BR112021008814A2 - método para fabricar lactoferrina e lactoperoxidase altamente purificadas a partir de leite, colostro e soro ácido ou doce - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA FABRICAR LACTOFERRINA E LACTOPEROXIDASE ALTAMENTE PURIFICADAS A PARTIR DE LEITE, COLOSTRO E SORO ÁCIDO OU DOCE. Trata-se de um método para fabricar uma fração que compreende as proteínas lactoferrina e/ou lactoperoxidase a partir de uma fonte que contém pelo menos uma dessas proteínas, em que a fonte é selecionada a partir do grupo que consiste em leite, colostro, soro ácido ou doce, por meio de um processo de separação cromatográfico com uma coluna monolítica que tem propriedades de trocador catiônico, em que, no processo de separação, um gradiente de pH ou uma eluição de gradiente de pH e sal combinados é empregado após o carregamento da fonte na coluna. Além disso, é revelada uma composição de matéria que compreende lactoferrina que tem um valor C de > 60% e um valor A de > 1% ou lactoperoxidase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO

PARA FABRICAR LACTOFERRINA E LACTOPEROXIDASE ALTAMENTE PURIFICADAS A PARTIR DE LEITE, COLOSTRO E SORO ÁCIDO OU DOCE”

[001] A presente invenção se refere a um método para fabricar uma fração que compreende as proteínas lactoferrina ou lactoperoxidase a partir de uma fonte que contém pelo menos uma dessas proteínas e as proteínas lactoferrina ou lactoperoxidase altamente purificadas.

Introdução

[002] A lactoferrina (LF) e a lactoperoxidase (LPO) são proteínas menores funcionais presentes no leite, soro e colostro. A LF é uma proteína glicosilada de 80 kDa que pode responder a uma variedade de mudanças fisiológicas e ambientais e é, portanto, considerada um componente principal na primeira linha de defesa do hospedeiro. As características estruturais da LF fornecem funcionalidade além da função de homeostase de Fe3, comum a todas as transferrinas: forte atividade antimicrobiana contra um amplo espectro de bactérias, fungos, leveduras, vírus e parasitas; atividades anti-inflamatórias e anticarcinogênicas; e diversas funções enzimáticas [1]. A LPO exerce uma função vital na proteção da glândula mamária lactante, no trato intestinal de bebês recém-nascidos contra micro-organismos patogênicos e está envolvida na degradação de vários carcinógenos e na proteção de células animais contra efeitos peroxidativos [2].

[003] A LF tem capacidade para ligar ferro. A LF nativa compreende 15 a 20% de holo LF, que contém ferro. A parte restante é apo LF que não contém ferro [32]. Teoricamente, a apo LF tem um nível de saturação de ferro muito baixo (ferro já ligado – valor A). O valor A teórico da apo LF é aproximadamente <3%. Adicionalmente, a apo LF possuiu um alto potencial de ligação de ferro (capacidade de ferro – valor C). O valor C da apo LF é aproximadamente >50%. Apo LF de alta pureza e não desnaturada pode ter valores C ainda maiores de >70%. Por outro lado, a holo LF possuiu um alto valor A (>50%) e um baixo valor C (<10%). Quanto maior for o valor C da LF isolada, maior será o potencial de ligação de ferro da LF. Um potencial maior de ligação de ferro causa um nível mais alto de atividade antimicrobiana, devido ao fato de que a LF ativa remove o ferro necessário para crescimento microbiano.

[004] Atualmente, a LF e LPO são isoladas de subprotudos do leite e de processamento de leite (por exemplo, soro) por meio de muitas técnicas diferente como: (I) isolamento por partículas paramagnéticas com poli(glicidil-metacrilato) com ligante de heparina [3], (II) com o uso de tensoativo catiônico (por exemplo, brometo de etildimetilamônio) [4], (III) diferentes técnicas de cromatografia (por exemplo, troca de cátion ou cromatografia por afinidade) [1,2,5-10] e (IV) outras técnicas (por exemplo, líquidos iônicos hidrofóbicos [11]). De modo geral, as técnicas cromatográficas, cuja maior parte é a cromatografia de troca iônica, representam uma maneira de como separar a LF rapidamente a custos relativamente baixos

[12]. A abordagem cromatográfica também prevalece sobre outras devido a sua robustez e repetibilidade. A técnica mais comum na purificação cromatográfica de LF e LPO é usar fortes partículas e membranas de resina de troca catiônica ou colunas monolíticas [13-15].

[005] A presente cromatografia apresenta algumas desvantagens: (I) alargamento do pico com crescente velocidade de fluxo devido à transferência de massa por difusão nos poros, então, quando a velocidade de fluxo aumenta, o coeficiente angular do gradiente precisa se tornar mais inclinado a fim de obter a mesma resolução, (II) o fluxo aumentado diminui o tempo da etapa cromatográfica, porém ao mesmo tempo aumenta o volume de eluição e (III) o comprimento da coluna resulta em alta queda de pressão na coluna, o que é um fator limitativo para velocidade de fluxo.

[006] Na etapa de purificação cromatográfica, a LF e a LPO presentes no leite ou no soro estão sob determinadas condições ligadas à superfície de um trocador catiônico forte e após isso são coletadas em uma fração de eluição com o uso de tampões com concentrações mais altas de pH ou de sal. A fim de simplificar o processo de separação, na maioria das vezes, a LF e a LPO são eluídas com o uso de diversas soluções-tampão ou com alta força iônica ou pH>9 em um modo de gradação. Tal abordagem resulta frequentemente em pureza relativamente alta (60 – 95%) da fração da proteína desejada em uma etapa cromatográfica. Para dessalinizar, concentrar e aumentar a pureza, um processo de ultrafiltração é muitas vezes introduzido para eliminar a leve quantidade de impurezas de baixo peso molecular. Em seguida, o concentrado de proteínas obtido é normalmente seco por liofilização ou secagem por aspersão. Wang et al. [18] mostraram que a LF liofilizada contém menos água (aproximadamente 2 a 3%) que a LF seca por aspersão (aproximadamente 5%), ao passo que, em contrapartida, a LF seca por aspersão mostrou um grau de desnaturação levemente inferior e atividade antioxidante 6 a 7% maior, que esteve próximo à da LF de líquido fresco. A secagem por aspersão [1], é confiadamente usada para produzir pós amorfos de LF com configuração molecular intacta e altas capacidades antioxidantes.

[007] O documento n° EP 0418704 A1 [19] descreve processos de separação, purificação e recuperação de proteínas lácteas com capacidade de ligação de ferro com o uso de colunas de cromatografia de troca iônica que contêm partículas de resina com grupos sulfônicos de superfície. A LF é isolada pelo modo de eluição de gradação de pH/condutividade, e pureza do produto final é declarada como >90%. Além disso, é necessário um processo de ultrafiltração para eliminar a menor quantidade de impurezas de baixo peso molecular, fazendo com que, ao final, a LPO e a LF tenham pureza a 90% ou mais.

[008] O processo descrito no documento n° EP 1466923 A1 [20] inclui uma etapa cromatográfica com resina de troca catiônica de ácido forte (partículas), em que a pureza da LF isolada está em uma faixa entre 79 e 91%.

[009] O documento n° WO 2006/119644 A1 [21] descreve um método para purificar LF, estabilizando-a na solução a aprimorando sua atividade. O processo destina-se à purificação adicional de uma LF já isolada com pureza inferior. A purificação é conduzida com o uso de um absorvedor hidrofóbico (partículas) na presença de uma solução ácida aquosa que contém uma concentração de um soluto excluído carregado. A pureza final obtida da LF foi >95%.

[0010] O documento n° US 5.861.491 A [13] revela métodos para isolar LF humana, incluindo LF humana produzida por expressão de um transgene que codifica LF humana recombinante (rhLF), assim como outras espécies de LF relacionadas, do leite, tipicamente de leite bovino. De modo geral, leite ou uma fração do leite que contenha hLFis em contato com uma resina de forte troca catiônica na presença de uma força iônica relativamente alta para prevenir ligação de proteínas não LF e outras de substâncias à resina de forte troca catiônica. Após isso, as partículas da resina são separadas do leite por centrifugação, em seguida, a LF ligada à resina de troca catiônica é eluída com o uso de poucas soluções- tampão com uma concentração de sal diferente em um modo de gradação. A pureza das frações superiores da hLF e da bLF excede aproximadamente 95%.

[0011] O documento n° EP 0348508 B1 [22] revela o isolamento de LF de leite bruto com o uso de uma resina de polissacarídeo reticulado sulfonado (partículas).

[0012] A LF absorvida na coluna é eluída em modo de gradação com o uso de um tampão com concentração aumentada de NaCl. A pureza da LF bovina foi medida a 95%, ao passo que a LF obtida de colostro humano desengordurado teve pureza a 98%.

[0013] O método descrito no documento n° US 6.096.870 A [23] se refere à separação de proteínas de soro (imunoglobulina, β-lactoglobulina, α-lactalbumina, albumina sérica bovina, LF), particularmente, a separação sequencial de proteínas de soro em frações separadas com o uso de uma coluna cromatográfica pré-empacotada com partículas de resina de forte troca catiônica. A eluição sequencial de frações de proteína mencionadas é obtida com tampões a um pH e força iônica adequados em modo escalonado. A pureza dos produtos finais secos por aspersão foi: imunoglobulinas

≧80%, BSA e LF ≧75% e β-lactoglobulina ≧85%.

[0014] O documento n° U.S. 8.603.560 B2 [24] descreve um processo para isolar proteínas lácteas do leite ou do soro com o uso de uma resina de troca catiônica empacotada em uma coluna. A eluição é promovida por uma mudança escalonada do pH ou da força iônica. A pureza final da LF foi 80%.

[0015] O documento n° CA 2128111 C [25] descreve o processo para isolar LF e LPO do leite e de produtos lácteos em uma escala industrial. O isolamento é feito com um trocador catiônico que absorve as ditas proteínas e eluindo- se essas proteínas separada ou simultaneamente, por eluição de gradação com uma ou mais soluções salinas. Não há dados sobre a pureza final das proteínas isoladas.

[0016] O documento n° EP 0253395 B9 [26] revela um processo para isolar a LF bovina do leite em alta pureza com o uso de resina de troca catiônica com baixo teor ácido. A LF é recuperada do trocador iônico por eluição escalonada com soluções de cloreto de sódio que têm diferentes concentrações. De acordo com o antigo método de Laurell, a pureza de LF produzida é medida como 90 a 99%.

[0017] O documento n° U.S. 5.596.082 A [27] revela um processo para isolar a LF e a enzima LPO do leite e de produtos lácteos em uma escala industrial. O processo incluir as etapas de adsorver essas proteínas a um trocador catiônico passando-se o leite ou derivados lácteos sobre no trocador catiônico. A eluição das proteínas mencionadas é promovida por eluição de gradação com o uso de diferentes concentrações de sal. A pureza final da LPO e da LF foi de até 93% e 94%, respectivamente.

[0018] A invenção revelada no documento n° U.S.

9.115.211 B2 [28] descreve um isolamento de LF com o uso de uma resina de troca catiônica. A LF obtida pelo método descrito tem pureza superior a 95%, é substancialmente livre de LPS, de endotoxinas e de angiogenina com um nível de saturação de ferro compreendido entre 9% a 15%.

[0019] O documento n° EP2421894A1 [29] descreve um método para preparar LF com baixo teor de ferro com menos que 10% de saturação de ferro ou, com mais preferência, aproximadamente 9% a 3,89% de saturação de ferro. Essa LF com baixo teor de ferro produzida pelo processo mostra uma atividade antimicrobiana aumentada em comparação à LF padrão. Esse processo usa ácido e solvente. Após o Fe3+ ser liberado, os auxiliares do processo foram removidos por processo de UF e DF. O produto resultante é uma cor bege clara creme/pálida com 3,89% a 5,1 % de saturação de ferro (por fluorescência de HPLC/raio X (XRF)).

[0020] O documento n° WO2014/207678 A1 [30] revela um método para purificar LF de um fluido de secreção, sendo que o método compreende alcalizar o fluido de secreção, colocar o fluido de secreção alcalizado com ar e precipitar LF do fluido de secreção alcalizado com o uso de um solvente orgânico (acetona).

[0021] O documento n° WO1995/022258 A2 [31] revela métodos para purificação de LF humana do leite, especialmente de espécies não humanas, e para separação de LF humana de espécies macromoleculares indesejadas presentes no leite, incluindo separação de espécies de LF não humanas. A fim de realizar o isolamento, a resina de forte troca catiônica (por exemplo, S Sepharose™) é usada. As proteínas (LF e outras) foram eluídas com um sal e gradiente de pH escalonados.

[0022] G. Majka et al. (2013) A high-throughput method for the quantification of iron saturation in lactoferrin preparations, Anal. Bioanal. Chem., 405, 5.191 a 5.200 revelam um método para obter lactoferrina bovina com baixo teor de ferro. A realização da cromatografia de troca iônica não foi suficiente para obter lactoferrina com baixo teor de ferro. Portanto, a cromatografia de troca iônica foi combinada com diálise extensiva contra tampão de citrato a 100 mM durante 24 horas.

Sumário da Invenção

[0023] Um objetivo da presente invenção é fornecer uma composição de matéria de lactoferrina altamente ativa com alta pureza.

[0024] Outro objetivo da invenção é fornecer um método apropriado para superar pelo menos algumas das desvantagens da técnica anterior.

[0025] A lactoferrina altamente ativa é caracterizada por seu nível muito baixo de saturação de ferro (ferro já ligado – valor A) e seu alto potencial para ligação de ferro (capacidade de ligação de ferro – valor C).

[0026] Outro objetivo da invenção é fornecer uma composição de matéria que compreende lactoperoxidase em alta pureza.

[0027] Ainda outro objetivo da invenção é fornecer um método para fabricar lactoferrina ou lactoperoxidase em alta pureza a partir dessas fontes que contêm proteínas.

[0028] Esses objetivos são alcançados por um método para fabricar a fração que compreende as proteínas lactoferrina ou lactoperoxidase a partir de uma fonte que contém pelo menos uma dessas proteínas, em que a fonte é selecionada a partir do grupo que consiste em leite, colostro, soro ácido ou doce, por meio de um processo de separação cromatográfico com uma coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico, em que no processo de separação uma eluição de gradiente de pH ou uma eluição de gradiente de pH e sal combinados é empregada após carregamento da fonte na coluna.

[0029] Em uma modalidade da invenção, o gradiente de pH começa tipicamente uma faixa de pH de 4,0 a < pH 8,0, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5, com mais preferência, em uma faixa de pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente < pH 7, em particular, em uma faixa de pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente < pH 6,5.

[0030] Em outra modalidade da invenção, o gradiente de pH termina tipicamente em uma faixa de aproximadamente pH 8 a pH <13, de preferência, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH 12, em particular, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH <12.

[0031] Pode ser vantajoso filtrar a fonte antes de carregar a fonte na coluna.

[0032] Ainda em outra modalidade da invenção, o gradiente de sal é realizado aumentando-se a concentração de sal, em particular, o gradiente de sal corresponde a uma condutividade em uma faixa de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 55 mS/cm. É recomendável usar sais neutros para ajustar a concentração de sal a fim de evitar interferência com o pH da solução-tampão. Em particular, são úteis os sais que são empregados nos processos das industriais alimentícias, tipicamente, cloreto de sódio.

[0033] O gradiente de pH usado em combinação com o gradiente de sal mencionado anteriormente começa com o valor A do pH tipicamente em uma faixa de pH de 4,0 a < pH 8,0, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5, com mais preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a < pH 7, em particular, em uma faixa de pH de 4,5 a < pH 6,5. O gradiente de pH usado em combinação com o gradiente de sal termina tipicamente uma faixa de pH 8 a pH <13, de preferência, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH 12, em particular, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH <12.

[0034] Ainda em outra modalidade da invenção, pode ser coletada uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, de preferência, a uma faixa de pH de 8,0 a pH 10,0, com mais preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,2 a pH 10,0, em particular, aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10. Essa fração contém tipicamente lactoperoxidase.

[0035] Ainda em outra modalidade da invenção, pode ser coletada uma fração B que elui a uma faixa de pH de >10 a pH 12,0, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH >10,4 a pH 12, de preferência, aproximadamente pH ˃11 a aproximadamente 12, em particular aproximadamente pH >11 a aproximadamente 11,7. Essa fração contém tipicamente lactoferrina.

[0036] Em uma modalidade particularmente útil do método da invenção, o processo de separação cromatográfico compreende a etapa de (i) Ajustar o valor do pH da fonte para um valor inferior a pH 7, em particular, inferior a pH 6,5; (ii) Colocar a fonte da etapa (i) em contato com uma coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico; seguido por (iii) Submeter a fluxo um tampão de gradiente através da coluna, desse modo, aumentando o valor do pH; e (iv) Coletar uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,0 a pH 10,0, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,2 a pH 10,0, em particular, aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10; e/ou (v) Coletar uma fração B que elui a uma faixa de pH de >10 a pH 12,0, de preferência, aproximadamente pH ˃10,4 a aproximadamente 12, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH ˃11,0 a 12,0, em particular, aproximadamente pH >11 a aproximadamente 11,7; (vi) Opcionalmente, processar, também, as frações A e/ou B, em particular, por meio do tratamento por neutralização, concentração, preservação e semelhantes.

[0037] Pode ser útil filtrar a fonte que contém a lactoferrina e/ou lactoperoxidase antes da etapa (ii).

[0038] Em outra modalidade do método da invenção, a coluna monolítica pode ser equilibrada antes da etapa (ii) com um tampão de equilíbrio que tem valor A do pH de aproximadamente pH < 7, em particular aproximadamente pH <

6.

[0039] A coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico, em particular, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma coluna monolítica modificada por SO3H, coluna monolítica modificada por -COOH, coluna monolítica modificada por -OSO3H ou coluna monolítica modificada por -OPO3H. No contexto da invenção a coluna monolítica modificada por SO3H, -COOH, -OSO3H ou -OPO3H também abrange os sais correspondentes das porções químicas ácidas, em particular, seus sais álcali, tais como sódio, sais de potássio, por exemplo, SO3Na, -COONa, -OSO3Na, ou -OPO3Na ou SO3K, -COOK, -OSO3K ou -OPO3K.

[0040] De acordo com o método da invenção, a fração A, que elui a um valor do pH inferior à fração B, contém tipicamente lactoperoxidase ao passo que a fração B contém tipicamente lactoferrina.

[0041] Em uma modalidade adicional da invenção, a coluna pode ser lavada com o tampão de equilíbrio antes da etapa (iii) ou (iv).

[0042] Tipicamente, as frações que contêm lactoferrina e lactoperoxidase podem ser processadas adicionalmente, por exemplo, secas, em particular, por secagem por aspersão.

[0043] O método da invenção produz lactoferrina ou lactoperoxidase de alta pureza. A pureza da lactoferrina é

˃98%, e a pureza de lactoperoxidase é ˃78%. Além disso, o valor C de lactoferrina é ˃ 50% ou ˃ 60%, e o valor A de lactoferrina é ˃ 1%. De preferência, o valor C da lactoferrina é ˃ 70%, e o valor A da lactoferrina é ˃ 2%. De preferência, o valor C de lactoferrina é ≥ 70,0%, de preferência, entre 70,0% e 80,0%, com mais preferência, entre 70,0% e 77,0%. De preferência, o valor A de lactoferrina é ≥ 2,0%, de preferência, <3,9%, de preferência, entre 1,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 5,0%, com mais preferência, entre 2% e 4%.

[0044] De acordo com outra modalidade da invenção, a coluna monolítica pode ser sanificada lavando-se com um tampão de aproximadamente pH >12, tipicamente após uma etapa (iv) ou (v).

[0045] A matéria da invenção também é uma composição de matéria que compreende lactoferrina ou lactoperoxidase obteníveis pelo método de acordo com a invenção. O valor C de lactoferrina é ˃ 60%, e o valor A é ˃ 1%. De preferência, o valor C de lactoferrina é ˃ 70% e valor A de ˃ 2%. De preferência, o valor C de lactoferrina é ≥ 70,0%, de preferência, entre 70,0% e 80,0%, com mais preferência, entre 70,0% e 77,0%.

[0046] De preferência, o valor A de lactoferrina está entre 1,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 5,0%, com mais preferência, entre

2% e 4%, de preferência, está ≥ 2,0% e/ou de preferência, <3,9%.

[0047] De preferência, o valor A+C do produto da presente invenção é pelo menos 61% ou pelo menos 72% ou pelo menos 73%.

[0048] O método da invenção fornece - um método rápido e simples para isolamento de LF e LPO de leite, colostro e soro ácido ou doce, - um processo de isolamento de etapa cromatográfica única com o uso de gradiente linear pH para isolamento de LF e LPO, que resulta em proteínas-alvo altamente putas (por exemplo, LF pureza >98%), - um produto (proteína LF) obtido pelo método revelado que é, de acordo com um método bem estabelecido para medir Capacidade de Ligação de Ferro não Saturado (UIBC), altamente ativo (valor C >70%, kit de determinação de valor C para LF, NRL Pharma) e contém baixa quantidade de ferro já ligado (valor A <3,9%, kit de determinação de valor A para LF, NRL Pharma), que são características principais do LF disponíveis no mercado. O produto é produzido por um método muito dispendioso e que exige muitos procedimentos sem usar produtos químicos especiais e é conduzido no sítio (no trocador catiônico monolítico), - um método, que possibilita a produção de LF que contém baixa quantidade de ferro (valor A <3,9%) e é ao mesmo tempo livre de angiogenina, - um método, que possibilita produzir LF com alta bioatividade total (valor C + valor A> 72%), - um método que pode ser facilmente aumentado para uma escala de produção e que permite a produção econômica de LF e LPO altamente pura e bioativa, - um processo inteiro de isolamento de LF/LPO que compreende processo de cromatografia, concentração/dessalinização e de secagem que fornece recuperação geral de LF >85%, - um processo cromatográfico que permite altas taxas de fluxo de fase móvel (700 l/m2/h) sem impedir alta resolução de proteínas que resulta em processo de alta produtividade, - um processo que não introduz produtos químicos no meio com proteínas destinadas para isolamento (por exemplo, soro) ou, de outro modo, muda suas características; isso permite uso adicional dos meios em outros processos industriais bioquímicos, - um método que possibilita a produção de LF com compartilhamento pré-definido de Fe já ligado.

Breve Descrição das Figuras

[0049] Figura 1. Cromatográfico do pico de eluição de LF, composto dos subpicos de eluição de LF. O fenômeno é uma consequência de pequenas diferenças no ponto isoelétrico de LF (IEP) devido ao seu teor de ferro. Voswinkel et al. [32]

mostraram que a diminuição no teor de ferro diminui consequentemente a IEP da LF a um pequeno grau.

[0050] Figura 2. Cromatográficos de (A) soro ácido e (B) produtos de LF comerciais e LF.

[0051] Figura 3. Esquema do isolamento de LF do soro ácido com o uso de uma coluna monolítica de 8 l, CIMmultus™ SO3; BIA Separtions e informações básicas sobre o equilíbrio de massa do processo.

Descrição Detalhada da Invenção

[0052] Colunas monolíticas com fortes grupos de trocador catiônico CIMmultus™ SO3 - fortes CEX da BIA Separations foram testados em diferentes modos de eluição para isolar a LF e LPO do soro ou leite filtrados separadamente. O carregamento da LF/LPO foi realizado em um pH natural do soro, ao passo que as duas proteínas-alvo foram eluídas separadamente por (I) aumento escalonado do pH, (II) etapas de condutividade, (III) gradiente de condutividade linear e (IV) gradiente de pH linear.

[0053] No caso de modos de eluição em etapa, realizados a título de comparação, a pureza de LF obtida foi aproximadamente 95%, ao passo que no de gradiente de condutividade, a pureza obtida foi levemente maior que 95%.

De modo surpreendentemente, constatou-se que, de acordo com a invenção uma eluição com um gradiente de pH crescente, em particular com um gradiente de pH crescente linear, a pureza de proteína obtida estava acima de 98%. A pureza foi comprovada por HPLC, análise de página de SDS, Bioanalyzer e cromatografia SEC. O método da invenção fornece esses resultados por uma etapa cromatográfica única e em uma escala de produção. De todo modo, de acordo com método de Laurell

[26] usado para cálculo de pureza no documento n° EP 0253395, a pureza calculada para o produto da invenção que é obtenível pelo método da invenção é >118%. Aparentemente, o método estabelecido está desatualizado e não é mais adequado para a determinação corretar da pureza de LF.

[0054] No caso de eluição de gradiente de pH linear, verificou-se que a eluição de LF foi composto de diversos subpicos menores (Figura 1). O último sugere que a LF também foi separada no nível de teor de ferro de proteína, do mais baixo para o mais alto. A razão para isso já foi discutida e comprovada por outros [32].

[0055] A dispersão de água de LF concentrada foi seca por secagem por aspersão ou por um liofilizador, e a capacidade de ligação de ferro não saturada (UIBC) para a LF foi, então, medida. De acordo com kit de ensaio calorimétrico de ferro fornecido pela NRL Pharma Inc. Japão (o princípio detalhado foi publicado por Ito et al. [33]), a LF obtida pelo método da invenção teve um nível de saturação de ferro (ferro já ligado – valor A) entre 2% e 4,9%. Seu potencial para ligação de ferro (capacidade de ligação de ferro – valor

C), também denominada de capacidade de ligação de ferro não saturada (UIBC), estava acima de 70%. O resultado está classificado no topo em comparação aos produtos presentes no mercado, cujos valores A e C estão classificados entre 4,6 e 11,7% e 34,4 e 52,1%, respectivamente (consultar a Tabela 1). Ao mesmo tempo, seu bioatividade total (valor C + valor A) é normalmente inferior em comparação o produto da invenção.

Tabela 1: Bioatividade de Amostras de LF Comercialmente Disponíveis e LF da Invenção (Arhel d.o.o.) Amostras de Valor C [%] Valor A [%] (A+C)* [%]

LF Lactoferrin 34,4 4,6 39,0 a da Supps Planet Life 48,6**(31,1 - 11,7** (7,5 – 60,3 Extension vz.) vz.) (tampas de lactoferrin a - Bioferrina; 95% de Apolactofer rina) Ingredia 52,1 7,7 59,8 Nutritional (Lactoferri na pró- dieta, >95%) NRL Pharma 49,2 9,0 58,2 LF da 70,0 a 74,0 2,0 a 4,9 74,9 (média) invenção * A bioatividade total (A+C) é expressa somando-se os valores C e A, o que fornece a porcentagem da proteína ativa na amostra.

** O valor é recalculado de acordo com a quantidade de LF pura na amostra, que é 64%.

[0056] O método da invenção fornece um método para fabricar uma fração que compreende as proteínas lactoferrina ou lactoperoxidase de uma fonte que contém pelo menos uma dentre as proteínas, em que a fonte é selecionada a partir do grupo que consiste em leite, colostro, soro ácido ou doce, por meio de um processo de separação cromatográfico com uma coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico, em particular, uma coluna monolítica modificada por -SO3H em que, no processo de separação, uma eluição de gradiente de pH é empregada após carregar a fonte na coluna.

[0057] Uma coluna monolítica é comumente um equipamento de separação cromatográfico que compreende um corpo oco no qual é contido um material sólido poroso que é um polimerizado de monômeros. Os poros do material são formados, por exemplo, durante o processo de polimerização (U.S.

4.923.610. U.S. 4.952.344. U.S. 4.889.623).

[0058] Os dispositivos adequados são descritos na técnica anterior, por exemplo, nos documentos n° EP 1058844, EP 777725 e estão comercialmente disponíveis. O material de cromatografia monolítico usado no presente documento é modificado com porções químicas de -SO3H que são expostos,

entre outros, nas superfícies do material poroso. A modificação de superfície com grupos -SO3H fornece ao material as então chamadas propriedades de forte troca catiônica (CAX). O especialista no assunto sabe que outros materiais, por exemplo, classificados como trocador catiônico forte. Em contrapartida a isso, para outros propósitos, o trocador de ânion (AEX) pode ser usado.

[0059] Uma cromatografia de gradiente de pH é conduzida aumentando-se o pH de um valor inicial até um ponto final.

Pode ser projetada em um formato quase linear, porém também é possível um curso diferente, desde que seja obtido o resultado da invenção, isto é, os produtos lactoferrina e/ou lactoperoxidase, da invenção. Os especialistas no assunto sabem como realizar a cromatografia gradiente como tal. Uma otimização das condições da cromatografia de gradiente catiônico – com base na revelação explicita e implícita da invenção - está dentro da rotina da pessoa versada na técnica e não está relacionada com a carga indevida de experimentação.

[0060] A fim de estabelecer condições para um processamento reproduzível, pode ser vantajoso equilibrar a coluna monolítica antes da real separação pelo gradiente de pH. Nesse caso, a coluna é lavada com um tampão de equilíbrio. Tipicamente, a coluna é lavada com um volume do tampão de equilíbrio equivalente a 8 a 12x volumes mortes da coluna. A seleção do valor inicial do pH da cromatografia é, até certo ponto, influenciada pelo valor do pH da fonte que contém LF e/ou LPO. Por exemplo, caso o soro ácido seja a fonte para LF e/ou LPO, o valor do pH para equilíbrio pode ser o pH 4,6, ao passo que, caso soro doce seja usado, o valor do pH pode ser mais alto, isto é, pH 5,0 a pH 6,5.

[0061] Pode ser vantajoso filtrar a fonte antes de carregar a fonte na coluna. De modo geral, os meios de filtro usados na indústria de laticínios podem ser empregados.

Particularmente úteis são filtros de TFF cerâmicos, membranas enroladas em espiral ou outras tecnologias de filtração contínuas.

[0062] Após o carregamento da fonte na coluna monolítica, a princípio, a cromatografia de gradiente de pH pode ser iniciada. No entanto, pode ser útil que antes de começar a cromatografia de gradiente de pH, uma lavagem adicional da coluna com valor A do pH próximo das condições de equilíbrio possa ser empregada para remover impurezas.

Isso sustenta a separação das proteínas a serem fabricadas, devido fato de que as proteínas ou outros contaminantes que eluem nesse valor do pH não poluem a separação da LF e/ou LPO.

[0063] O gradiente de pH começa com o valor A do pH tipicamente em uma faixa de pH de 4,0 a < pH 8,0, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5, de preferência,

em uma faixa de pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente < pH 7, em particular, em uma faixa de pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente < pH 6,5. O gradiente de pH termina tipicamente em uma faixa de aproximadamente pH 8 a pH <13, de preferência, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH 12, em particular, pH 8 a pH <12. A Figura 1 retrata um curso típico de uma cromatografia de gradiente de pH.

[0064] Deve-se verificar, também, que a força iônica do tampão de eluição pode ter alguma influência na separação.

A força iônica também pode seguir um gradiente crescente durante a separação cromatográfica que se sobrepõe ao gradiente de pH necessário. O gradiente de pH necessário para uso em combinação com o gradiente de sal mencionado antes se inicia com o valor A do pH tipicamente em uma faixa de pH de 4,0 a < pH 8,0, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a 7,5, de preferência, em uma faixa de pH de 4,0 a < pH 7, em particular, em uma faixa de pH de 4,5 a < pH 6,5.

O gradiente de pH usado em combinação com o gradiente de sal termina tipicamente uma faixa de pH 8 a pH <13, de preferência, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH 12, em particular, em uma faixa de pH que começa em pH 8 a pH <12.

[0065] Por exemplo, a LPO é eluída a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH < 11, caso a força iônica seja equivalente a uma condutividade de aproximadamente 15 mS/cm, porém em um pH inferior na faixa de aproximadamente pH 6,6 a aproximadamente pH 7,5, caso a condutividade aumente de 4 a 55 mS/cm, de preferência, de 5 a 55 mS/cm. A eluição da LF segue um regime semelhante. Caso a condutividade seja intermediária, porém permaneça constante, a LF é eluída em uma faixa de aproximadamente pH 10,7 a aproximadamente pH 11,7, caso a condutividade aumente de 4 para 55 mS/cm, de preferência, de 5 para 55 mS/cm, a LF é eluída em um pH inferior na faixa de aproximadamente pH 9,6 a aproximadamente pH 10,7. A força iônica, isto é, a condutividade pode ser ajustada adicionando-se sais adequados. Com o uso de sais adequados, o valor do pH do tampão de eluição também pode ser ajustado.

[0066] Uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, de preferência, a uma faixa de pH de pH 8,0 a pH 10,0, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,2 a pH 10,0, em particular, aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10, ou aproximadamente pH 6,6 a aproximadamente pH 7,5 em uma condutividade mais alta de aproximadamente 5 a 55 mS/cm é coletada. Essa fração contém tipicamente lactoperoxidase. Uma fração B que elui a uma faixa de pH de >10 a pH 12,0, de preferência, a uma faixa de pH de pH >10,4 a pH 12, de preferência, aproximadamente pH ˃11 a aproximadamente 12, em particular, aproximadamente pH

>11 a aproximadamente 11,7, ou aproximadamente pH 9,6 a aproximadamente pH 10,7 (condutividade mais alta, aproximadamente 5 a 55 mS/cm) é coletado. Essa fração contém tipicamente lactoferrina.

[0067] A seguir, será descrito um desempenho típico do método da invenção. As faixas de pH nas quais LF e LPO estão eluindo correspondem a uma condutividade intermediária de aproximadamente 15 mS/cm. O processo de separação cromatográfico compreende as etapas de (i) Ajustar o valor do pH da fonte para um valor inferior a pH 7, em particular, inferior a pH 6,5; (ii) Colocar a fonte da etapa (i) em contato com uma coluna monolítica que tem propriedades catiônicas fortes, em particular, uma coluna monolítica modificada por -SO3; seguida por (iii) Submeter a fluxo um tampão de gradiente através da coluna, desse modo, aumentando o valor do pH; e (iv) Coletar uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,0 a pH 10,0, de preferência, a uma faixa de pH que começa em pH 8,2 a pH 10,0, em particular, aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10; e/ou (v) Coletar uma fração B que elui uma faixa de pH de >10 a pH 12,0, de preferência, aproximadamente pH ˃10,4 a aproximadamente 12, de preferência, a uma faixa de pH de >11 a pH 12, em particular aproximadamente pH >11 a aproximadamente 11,7; (vi) Opcionalmente, processar, também, as frações A e/ou B, em particular, por meio do tratamento por neutralização, concentração, preservação e semelhantes.

[0068] A fim de remover material indesejado, a fonte que contém a lactoferrina e/ou lactoperoxidase é filtrada antes da etapa (ii) através de um filtro cerâmico.

[0069] A coluna monolítica é equilibrada antes da etapa (ii) com um tampão de equilíbrio que tem valor A do pH de aproximadamente pH < 7, em particular aproximadamente pH <

6. A coluna é lavada com o tampão de equilíbrio antes da etapa (iii) ou (iv).

[0070] Após coletar as frações que contêm lactoferrina e lactoperoxidase, estas são processadas adicionalmente por secagem por aspersão.

[0071] A lactoferrina ou lactoperoxidase obtidas têm alta pureza. A pureza da lactoferrina é ˃98%, e a pureza de lactoperoxidase é ˃78%. Além disso, o valor C de lactoferrina é ≥ 60% e o valor A de lactoferrina é ≥ 1%. De preferência, o valor C da lactoferrina é ˃ 70%, e o valor A da lactoferrina é ˃ 2%. De preferência, o valor C de lactoferrina é ≥ 70,0%, de preferência, entre 70,0% e 80,0%, com mais preferência, entre 70,0% e 77,0%. De preferência, o valor A de lactoferrina está, de preferência, entre 1,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 7,0%, de preferência, entre 2,0% e 5,0%, com mais preferência, entre 2% e 4%, de preferência, ≥ 2,0% e/ou de preferência, <3,9%.

[0072] De acordo com outra modalidade da invenção, a coluna monolítica pode ser sanificada lavando-se com um tampão de aproximadamente pH >13, tipicamente após a etapa (iv) ou (v).

[0073] Uma etapa de sanificação é realizada lavando-se a coluna com água deionizada (10 a 15 Cvs), NaOH 1 M (4 a 10 CVs) com tempo de contato de 1 a 3 h e novamente por lavagem com água (>30 CVs). Essa etapa pode ser executada a cada 8 a 10 execuções de cromatografia.

[0074] A exclusividade dessa abordagem inovadora, de acordo com o método da invenção, também está nos fatos de que (I) não precisa de qualquer modificação química da fonte (por exemplo, soro) da qual a proteína é isolada, porém apenas pré-filtração com o uso de técnicas de filtração padrão, (II) em contrapartida a outros processos (por exemplo, EP2421894 A1 [29]) usa químicos não dispendioso (tampões) em baixas quantidades (III) fornece frações separadas altamente puras de LPO e LF, (IV) possibilita a produção de LF com compartilhamento predefinido de Fe já ligado e (V) resulta na recuperação de alta proteína, que é superior a 85%, incluindo dessalinização/concentração da dispersão de eluição de proteína e etapas de produção de secagem.

[0075] Todas as referências citadas no presente documento são incorporadas a título de referência desde que a incorporação não seja inconsistente com os ensinamentos expressos no presente documento.

[0076] A invenção é explicada adicionalmente e ilustrada nos exemplos não limitativos a seguir.

Exemplos: Análise: Análise de HPLC:

[0077] A fim de determinar a LF e LPO nas amostras, foi empregado um sistema cromatográfico equipado com detector de múltiplos comprimentos de onda MWD e monitor de condutividade com kit de medição de pH (PATfix™, BIA Separations d.o.o., Ajdovscina, Slovenia). As separações cromatográficas foram executadas em uma coluna analítica CIMac™ SO3-0.1 (Poros 1,3 µm, BIA Separations d.o.o., Ajdovscina, Slovenia) com o uso de duas soluções-tampão monobásicas de fosfato de sódio (25 mM, pH=7,5) no modo de gradiente de condutividade que aumentou de 3,5 para 152 mS/cm. A eluição de proteínas analisada foi monitorada por detector MWD a 226 nm. As informações detalhadas sobre o método cromatográfico são apresentadas na Tabela 2, embora os cromatogramas de algumas amostras analisadas sejam mostrados nas Figuras 1 e 2. Todas as amostras foram anteriores à análise, filtradas por filtros de ésteres misturados com celulose CHROMAFIL® A-45/25, 0,45 μm.

Tabela 2. Sistema Cromatográfico e Método usado para Análise de Amostra.

Sistema Cromatográfico: Sistema de HPLC PATfixTM Coluna Cromatográfica: CIMacTM SO3, 100 µl (BIA Separations d.o.o., Ajdovscina, Slovenia) Volume de Injeção: 15 μl Detecção: 226 nm Tempo A (%) B (%) Fluxo (ml/min) (min) (c(NaH2PO4x2H2O)=2 (c(NaH2PO4x2H2O 5 mM, pH=7,5) )=25 mM, c(NaCl)=2M, pH=7,5) 0 100 0 2,6 0,2 100 0 2,6 1,24 0 100 2,6 1,85 0 100 2,6 1,87 100 0 2,6 3,0 100 0 2,6 Determinação dos Valores C e A:

[0078] A fim de determinar os valores C e A das amostras secas de LF, foi usado o kit de ensaio calorimétrico de ferro fornecido pela NRL Pharma Inc., Japão (o princípio detalhado foi publicado por Ito et al. [33]), ao passo que para determinar o valor A para amostras secas e líquidas, foi usada a mesma abordagem descrita na literatura [33,34] em combinação com o método de HPLC.

Determinação de Valores C:

[0079] A fim de determinar o valor C de LF, a LF foi saturada por uma quantidade excessiva de ferro conhecida. O ferro restante foi colorido por um reagente quelante (absorbância máxima 760 nm). O ferro restante é quantidade por espectrofotometria a 760 nm. Uma diluição em série do complexo de ferro é preparada, e a curva de calibração é determinada por espectrofotometria a 760 nm. O ferro ligado é calculado subtraindo-se o ferro restante do ferro adicionado. O valor C é indicado em termos relativos, em que a capacidade teórica de ligação de ferro calculada da LF (cada molécula de LF pode ligar 2 átomos de ferro) é definida como 100%.

Cálculo do valor C: µ𝑔 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 (𝐿𝐹) 𝑑𝑙 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝐿𝐹 𝑀(𝐹𝑒) 1.000 µ𝑙 × 10.0000 µ𝑙 = × × 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑀(𝐿𝐹) 1 𝑚𝑔 × 1 𝑑𝑙 (1) M(Fe): peso molecular de ferro; M(LF): peso molecular de LF µ𝑔 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑔𝑎𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝐿𝐹 = 𝑐(𝐹𝑒 ) − 𝑐 𝐹𝑒 𝑑𝑙 (2) c(FeInicial): concentração inicial do ferro; c(FeFinal): concentração do ferro restante 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑔𝑎𝑑𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝐿𝐹 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐶 [%] = × 100 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 𝐿𝐹

(3) Determinação de Valores A:

[0080] A fim de determinar o valor A da LF, a LF foi desnaturada por um reagente de desnaturação, e o ferro liberado foi colorido por um agente quelante (absorbância máxima 760 nm). O ferro liberado é quantidade por espectrofotometria a 760 nm. Uma diluição em série do complexo de ferro é preparada, e a curva de calibração é determinada por espectrofotometria a 760 nm. O ferro já ligado (valor A) é indicado em termos relativos, em que 2 átomos de ferro ligados a uma molécula de LF é definida como 100%.

Cálculo do Valor A: µ𝑔 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 (𝐿𝐹) 𝑑𝑙 𝑞𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝐿𝐹 𝑀(𝐹𝑒) 1.000 µ𝑙 × 10.0000 µ𝑙 = × × 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑀(𝐿𝐹) 1 𝑚𝑔 × 1 𝑑𝑙 (1) M(Fe): peso molecular de ferro; M(LF): peso molecular de LF 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑎 𝐿𝐹 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝐴 [%] = × 100 𝑐𝑎𝑝𝑎𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑎çã𝑜 𝑑𝑒 𝑓𝑒𝑟𝑟𝑜 𝐿𝐹 (4) Esquema de um Sistema Piloto

[0081] A Figura 3 retrata um fluxograma sobre os princípios na tecnologia para isolamento de LP/LPO e valores aproximados no equilíbrio de massa do processo em uma escala de uma execução cromatográfica. Antes do isolamento da LF/LPO, 1.100 l de soro ácido são filtrados com o uso de um sistema de filtro de TFF cerâmico com um diâmetro de poro inferior a 0,8 µm. Em seguida, o soro filtrado (1.000 l) é bombeado através de uma coluna cromatográfica equilibrada.

Após isso, a LF e LPO ligadas à coluna são eluídas por uma combinação de diferentes soluções-tampão. Em seguida, as frações eluídas são concentradas e, caso necessário, dessalinizadas. Após secagem da proteína concentrada, 60 a 90 g de produto de LF seco são obtidos. Soro e pasta fluida de soro de fluxo passante mudados de maneira negligenciável também podem ser usados, separadamente ou misturados, ou processados a jusante.

Exemplo 1

[0082] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 80 ml; BIA Separations, antes do carregamento, foi equilibrada com o uso de 800 ml da solução-tampão A (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM, pH = 4,6). Após o equilíbrio, o soro ácido filado foi bombeado através da coluna até que a capacidade de coluna para o LF e LPO fosse atingida. A saturação da capacidade de coluna foi verificada analisando- se amostras de fluxo passante do lado do efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise. O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 0,24 l/min foi normalmente 10 a 20 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado. Em seguida, a coluna foi lavada com solução-tampão A. A separação da LF e LPO foi acionada lavando-se a coluna com o uso de duas soluções-tampão (mistura de citrato de sódio, fosfato, TRIS e tampões de carbonato, 4 a 50 mM, pH= 4,6 e 12,0) em modo de gradiente de pH linear. O pH foi mudado de maneira gradualmente linear em uma faixa de 4,6 a 12,0. As faixas de pH para eluição de LPO/LF foram 8,9 a 10 e 11 a 11,7, respectivamente. Os resultados do procedimento de separação foram duas frações de eluição muito bem separadas por cromatografia de LPO e LF, que também foram processadas separadamente com facilidade. Nas etapas a seguir, as frações das proteínas isoladas foram neutralizadas para pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada, concentradas com o uso da membrana de TFF com um tamanho de poro de 1 a 50 kDa e secas por aspersão. As purezas finais de LF e LPO foram >98% e >70%, respectivamente. Os valores C e A da LF foram determinadas como 71% e 3,4%, respectivamente.

Exemplo 2

[0083] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 80 ml; BIA Separations, foi equilibrada antes do carregamento com o uso da solução-tampão B (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM, pH = 5,0 a 6,5, como o pH de soro doce).

Após isso, o soro doce pôde fluir através da coluna até que a capacidade da coluna para LF e LPO fosse atingida.

A saturação da capacidade da coluna foi verificada analisando-

se as amostras de fluxo passante no lado de efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise.

O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 0,24 l/min foi normalmente 10 a 40 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado.

Em seguida, a coluna foi lavada com solução-tampão B.

A separação da LF e LPO foi acionada lavando-se a coluna com o uso de duas soluções-tampão (mistura de citrato de sódio,

fosfato, TRIS e tampões de carbonato, 4 a 50 mM, pH= 5,0 e

12,0) em modo de gradiente de pH linear.

O pH muda de maneira gradualmente linear em uma faixa de 5,0 a 12,0. As faixas de pH para eluição de LPO/LF foram 8,9 a 10 e 11 a 11,7,

respectivamente.

Os resultados do procedimento mencionado acima foram duas frações muito bem separadas por cromatografia de LPO e LF, que também foram processadas separadamente com facilidade.

Nas etapas a seguir, as frações das proteínas isoladas foram neutralizadas para pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada,

concentradas com o uso da membrana de TFF com um tamanho de poro de 1 a 50 kDa e secas por aspersão.

A pureza final da

LF/LPO foi >98% ou >70%. Os valores C e A da LF foram determinadas como 70,2% e 3,9%, respectivamente.

Exemplo 3

[0084] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 8 l - CEX Forte; Bia Separations, antes do carregamento, foi equilibrada por 40 a 80 l de solução-tampão C (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM com adição de NaCl, pH = 4,6 e condutividade de 15 mS/cm). Após isso, o soro ácido pôde fluir através da coluna até que a capacidade da coluna para LF e LPO fosse atingida. A saturação da capacidade da coluna foi verificada analisando-se as amostras de fluxo passante no lado de efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise. O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 8 l/min foi normalmente 1.000 a 2.000 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado. Em seguida, a coluna foi lavada com a solução-tampão C. A separação da LF e LPO foi conduzida lavando-se a coluna com o uso de duas soluções-tampão (mistura de citrato de sódio, fosfato, TRIS e carbonato, 4 a 50 mM com adição de NaCl, pH= 4,6 e 120,0) em modo de gradiente de pH linear. O pH foi mudou de maneira gradualmente linear em uma faixa de 4,6 a 12,0, ao passo que a condutividade (15 mS/cm) permaneceu constante através de todo o gradiente de pH linear. As faixas de pH para eluição de LPO/LF foram 8,2 a 9,3 e 10,7 a 11,2, respectivamente. Os resultados do procedimento mencionado acima foram duas frações de eluição muito bem separadas por cromatografia de LPO e LF, que também foram processadas separadamente com facilidade. Nas etapas a seguir, as frações de proteínas coletadas foram primeiramente neutralizadas a pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada, dessalinizada e concentrada com o uso de membrana de TFF com um tamanho de puro de 1 a 50 kDa e seco por secagem por aspersão. A pureza final da LF/LPO foi >98% ou >75%. Os valores C e A da LF foram determinadas como 74,2% e 2,5%, respectivamente.

Exemplo 4

[0085] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 8 l - Strong CEX; Bia Separations, antes do carregamento, foi equilibrada com o uso da solução-tampão C (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM, pH = 5,0 a 6,5, como o pH de soro doce). Após isso, o soro ácido pôde fluir através da coluna até que as capacidades da coluna para LF e LPO fossem atingidas. A saturação da capacidade da coluna foi verificada analisando-se as amostras de fluxo passante no sítio de efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise. O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 8 l/min foi normalmente 1.000 a 2.000 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado. As proteínas com IEP <7,5 foram eluídas inicialmente pelo modo de eluição em etapa de pH com o uso de uma solução-tampão C com pH=7,5 e, em seguida, a separação de LF e LPO foi realizada lavando-se a coluna no modo de gradiente de pH linear com o uso dos mesmos tampões do Exemplo 2. O pH foi mudado de maneira gradualmente linear em uma faixa de 7,5 a 12,0. As faixas de pH para eluição de LPO/LF são 8,9 a 10 e 11 a 11,7, respectivamente. Em seguida, as frações de eluição coletadas separadamente de LPO e LF foram neutralizadas para pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada, concentradas com o uso da membrana de TFF com um tamanho de poro de 1 a 50 kDa e secas por secagem por aspersão. As purezas finais de LF e LPO foram >98% e >75%, respectivamente. Os valores C e A da LF foram determinadas como 72,6% e 2,8%, respectivamente.

Exemplo 5

[0086] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 8 l - Strong CEX; Bia Separations, antes do carregamento, foi equilibrada com o uso da solução-tampão C (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM com adição de NaCl, pH = 4,6 e condutividade de 15 mS/cm). Após isso, o soro ácido pôde fluir através da coluna até que as capacidades da coluna para LF e LPO fossem atingidas. A saturação da capacidade da coluna foi verificada analisando-se as amostras de fluxo passante no lado de efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise. O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 8 l/min foi normalmente

1.000 a 2.000 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado. Em seguida, a coluna foi lavada com solução-tampão C. As proteínas com IEP <7,5 foram eluídas inicialmente pelo modo de eluição em etapa de pH com o uso de uma solução-tampão C com pH=7,5 e, em seguida, a separação de LF e LPO foi realizada lavando-se a coluna no modo de gradiente de pH linear com o uso dos mesmos tampões do Exemplo 3. O pH foi mudado de maneira gradualmente linear em uma faixa de 7,5 a 12,0, ao passo que a condutividade (15 mS/cm) permaneceu constante por todo o gradiente de pH. As faixas de pH para eluição de LPO/LF foram 8,2 a 9,3 e 10,7 a 11,2, respectivamente. Em seguida, as frações de eluição coletadas separadamente de LPO e LF foram neutralizadas para pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada, concentradas com o uso da membrana de TFF com um tamanho de poro de 1 a 50 kDa e secas pela técnica de secagem por aspersão. As purezas finais de LF e LPO foram >98% e >80%, respectivamente. Os valores C e A da LF foram determinadas como 71,6% e 3,2%, respectivamente.

Exemplo 6

[0087] Uma coluna monolítica, CIMmultus™ SO3 a 8 l - Strong CEX; Bia Separations, antes do carregamento, foi equilibrada com o uso da solução-tampão C (tampão de fosfato de sódio ou de citrato: 5 a 50 mM, pH = 4,6). Após isso, o soro ácido pôde fluir através da coluna até que as capacidades da coluna para LF e LPO fossem atingidas.

A saturação da capacidade de coluna foi verificada analisando-

se amostras de fluxo passante do lado do efluxo da coluna pelo método de HPLC descrito na seção Análise.

O volume do soro bombeado através da coluna a uma taxa de fluxo de 8 l/min foi normalmente 1.000 a 2.000 l, que era principalmente dependente da concentração de LF/LPO no soro processado.

Em seguida, a coluna foi nivelada com solução-tampão C.

As proteínas com IEP <7,5 foram inicialmente eluídas pelo modo de eluição em etapa de pH com o uso de uma solução-tampão C com pH=7,5 e, em seguida, a separação da LF e LPO foi conduzida lavando-se a coluna com o uso de duas soluções-

tampão (mistura de citrato de sódio, fosfato, TRIS e carbonato, 4 a 50 mM com adição de NaCl para obter a condutividade apropriada, pH= 4,6 e 12,0). O pH foi mudado gradualmente em uma faixa de 7,0 a 12,0, ao passo que o gradiente de condutividade aumentou de 4 a 55 mS/cm.

As faixas de pH para eluição LPO/LF foram 6,6 a 7,5 e 9,6 a

10,7, respectivamente.

Em seguida, as frações de eluição coletadas separadamente de LPO e LF foram neutralizadas para pH=6 com o uso de uma pequena quantidade de solução ácida apropriada, dessalinizadas e concentradas com o uso da membrana de TFF com um tamanho de poro de 1 a 50 kDa e secas pela técnica de secagem por aspersão.

As purezas finais de

LF e LPO foram >98% ou >85%. Os valores C e A da LF foram determinadas como 76,1% e 2,0%, respectivamente.

Referências:

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Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para fabricar uma fração que compreende as proteínas lactoferrina e/ou lactoperoxidase a partir de uma fonte que contém pelo menos uma dessas proteínas, em que a fonte é selecionada a partir do grupo que consiste em leite, colostro, soro ácido ou doce, por meio de um processo de separação cromatográfico com uma coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico, caracterizado pelo fato de que, no processo de separação, um gradiente de pH ou uma eluição de gradiente de pH e sal combinados é empregado após o carregamento da fonte na coluna.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH começa em uma faixa de pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente < pH 8,0.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH termina em uma faixa de aproximadamente pH 8 a pH <13.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a fonte é filtrada antes do carregamento da fonte na coluna.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é coletada uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, em particular,

aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10 ou aproximadamente pH 6,6 a aproximadamente pH 7,5 em uma condutividade mais alta na faixa de aproximadamente 5 a 55 mS/cm.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de é coletada uma fração B que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH ˃10,4 a aproximadamente 12, em particular, aproximadamente pH >11 a aproximadamente 11,7, ou aproximadamente pH 9,6 a aproximadamente pH 10,7 a uma condutividade mais alta na faixa de aproximadamente 5 a 55 mS/cm.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o processo de separação cromatográfico compreende as etapas de (i) Ajustar o valor do pH da fonte para um valor inferior a pH 7, em particular, inferior a pH 6,5; (ii) Colocar a fonte da etapa (i) em contato com uma coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico; seguido por (iii) Submeter a fluxo um tampão de gradiente de pH através da coluna, desse modo, aumentando o valor do pH; e (iv) Coletar uma fração A que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8 a aproximadamente pH <11, em particular, aproximadamente pH 8,0 a aproximadamente pH 10, de preferência, a uma faixa de pH de aproximadamente pH 8,2 a aproximadamente pH 10, com mais preferência, aproximadamente pH 8,9 a aproximadamente pH 10, ou aproximadamente pH 6,6 a aproximadamente pH 7,5 a uma condutividade mais alta na faixa de aproximadamente 5 a 55 mS/cm e compreende tipicamente lactoperoxidase; e/ou (v) Coletar uma fração B que elui a uma faixa de pH de aproximadamente pH >10 a aproximadamente pH 12,0, de preferência, aproximadamente pH ˃10,4 a aproximadamente 12, com mais preferência, aproximadamente pH ˃11,0 a aproximadamente pH 12,0, em particular, aproximadamente pH >11 a aproximadamente 11,7 ou aproximadamente pH 9,6 a aproximadamente pH 10,7 a uma condutividade mais alta aproximadamente 5 a 55 mS/cm e compreende tipicamente lactoferrina; (vi) Opcionalmente, processar, também, as frações A e/ou B, em particular, por meio do tratamento por neutralização, concentração, preservação e semelhantes.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a fonte é filtrada antes da etapa (ii) ou em que a coluna monolítica é, antes da etapa (ii), equilibrada com um tampão de equilíbrio que tem um valor de pH de aproximadamente pH <7, em particular, aproximadamente pH < 6,5.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a coluna monolítica que tem fortes propriedades de trocador catiônico é selecionada a partir do grupo que consiste em uma coluna monolítica modificada por -SO3H, coluna monolítica modificada por -COOH, coluna monolítica modificada por - OSO3H ou coluna monolítica por -OPO3H.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o gradiente de sal é produzido pela concentração de sais, em particular, o gradiente de sal corresponde a uma condutividade em uma faixa de aproximadamente 5 mS/cm a aproximadamente 55 mS/cm.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que, antes da etapa (iii) ou (iv), a coluna é lavada com o tampão de equilíbrio, conforme definido na reivindicação 8.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a lactoferrina e lactoperoxidase que contêm frações são secas, em particular, por meio de secagem por aspersão.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a pureza de lactoferrina é ˃90% e a pureza de lactoperoxidase é ˃50%, em particular, em que o valor C de lactoferrina é ˃50 e o valor A de lactoferrina é ˃1.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a coluna é sanificada lavando-se uma coluna com um tampão de aproximadamente pH >12 após a etapa (iv) ou (v).

15. Composição de matéria caracterizada pelo fato de que compreende lactoferrina que tem um valor C de ˃ 60% e um valor A de ˃1%.

16. Composição de matéria, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o valor C é 70% ou mais e o valor A é 2% ou mais.

17. Composição de matéria caracterizada pelo fato de que a lactoferrina ou lactoperoxidase são obteníveis por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.