JP2022513594A - 乳、初乳及び酸性又は甘性ホエーから高度に精製されたラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼを製造する方法 - Google Patents
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Abstract
ラクトフェリンタンパク質及び／又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法であって、前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、前記分離プロセスにおいて、前記カラムに前記原料を導入後、ｐＨ勾配又はｐＨ及び塩を組み合わせた勾配溶出を利用する、方法。さらに、Ｃ値が６０％超であり、Ａ値が１％超であるラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼを含む組成物が開示されている。
Description
本発明は、ラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質の少なくとも一つを含む原料からラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分を製造する方法並びに高度に精製されたラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質に関する。
ラクトフェリン（ＬＦ）及びラクトペルオキシダーゼ（ＬＰＯ）は、乳、ホエー及び初乳中に存在する機能性の微量タンパク質である。ＬＦは、様々な生理的変化及び環境変化に対応可能な８０ｋＤａのグリコシル化タンパク質であり、そのために、ホストの防御の最前線において重要な成分だと考えられている。ＬＦの構造特性は、Ｆｅ３＋恒常性機能に加えて、全てのトランスフェリンに共通する機能である、広範囲の細菌、菌類、酵母、ウイルス及び寄生生物に対する広範なスペクトラムの抗菌活性；抗炎症活性及び抗発がん活性；並びにいくつかの酵素機能をもたらす［１］。ＬＰＯは、病原微生物に対する乳腺及び新生児の腸管の保護において極めて重要な役割を果たしており、様々な発がん物質の分解及び過酸化効果に対する動物細胞の保護に関与している［２］。
ＬＦは、鉄を結合させることができる。天然ＬＦは、１５～２０％のホロＬＦを含み、ホロＬＦは鉄を含む。残部はアポＬＦであり、アポＬＦは鉄を含まない［３２］。理論上では、アポＬＦはやや低い鉄飽和度を有する（既に結合した鉄－Ａ値）。アポＬＦのＡ値の理論値は、約３％未満である。さらに、アポＬＦは、高い鉄結合ポテンシャル（鉄容量－Ｃ値）を有する。アポＬＦのＣ値は、約５０％超である。高純度及び非変性のアポＬＦは、７０％超のより高いＣ値を有するポテンシャルを有している。一方で、ホロＬＦは高いＡ値（５０％超）及び低いＣ値（１０％未満）を有する。単離ＬＦのＣ値が高いほど、ＬＦの鉄結合ポテンシャルが高くなる。活性ＬＦは微生物の増殖に必要な鉄を除去するため、高い鉄結合ポテンシャルはより高レベルの抗菌活性をもたらす。
最近では、ＬＦ及びＬＰＯは、（Ｉ）ヘパリンリガンドを有するポリ(メタクリル酸グリシジル)を有する常磁性粒子による単離［３］、（ＩＩ）カチオン性界面活性剤（例えば、臭化セチルジメチルアンモニウム）の使用［４］、（ＩＩＩ）様々なクロマトグラフィー法（例えば、カチオン交換又はアフィニティークロマトグラフィー）［１、２、５～１０］、及び（ＩＶ）他の方法（例えば、疎水性イオン液体［１１］）などの多くの様々な方法によって、乳及び乳加工副生成物（例えば、ホエー）から単離される。一般的に、クロマトグラフィー法、特にイオン交換クロマトグラフィーは、ＬＦを比較的低コストで速く分離する方法を代表している［１２］。クロマトグラフィー法はまた、そのロバスト性及び繰り返し性のために他の方法に勝る。ＬＦ及びＬＰＯのクロマトグラフィー精製における最も一般的な方法では、強カチオン交換樹脂粒子及び膜又はモノリスカラムを用いる［１３～１５］。
現在のクロマトグラフィーは、（Ｉ）流速の増加に伴い、細孔内での拡散物質移動に起因してピークが広がるため、流速が増加する場合には、同じ分解能を得るために勾配の傾斜を緩やかにする必要があること、（ＩＩ）増加した流速は、クロマトグラフィー工程の時間を減少させるが、同時に溶出体積を増加させること、及び（ＩＩＩ）カラム長さによりカラムの圧力損失が大きくなり、流速の制限要因となることなどのいくつかの難点を有する。
クロマトグラフィー精製工程において、乳又はホエー中に存在するＬＦ及びＬＰＯは、所定の条件下で強カチオン交換体の表面に結合し、その後、高ｐＨ又は高塩濃度を有する緩衝剤を用いて溶出画分中に収集される。分離プロセスを簡略化するため、多くの場合、ＬＦ及びＬＰＯは、ステップモードにおいて高イオン強度又はｐＨ＞９のどちらかを有するいくつかの緩衝液を用いて溶出される。このような方法は、一つのクロマトグラフィー工程において、所望のタンパク質の画分について比較的高い純度（６０～９５％）をもたらすことが多い。脱塩、濃縮及び純度向上のため、限外ろ過法が微量の低分子量不純物を除去するために導入されることが多い。得られたタンパク質濃縮物は、その後、凍結乾燥又は噴霧乾燥によって乾燥されることが多い。Ｗａｎｇ他は、凍結乾燥ＬＦが噴霧乾燥ＬＦ（≒５％）に比べてより少ない水（約２～３％）を含むが、それに対して噴霧乾燥ＬＦはわずかに低い変性度及び６～７％高い抗酸化活性を示し、新鮮な液体ＬＦに近いことを示した［１８］。噴霧乾燥［１］は、損傷のない分子構造及び高い抗酸化能力を有するアモルファスＬＦ粉末を製造するために確信を持って用いられている。
欧州特許第０４１８７０４号［１９］は、表面スルホン酸基を有する樹脂粒子を含むイオン交換クロマトグラフィーカラムを用いた、鉄と結合可能な乳タンパク質の分離、精製及び回収のプロセスを記載している。ＬＦは、ｐＨ／伝導度ステップ溶出モード（ｐＨ／ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔｅｐ ｅｌｕｔｉｏｎ ｍｏｄｅ）によって単離され、最終生産物の純度は９０％超と主張されている。また、微量の低分子量不純物を除去するために限外ろ過法が必要とされ、最終的にＬＰＯ及びＬＦの純度は９０％以上とされている。
欧州特許出願公開第１４６６９２３号［２０］に記載されたプロセスは、強酸性カチオン交換樹脂（粒子）を用いたクロマトグラフィー工程を含み、単離ＬＦの純度が７９～９１％の範囲内にある。
国際公開第２００６／１１９６４４号［２１］は、ＬＦを精製し、溶液中で安定化させ、活性を向上させる方法を記載している。このプロセスは、既に単離された低純度のＬＦをさらに精製することを意図している。精製は、ある濃度の荷電した除外溶質を含む酸性水溶液の存在下で疎水性吸着剤（粒子）を用いて行われる。得られるＬＦの最終純度は、９５％超であった。
米国特許第５８６１４９１号［１３］は、組み換えヒトＬＦ（ｒｈＬＦ）をコードする導入遺伝子の発現によって生成されたヒトＬＦを含むヒトＬＦ及び他の関連ＬＦ種を、乳、典型的には牛乳から単離する方法を記載している。一般に、ｈＬＦを含む乳又は乳画分は、強カチオン交換樹脂への非ＬＦタンパク質及び他の物質の結合を抑制するために、比較的高いイオン強度において強カチオン交換樹脂と接触させられる。そして、樹脂粒子は遠心分離によって乳から分離され、所定のカチオン交換樹脂に結合したＬＦは、その後、ステップモードにおいて様々な塩濃度を有するいくつかの緩衝液を用いて溶出される。ｈＬＦ及びｂＬＦの上位画分（ｔｏｐ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）の純度は、約９５％超である。
欧州特許第０３４８５０８号［２２］は、スルホン化架橋多糖類樹脂（粒子）を用いた生乳からのＬＦ単離を開示している。
カラムに吸着したＬＦは、より高いＮａＣｌ濃度を有する緩衝剤を用いてステップモードにおいて溶出される。脱脂したヒト初乳から得られたＬＦの純度は９８％であり、ウシＬＦの純度は９５％と測定された。
米国特許第６０９６８７０号［２３］に記載された方法は、ホエータンパク質（免疫グロブリン、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、ＬＦ）の分離に関し、特に、強カチオン交換樹脂粒子を有するプレパッククロマトグラフィーカラムを用いた、ホエータンパク質の別個の画分への逐次分離に関する。前記タンパク質画分の逐次溶出は、ステップワイズモードにおいて好適なｐＨ及びイオン強度の緩衝剤を用いて達成される。噴霧乾燥した最終生産物の純度は、免疫グロブリンでは８０％以上、ＢＳＡ及びＬＦでは７５％以上、及びβ－ラクトグロブリンでは８５％以上であった。
米国特許第８６０３５６０号［２４］は、カラムに充填されたカチオン交換樹脂を用いて、乳又はホエーから乳タンパク質を単離するプロセスを記載している。溶出は、ｐＨ又はイオン強度の段階的変化によって促進される。最終ＬＦ純度は、８０％であった。
カナダ特許第２１２８１１１号［２５］は、工業規模で乳及び乳製品からＬＦ及びＬＰＯを単離するプロセスを記載している。単離は、前記タンパク質をカチオン交換体に吸着し、一つ以上の塩溶液を用いた段階的溶出によって、これらのタンパク質を別個に又は同時に溶出することによって達成される。単離タンパク質の最終純度に関する情報はない。
欧州特許第０２５３３９５号［２６］は、弱酸性カチオン交換樹脂を用いて、高純度で乳からウシＬＦを単離するプロセスを開示している。ＬＦは、様々な濃度を有する塩化ナトリウム溶液を用いた段階的溶出によってイオン交換体から回収される。従来のローレル法によると、生成したＬＦの純度は９０～９９％になると測定される。
米国特許第５５９６０８２号［２７］は、工業規模で乳及び乳製品からＬＦ及び酵素ＬＰＯを単離するプロセスを開示している。このプロセスは、乳又は乳誘導体をカチオン交換体に通すことによって、これらのタンパク質をカチオン交換体に吸着させる工程を含む。前記タンパク質の溶出は、様々な塩濃度を用いた段階的溶出によって促進される。ＬＰＯ及びＬＦの最終純度は、それぞれ９３％及び９４％であった。
米国特許第９１１５２１１号［２８］に開示された発明は、カチオン交換樹脂を用いたＬＦの単離を記載している。記載された方法によって得られたＬＦは、純度が９５％超であり、実質的にＬＰＳ、エンドトキシン及びアンギオゲニンを含まず、９％～１５％の鉄飽和度を有する。
欧州特許出願公開第２４２１８９４号［２９］は、鉄飽和度が１０％未満又はより好ましくは約９％～３．８９％である低鉄分ＬＦを調製する方法を記載している。このプロセスによって生成された低鉄分ＬＦは、標準のＬＦと比べて高い抗菌活性を示す。このプロセスは、酸及び溶媒を使用する。Ｆｅ３＋が放出された後、添加されたプロセス助剤はＵＦ及びＤＦプロセスによって除去された。得られた生産物は、薄黄色／薄茶色であり、（ＨＰＬＣ／蛍光Ｘ線分析（ＸＲＦ）による）鉄飽和度が３．８９％～５．１％である。
国際公開第２０１４／２０７６７８号［３０］は、分泌液からＬＦを精製する方法を開示しており、この方法は、分泌液をアルカリ化すること、アルカリ化分泌液を空気と接触させること、そして有機溶媒（アセトン）を用いてアルカリ化分泌液からＬＦを析出させることを含む。
国際公開第１９９５／０２２２５８号［３１］は、乳、特にヒト以外の種の乳からヒトＬＦを精製する方法、及びヒト以外のＬＦ種からの分離を含む、乳中に存在する不要な高分子種からヒトＬＦを分離する方法を開示している。単離を行うためには、強カチオン交換樹脂（例えば、Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））が用いられる。タンパク質（ＬＦなど）は、段階的な塩及びｐＨの勾配を利用して溶出された。
Ｇ．Ｍａｊｋａ他（ラクトフェリン調製における鉄飽和度の定量化のためのハイスループット法、Ａｎａｌ． Ｂｉｏａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．、４０５、５１９１～５２００、２０１３）は、低い鉄含有量のウシラクトフェリンを得る方法を開示している。低い鉄含有量のラクトフェリンを得るためには、イオン交換クロマトグラフィーを行うだけでは不十分であった。したがって、イオン交換クロマトグラフィーは、１００ｍＭのクエン酸緩衝剤に対して２４時間の大々的な透析法と組み合わされた。
本発明の一つの目的は、高純度な高活性ラクトフェリンの組成物を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、先行技術の課題の少なくともいくつかを解決するのに適切な方法を提供することである。
高活性ラクトフェリンは、やや低い鉄飽和度（既に結合した鉄－Ａ値）及び高い鉄結合ポテンシャル（鉄結合容量－Ｃ値）を特徴とする。
本発明のもう一つの目的は、ラクトペルオキシダーゼを高純度で含む組成物を提供することである。
本発明のさらにもう一つの目的は、ラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼをこれらのタンパク質を含む原料から高純度で製造する方法を提供することである。
これらの目的は、ラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法によって達成され、前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、分離プロセスにおいては、カラムに原料を導入後、ｐＨ勾配又はｐＨ及び塩を組み合わせた勾配溶出が利用される。
本発明の一つの実施形態では、ｐＨ勾配は、通常４．０～８．０未満のｐＨ範囲内、好ましくは４．０～７．５のｐＨ範囲内、より好ましくは約４．０～約７未満のｐＨ範囲内、特に約４．５～約６．５未満のｐＨ範囲内で開始する。
本発明の他の実施形態では、ｐＨ勾配は、典型的には、約８～１３未満のｐＨ範囲内、好ましくは８～１２のｐＨ範囲内、特に８～１２未満のｐＨ範囲内で終了する。
カラムに原料を導入する前に原料をろ過することが有利となり得る。
本発明のさらに別の実施形態では、塩勾配は、塩濃度を増加させることによって行われ、特に塩勾配は、約５ｍＳ／ｃｍ～約５５ｍＳ／ｃｍの範囲内における伝導度に対応する。緩衝液のｐＨへの干渉を避けるため、塩濃度を調整するには中性塩を用いることが望ましい。食品工業プロセスにおいて用いられる塩、典型的には塩化ナトリウム、が特に有利である。
前述の塩勾配と組み合わせて用いられるｐＨ勾配は、典型的には、４．０～８．０未満のｐＨ範囲内、好ましくは４．０～７．５のｐＨ範囲内、より好ましくは４．０～７未満のｐＨ範囲内、特に４．５～６．５未満のｐＨ範囲内におけるｐＨ値で開始する。塩勾配と組み合わせて用いられるｐＨ勾配は、典型的には、８～１３未満のｐＨ範囲内、好ましくは８～１２のｐＨ範囲内、特に８～１２未満のｐＨ範囲内で終了する。
本発明のさらに別の実施形態では、約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、さらに好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲において溶出する画分Ａが回収され得る。この画分は、典型的にはラクトペルオキシダーゼを含む。
本発明のさらに別の実施形態では、１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは１０．４超～１２のｐＨ範囲、好ましくは約１１超～約１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂが回収され得る。この画分は、典型的にはラクトフェリンを含む。
本発明の方法の特に有用な実施形態では、クロマトグラフィー分離プロセスは、
（ｉ）原料のｐＨを７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の原料を強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）勾配緩衝剤をカラムに流し、それによってｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲において溶出する画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、好ましくは１１．０超～１２．０のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、画分Ａ及び／又は画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む。
（ｉ）原料のｐＨを７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の原料を強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）勾配緩衝剤をカラムに流し、それによってｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲において溶出する画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、好ましくは１１．０超～１２．０のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、画分Ａ及び／又は画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む。
工程（ｉｉ）の前に、ラクトフェリン及び／又はラクトペルオキシダーゼを含む原料をろ過することが有利となり得る。
本発明の方法の他の実施形態では、モノリスカラムは、工程（ｉｉ）の前に、約７未満、特に約６未満のｐＨ値を有する平衡化緩衝剤を用いて平衡化され得る。
強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムは、特に、ＳＯ３Ｈ修飾モノリスカラム、－ＣＯＯＨ修飾モノリスカラム、－ＯＳＯ３Ｈ修飾モノリスカラム又は－ＯＰＯ３Ｈ修飾モノリスカラムからなる群から選択される。本発明との関係において、ＳＯ３Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＯＳＯ３Ｈまたは－ＯＰＯ３Ｈ修飾モノリスカラムは、また、酸性部分に対応する塩、特にナトリウム塩及びカリウム塩などのこれらのアルカリ塩を包含し、例えば、ＳＯ３Ｎａ、－ＣＯＯＮａ、－ＯＳＯ３Ｎａ若しくは－ＯＰＯ３Ｎａ又はＳＯ３Ｋ、－ＣＯＯＫ、－ＯＳＯ３Ｋ若しくは－ＯＰＯ３Ｋが挙げられる。
本発明の方法によると、画分Ｂは典型的にはラクトフェリンを含み、画分Ｂよりも低いｐＨ値で溶出する画分Ａは典型的にはラクトペルオキシダーゼを含む。
本発明のさらなる実施形態では、工程（ｉｉｉ）又は工程（ｉｖ）の前に、カラムは平衡化緩衝剤で洗い流され得る。
典型的には、ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼを含む画分は、例えば、乾燥、特に噴霧乾燥による乾燥などの更なる処理を施され得る。
本発明の方法により、高純度のラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼが得られる。ラクトフェリンの純度は９８％超であり、ラクトペルオキシダーゼの純度は７８％超である。さらに、ラクトフェリンのＣ値は５０％超又は６０％超であり、ラクトフェリンのＡ値は１％超である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は７０％超であり、ラクトフェリンのＡ値は２％超である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は、７０．０％以上であり、好ましくは７０．０％と８０．０％との間であり、より好ましくは７０．０％と７７．０％との間である。好ましくは、ラクトフェリンのＡ値は、２．０％以上であり、好ましくは３．９％未満であり、好ましくは１．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と５．０％との間であり、より好ましくは２％と４％との間である。
本発明の他の実施形態によると、典型的には、工程（ｉｖ）又は工程（ｖ）の後、モノリスカラムは、ｐＨが約１２超の緩衝剤で洗い流すことにより洗浄され得る。
本発明の対象は、本発明の方法により得られるラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼを含む組成物でもある。ラクトフェリンのＣ値は６０％超であり、Ａ値は１％超である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は７０％超であり、Ａ値は２％超である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は７０．０％以上であり、好ましくは７０．０％と８０．０％との間であり、より好ましくは７０．０％と７７．０％との間である。
好ましくは、ラクトフェリンのＡ値は、１．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と５．０％との間であり、より好ましくは２％と４％との間であり、好ましくは２．０％以上及び／又は好ましくは３．９％未満である。
好ましくは、本発明の生産物のＡ＋Ｃの値は、少なくとも６１％であり、少なくとも７２％であり、又は少なくとも７３％である。
本発明の方法は、
・乳、初乳及び酸性又は甘性ホエーからＬＦ及びＬＰＯを単離する迅速かつ簡単な方法、
・高純度な目的タンパク質（例えば、純度が９８％超のＬＦ）を得ることができる、ＬＦ及びＬＰＯ単離のための線形ｐＨ勾配を用いた単一のクロマトグラフィー工程単離プロセス、
・開示された方法によって得られた生産物（ＬＦタンパク質）であり、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）を測定するために確立された方法によると、高活性（Ｃ値が７０％超、ＬＦ用Ｃ値決定キット、株式会社ＮＲＬファーマ製）であり、既に結合した鉄の量（Ａ値が３．９％未満、ＬＦ用Ａ値決定キット、株式会社ＮＲＬファーマ製）が少なく、これらは市場で入手可能なＬＦのなかでも優れた特徴である。前記生産物は、特殊な化学物質を使用することなく、オンサイトで（モノリスカチオン交換体において）行われる、経済的で手段的に無理のない方法によって製造される。
・少ない量の鉄（Ａ値が３．９％未満）を含むと同時にアンギオゲニンを含まないＬＦの製造を可能にする方法、
・高い総生物活性（Ｃ値＋Ａ値が７２％超）を有するＬＦの製造を可能にする方法、
・製造規模まで容易にスケールアップでき、高純度及び高生物活性であるＬＦ及びＬＰＯのコスト効率の高い製造を可能にする方法、
・全体としてＬＦの８５％超を回収できる、クロマトグラフィー、濃縮／脱塩及び乾燥プロセスを含む、ＬＦ／ＬＰＯ単離の全プロセス、
・タンパク質の高分解能を妨げることなく、移動相の高流速（７００Ｌ／ｍ２／ｈ）を可能にし、高生産性プロセスをもたらすクロマトグラフィープロセス、
・単離を目的としたタンパク質（例えば、ホエー）を有する媒質に化学物質を導入しないか、あるいは他の方法でその特性を変化させないプロセスであって、これにより他の生物化学産業プロセスにおいて媒質をさらに利用可能にするプロセス、
・既に結合した鉄を所定割合で有するＬＦの製造を可能にする方法、
を提供する。
・乳、初乳及び酸性又は甘性ホエーからＬＦ及びＬＰＯを単離する迅速かつ簡単な方法、
・高純度な目的タンパク質（例えば、純度が９８％超のＬＦ）を得ることができる、ＬＦ及びＬＰＯ単離のための線形ｐＨ勾配を用いた単一のクロマトグラフィー工程単離プロセス、
・開示された方法によって得られた生産物（ＬＦタンパク質）であり、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）を測定するために確立された方法によると、高活性（Ｃ値が７０％超、ＬＦ用Ｃ値決定キット、株式会社ＮＲＬファーマ製）であり、既に結合した鉄の量（Ａ値が３．９％未満、ＬＦ用Ａ値決定キット、株式会社ＮＲＬファーマ製）が少なく、これらは市場で入手可能なＬＦのなかでも優れた特徴である。前記生産物は、特殊な化学物質を使用することなく、オンサイトで（モノリスカチオン交換体において）行われる、経済的で手段的に無理のない方法によって製造される。
・少ない量の鉄（Ａ値が３．９％未満）を含むと同時にアンギオゲニンを含まないＬＦの製造を可能にする方法、
・高い総生物活性（Ｃ値＋Ａ値が７２％超）を有するＬＦの製造を可能にする方法、
・製造規模まで容易にスケールアップでき、高純度及び高生物活性であるＬＦ及びＬＰＯのコスト効率の高い製造を可能にする方法、
・全体としてＬＦの８５％超を回収できる、クロマトグラフィー、濃縮／脱塩及び乾燥プロセスを含む、ＬＦ／ＬＰＯ単離の全プロセス、
・タンパク質の高分解能を妨げることなく、移動相の高流速（７００Ｌ／ｍ２／ｈ）を可能にし、高生産性プロセスをもたらすクロマトグラフィープロセス、
・単離を目的としたタンパク質（例えば、ホエー）を有する媒質に化学物質を導入しないか、あるいは他の方法でその特性を変化させないプロセスであって、これにより他の生物化学産業プロセスにおいて媒質をさらに利用可能にするプロセス、
・既に結合した鉄を所定割合で有するＬＦの製造を可能にする方法、
を提供する。
強カチオン交換基を有するモノリスカラムＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、ろ過したホエー又は乳からＬＦ及びＬＰＯを別々に単離するための様々な溶出モードにおいて試験された。ＬＦ／ＬＰＯの導入は、ホエーの本来のｐＨで行われ、２つの目的タンパク質は、（Ｉ）ｐＨの段階的増加、（ＩＩ）伝導度ステップ、（ＩＩＩ）線形伝導度勾配及び（ＩＶ）線形ｐＨ勾配によって、別々に溶出された。
比較のために行われたステップ溶出モードの場合、得られたＬＦの純度は約９５％であり、伝導度勾配の場合に得られた純度は９５％よりも僅かに高くなった。驚くべきことに、本発明によると、増加するｐＨ勾配、特に線形的に増加するｐＨ勾配による溶出で、９８％超のタンパク質純度が達成されることが見出された。純度は、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、バイオアナライザ及びＳＥＣクロマトグラフィーによって証明された。本発明の方法は、単一のクロマトグラフィー工程により、製造規模において、これらの結果を提供する。なお、欧州特許第０２５３３９５号において純度計算に用いられたローレル法［２６］によると、本発明の方法により得られる生産物の算出純度は１１８％超である。この確立された計算方法は、古く、ＬＦ純度の正確な決定にはもはや適していないとみられる。
線形ｐＨ勾配溶出の場合、ＬＦ溶出はいくつかの小さなサブピークからなることが分かった（図１）。後者は、ＬＦがタンパク質の鉄含有量レベルで、低いものから高いものまで分離されたことを示唆している。この理由は、他者によって既に議論され証明されている［３２］。
濃縮されたＬＦ水分散液は噴霧乾燥又は凍結乾燥機によって乾燥され、その後、ＬＦの不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）が測定された。株式会社ＮＲＬファーマによって提供された鉄比色分析キットによると（詳細な原理はＩｔｏ他［３３］によって公表された）、本発明の方法によって得られたＬＦは、２％と４．９％との間の鉄飽和度（既に結合した鉄－Ａ値）を有していた。不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）とも呼ばれる鉄結合ポテンシャル（鉄結合容量－Ｃ値）は、７０％超であった。前記結果は、Ａ値及びＣ値がそれぞれ４．６～１１．７％及び３４．４～５２．１％の間に位置する市販品と比べて、上位を占める（表１を参照）。同時に、市販品の総生物活性（Ｃ値＋Ａ値）は、通常、本発明の生産物と比べて低い。
本発明の方法は、ラクトフェリンタンパク質又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法を提供し、前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、強カチオン交換体特性を有するモノリスカラム、特に－ＳＯ３Ｈ修飾モノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、分離プロセスにおいて、カラムに原料を導入後、ｐＨ勾配溶出を利用する。
モノリスカラムは、一般的に中空体を備えたクロマトグラフィー分離装置であり、モノマーのポリメリセート（ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｅ）である多孔質固体材料を含む。前記材料の孔は、例えば、重合プロセスの間に形成される（米国特許第４９２３６１０号、米国特許第４９５２３４４号、米国特許第４８８９６２３号）。
好適な装置は、例えば、欧州特許第１０５８８４４号及び欧州特許第７７７７２５号などの先行技術文献に記載されており、市場で入手可能である。本発明で用いられるモノリスクロマトグラフィー材料は、特に多孔質材料の表面に露出している－ＳＯ３Ｈ部分によって修飾されている。－ＳＯ３Ｈ基による表面修飾は、前記材料にいわゆる強カチオン交換特性（ＣＡＸ）を提供する。当業者なら、例えば、弱カチオン交換体に分類される他の材料を知っている。これに対して、他の目的でアニオン交換体（ＡＥＸ）が用いられ得る。
ｐＨ勾配クロマトグラフィーは、ｐＨを開始値から終点まで増加させることによって行われる。略線形に設計することもできるが、本発明の結果、すなわち本発明のラクトフェリン及び/又はラクトペルオキシダーゼが得られる限り、異なる軌道でもよい。当業者は、そのような勾配クロマトグラフィーをどのように実行するかを知っている。本発明の明示的かつ暗示的な開示に基づく、カチオン勾配クロマトグラフィー条件の最適化は、当業者の通常の行為の範囲内であり、過度な負担のかかる実験を要しない。
再現性のある処理条件を確立するために、ｐＨ勾配による実際の分離の前に、モノリスカラムを平衡化することが有利であり得る。この場合、カラムは平衡化緩衝剤で洗い流される。典型的には、カラムのデッドボリュームの８～１２倍に相当する体積の平衡化緩衝剤でカラムは洗い流される。クロマトグラフィーの開始ｐＨ値の選択は、ＬＦ及び／又はＬＰＯを含む原料のｐＨ値による影響をある程度受ける。例えば、酸性ホエーがＬＦ及び／又はＬＰＯの原料である場合、平衡化のためのｐＨ値は４．６となり得、甘性ホエーを使用する場合のｐＨ値は、より高い値、すなわち５．０～６．５となり得る。
カラムに原料を導入する前に原料をろ過することが有利であり得る。一般に、乳製品産業において使用されるろ過手段を用いることができる。特に有用なのは、セラミックＴＦＦフィルター、スパイラル型膜又は他の連続ろ過法である。
原則として、ｐＨ勾配クロマトグラフィーは、モノリスカラムに原料を導入した後に開始することができる。しかし、ｐＨ勾配クロマトグラフィーを開始する前に、不純物を除去するために、平衡条件付近のｐＨ値でカラムをさらに洗い流すことが有用であり得る。これにより、ＬＦ及び／又はＬＰＯの分離がそのｐＨ値で溶出するタンパク質または他の混入物質により汚染されないため、製造されるタンパク質の分離が補助される。
ｐＨ勾配は、典型的には、４．０～８．０未満のｐＨ範囲内、好ましくは４．０～７．５のｐＨ範囲内、好ましくは約４．０～約７未満のｐＨ範囲内、特に約４．５～約６．５未満のｐＨ範囲内におけるｐＨ値で開始する。ｐＨ勾配は、典型的には、約８～１３未満のｐＨ範囲内、好ましくは８～１２のｐＨ範囲内、特に８～１２未満のｐＨ範囲内で終了する。図１は、ｐＨ勾配クロマトグラフィーの典型的な軌道を図示している。
溶出緩衝剤のイオン強度もまた分離に何らかの影響を及ぼす可能性があることに留意するべきである。イオン強度はまた、必要なｐＨ勾配をカバーするクロマトグラフィー分離の間の増加勾配に従う可能性がある。前述の塩勾配と組み合わせて用いられるために必要なｐＨ勾配は、典型的には、４．０～８．０未満のｐＨ範囲内、好ましくは４．０～７．５のｐＨ範囲内、好ましくは４．０～７未満のｐＨ範囲内、特に４．５～６．５未満のｐＨ範囲内におけるｐＨ値で開始する。塩勾配と組み合わせて用いられるｐＨ勾配は、典型的には、８～１３未満のｐＨ範囲内、好ましくは８～１２のｐＨ範囲内、特に８～１２未満のｐＨ範囲内で終了する。
例えば、ＬＰＯは、イオン強度が約１５ｍＳ／ｃｍの伝導度に相当する場合、約８～約１１未満のｐＨ範囲で溶出するが、伝導度が４ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに、好ましくは５ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに増加する場合は、約６．６～約７．５のｐＨ範囲内のより低いｐＨで溶出する。ＬＦの溶出は、同様の形態に従う。伝導度が中程度で一定のままである場合、ＬＦは約１０．７～約１１．７のｐＨ範囲内で溶出するが、伝導度が４ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに、好ましくは５ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに増加する場合は、ＬＦは約９．６～約１０．７のｐＨ範囲内のより低いｐＨで溶出する。イオン強度、すなわち伝導度は、適切な塩を添加することによって調整することができる。適切な塩を使用することにより、溶出緩衝剤のｐＨ値を調整してもよい。
約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍのより高い伝導度においては約６．６～約７．５のｐＨ範囲において溶出する画分Ａは、回収される。この画分は、典型的にはラクトペルオキシダーゼを含む。１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは１０．４超～１２のｐＨ範囲、好ましくは約１１超～約１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲、又は約９．６～約１０．７のｐＨ範囲（より高い伝導度：約５～５５ｍＳ／ｃｍ）において溶出する画分Ｂは、回収される。この画分は、典型的にはラクトフェリンを含む。
以下に、本発明の方法の典型的な工程を説明する。ＬＦ及びＬＰＯが溶出するｐＨ範囲は、約１５ｍＳ／ｃｍの中程度の伝導度に対応する。クロマトグラフィー分離プロセスは、
（ｉ）原料のｐＨを７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の原料を強カチオン特性を有するモノリスカラム、特に－ＳＯ３修飾モノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）勾配緩衝剤をカラムに流し、それによってｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲において溶出する画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、好ましくは１１超～１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、画分Ａ及び／又は画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む。
（ｉ）原料のｐＨを７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）の原料を強カチオン特性を有するモノリスカラム、特に－ＳＯ３修飾モノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）勾配緩衝剤をカラムに流し、それによってｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、好ましくは８．０～１０．０のｐＨ範囲、好ましくは８．２～１０．０のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲において溶出する画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）１０超～１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、好ましくは１１超～１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、画分Ａ及び／又は画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む。
不要な物質を除去するため、ラクトフェリン及び／又はラクトペルオキシダーゼを含む原料は、工程（ｉｉ）の前に、セラミックフィルターを通してろ過される。
モノリスカラムは、工程（ｉｉ）の前に、約７未満、特に約６未満のｐＨ値を有する平衡化緩衝剤を用いて平衡化される。工程（ｉｉｉ）又は工程（ｉｖ）の前に、カラムは平衡化緩衝剤で洗い流される。
ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼを含む画分を回収した後、これらは噴霧乾燥によりさらに処理される。
得られたラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼは高純度である。ラクトフェリンの純度は９８％超であり、ラクトペルオキシダーゼの純度は７８％超である。さらに、ラクトフェリンのＣ値は６０％以上であり、ラクトフェリンのＡ値は１％以上である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は７０％超であり、ラクトフェリンのＡ値は２％超である。好ましくは、ラクトフェリンのＣ値は、７０．０％以上であり、好ましくは７０．０％と８０．０％との間であり、より好ましくは７０．０％と７７．０％との間である。好ましくは、ラクトフェリンのＡ値は、１．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と７．０％との間であり、好ましくは２．０％と５．０％との間であり、より好ましくは２％と４％との間であり、好ましくは２．０％以上及び／又は好ましくは３．９％未満である。
本発明の他の実施形態によると、典型的には、工程（ｉｖ）又は工程（ｖ）の後、モノリスカラムは、ｐＨが約１３超の緩衝剤で洗い流すことにより洗浄される。
洗浄工程は、１～３時間の接触時間で、脱イオン水（１０－１５ｃｖ）、１ＭのＮａＯＨ（４－１０ｃｖ）でカラムを洗い流し、再び水（３０ｃｖ超）で洗い流すことによって行われる。この工程は、クロマトグラフィーを８～１０回実行する毎に行ってもよい。
本発明の方法による新規アプローチの独自性は、（Ｉ）タンパク質が単離される原料（例えば、ホエー）の化学的修飾を必要せず、標準的なろ過法を用いて単に事前ろ過すればよく、（ＩＩ）他のプロセス（例えば、欧州特許出願公開第２４２１８９４号［２９］）とは異なり、安価な化学物質(緩衝剤)を少量使用し、（ＩＩＩ）ＬＰＯ及びＬＦの高純度な分離画分を提供し、（ＩＶ）既に結合した鉄を所定割合で有するＬＦの製造を可能にし、さらに（Ｖ）タンパク質溶出分散液の脱塩／濃縮及び乾燥の製造工程を含めて８５％超の高いタンパク質回収率をもたらす、ということにもある。
本明細書に引用された全ての参考文献は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、その全範囲が、本明細書に参照により取り込まれる。
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明され、例示される。
＜分析＞
［ＨＰＬＣ分析］
サンプル中のＬＦ及びＬＰＯを特定するために、ＭＷＤ多波長検出器及びｐＨ測定キットを有する伝導度モニターを備えたクロマトグラフィーシステム（ＰＡＴｆｉｘ（商標）、ＢＩＡセパレーションズ社製、アイドフシュチナ、スロベニア）を使用した。クロマトグラフィー分離は、３．５ｍＳ／ｃｍから１５２ｍＳ／ｃｍに増加させた伝導度勾配モードで、２つのリン酸ナトリウム一塩基緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７．５）を使用して、ＣＩＭａｃ ＳＯ３－０．１（孔１．３μｍ、ＢＩＡセパレーションズ社製、アイドフシュチナ、スロベニア）分析カラムにおいて実行した。分析されたタンパク質の溶出は、２２６ｎｍにおいてＭＷＤ検出器によって観察された。クロマトグラフィー法に関する詳細な情報は表２に示され、いくつかの分析したサンプルのクロマトグラムは図１及び２に示されている。すべてのサンプルは、分析の前に、ＣＨＲＯＭＡＦＩＬ（商標） Ａ－４５／２５（孔径０．４５μｍ）セルロース混合エステルフィルターを用いてろ過された。
［ＨＰＬＣ分析］
サンプル中のＬＦ及びＬＰＯを特定するために、ＭＷＤ多波長検出器及びｐＨ測定キットを有する伝導度モニターを備えたクロマトグラフィーシステム（ＰＡＴｆｉｘ（商標）、ＢＩＡセパレーションズ社製、アイドフシュチナ、スロベニア）を使用した。クロマトグラフィー分離は、３．５ｍＳ／ｃｍから１５２ｍＳ／ｃｍに増加させた伝導度勾配モードで、２つのリン酸ナトリウム一塩基緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝７．５）を使用して、ＣＩＭａｃ ＳＯ３－０．１（孔１．３μｍ、ＢＩＡセパレーションズ社製、アイドフシュチナ、スロベニア）分析カラムにおいて実行した。分析されたタンパク質の溶出は、２２６ｎｍにおいてＭＷＤ検出器によって観察された。クロマトグラフィー法に関する詳細な情報は表２に示され、いくつかの分析したサンプルのクロマトグラムは図１及び２に示されている。すべてのサンプルは、分析の前に、ＣＨＲＯＭＡＦＩＬ（商標） Ａ－４５／２５（孔径０．４５μｍ）セルロース混合エステルフィルターを用いてろ過された。
［Ｃ値及びＡ値の決定］
乾燥ＬＦサンプルのＣ値及びＡ値を決定するために、株式会社ＮＲＬファーマ（日本）によって提供された鉄比色分析キットを使用し（詳細な原理はＩｔｏ他［３３］によって公表された）、乾燥サンプル及び液体サンプルのＡ値を決定するために、ＨＰＬＣ法と組み合わせて、文献［３３、３４］に記載されたアプローチと同じものを用いた。
乾燥ＬＦサンプルのＣ値及びＡ値を決定するために、株式会社ＮＲＬファーマ（日本）によって提供された鉄比色分析キットを使用し（詳細な原理はＩｔｏ他［３３］によって公表された）、乾燥サンプル及び液体サンプルのＡ値を決定するために、ＨＰＬＣ法と組み合わせて、文献［３３、３４］に記載されたアプローチと同じものを用いた。
［Ｃ値の決定］
ＬＦのＣ値を決定するために、ＬＦは公知の過剰量の鉄で飽和された。残留鉄はキレート試薬(最大吸収波長７６０ｎｍ）で着色された。残留鉄は７６０ｎｍで分光光度法で定量化される。鉄錯体の連続希釈液を調製し、検量線を７６０ｎｍで分光光度法で決定する。結合した鉄は、添加した鉄から残留鉄を差し引くことで算出される。Ｃ値は相対的に示され、ＬＦの算出された理論鉄結合容量（ＬＦの各分子は２個の鉄原子に結合できる）は１００％として設定される。
ＬＦのＣ値を決定するために、ＬＦは公知の過剰量の鉄で飽和された。残留鉄はキレート試薬(最大吸収波長７６０ｎｍ）で着色された。残留鉄は７６０ｎｍで分光光度法で定量化される。鉄錯体の連続希釈液を調製し、検量線を７６０ｎｍで分光光度法で決定する。結合した鉄は、添加した鉄から残留鉄を差し引くことで算出される。Ｃ値は相対的に示され、ＬＦの算出された理論鉄結合容量（ＬＦの各分子は２個の鉄原子に結合できる）は１００％として設定される。
［Ｃ値の計算］
Ｍ（Ｆｅ）：鉄の分子量、Ｍ（ＬＦ）：ＬＦの分子量
ｃ（ＦｅＳｔａｒｔ）：鉄の開始濃度、ｃ（ＦｅＥｎｄ）：残留鉄の濃度
ｃ（ＦｅＳｔａｒｔ）：鉄の開始濃度、ｃ（ＦｅＥｎｄ）：残留鉄の濃度
［Ａ値の決定］
ＬＦのＡ値を決定するために、ＬＦは変性試薬で変性され、放出された鉄はキレート試薬(最大吸収波長７６０ｎｍ）で着色された。放出された鉄は７６０ｎｍで分光光度法で定量される。鉄錯体の連続希釈液を調製し、検量線を７６０ｎｍで分光光度法で決定する。既に結合した鉄（Ａ値）は、相対的に示され、１個のＬＦ分子に結合した２個の鉄原子は１００％として定義される。
ＬＦのＡ値を決定するために、ＬＦは変性試薬で変性され、放出された鉄はキレート試薬(最大吸収波長７６０ｎｍ）で着色された。放出された鉄は７６０ｎｍで分光光度法で定量される。鉄錯体の連続希釈液を調製し、検量線を７６０ｎｍで分光光度法で決定する。既に結合した鉄（Ａ値）は、相対的に示され、１個のＬＦ分子に結合した２個の鉄原子は１００％として定義される。
［Ａ値の計算］
Ｍ（Ｆｅ）：鉄の分子量、Ｍ（ＬＦ）：ＬＦの分子量
Ｍ（Ｆｅ）：鉄の分子量、Ｍ（ＬＦ）：ＬＦの分子量
［試験的システムのスキーム］
図３は、ＬＦ／ＬＰＯ単離法における原理に関するフローシート及び１回のクロマトグラフィー実験の規模におけるプロセスの物質収支の概算値を示す。ＬＦ／ＬＰＯ単離の前に、１１００Ｌの酸性ホエーは、０．８μｍ未満の孔径を有するセラミックＴＦＦフィルターシステムを用いてろ過される。次いで、ろ過したホエー（１０００Ｌ）は、平衡化されたクロマトグラフィーカラムに送り出される。その後、カラムに結合したＬＦ及びＬＰＯは、様々な緩衝液の組み合わせによって溶出される。次いで、溶出した画分は濃縮され、必要に応じて脱塩される。濃縮タンパク質の乾燥後、６０～９０ｇの乾燥ＬＦ生産物が得られる。僅かに変化したフロースルーホエー及びホエースラリーは、別個で又は混合され、下流においてさらに使用又は処理され得る。
図３は、ＬＦ／ＬＰＯ単離法における原理に関するフローシート及び１回のクロマトグラフィー実験の規模におけるプロセスの物質収支の概算値を示す。ＬＦ／ＬＰＯ単離の前に、１１００Ｌの酸性ホエーは、０．８μｍ未満の孔径を有するセラミックＴＦＦフィルターシステムを用いてろ過される。次いで、ろ過したホエー（１０００Ｌ）は、平衡化されたクロマトグラフィーカラムに送り出される。その後、カラムに結合したＬＦ及びＬＰＯは、様々な緩衝液の組み合わせによって溶出される。次いで、溶出した画分は濃縮され、必要に応じて脱塩される。濃縮タンパク質の乾燥後、６０～９０ｇの乾燥ＬＦ生産物が得られる。僅かに変化したフロースルーホエー及びホエースラリーは、別個で又は混合され、下流においてさらに使用又は処理され得る。
＜実施例１＞
モノリスカラム、８０ｍＬ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、８００ｍＬの緩衝液Ａ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６）を用いて平衡化された。平衡化後、ろ過された酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに送り出された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。０．２４Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０～２０Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ａで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって、開始された。ｐＨは、４．６～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。分離操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの溶出画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、単離されたタンパク質の画分は、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超及び７０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７１％及び３．４％であると決定された。
モノリスカラム、８０ｍＬ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、８００ｍＬの緩衝液Ａ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６）を用いて平衡化された。平衡化後、ろ過された酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに送り出された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。０．２４Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０～２０Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ａで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって、開始された。ｐＨは、４．６～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。分離操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの溶出画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、単離されたタンパク質の画分は、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超及び７０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７１％及び３．４％であると決定された。
＜実施例２＞
モノリスカラム、８０ｍＬ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｂ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、甘性ホエーのｐＨと同じｐＨ＝５．０～６．５）を用いて平衡化された。その後、甘性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。０．２４Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０～４０Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｂで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝５．０及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって、開始された。ｐＨは、５．０～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。前述の操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、単離されたタンパク質の画分は、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥された。ＬＦ／ＬＰＯの最終純度は、９８％超又は７０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７０．２％及び３．９％であると決定された。
モノリスカラム、８０ｍＬ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｂ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、甘性ホエーのｐＨと同じｐＨ＝５．０～６．５）を用いて平衡化された。その後、甘性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。０．２４Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０～４０Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｂで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝５．０及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって、開始された。ｐＨは、５．０～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。前述の操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、単離されたタンパク質の画分は、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥された。ＬＦ／ＬＰＯの最終純度は、９８％超又は７０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７０．２％及び３．９％であると決定された。
＜実施例３＞
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、４０～８０Ｌの緩衝液Ｃ（ＮａＣｌを添加した、リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１５ｍＳ／ｃｍの伝導度）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（ＮａＣｌを添加した、クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって行われた。ｐＨは４．６～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させ、伝導度（１５ｍＳ／ｃｍ）は、線形ｐＨ勾配の全体を通して一定であった。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．２～９．３及び１０．７～１１．２であった。前述の操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの溶出画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、回収されたタンパク質の画分は、先ず、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて脱塩及び濃縮され、そして噴霧乾燥により乾燥された。ＬＦ／ＬＰＯの最終純度は、９８％超又は７５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７４．２％及び２．５％であると決定された。
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、４０～８０Ｌの緩衝液Ｃ（ＮａＣｌを添加した、リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１５ｍＳ／ｃｍの伝導度）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＬＦ及びＬＰＯの分離は、線形ｐＨ勾配モードにおいて、２つの緩衝液（ＮａＣｌを添加した、クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって行われた。ｐＨは４．６～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させ、伝導度（１５ｍＳ／ｃｍ）は、線形ｐＨ勾配の全体を通して一定であった。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．２～９．３及び１０．７～１１．２であった。前述の操作の結果は、クロマトグラフ的に非常によく分離されたＬＰＯ及びＬＦの２つの溶出画分であり、これらはさらに別々に容易に処理された。引き続く工程において、回収されたタンパク質の画分は、先ず、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて脱塩及び濃縮され、そして噴霧乾燥により乾燥された。ＬＦ／ＬＰＯの最終純度は、９８％超又は７５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７４．２％及び２．５％であると決定された。
＜実施例４＞
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、甘性ホエーのｐＨと同じｐＨ＝５．０～６．５）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、実施例２の緩衝液と同じ緩衝液を使用し、線形ｐＨ勾配モードにおいてカラムを洗い流すことで行われた。ｐＨは７．５～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は７５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７２．６％及び２．８％であると決定された。
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、甘性ホエーのｐＨと同じｐＨ＝５．０～６．５）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、実施例２の緩衝液と同じ緩衝液を使用し、線形ｐＨ勾配モードにおいてカラムを洗い流すことで行われた。ｐＨは７．５～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．９～１０及び１１～１１．７であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は７５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７２．６％及び２．８％であると決定された。
＜実施例５＞
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（ＮａＣｌを添加した、リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１５ｍＳ／ｃｍの伝導度）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、実施例３の緩衝液と同じ緩衝液を使用し、線形ｐＨ勾配モードにおいてカラムを洗い流すことで行われた。ｐＨは７．５～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させ、伝導度（１５ｍＳ／ｃｍ）は、ｐＨ勾配の全体を通して一定であった。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．２～９．３及び１０．７～１１．２であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥法により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は８０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７１．６％及び３．２％であると決定された。
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（ＮａＣｌを添加した、リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１５ｍＳ／ｃｍの伝導度）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、実施例３の緩衝液と同じ緩衝液を使用し、線形ｐＨ勾配モードにおいてカラムを洗い流すことで行われた。ｐＨは７．５～１２．０の範囲内で徐々に線形的に変化させ、伝導度（１５ｍＳ／ｃｍ）は、ｐＨ勾配の全体を通して一定であった。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ８．２～９．３及び１０．７～１１．２であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて濃縮され、そして噴霧乾燥法により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は８０％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７１．６％及び３．２％であると決定された。
＜実施例６＞
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、２つの緩衝液（好適な伝導度を得るためにＮａＣｌを添加した、クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって行われた。ｐＨは７．０～１２．０の範囲内で徐々に変化させ、その間、伝導度の勾配を４ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに増加させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ６．６～７．５及び９．６～１０．７であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて脱塩及び濃縮され、噴霧乾燥法により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は８５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７６．１％及び２．０％であると決定された。
モノリスカラム、８Ｌ ＣＩＭｍｕｌｔｕｓ（商標） ＳＯ３－Ｓｔｒｏｎｇ ＣＥＸ（ＢＩＡセパレーションズ社製）は、導入前に、緩衝液Ｃ（リン酸ナトリウム又はクエン酸緩衝剤：５～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６）を用いて平衡化された。その後、酸性ホエーは、ＬＦ及びＬＰＯのカラム容量に達するまでカラムに流された。カラム容量の飽和は、分析の項目で説明されたＨＰＬＣ法により、カラムの流出側におけるフロースルーサンプルを分析することによって確認された。８Ｌ／ｍｉｎの流速でカラムに送り出されたホエーの体積は、通常、処理されたホエー中のＬＦ／ＬＰＯ濃度に主に依存して、１０００～２０００Ｌであった。その後、カラムは緩衝液Ｃで洗い流された。ＩＥＰが７．５未満であるタンパク質は、先ず、ｐＨ＝７．５の緩衝液Ｃを用いてｐＨステップ溶出モードにより溶出され、その後、ＬＦ及びＬＰＯの分離は、２つの緩衝液（好適な伝導度を得るためにＮａＣｌを添加した、クエン酸ナトリウム緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、ＴＲＩＳ緩衝剤及び炭酸塩緩衝剤の混合物、４～５０ｍＭ、ｐＨ＝４．６及び１２．０）を使用してカラムを洗い流すことによって行われた。ｐＨは７．０～１２．０の範囲内で徐々に変化させ、その間、伝導度の勾配を４ｍＳ／ｃｍから５５ｍＳ／ｃｍに増加させた。ＬＰＯ／ＬＦ溶出のｐＨ範囲は、それぞれ６．６～７．５及び９．６～１０．７であった。別々に回収されたＬＰＯ及びＬＦの溶出画分は、その後、少量の好適な酸性溶液を用いてｐＨ＝６に中和され、１～５０ｋＤａの孔径を有するＴＦＦ膜を用いて脱塩及び濃縮され、噴霧乾燥法により乾燥された。ＬＦ及びＬＰＯの最終純度は、それぞれ９８％超又は８５％超であった。ＬＦのＣ値及びＡ値は、それぞれ７６．１％及び２．０％であると決定された。
（参考文献）
[1] Susana A. Gonzalez-Chavez, Sigifredo Arevalo-Gallegos, and QuintinRascon-Cruz. Lactoferrin: structure, function and applications. International Journal of Antimicrobial Agents, 33(4): 301.e1 - 301.e8, 2009.
[2] Nicolas Urtasun, Maria Fernanda Baieli, Daniela BelenHirsch, Maria Camila Martinez-Ceron, Osvaldo Cascone, and Federico Javier Wolman. Lactoperoxidase purification from whey by using dye affinity chromatography. Food and Bioproducts Processing, 103:58 - 65, 2017.
[3] Lin Chen, Chen Guo, Yueping Guan, and Huizhou Liu. Isolation of lactoferrin from acid whey by magnetic affinity separation. Separation and Purification Technology, 56(2):168 - 174, 2007.
[4] Rhee-M.S. Imm J.Y. Noh, K.H. Separation of lactoferrin from model whey protein mixture by reverse micelles formed by cationic surfactant. Food Sci. Biotechnol., 14:131-136., 2005.
[5] Shalan Alwan Al-Mashikhi, Eunice Li-Chan, and ShuryoNakai. Separation of immunoglobulins and lactoferrin from cheese whey by chelating chromatography. Journal of Dairy Science, 71(7):1747 - 1755, 1988.
[6] S. Yoshida, Z. Wei, Y. Shinmura, and N. Fukunaga. Separation of lactoferrin-a and -b from bovine colostrum. Journal of Dairy Science, 83(10):2211 - 2215, 2000.
[7] Jonatan Andersson and Bo Mattiasson. Simulated moving bed technology with a simplified approach for protein purification: Separation of lactoperoxidase and lactoferrin from whey protein concentrate. Journal of Chromatography A, 1107(1):88 - 95, 2006.
[8] Rong Rong Lu, Shi Ying Xu, Zhang Wang, and Rui Jin Yang. Isolation of lactoferrin from bovine colostrum by ultrafiltration coupled with strong cation exchange chromatography on a production scale. Journal of Membrane Science, 297(1):152 - 161, 2007.
[9] T. Uchida, S. Dosako, K. Sato, and H. Kawakami. Sequential separation of lactoferrin, lactoperoxidase, and secretory component by sulfate-linked ion-exchange chromatography. Milchwissenschaft, 9(58):482-486, January 2003.
[10] O. Cascone Mariano Grasselli. Separation of lactoferrin from bovine whey by dye affinity chromatography. Netherlands Milk and Dairy Journal, 4(50):551-561, January 1996.
[11] Enrique Alvarez-Guerra and Angel Irabien. Extraction of lactoferrin with hydrophobic ionic liquids. Separation and Purification Technology, 98:432 - 440, 2012.
[12] Vojtech Adam, OndrejZitka, Petr Dolezal, Ladislav Zeman, Ales Horna, Jaromir Hubalek, Jan Sileny, Sona Krizkova, Libuse Trnkova, and Rene Kizek. Lactoferrin isolation using monolithic column coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors (Basel), 1(8):464-487, January 2008.
[13] J.H. Nuijens and H.H. Van Veen. Isolation of lactoferrin from milk, January 19 1999. 米国特許第５８６１４９１号.
[14] Conan J. Fee and Amita Chand. Capture of lactoferrin and lactoperoxidase from raw whole milk by cation exchange chromatography. Separation and Purification Technology, 48(2):143 - 149, 2006. Separation and Purification in the Food Industry.
[15] Chalore Teepakorn, Koffi Fiaty, and Catherine Charcosset. Comparison of membrane chromatography and monolith chromatography for lactoferrin and bovine serum albumin separation. Processes, 4(3), 2016.
[16] P. Milavec Zmak, H. Podgornik, J. Jancar, A. Podgornik, and A. Strancar. Transfer of gradient chromatographic methods for protein separation to convective interaction media monolithic columns. Journal of Chromatography A, 1006(1):195 - 205, 2003. International Symposium on Preparative and Industrial Chromatography and Allied Techniques.
[17] Shuichi Yamamoto and Ayako Kita. Theoretical background of short chromatographic layers: Optimization of gradient elution in short columns. Journal of Chromatography A, 1065(1):45 - 50, 2005. 1st Monolith Summer School.
[18] Bo Wang, Yakindra Prasad Timilsena, Ewan Blanch, and Benu Adhikari. Characteristics of bovine lactoferrin powders produced through spray and freeze drying processes. International Journal of Biological Macromolecules, 95:985 - 994, 2017.
[19] K. Sato and S.I. Dousako. Process of separating, purifying and recovering milk proteins capable of binding iron, March 27 1991. 欧州特許出願第１９９００１１７４４２号.
[20] K. Sato, M. Shiba, A. Shigematsu, N. Teduka, and A. Tomizawa. Method for producing lactoferrin, October 13 2004. 欧州特許出願第２００４０００８００８号.
[21] G. Rowe, H. Aomari, and D. Petitclerc. New purification method of lactoferrin, November 16 2006. 国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００７８０号.
[22] H. Kawakami, M. Tanimoto, and S. Dousako. Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound, September 9 1992. 欧州特許第０３４８５０８号.
[23] Z. Mozaffar, S.H. Ahmed, V. Saxena, and Q.R. Miranda. Sequential separation of whey, August 1 2000. 米国特許第６０９６８７０号.
[24] J. Souppe. Milk protein isolate and process for its preparation, December 10 2013. 米国特許第８６０３５６０号.
[25] Kussendrager K.D., Kivits M.G.C., and Verver A.B. Process for isolating lactoferrin and lactoperoxidase from milk and milk products, and products obtained by such process, June 16 1998. カナダ特許第２１２８１１１号.
[26] S. Okonogi, M. Tomita, T. Tomimura, Y. Tamura, and T. Mizota. A process for producing bovine lactoferrin in high purity, July 5 2006. 欧州特許第０２５３３９５号.
[27] K.D. Kussendrager, M.G.C. Kivits, and A.B. Verver. Process for isolating lactoferrin and lactoperoxidase from milk and milk products, and products obtained by such process, January 21 1997. 米国特許第５５９６０８２号.
[28] Jean-Paul Perraudin. Method for production of lactoferrin, August 2015. 米国特許第９１１５２１１号.
[29] Kevin Neil Pearce Shaojiang Chen. Method of preparing low-iron lactoferrin, February 2012. 欧州特許出願公開第２４２１８９４号.
[30] Hassan Mohamed Hassan Abdalla. Method for purifying lactoferrin, December 2014. 米国特許第９４５８２２５号.
[31] Jan H. Nuijens Veen Harry H. Van. Isolation of lactoferrin from milk, August 1995. 国際公開第１９９５／０２２２５８号.
[32] Linda Voswinkel, Thomas Vogel, and Ulrich Kulozik. Impact of the iron saturation of bovine lactoferrin on adsorption to a strong cation exchanger membrane. International Dairy Journal, 56:134 - 140, 2016.
[33] Satoshi Ito, Katsuya Ikuta, Daisuke Kato, Kotoe Shibusa, Noriyasu Niizeki, Hiroki Tanaka, Lynda Addo, Yasumichi Toki, Mayumi Hatayama, Junki Inamura, MotohiroShindo, Katsunori Sasaki, Naomi Iizuka, Mikihiro Fujiya, Yoshihiro Torimoto, and Yutaka Kohgo. Non-transferrin-bound iron assay system utilizing a conventional automated analyzer. ClinicaChimica Acta, 437:129 - 135, 2014.
[34] Robert J. Hilton, Matthew C. Seare, N. David Andros, Zachary Kenealey, Catalina Matias Orozco, Michael Webb, and Richard K. Watt. Phosphate inhibits in vitro Fe3+ loading into transferrin by forming a soluble Fe(iii) phosphate complex: A potential non-transferrin bound iron species. Journal of Inorganic Biochemistry, 110:1 - 7, 2012.
[1] Susana A. Gonzalez-Chavez, Sigifredo Arevalo-Gallegos, and QuintinRascon-Cruz. Lactoferrin: structure, function and applications. International Journal of Antimicrobial Agents, 33(4): 301.e1 - 301.e8, 2009.
[2] Nicolas Urtasun, Maria Fernanda Baieli, Daniela BelenHirsch, Maria Camila Martinez-Ceron, Osvaldo Cascone, and Federico Javier Wolman. Lactoperoxidase purification from whey by using dye affinity chromatography. Food and Bioproducts Processing, 103:58 - 65, 2017.
[3] Lin Chen, Chen Guo, Yueping Guan, and Huizhou Liu. Isolation of lactoferrin from acid whey by magnetic affinity separation. Separation and Purification Technology, 56(2):168 - 174, 2007.
[4] Rhee-M.S. Imm J.Y. Noh, K.H. Separation of lactoferrin from model whey protein mixture by reverse micelles formed by cationic surfactant. Food Sci. Biotechnol., 14:131-136., 2005.
[5] Shalan Alwan Al-Mashikhi, Eunice Li-Chan, and ShuryoNakai. Separation of immunoglobulins and lactoferrin from cheese whey by chelating chromatography. Journal of Dairy Science, 71(7):1747 - 1755, 1988.
[6] S. Yoshida, Z. Wei, Y. Shinmura, and N. Fukunaga. Separation of lactoferrin-a and -b from bovine colostrum. Journal of Dairy Science, 83(10):2211 - 2215, 2000.
[7] Jonatan Andersson and Bo Mattiasson. Simulated moving bed technology with a simplified approach for protein purification: Separation of lactoperoxidase and lactoferrin from whey protein concentrate. Journal of Chromatography A, 1107(1):88 - 95, 2006.
[8] Rong Rong Lu, Shi Ying Xu, Zhang Wang, and Rui Jin Yang. Isolation of lactoferrin from bovine colostrum by ultrafiltration coupled with strong cation exchange chromatography on a production scale. Journal of Membrane Science, 297(1):152 - 161, 2007.
[9] T. Uchida, S. Dosako, K. Sato, and H. Kawakami. Sequential separation of lactoferrin, lactoperoxidase, and secretory component by sulfate-linked ion-exchange chromatography. Milchwissenschaft, 9(58):482-486, January 2003.
[10] O. Cascone Mariano Grasselli. Separation of lactoferrin from bovine whey by dye affinity chromatography. Netherlands Milk and Dairy Journal, 4(50):551-561, January 1996.
[11] Enrique Alvarez-Guerra and Angel Irabien. Extraction of lactoferrin with hydrophobic ionic liquids. Separation and Purification Technology, 98:432 - 440, 2012.
[12] Vojtech Adam, OndrejZitka, Petr Dolezal, Ladislav Zeman, Ales Horna, Jaromir Hubalek, Jan Sileny, Sona Krizkova, Libuse Trnkova, and Rene Kizek. Lactoferrin isolation using monolithic column coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors (Basel), 1(8):464-487, January 2008.
[13] J.H. Nuijens and H.H. Van Veen. Isolation of lactoferrin from milk, January 19 1999. 米国特許第５８６１４９１号.
[14] Conan J. Fee and Amita Chand. Capture of lactoferrin and lactoperoxidase from raw whole milk by cation exchange chromatography. Separation and Purification Technology, 48(2):143 - 149, 2006. Separation and Purification in the Food Industry.
[15] Chalore Teepakorn, Koffi Fiaty, and Catherine Charcosset. Comparison of membrane chromatography and monolith chromatography for lactoferrin and bovine serum albumin separation. Processes, 4(3), 2016.
[16] P. Milavec Zmak, H. Podgornik, J. Jancar, A. Podgornik, and A. Strancar. Transfer of gradient chromatographic methods for protein separation to convective interaction media monolithic columns. Journal of Chromatography A, 1006(1):195 - 205, 2003. International Symposium on Preparative and Industrial Chromatography and Allied Techniques.
[17] Shuichi Yamamoto and Ayako Kita. Theoretical background of short chromatographic layers: Optimization of gradient elution in short columns. Journal of Chromatography A, 1065(1):45 - 50, 2005. 1st Monolith Summer School.
[18] Bo Wang, Yakindra Prasad Timilsena, Ewan Blanch, and Benu Adhikari. Characteristics of bovine lactoferrin powders produced through spray and freeze drying processes. International Journal of Biological Macromolecules, 95:985 - 994, 2017.
[19] K. Sato and S.I. Dousako. Process of separating, purifying and recovering milk proteins capable of binding iron, March 27 1991. 欧州特許出願第１９９００１１７４４２号.
[20] K. Sato, M. Shiba, A. Shigematsu, N. Teduka, and A. Tomizawa. Method for producing lactoferrin, October 13 2004. 欧州特許出願第２００４０００８００８号.
[21] G. Rowe, H. Aomari, and D. Petitclerc. New purification method of lactoferrin, November 16 2006. 国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００６／０００７８０号.
[22] H. Kawakami, M. Tanimoto, and S. Dousako. Process for separating and purifying lactoferrin from milk using sulfate compound, September 9 1992. 欧州特許第０３４８５０８号.
[23] Z. Mozaffar, S.H. Ahmed, V. Saxena, and Q.R. Miranda. Sequential separation of whey, August 1 2000. 米国特許第６０９６８７０号.
[24] J. Souppe. Milk protein isolate and process for its preparation, December 10 2013. 米国特許第８６０３５６０号.
[25] Kussendrager K.D., Kivits M.G.C., and Verver A.B. Process for isolating lactoferrin and lactoperoxidase from milk and milk products, and products obtained by such process, June 16 1998. カナダ特許第２１２８１１１号.
[26] S. Okonogi, M. Tomita, T. Tomimura, Y. Tamura, and T. Mizota. A process for producing bovine lactoferrin in high purity, July 5 2006. 欧州特許第０２５３３９５号.
[27] K.D. Kussendrager, M.G.C. Kivits, and A.B. Verver. Process for isolating lactoferrin and lactoperoxidase from milk and milk products, and products obtained by such process, January 21 1997. 米国特許第５５９６０８２号.
[28] Jean-Paul Perraudin. Method for production of lactoferrin, August 2015. 米国特許第９１１５２１１号.
[29] Kevin Neil Pearce Shaojiang Chen. Method of preparing low-iron lactoferrin, February 2012. 欧州特許出願公開第２４２１８９４号.
[30] Hassan Mohamed Hassan Abdalla. Method for purifying lactoferrin, December 2014. 米国特許第９４５８２２５号.
[31] Jan H. Nuijens Veen Harry H. Van. Isolation of lactoferrin from milk, August 1995. 国際公開第１９９５／０２２２５８号.
[32] Linda Voswinkel, Thomas Vogel, and Ulrich Kulozik. Impact of the iron saturation of bovine lactoferrin on adsorption to a strong cation exchanger membrane. International Dairy Journal, 56:134 - 140, 2016.
[33] Satoshi Ito, Katsuya Ikuta, Daisuke Kato, Kotoe Shibusa, Noriyasu Niizeki, Hiroki Tanaka, Lynda Addo, Yasumichi Toki, Mayumi Hatayama, Junki Inamura, MotohiroShindo, Katsunori Sasaki, Naomi Iizuka, Mikihiro Fujiya, Yoshihiro Torimoto, and Yutaka Kohgo. Non-transferrin-bound iron assay system utilizing a conventional automated analyzer. ClinicaChimica Acta, 437:129 - 135, 2014.
[34] Robert J. Hilton, Matthew C. Seare, N. David Andros, Zachary Kenealey, Catalina Matias Orozco, Michael Webb, and Richard K. Watt. Phosphate inhibits in vitro Fe3+ loading into transferrin by forming a soluble Fe(iii) phosphate complex: A potential non-transferrin bound iron species. Journal of Inorganic Biochemistry, 110:1 - 7, 2012.
Claims (17)
- ラクトフェリンタンパク質及び／又はラクトペルオキシダーゼタンパク質を含む画分をこれらのタンパク質の少なくとも一つを含む原料から製造する方法であって、
前記原料は、乳、初乳、酸性又は甘性ホエーからなる群から選択され、
強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムを用いたクロマトグラフィー分離プロセスを利用し、
前記分離プロセスにおいて、前記カラムに前記原料を導入後、ｐＨ勾配又はｐＨ及び塩を組み合わせた勾配溶出を利用する、方法。 - 前記ｐＨ勾配が、約４．０～約８．０未満のｐＨ範囲内で開始する、請求項１に記載の方法。
- 前記ｐＨ勾配が、約８～１３未満のｐＨ範囲内で終了する、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記原料が、カラムへの前記原料の導入前に、ろ過される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 約８～約１１未満のｐＨ範囲、特に約８．９～約１０のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約６．６～約７．５のｐＨ範囲において溶出する画分Ａが回収される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約９．６～約１０．７のｐＨ範囲において溶出する画分Ｂが回収される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離プロセスが、
（ｉ）前記原料のｐＨをｐＨ７未満の値、特にｐＨ６．５未満に調整する工程、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）の原料を強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムと接触させる工程、次いで、
（ｉｉｉ）ｐＨ勾配緩衝剤を前記カラムに流し、それによって前記ｐＨ値を増加させる工程、及び
（ｉｖ）約８～約１１未満のｐＨ範囲、特に約８．０～約１０のｐＨ範囲、好ましくは約８．２～約１０のｐＨ範囲、より好ましくは約８．９～約１０のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍの範囲内のより高い伝導度において約６．６～約７．５のｐＨ範囲において溶出し、典型的にはラクトペルオキシダーゼを含む、画分Ａを回収する工程、及び／又は
（ｖ）約１０超～約１２．０のｐＨ範囲、好ましくは約１０．４超～約１２のｐＨ範囲、より好ましくは１１．０超～１２．０のｐＨ範囲、特に約１１超～約１１．７のｐＨ範囲、又は約５～５５ｍＳ／ｃｍのより高い伝導度において約９．６～約１０．７のｐＨ範囲において溶出し、典型的にはラクトフェリンを含む、画分Ｂを回収する工程、
（ｖｉ）任意で、前記画分Ａ及び／又は前記画分Ｂを、特に、中和、濃縮及び保存などの処理によって、さらに処理する工程、
を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記原料が、前記工程（ｉｉ）の前にろ過され、又は前記モノリスカラムが、前記工程（ｉｉ）の前に、約７未満、特に約６．５未満のｐＨ値を有する平衡化緩衝剤を用いて平衡化される、請求項７に記載の方法。
- 前記強カチオン交換体特性を有するモノリスカラムが、－ＳＯ３Ｈ修飾モノリスカラム、－ＣＯＯＨ修飾モノリスカラム、－ＯＳＯ３Ｈ修飾モノリスカラム又は－ＯＰＯ３Ｈ修飾モノリスカラムからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩勾配が塩の濃度によって行われ、特に前記塩勾配は、約５ｍＳ／ｃｍ～約５５ｍＳ／ｃｍの範囲内における伝導度に対応する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程（ｉｉｉ）又は前記工程（ｉｖ）の前に、前記カラムが、請求項８に記載の前記平衡化緩衝剤で洗い流される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ラクトフェリン及び前記ラクトペルオキシダーゼを含む画分は、乾燥され、特に噴霧乾燥によって乾燥される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ラクトフェリンの純度は９０％超であり、前記ラクトペルオキシダーゼの純度は５０％超であり、特に前記ラクトフェリンのＣ値は５０％超であり、前記ラクトフェリンのＡ値は１％超である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程（ｉｖ）又は前記工程（ｖ）の後、前記カラムは、ｐＨが約１２超の緩衝剤で前記カラムを洗い流すことにより洗浄される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
- Ｃ値が６０％超であり、Ａ値が１％超であるラクトフェリンを含む組成物。
- 前記Ｃ値が７０％以上であり、前記Ａ値が２％以上である、請求項１５に記載の組成物。
- 請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、ラクトフェリン又はラクトペルオキシダーゼを含む組成物。
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|---|---|---|---|---|
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| IE61701B1 (en) | 1986-07-17 | 1994-11-30 | Morinaga Milk Industry Co Ltd | Process for producing bovine lactoferrin in high purity |
| JPH0725800B2 (ja) | 1987-04-10 | 1995-03-22 | 雪印乳業株式会社 | 硫酸エステル化物を用いて乳からラクトフエリンを分離、精製する方法 |
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| US4889632A (en) | 1987-12-10 | 1989-12-26 | Ceskoslovenska Akademie Ved | Macroporous polymeric membranes for the separation of polymers and a method of their application |
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| CA2128111C (en) | 1992-01-15 | 1998-06-16 | Klaas Daniel Kussendrager | Process for isolating lactoferrin and lactoperoxidase from milk and milk products, and products obtained by such process |
| ZA932568B (en) * | 1992-04-24 | 1993-11-12 | Baylor College Midecine A Non | Production of recombinant human lactoferrin |
| US6096870A (en) * | 1994-01-05 | 2000-08-01 | Sepragen Corporation | Sequential separation of whey |
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| DE69520586T2 (de) | 1994-08-23 | 2001-11-15 | Bia Separations Doo | Verfahren und vorrichtung zur schnellen trennung und/oder umwandlung von substraten |
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| FR2841747B1 (fr) | 2002-07-02 | 2004-08-20 | Cie Laitiere Europeenne | Isolat de proteines de lait et procede pour sa preparation |
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| EP1899375A4 (en) | 2005-05-13 | 2009-05-06 | Crea Biopharma Inc | NEW METHOD FOR THE PURIFICATION OF LACTOFERRIN |
| ITBO20060891A1 (it) * | 2006-12-28 | 2008-06-29 | Cesare Pasquini | Lievito ricombinante lattoferrina suina, vettore di espressione del gene lattoferrina suina, lattoferrina suina ricombinante e processi di produzione degli stessi |
| WO2010112988A1 (en) | 2009-01-28 | 2010-10-07 | Jean-Paul Perraudin | Method for production of lactoferrin |
| US9359426B2 (en) | 2009-04-24 | 2016-06-07 | Westland Co-Operative Diary Company Limited | Method of preparing low-iron lactoferrin |
| US20140073766A1 (en) * | 2012-09-07 | 2014-03-13 | Avianax Llc | METHODS FOR PURIFYING IgY ANTIBODIES |
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