킹된 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 유청 단백질을 별도의 분획으로 순차적으로 분리하는 것과 관련된다. 언급된 단백질 분획의 순차적 용출은 단계적 모드(stepwise mode)에서 적합한 pH 및 이온 강도의 완충액으로 순차적으로 용출된다.

최종 분무 건조된 생성물 순도는 다음과 같았다: 면역글로불린 ≥ 80%, BSA 및 LF ≥ 75% 및 β락토글로불린 ≥ 85%.

US 8,603,560 B2 [24]는 컬럼에 패킹(packing)된 양이온-교환 수지를 사용하여 우유 또는 유청으로부터 우유 단백질을 단리하는 공정을 설명한다. 용출은 pH 또는 이온 강도의 단계적 변화(stepwise change)에 의해 촉진된다. 최종 LF 순도는 80%였다.

CA 2128111 C [25]는 산업 규모의 우유 및 유제품으로부터 LF 및 LPO를 단리하는 공정을 설명한다. 상기 단백질은 양이온 교환기에 흡착되고 이들 단백질을 하나 이상의 염 용액에 의한 단계적 용출 방법을 통해 개별적 또는 동시 용출함으로써 단리된다. 단리된 단백질의 최종 순도에 대한 데이터는 없다.

EP 0253395 B9 [26]는 약산성 양이온-교환 수지를 사용하여 우유로부터 소 LF를 고순도로 단리하는 방법을 개시한다. LF는 상이한 농도를 갖는 염화나트륨 용액으로 단계적으로 용출하여 이온 교환기로부터 회수된다. 이전 Laurell의 방법에 따르면, 생산된 LF의 순도는 최대 90 내지 99%까지 측정된다.

US 5,596,082 A [27]는 산업적 규모의 우유 및 유제품으로부터 LF 및 효소 LPO를 단리하는 방법을 개시한다. 이 공정은 우유 또는 우유 유도체를 양이온 교환기에 통과시켜 이러한 단백질을 양이온 교환기에 흡착시키는 단계를 포함한다. 언급된 단백질의 용출은 상이한 염 농도를 사용하는 단계 용출에 의해 촉진된다. LPO 및 LF의 최종 순도는 각각 최대 93% 및 94%였다.

US 9,115,211 B2 [28]에 개시된 발명은 양이온 교환 수지를 사용하는 LF의 단리를 기술한다. 기재된 방법에 의해 수득된 LF는 95% 보다 더 순수하고 LPS, 내 독소(endotoxin) 및 안지오제닌이 실질적으로 없으며 철 포화 수준은 9%와 15% 사이에 포함된다.

EP2421894A1 [29]은 10% 미만의 철 포화도 또는 보다 바람직하게는 약 9% 내지 3.89%의 철 포화도를 갖는 저-철분 LF를 제조하는 방법을 설명한다. 이러한 공정에 의해 제조된 상기 저 철분 LF는 표준 LF 대비 증가된 항균 활성을 나타낸다. 이러한 공정은 산과 용매를 사용한다. Fe³⁺가 방출된 후, 추가된 공정 보조제는 UF 및 DF 공정에 의해 제거되었다. 생성된 생성물은 3.89%에서 5.1%의 철 포화도 (HPLC/X-선 형광 (XRF)에 의함)를 갖는 밝은 크림/옅은 베이지 색이다.

WO2014/207678 A1 [30]은 분비액으로부터 LF를 정제하는 방법을 개시하였다. 상기 방법은 분비액을 알칼리화하는 단계, 상기 알칼리화된 분비액을 공기와 접촉시키는 단계, 및 유기 용매 (아세톤)를 사용하여 알칼리화된 분비액으로부터 LF를 침전시키는 단계를 포함한다.

WO1995/022258 A2 [31]는 우유, 특히 비인간 종의 우유로부터 인간 LF를 정제하고, 비인간 LF 종으로부터의 분리를 포함하여 우유에 존재하는 원치 않는 거대 분자 종으로부터 인간 LF를 분리하는 방법을 개시한다. 단리를 수행하기 위해, 강한 양이온 교환 수지 (예를 들어, S Sepharose™가 사용된다. 단백질 (LF 및 기타)은 단계식 염 및 pH 구배로 용출되었다.

G. Majka 등 (2013) (A high-throughput method for the quantification of iron saturation in lactoferrin preparations, Anal. Bioanal. Chem., 405, 5191-5200)은 철 함량이 낮은 소 락토페린을 수득하는 방법을 개시한다. 철 함량이 낮은 락토페린을 얻기 위해 이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 것만으로는 충분하지 않았다. 따라서, 이온 교환 크로마토그래피는 24시간 동안 100 mM 시트레이트 완충액에 대한 광범위한 투석과 결합되었다.

본 발명의 하나의 목적은 고순도, 고 활성의 락토페린 물질의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종래 기술의 단점 중 적어도 일부를 극복하기 위한 적절한 방법을 제공하는 것이다.

고 활성 락토페린은 철 포화 수준이 다소 낮고 (이미 결합된 철- A 값) 철 결합 가능성이 높다 (철 결합 용량-C 값)는 특징이 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고순도의 락토퍼옥시다제를 포함하는 물질의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이러한 단백질 함유 공급원으로부터 고순도로 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 락토페린 또는 락토퍼옥시다제 단백질 중 적어도 하나를 함유하는 공급원으로부터 단백질 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 분획을 제조하는 방법에 의해 해결된다. 상기 공급원은 강한 양이온 교환 성질을 갖는 모놀리식 컬럼을 사용하는 크로마토그래피 분리 공정 수단에 의해 우유, 초유, 산 또는 스위트 유청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 분리 공정에서, 공급원을 컬럼에 로딩한 후 pH 구배 용출(pH gradient elution) 또는 pH 구배 용출 및 염 구배 용출(salt gradient elution)이 결합된 용출이 사용된다.

본 발명의 하나의 구현예에서, pH 구배는 일예로 4.0 내지 < pH 8.0 (pH 4.0 이상 8.0 미만)의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 7.5의 pH 범위, 보다 바람직하게는 약 4.0 내지 약 < pH 7 (pH 약 4.0 이상 약 7 미만)의 pH 범위, 특히 약 4.5 내지 약 < pH 6.5 (pH 약 4.5 이상 약 6.5 미만)의 pH 범위에서 시작한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, pH 구배는 일예로 약 pH 8 내지 pH < 13 (pH 약 8이상 13 미만)의 범위, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 12의 pH 범위, 특히 pH 8 내지 pH < 12 (pH 8 이상 12 미만)의 pH 범위에서 종료된다.

공급원을 컬럼에 로딩하기 전에 공급원을 여과하는 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 염 구배는 염 농도를 증가시킴으로써 수행되며, 특히 염 구배는 약 5 mS/cm 내지 약 55 mS/cm 범위의 전도도에 해당한다. 완충 용액의 pH에 대한 간섭을 피하기 위해 중성 염을 사용하여 염 농도를 조정하는 것이 바람직하며, 특히 식품 산업 공정에 사용되는 염, 일예로 염화나트륨이 바람직하다.

상술한 염 구배와 조합하여 사용된 pH 구배는 일예로 4.0 내지 < pH 8.0의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 7.5의 pH 범위, 보다 바람직하게는 4.0 내지 < pH 7의 pH 범위, 특히 4.5 내지 < pH 6.5의 pH 범위의 pH 값으로 시작한다. 염 구배와 조합하여 사용된 pH 구배는 일예로 pH 8 내지 pH < 13의 범위, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 12의 pH 범위, 특히 pH 8 내지 pH < 12의 pH 범위에서 종료된다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 약 pH 8 내지 약 pH < 11의 pH 범위, 바람직하게는 8.0 내지 pH 10.0의 pH 범위, 보다 바람직하게는 pH 8.2 내지 pH 10.0의 pH 범위, 특히 약 pH 8.9 내지 약 pH 10의 pH 범위에서 용출되는 분획 A를 수집할 수 있다. 이 분획은 일예로 락토퍼옥시다제를 함유한다.

본 발명의 더 또 다른 구현예에서, > 10 내지 pH 12.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH > 10.4 내지 pH 12의 pH 범위, 바람직하게는 약 pH > 11 내지 약 12, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7에서 용출되는 분획 B를 수집할 수 있다. 이 분획은 일예로 락토페린을 함유한다.

본 발명의 방법의 유용한 일 구현예에서, 크로마토그래피 분리 공정은 다음 단계를 포함한다:

(i) 공급원(source)의 pH 값을 pH 7보다 낮은 값, 특히 pH 6.5보다 낮은 값으로 조정하는 단계;

(ii) 단계 (i)의 공급원을 강한 양이온 교환기 성질을 갖는 모놀리식 컬럼과 접촉시키는 단계;에 이어서

(iii) 컬럼을 통해 구배 완충액을 흘려보내 pH 값을 증가시키는 단계; 및

(iv) 약 pH 8 내지 약 pH < 11의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.0 내지 pH 10.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.2 내지 pH 10.0의 pH 범위, 특히 약 pH 8.9 내지 약 pH 10에서 용출되는 분획 A를 수집하는 단계; 및/또는

(v) > 10 내지 pH 12.0, 바람직하게는 약 pH > 10.4 내지 약 12의 pH 범위, 바람직하게는 pH > 11.0 내지 12.0, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7의 pH 범위에서 용출되는 분획 B를 수집하는 단계;

(vi) 선택적으로, 특히 중화, 농축, 보존 등을 위한 처리에 의해 분획 A 및/또는 B를 추가로 처리하는 단계.

단계 (ii) 전에 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제를 함유하는 공급원을 여과하는 것이 유용할 수 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 모놀리식 컬럼은 약 pH < 7, 특히 약 pH < 6의 pH 값을 갖는 평형 완충액으로 단계 (ii) 전에 평형화될 수 있다.

특히 강한 양이온 교환 성질을 갖는 모놀리식 컬럼은 SO₃H 개질된 모놀리식 컬럼, -COOH 개질된 모놀리식 컬럼, -OSO₃H 개질된 모놀리식 컬럼 또는 -OPO₃H 개질된 모놀리식 컬럼으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 맥락에서, SO₃H, -COOH, -OSO₃H, 또는 -OPO₃H 개질된 모놀리식 컬럼은 또한 산성 모이어티의 상응하는 염, 특히 나트륨, 칼륨 염, 예를 들어, SO₃Na, -COONa, -OSO₃Na, 또는 -OPO₃Na 또는 SO₃K, -COOK, -OSO₃K, 또는 -OPO₃K와 같은 알칼리 염을 포함한다.

본 발명의 방법에 따르면, 분획 B보다 낮은 pH 값에서 용출하는 분획 A는 일예로 락토퍼옥시다제를 함유하는 반면, 분획 B는 일예로 락토페린을 함유한다.

본 발명의 추가 구현예에서, 상기 컬럼은 단계 (iii) 또는 (iv) 전에 평형 완충액으로 플러싱(flushing)될 수 있다.

전형적으로, 분획을 함유하는 락토페린 및 락토퍼옥시다제는, 예를 들어, 건조, 특히 분무 건조에 의해 추가로 처리될 수 있다.

본 발명의 방법은 고순도의 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 생성한다. 락토페린의 순도는 > 98%이고, 락토퍼옥시다제의 순도는 > 78%이다. 또한, 락토페린 C 값은 > 50% 또는 > 60%이고, 락토페린 A 값은 > 1%이다. 바람직하게는, 락토페린 C 값은 > 70%이고, 락토페린 A 값은 > 2%이다. 바람직하게는, 락토페린 C 값은 ≥ 70.0%, 바람직하게는 70.0%와 80.0% 사이, 보다 바람직하게는 70.0%와 77.0% 사이이다. 바람직하게는, 락토페린 A 값은 ≥ 2.0%, 바람직하게는 < 3.9%, 바람직하게는 1.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 5.0% 사이, 보다 바람직하게는 2%와 4% 사이이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 모놀리식 컬럼은 전형적으로 단계 (iv) 또는 (v) 후에 약 pH > 12의 완충액으로 플러싱함으로써 살균될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 락토페린의 C 값은 > 60%이고, A 값은 > 1%이다. 바람직하게는, 락토페린의 C 값은 > 70%이고, A 값은 > 2%이다. 바람직하게는, 락토페린 C 값은 ≥ 70.0%, 바람직하게는 70.0%와 80.0% 사이, 보다 바람직하게는 70.0%와 77.0% 사이이다.

바람직하게는, 락토페린 A 값은 1.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 5.0% 사이, 보다 바람직하게는 2%와 4% 사이, 바람직하게는 ≥ 2.0%이고/이거나 바람직하게는 < 3.9%이다.

바람직하게는, 본 발명의 생성물의 A+C 값은 적어도 61%, 또는 적어도 72% 또는 적어도 73%이다.

본 발명의 방법은 다음을 제공한다:

- 우유, 초유 및 산 또는 스위트 유청으로부터 LF 및 LPO 단리를 위한 빠르고 간단한 방법,

- LF 및 LPO 단리를 위해 pH 선형 구배를 사용하는 단일 크로마토그래피 단계 단리 공정으로, 이는 고도로 순수한 표적 단백질 (예를 들어, LF 순도 > 98%)을 생성함,

- 불포화 철 결합 용량 (UIBC: Unsaturated Iron Binding Capacity)을 측정하기 위한 잘 확립된 방법에 따라 고도로 활성 (C-값 > 70%, LF에 대한 C-값 결정 키트, NRL Pharma)이고 이미 결합된 철을 적은 양 함유하는 (A-값 < 3.9%, LF에 대한 A-값 결정 키트, NRL Pharma) (이는 시판중인 LF의 주요 특성이다) 개시된 방법에 의해 수득되는 제품 (LF 단백질). 제품은 특수 화학물질을 사용하지 않고 경제적이며 까다로운 요구를 하지 않은 방법(procedually undemanding method)에 의해 생산되며 현장 (모놀리식 양이온 교환기)에서 수행된다,

- 적은 양의 철 (A-값 < 3.9%)을 함유하고 동시에 안지오제닌을 함유하지 않는 LF를 생산할 수 있는 방법,

- 높은 총 생물 활성 (C-값 + A-값> 72%)으로 LF를 생산할 수 있는 방법,

- 생산 규모를 쉽게 확장할 수 있고, 높은 순도 및 생물 활성을 갖는 LF 및 LPO를 효율적인 비용으로 생산할 수 있는 방법,

- 전체 > 85% LF 회수율을 제공하는 크로마토그래피, 농축/탈염 및 건조 공정을 포함하는 LF/LPO 단리 전체 공정,

- 단백질의 높은 분리도를 저해하지 않고, 높은 유속이 가능한 이동상 (700 L/m²/h)으로 인해 고생산성을 갖는 크로마토그래피 공정,

- 단리를 목적으로 하는 단백질 (예를 들어, 유청)과 함께 배지(media)에 화합물을 도입하지 않거나 달리 특성을 변화시키지 않은 공정; 이는 다른 생화학 산업 공정에서 배지의 추가 사용을 허용한다,

- 기존에 정의된기결합된 철(Fe)의 몫(pre-defined share of already bound Fe)으로 LF의 생산을 가능하게 하는 방법.

도 1은 LF 용출 서브피크로 구성된 LF 용출 피크의 크로마토그래피 결과이다. 상기 현상은 철 함량으로 인한 LF 등전점 (IEP)의 작은 차이의 결과이다. Voswinkel 등 [32]은 철분 함량의 감소가 결과적으로 LF의 IEP를 작은 정도로 낮춘다는 것을 보여주었다.
도 2는 (A) 산성 유청 및 (B) 시판중인 LF 제품 및 LF의 크로마토그래피 결과이다.
도 3은 8 L 모노리스 컬럼(monolith columb, CIMmultus^TM SO3; BIA Separations사)을 사용하여 산성 유청으로부터의 LF 단리 모식도및 공정의 질량 균형에 대한 기본 정보에 관한 것이다.

제조사 (BIA Separations)로부터의 강한 양이온 교환기 그룹을 갖는 모노리스 컬럼(CIMmultusTM SO3 - strong CEX; BIA Separations사) 여과된 유청 또는 우유로부터 LF 및 LPO를 단리하기 위해 상이한 용출 모드에서 개별적으로 테스트되었다. LF/LPO의 로딩은 중성 pH의 유청에서 수행되었으며, 2개의 표적 단백질은 (I) pH의 단계적 증가, (II) 전도도 단계, (III) 선형 전도도 구배 및 (IV) 선형 pH 구배에 의해 개별적으로 용출되었다.

비교를 위해 수행된 단계 용출 모드(step elution mode)의 경우, 달성된 LF의 순도는 약 95%였고, 전도도 구배의 경우, 달성된 순도는 95%보다 약간 높았다. 놀랍게도, 본 발명에 따르면 증가하는 pH 구배, 특히 선형 증가하는 pH 구배를 갖는 용출은 달성된 단백질 순도가 98%를 초과하는 것으로 밝혀졌다. 순도는 HPLC, SDS-page 분석, 바이오애널라이저 (Bioanalyzer) 및 SEC 크로마토그래피로 입증되었다. 본 발명의 방법은 단일 크로마토그래피 단계 및 생산 규모에 의해 이러한 결과를 제공한다. 그런데, EP 0253395에서 순도 계산을 위해 사용된 Laurell의 방법 [26]에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 본 발명 제품의 계산된 순도는 > 118%이다. 확립된 방법이 시대에 뒤져서 LF 순도의 정확한 결정에 더 이상 적합하지 않다.

선형 pH 구배 용출의 경우, LF 용출이 여러 작은 하위-피크(sub-peaks)로 구성되어 있음을 주목하였다 (도 1). 후자는 LF가 또한 단백질 철 함량의 수준이 낮은 것에서 높은 것으로 분리되었음을 시사한다. 그 이유는 이미 다른 사람들에 의해 논의되고 입증되었다 [32].

농축된 LF 수 분산액은 분무 건조 또는 동결 건조기로 건조되었고, LF에 대한 불포화 철-결합 용량 (UIBC)이 측정된 것보다 더 많았다. NRL Pharma Inc. Japan에 의해 제공되는 철 비색 검정 키트 (Iron Colorimetric Assay Kit) (상세한 원리는 Ito et al. [33]에 의해 공지되었음)에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 수득된 LF는 2%와 4.9% 사이의 철 포화 수준 (이미 결합된 철 - A 값)을 가졌다. 불포화 철 결합 용량 (UIBC)으로도 불리는 철 결합 가능성 (철 결합 용량 - C 값)은 70% 초과였다. A 값과 C 값이 각각 4.6%와 11.7% 사이 그리고 34.4%와 52.1% 사이인, 시판중인 제품에 비해 결과가 최상위를 차지하였다 (표 1 참조). 동시에, 이들의 총 생물 활성 (C 값 + A 값)은 일반적으로 본 발명의 제품보다 낮았다.

[표 1] 시판중인 LF 샘플 및 본 발명의 LF의 생물 활성 (Arhel d.o.o.)

* 총 생물 활성 (A+C)은 C 값과 A 값을 합하여 표현되고, 이는 샘플에서 활성 단백질의 백분율을 제공한다.

** 값은 샘플의 순수 LF의 양에 따라 다시 계산되며, 64%이다.

본 발명의 방법은 이들 단백질 중 하나 이상을 함유하는 공급원(source)으로부터 단백질 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 분획을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 공급원은 강한 양이온 교환기 성질을 갖는 모놀리식 컬럼을 사용한 크로마토그래피 분리 공정 수단에 의해 우유, 초유, 산 또는 스위트 유청으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 분리 공정에서, 공급원을 컬럼에 로딩한 후 pH 구배 용출이 사용된다.

모놀리식 컬럼은 통상적으로 단량체의 중합물 (polymerisate)인 다공성 고체 물질이 함유된 중공체를 포함하는 크로마토그래피 분리 장비이다. 예를 들어, 중합 공정 동안에 상기 물질의 기공(pores)이 형성된다 (US 4,923,610, US 4,952,344, US 4,889,623).

적합한 장치는 선행 기술, 예를 들어, EP 1058844, EP 777725에 설명되어 있으며 이는 상업적으로 이용 가능하다. 본원에 사용된 모놀리식 크로마토그래피 물질은 다공성 물질의 표면에서 노출되는 -SO₃H 모이어티(moiety)로 개질된다. -SO₃H 그룹을 사용한 표면 개질은 소위 강한 양이온 교환 특성 (CAX)을 가진 물질을 제공한다. 당업자라면 일예로 다른 물질이 약한 양이온 교환기로 분류된다는 것을 알고 있다. 이와 대조적으로, 다른 목적으로 음이온 교환기 (AEX)를 사용할 수 있다.

pH 구배 크로마토그래피는 시작 값에서 끝점까지 pH를 증가시켜 수행된다. 상기 구배는 거의 선형으로 설계될 수 있지만, 본 발명의 결과, 즉 본 발명의 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제의 생성물이 수득되는 한, 다른 경로도 가능하다. 당업자(skilled person)는 그러한 구배 크로마토그래피를 수행하는 방법을 알고 있다. 본 발명의 명시적이고 묵시적인 개시내용에 기반한 양이온 구배 크로마토그래피의 조건의 최적화는 당업자의 루틴에 속하며 과도한 실험 부담과 관련이 없다.

재현 가능한 처리를 위한 조건을 설정하기 위해, pH 구배로 실제 분리하기 전에 모놀리식 컬럼을 평형화하는 것이 바람직하다. 이 경우, 컬럼은 평형 완충액으로 플러싱된다. 일예로, 컬럼은 컬럼의 8 내지 12x 무용 부피(dead volume)에 해당하는 평형 완충액 체적으로 플러싱된다. 크로마토그래피의 시작 pH 값의 선택은 LF 및/또는 LPO를 함유하는 공급원의 pH 값에 어느 정도 영향을 받는다. 예를 들어, 산성 유청이 LF 및/또는 LPO의 공급원인 경우, 평형을 위한 pH 값은 pH 4.6이 될 수 있는 반면, 스위트 유청을 사용하는 경우, pH 값은 더 높을 수 있으며, 일예로 pH 5.0 내지 pH 6.5일 수 있다.

공급원을 컬럼에 로딩하기 전에 공급원을 여과하는 것이바람직하다. 일반적으로, 유제품 산업에서 사용되는 필터 수단을 사용할 수 있다. 세라믹 TFF 필터, 나선형으로 감긴 멤브레인 또는 기타 연속 여과 기술이 특히 유용하다.

모놀리식 컬럼에 공급원을 로딩한 후, 원칙적으로 pH 구배 크로마토그래피를 시작할 수 있다. 그러나, pH 구배 크로마토그래피를 시작하기 전에, 평형 조건 주변의 pH 값으로 컬럼을 추가로 플러싱하여 불순물을 제거하는 것이 바람직하다. 이는, 이 pH 값에서 용출되는 단백질 또는 기타 오염물질이 분리된 LF 및/또는 LPO를 오염시키지 않기 때문에 제조될 단백질의 분리를 지원한다.

pH 구배는 일예로 4.0 내지 < pH 8.0의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 7.5의 pH 범위, 바람직하게는 약 4.0 내지 약 < pH 7의 pH 범위, 특히 약 4.5 내지 약 < pH 6.5의 pH 범위에서 pH 값으로 시작한다. pH 구배는 일예로약 pH 8 내지 pH < 13의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 12의 pH 범위, 특히 pH 8 내지 pH < 12의 범위에서 종료된다. 도 1은 pH 구배 크로마토그래피의 일반적인 과정을 도시한다.

용출 완충액의 이온 강도 또한 분리에 약간의 영향을 미칠 수 있음에 주목해야 한다. 이온 강도는 필요한 pH 구배를 오버레이하는 크로마토그래피 분리 동안 증가하는 구배를 따를 수 있다. 상술한 염 구배와 조합하여 사용하는데 필요한 pH 구배는 일예로 4.0 내지 < pH 8.0의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 7.5의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 < pH 7의 pH 범위, 특히 4.5 내지 < pH 6.5의 pH 범위의 pH 값으로 시작한다. 염 구배와 조합하여 사용되는 pH 구배는 일예로 pH 8 내지 pH < 13의 범위, 바람직하게는 pH 8 내지 pH 12의 pH 범위, 특히 pH 8 내지 pH < 12의 pH 범위에서 종료된다.

예를 들어, LPO는 이온 강도가 약 15 mS/cm의 전도도와 동등한 경우 약 pH 8 내지 약 pH < 11의 pH 범위에서 용출되지만, 전도도가 4 mS/cm에서 55 mS/cm로, 바람직하게는 5 mS/cm에서 55 mS/cm로 증가하는 경우 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.5 범위의 더 낮은 pH에서 용출된다. LF의 용출은 유사한 방식을 따른다. 전도도가 중간이지만 일정하게 유지되는 경우, LF는 약 pH 10.7 내지 약 pH 11.7의 범위에서 용출되고, 전도도가 4 mS/cm에서 55 mS/cm로, 바람직하게는 5 mS/cm에서 55 mS/cm로 증가하는 경우, LF는 약 pH 9.6 내지 약 pH 10.7 범위의 더 낮은 pH에서 용출된다. 이온 강도, 즉 전도도는 적합한 염을 추가하여 조정될 수 있다. 적합한 염을 사용하여 용출 완충액의 pH 값도 조정될 수 있다.

약 pH 8 내지 약 pH < 11의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.0 내지 pH 10.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.2 내지 pH 10.0의 pH 범위, 특히 약 pH 8.9 내지 약 pH 10, 또는 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.5에서 약 5 내지 55 mS/cm의 더 높은 전도도에서 용출되는 분획 A가 수집된다. 이 분획은 일예로 락토퍼옥시다제를 함유한다. > 10 내지 pH 12.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH > 10.4 내지 pH 12, 바람직하게는 약 pH 11 내지 약 12, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7, 또는 약 pH 9.6 내지 약 pH 10.7 (더 높은 전도도, 약 5 내지 55 mS/cm)에서 용출되는 분획 B가 수집된다. 이 분획은 일예로 락토페린을 포함한다.

다음으로, 본 발명의 일반적인 성능에 대해 설명한다. LF 및 LPO가 용출되는 pH 범위는 약 15 mS/cm의 중간 전도도에 해당한다. 크로마토그래피 분리 공정은 다음 단계를 포함한다:

(i) 공급원(source)의 pH 값을 pH 7보다 낮은 값, 특히 pH 6.5보다 낮은 값으로 조정하는 단계;

(ii) 단계 (i)의 공급원을 강한 양이온 성질을 갖는 모놀리식 컬럼, 특히 -SO₃ 개질된 모놀리식 컬럼과 접촉시키는 단계;에 이어서

(iii) 컬럼을 통해 구배 완충액을 흘려보내 pH 값을 증가시키는 단계; 및

(iv) 약 pH 8 내지 약 pH < 11의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.0 내지 pH 10.0의 pH 범위, 바람직하게는 pH 8.2 내지 pH 10.0의 pH 범위, 특히 약 pH 8.9 내지 약 pH 10에서 용출되는 분획 A를 수집하는 단계; 및/또는

(v) > 10 내지 pH 12.0의 pH 범위, 바람직하게는 약 pH > 10.4 내지 약 12, 바람직하게는 > 11 내지 pH 12의 pH 범위, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7에서 용출되는 분획 B를 수집하는 단계;

(vi) 선택적으로, 특히 중화, 농축, 보존 등을 위한 처리에 의해 분획 A 및/또는 B를 추가로 처리하는 단계.

원하지 않는 물질을 제거하기 위해, 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제를 함유하는 공급원은 세라믹 필터를 통해 단계 (ii) 전에 여과된다.

모놀리식 컬럼은 약 pH < 7, 특히 약 pH < 6의 pH 값을 갖는 평형 완충액으로 단계 (ii) 전에 평형화된다. 컬럼은 단계 (iii) 또는 (iv) 전에 평형 완충액으로 플러싱된다.

락토페린 및 락토퍼옥시다제 함유 분획을 수집한 후, 이들은 분무 건조에 의해 추가로 처리된다.

수득된 락토페린 또는 락토퍼옥시다제는 고순도이다. 락토페린의 순도는 > 98%이고, 락토퍼옥시다제의 순도는 > 78%이다. 또한, 락토페린 C 값은 ≥ 60% (60% 이상)이고, 락토페린 A 값은 ≥ 1%이다. 바람직하게는, 락토페린 C 값은 > 70%이고, 락토페린 A 값은 > 2%이다. 바람직하게는, 락토페린 C 값은 ≥ 70.0%, 바람직하게는 70.0%와 80.0% 사이, 보다 바람직하게는 70.0%와 77.0% 사이이다. 바람직하게는, 락토페린 A 값은 바람직하게는 1.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 7.0% 사이, 바람직하게는 2.0%와 5.0% 사이, 보다 바람직하게는 2%와 4% 사이, 바람직하게는 ≥ 2.0% 및/또는 < 3.9%이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 모놀리식 컬럼은 전형적으로 단계 (iv) 또는 (v) 후에 약 pH > 13의 완충액으로 플러싱함으로서 살균될 수 있다.

살균 단계는 컬럼을 탈이온수 (10 내지 15 CVs), 1M NaOH (4 내지 10 CVs)로 1 내지 3시간 접촉시켜 플러싱하고, 다시 물 (> 30 CVs)로 플러싱하여 수행된다. 이 단계는 8 내지 10회의 크로마토그래피 실행마다 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 새로운 접근법의 특이성은 또한 (I) 단백질이 단리된 공급원 (예를 들어, 유청)의 임의의 화학적 변형이 필요하지 않고 표준 여과 기술을 사용한 사전 여과 (pre-filtration) 만이 필요하고, (II) 다른 공정 (예를 들어, EP2421894 A1 [29])과 달리, 저렴한 화학물질 (완충액)을 적응 양으로 사용하고, (III) LPO 및 LF의 분리된 고순도 분획을 제공하고, (IV) 기존 정의된 기결합 철의 몫으로 LF의 생산을 가능하게 하고, (V) 단백질 용출 분산액의 탈염/농축 및 생산 단계 건조를 포함하여 85%가 넘는 높은 단백질 회수율을 나타낸다는 사실에 있다.

본원에 인용된 모든 참조문헌은 본원의 명시적인 교시와 일치하지 않는 전체 범위까지 참조로 포함된다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예를 통해 추가로 설명되고 예시된다.

실시예:

분석:

HPLC 분석:

샘플에서 LF 및 LPO를 결정하기 위해, MWD 다파장 검출기와 pH 측정 키트를 구비한 전도도 모니터가 장착된 크로마토그래피 시스템 (PATfix^TM, BIA Separations d.o.o., Ajdovscina, Slovenia)을 사용하였다. 3.5 mS/cm에서 152 mS/cm로 증가된 전도도 구배 모드 (conductivity gradient mode)에서 2개의 소듐 포스페이트 1염기성(monobasic) 완충 용액 (25 mM, pH=7.5)을 사용하여 CIMac^TM SO3-0.1 (Pores 1.3 μm, BIA Separations d.o.o., Ajdovscina, Slovenia) 분석 컬럼에서 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 분석된 단백질의 용출을 226 nm에서 MWD 검출기로 모니터링하였다. 크로마토그래피 방법에 대한 자세한 정보는 표 2에 제시되어 있으며 일부 분석된 샘플의 크로마토그램은 도 1 및 2에 도시하였었다. 모든 샘플은 CHROMAFIL® A-45/25, 0.45 μm, 셀룰로오스 혼합된 에스테르 필터를 통해 사전에 여과시켰다.

[표 2] 샘플 분석에 사용되는 크로마토그래피 시스템 및 방법

C- 및 A-값의 결정:

건조 LF 샘플의 C- 및 A-값을 결정하기 위해, 일본의 NRL Pharma Inc.이 제공하는 철 색도계 분석 키트 (Iron Colorimetric Assay Kit)를 사용했고 (자세한 원리는 Ito 등 [33]에 의해 발표됨), 건조 및 액체 샘플에 대한 A-값을 결정하기 위해 HPLC 방법과 함께 문헌 [33,34]에 설명된 것과 동일한 접근법을 사용하였다.

C 값의 결정:

LF의 C 값을 결정하기 위해, LF는 알려진 과량의 철로 포화시켰다. 잔여 철은 킬레이트 시약 (최대 흡광도 760 nm)으로 착색한 후, 760 nm에서 분광광도계로 정량화하였다. 철 복합체를 연속적으로 희석하여 760 nm에서 분광광도계로 검량선(calibration curve)을 결정하였다. 결합된 철은 추가된 철에서 잔여 철의 양을 제하여 계산하였다. C 값은 상대적인 용어로 표시되며, 여기서 계산된 LF의 이론적 철 결합 용량 (LF의 각 분자는 2개의 철 원자에 결합할 수 있다)이 100%로 설정된다

C 값의 계산:

M(Fe): 철의 분자량; M(LF): LF의 분자량

c(Fe_시작): 철의 시작 농도; c(Fe_종료): 남은 철의 농도

A 값의 결정:

LF의 A 값을 결정하기 위해, LF는 변성 시약으로 변성되었고 방출된 철은 킬레이트제 (최대 흡광도 760 nm)로 착색되었다. 방출된 철은 760 nm에서 분광광도계로 정량화된다. 철 복합체의 연속 희석이 준비되고 검량선이 760 nm에서 분광광도계로 결정된다. 이미 결합된 철 (A 값)은 상대적인 용어로 표시되며, 여기서 하나의 LF 분자에 결합된 2개의 철 원자는 100%로 정의된다.

A 값의 계산:

M(Fe): 철의 분자량; M(LF): LF의 분자량

파일럿 시스템 모식도

도 3은 LP/LPO 단리 기술의 원리와 1회 크로마토그래피 실행 규모에서 공정의 질량 균형에 대한 근사 값에 대한 흐름도를 도시한다. LF/LPO 단리 전에, 1,100 L의 산성 유청을 기공 직경이 0.8 μm 미만인 세라믹 TFF 필터 시스템을 사용하여 여과하였다. 이이서, 여과된 유청 (1,000 L)은 평형화된 크로마토그래피 컬럼을 통해 펌핑된다. 컬럼-결합된 LF 및 LPO는 그 후 상이한 완충 용액의 조합에 의해 용출된다. 이어서, 용출된 분획을 농축하고, 필요한 경우, 탈염한다. 농축된 단백질을 건조시킨 후, 60 내지 90 g의 건조 LF 생성물을 수득한다. 유청 및 유청 슬러리를 통한 무시할만한 흐름 변화는 별도로 또는 혼합하여 추가로 사용하거나 다운스트림에서 처리할 수 있다.

실시예 1

모놀리식 컬럼 (80 mL CIMmultus^TM SO3; BIA Separations)은 800 mL의 완충 용액 A (소듐 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: 5 내지 50 mM, pH = 4.6)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 여과된 산성 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 펌핑하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 면(outflow side)에서 흘러 통과하는 샘플을 분석하여 확인되었다. 0.24 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 부피는 일반적으로 10 내지 20 L였으며, 이는 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. 이어서, 컬럼을 완충 용액 A로 플러싱하였다. LF 및 LPO의 분리는 선형 pH 구배 모드에서 2개의 완충 용액 (소듐 시트레이트, 포스페이트, TRIS 및 카보네이트 완충액의 혼합물, 4 내지 50 mM, pH= 4.6 및 12.0)을 사용하여 컬럼을 플러싱하여 수행하였다. pH는 4.6에서 12.0까지의 범위에서 서서히 선형적으로 변화하였다. LPO/LF 용출을 위한 pH 범위는 각각 8.9 내지 10 및 11 내지 11.7이었다. 분리 과정의 결과는 크로마토그래피적으로 매우 잘 분리된 LPO 및 LF 용출 분획 2개였으며, 추가적으로 용이하게 분리 처리하였다. 다음 단계에서, 단리된 단백질의 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 중화시키고, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조시켰다. 최종 LF 및 LPO 순도는 각각 > 98% 및 > 70%였다. LF C- 및 A-값은 각각 71% 및 3.4%로 결정되었다.

실시예 2

모놀리식 컬럼 (80 mL CIMmultus^TM SO3; BIA Separations)은 완충 용액 B (소듐 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: 5 내지 50 mM, pH = 5.0 내지 6.5, 스위트 유청의 pH로서)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 스위트 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 흐르도록 하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 면에서 흘러 통과하는 샘플을 분석하여 확인되었다. 0.24 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 부피는 일반적으로 10 내지 40 L였으며, 이는 주로 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. 이어서, 컬럼을 완충 용액 B로 플러싱하였다. LF 및 LPO의 분리는 선형 pH 구배 모드에서 2개의 완충 용액 (소듐 시트레이트, 포스페이트, TRIS 및 카보네이트 완충액의 혼합물, 4 내지 50 mM, pH= 5.0 및 12.0)을 사용하여 컬럼을 플러싱하여 수행하였다. pH는 5.0에서 12.0까지의 범위에서 서서히 선형적으로 변화하였다. LPO/LF 용출을 위한 pH 범위는 각각 8.9 내지 10 및 11 내지 11.7이었다. 상기 언급된 과정의 결과는 크로마토그래피적으로 매우 잘 분리된 LPO 및 LF 분획 2개였으며, 추가적으로 용이하게 분리 처리하였다. 다음 단계에서, 단리된 단백질의 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 중화시키고, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조시켰다. 최종 LF/LPO 순도는 각각 > 98% 또는 > 70%였다. LF C- 및 A-값은 각각 70.2% 및 3.9%로 결정되었다.

실시예 3

모놀리식 컬럼 (8 L CIMmultus^TM SO3 - strong CEX; BIA Separation)은 완충 용액 C (나트륨 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: NaCl을 첨가하여 5 내지 50 mM, pH = 4.6 및 15 mS/cm의 전도도)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 산성 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 흐르하도록 하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 면에서 흘러 통과하는 샘플을 분석하여 확인되었다. 8 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 부피는 일반적으로 1000 내지 2000 L였으며, 이는 주로 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. 이어서, 컬럼을 완충 용액 C로 플러싱하였다. LF 및 LPO의 분리는 선형 pH 구배 모드에서 2개의 완충 용액 (소듐 시트레이트, 포스페이트, TRIS 및 카보네이트 완충액의 혼합물, NaCl을 첨가하여 4 내지 50 mM, pH= 4.6 및 12.0)을 사용하여 컬럼을 플러싱함하여 수행하였다. pH는 4.6에서 12.0까지의 범위에서 점진적으로 선형적으로 변화하였고, 전도도 (15 mS/cm)는 전체 선형 pH 구배를 통해 일정하게 유지되었다. LPO/LF 용출에 대한 pH 범위는 각각 8.2 내지 9.3 및 10.7 내지 11.2였다. 상기 언급된 과정의 결과는 크로마토그래피적으로 매우 잘 분리된 LPO 및 LF 분획 2개였으며, 추가적으로 용이하게 분리 처리하였다. 다음 단계에서, 수집된 단백질의 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 먼저 중화시키고, 탈염하고, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조로 건조시켰다. 최종 LF/LPO 순도는 각각 > 98% 또는 > 75%였다. LF C- 및 A-값은 각각 74.2% 및 2.5%로 결정되었다.

실시예 4

모놀리식 컬럼 (8 L CIMmultus^TM SO3 - strong CEX; BIA Separations)은 완충 용액 C (소듐 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: 5 내지 50 mM, 5.0 내지 6.5, 스위트 유청의 pH로서)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 산성 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 흐르도록 하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 면에서 흘러 통과하는 샘플을 분석하여 확인하였다. 8 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 부피는 일반적으로 1000 내지 2000 L였으며, 이는 주로 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. IEP < 7.5인 단백질은 pH = 7.5인 완충 용액 C를 사용하여 pH 단계 용출 모드로 초기에 용출된 다음, 실시예 2와 동일한 완충액을 사용하여 선형 pH 구배 모드에서 컬럼을 플러싱하여 LF 및 LPO의 분리를 수행하였다. pH는 7.5에서 12.0까지의 범위에서 서서히 선형적으로 변화하였다. LPO/LF 용출을 위한 pH 범위는 각각 8.9 내지 10 및 11 내지 11.7이었다. 별도로 수집된 LPO 및 LF의 용출 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 중화시키고, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조시켰다. 최종 LF/LPO 순도는 각각 > 98% 및 > 75%였다. LF C- 및 A-값은 각각 72.6% 및 2.8%로 결정되었다.

실시예 5

모놀리식 컬럼 (8 L CIMmultus^TM SO3 - strong CEX; BIA Separations)은 완충 용액 C (소듐 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: NaCl을 첨가하여 5 내지 50 mM, pH = 4.6 및 15 mS/cm의 전도도)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 산성 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 흐르도록 하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 면에서 흘러 통과하는 샘플을 분석하여 확인되었다. 8 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 부피는 일반적으로 1000 내지 2000 L였으며, 이는 주로 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. 이어서, 컬럼을 완충 용액 C로 플러싱하였다. IEP < 7.5인 단백질은 pH = 7.5인 완충 용액 C를 사용하여 pH 단계 용출 모드로 초기에 용출된 다음, 실시예 3과 동일한 완충액을 사용하여 선형 pH 구배 모드에서 컬럼을 플러싱하여 LF 및 LPO의 분리를 수행하였다. pH는 7.5에서 12.0까지의 범위에서 서서히 선형적으로 변화하였고, 전도도 (15 mS/cm)는 전체 선형 pH 구배를 통해 일정하게 유지되었다. LPO/LF 용출에 대한 pH 범위는 각각 8.2 내지 9.3 및 10.7 내지 11.2였다. 이어서, 별도로 수집된 LPO 및 LF의 용출 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 중화시키고, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조시켰다. 최종 LF/LPO 순도는 각각 > 98% 및 > 80%였다. LF C- 및 A-값은 각각 71.6% 및 3.2%로 결정되었다.

실시예 6

모놀리식 컬럼 (8 L CIMmultus^TM SO3 - strong CEX; BIA Separations)은 완충 용액 C (소듐 포스페이트 또는 시트레이트 완충액: 5 내지 50 mM, pH = 4.6)를 사용하여 로딩하기 전에 평형화되었다. 평형화 후, 산성 유청을 LF 및 LPO에 대한 컬럼 용량에 도달할 때까지 컬럼을 통해 흐르하도록 하였다. 컬럼 용량의 포화도는 분석 섹션에 설명된 HPLC 방법에 의해 컬럼의 유출 측에서 샘플을 통한 흐름을 분석하여 확인되었다. 8 L/min의 유속으로 컬럼을 통해 펌핑된 유청의 체적은 일반적으로 1000 내지 2000 L였으며, 이는 주로 가공된 유청의 LF/LPO 농도에 주로 의존한다. 이어서, 컬럼을 완충 용액 C로 플러싱하였다. IEP < 7.5인 단백질은 pH = 7.5인 완충 용액 C를 사용하여 pH 단계 용출 모드로 초기에 용출된 다음, LF 및 LPO의 분리는 2개의 완충 용액 (소듐 시트레이트, 포스페이트, TRIS 및 카보네이트 완충액의 혼합물, NaCl을 첨가하여 4 내지 50 mM, pH= 4.6 및 12.0)을 사용하여 컬럼을 플러싱함으로써 수행되었다. pH는 7.0에서 12.0까지의 범위에서 서서히 변화하였고, 전도도의 구배는 4 mS/cm에서 55 mS/cm까지 증가하였다. LPO/LF 용출에 대한 pH 범위는 각각 6.6 내지 7.5 및 9.6 내지 10.7이었다. 이어서, 별도로 수집된 LPO 및 LF의 용출 분획을 소량의 적절한 산 용액을 사용하여 pH = 6으로 중화시키고, 탈염한 후, 기공 크기가 1 내지 50 kDa인 TFF 멤브레인을 사용하여 농축하고, 분무 건조시켰다. 최종 LF/LPO 순도는 각각 > 98% 또는 > 85%였다. LF C- 및 A-값은 각각 71.6% 및 2.0%로 결정되었다.

참조:

Claims (17)

1. 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제 단백질 중 적어도 하나를 함유하는 공급원으로부터 단백질 락토페린 및/또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 분획을 제조하는 방법으로서, 여기서, 상기 공급원은 강한 양이온 교환기 성질을 갖는 모놀리식 컬럼을 사용한 크로마토그래피 분리 공정 수단에 의해 우유, 초유, 산 또는 스위트 유청 (sweet whey)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 분리 공정에서, pH 구배 또는 결합된 pH 및 염 구배 용출은 상기 공급원을 상기 컬럼에 로딩한 후 사용되는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 pH 구배는 약 4.0 내지 약 < pH 8.0의 pH 범위에서 시작하는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 pH 구배는 약 pH 8 내지 pH < 13의 범위에서 종료되는, 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공급원을 상기 컬럼에 로딩하기 전에 공급원을 여과하는, 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약 pH 8 내지 약 pH < 11, 특히 약 pH 8.9 내지 약 pH 10 또는 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.5의 pH 범위에서 약 5 내지 55 mS/cm 범위의 더 높은 전도도에서 용출되는 분획 A가 수집되는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 pH > 10.4 내지 약 12, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7, 또는 약 pH 9.6 내지 약 pH 10.7의 pH 범위에서 약 5 내지 55 mS/cm 범위의 더 높은 전도도에서 용출되는 분획 B가 수집되는, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 크로마토그래피 분리 공정은 다음 단계를 포함하는, 방법:
   (i) 상기 공급원의 pH 값을 pH 7보다 낮은 값, 특히 pH 6.5보다 낮은 값으로 조정하는 단계;
   (ii) 단계 (i)의 공급원을 강한 양이온 교환기 성질을 갖는 모놀리식 컬럼과 접촉시키는 단계;에 이어서
   (iii) 상기 컬럼을 통해 pH 구배 완충액을 흘려보내 pH 값을 증가시키는 단계; 및
   (iv) 약 pH 8 내지 약 pH < 11, 특히 약 pH 8.0 내지 약 pH 10의 pH 범위, 바람직하게는 약 pH 8.2 내지 약 pH 10, 보다 바람직하게는 약 pH 8.9 내지 약 pH 10, 또는 약 pH 6.6 내지 약 pH 7.5의 pH 범위에서 약 5 내지 55 mS/cm 범위의 더 높은 전도도에서 용출되고 일예로 락토퍼옥시다제를 포함하는 분획 A를 수집하는 단계; 및/또는
   (v) 약 pH > 10 내지 약 pH 12.0, 바람직하게는 약 pH > 10.4 내지 약 12, 보다 바람직하게는 약 pH > 11.0 내지 약 pH 12.0, 특히 약 pH > 11 내지 약 11.7, 또는 약 pH 9.6 내지 약 pH 10.7의 pH 범위에서 약 5 내지 55 mS/cm의 더 높은 전도도에서 용출되고 일예로 락토페린을 포함하는 분획 B를 수집하는 단계;
   (vi) 선택적으로, 특히 중화, 농축, 보존 등을 위한 처리에 의해 분획 A 및/또는 B를 추가로 처리하는 단계.
8. 제7항에 있어서, 상기 공급원은 단계 (ii) 전에 여과되거나, 상기 모놀리식 컬럼은 단계 (ii) 전에 약 pH <7, 특히 약 pH < 6.5의 pH 값을 갖는 평형 완충액으로 평형화되는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 강한 양이온 교환기 성질을 갖는 상기 모놀리식 컬럼은 -SO₃H 개질된 모놀리식 컬럼, -COOH 개질된 모놀리식 컬럼, -OSO₃H 개질된 모놀리식 컬럼 또는 -OPO₃H 개질된 모놀리식 컬럼으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염 구배는 염의 농도에 의해 수행되고, 특히 상기 염 구배는 약 5 mS/cm 내지 약 55 mS/cm 범위의 전도도에 해당하는, 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii) 또는 (iv) 전에 상기 컬럼은 제8항의 평형 완충액으로 플러싱되는, 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 락토페린 및 락토퍼옥시다제 함유 분획은 건조, 특히 분무 건조되는, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 락토페린의 순도는 > 90%이고, 락토퍼옥시다제의 순도는 > 50%이고, 특히 상기 락토페린 C 값은 > 50%이고, 상기 락토페린 A 값은 > 1%인, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼은 단계 (iv) 또는 (v) 후에 약 pH > 12의 완충액으로 컬럼을 플러싱함으로써 살균되는, 방법.
15. C 값이 > 60%이고 A 값이 > 1%인 락토페린을 포함하는 물질의 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 C 값은 70% 이상이고, 상기 A 값은 2% 이상인, 물질의 조성물.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 락토페린 또는 락토퍼옥시다제를 포함하는 물질의 조성물.

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