KR20230086688A - 양이온성 단백질 분획의 정제 방법 및 이로부터 수득된 분획 - Google Patents
양이온성 단백질 분획의 정제 방법 및 이로부터 수득된 분획 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 내독소 제거에 의한 양이온성 단백질 분획의 정제 방법, 및 또한 이렇게 수득된 정제 분획에 관한 것이다.
Description
본 발명은 내독소 제거에 의한 양이온성 단백질 분획의 정제 방법에 관한 것이고; 본 발명은 또한 이렇게 수득된 정제 분획에 관한 것이다.
내독소는 그람 음성 박테리아의 벽 구성요소이다. 내독소는 이러한 박테리아의 용해 또는 파괴 동안 방출되며, 이러한 유형의 박테리아에 의한 감염 동안 패혈성 쇼크와 같은 전신 염증 증상에 책임이 있다. 이러한 이유로, 내독소 함량의 한계는 FDA(https://www.fda.gov/inspections-compliance-enforcement-and-criminal-investigations/inspection-technical-guides/bacterial-endotoxinspyrogens)와 같은 기관에 의한 약물 또는 주사 제품(예컨대 물)에 대해 정의된다. 주사 가능한 용도 외에도, 화장품 분야, 의료 기기 분야 및 영양 분야에서의 용도는 점점 더 사용되는 성분의 내독소 함량의 감소를 필요로 하고 있다.
지질다당류(LPS)라고도 하는 내독소는 글리칸 사슬이 부착된 지질(지질 A)로 구성된다. 글리칸 부분은 2개 부분으로 이루어지는데, 1개 부분은 코어 올리고당이라고 하고 다른 부분은 O 측쇄 다당류(O 항원)라고 한다. 도 1은 이의 개략도를 보여준다(Maeshima & Fernandez 2013). 각각의 LPS 분자는 지질 A의 포스페이트 및 산 기로부터의 그리고 코어 올리고당으로부터의 다중 음전하를 갖는다. 내독소는 열적으로 그리고 화학적으로 안정한 것으로 알려져 있다. 내독소 함량은 1 EU(내독소 단위)와 동등한 IU(국제 단위)로 표현되며(3.4 세균 내독소 시험, The International Pharmacopoeia - 제9판); 표시로서, 1 ng의 LPS는 약 10 EU(WHO 국제 표준, 내독소에 대한 3rd IS)에 상응하며, 이는 박테리아 균주의 기원에 따라 상이할 수 있다.
생명공학적 방법으로부터 유래된 단백질에 기초한 약물 개발 및 생물학적 물질의 구현 분야에서, 내독소를 제거하기 위한 다양한 단백질 정제 방법이 개발되어 왔으며; 이러한 방법은 예를 들어 용매 추출, 친화성 크로마토그래피(예를 들어 폴리믹신 B 그래프트 수지, 그러나 식품 제조용으로 승인되지 않은 처리), 막 기법(예를 들어 한외여과), 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피이다(Petsch, D., 2000. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology 76, 97-119; Ongkudon, C.M., Chew, J.H., Liu, B., Danquah, M.K., 2012. Chromatographic Removal of Endotoxins: A Bioprocess Engineer's Perspective. ISRN Chromatography 2012, 1-9).
그러나, 양이온성 단백질 분획으로부터 내독소를 제거하는 것은 대부분의 양이온성 단백질, 예컨대 리소자임 때문에 달성하기 어려운 것으로 알려져 있고(Petsch, D., Deckwer, W.-D., Anspach, F.B., 1998. Proteinase K Digestion of Proteins Improves Detection of Bacterial Endotoxins by the LimulusAmebocyte Lysate Assay: Application for Endotoxin Removal from Cationic Proteins. Analytical Biochemistry 259, 42-47), 리보뉴클레아제 A 및 락토페린(Elass-Rochard, E., Roseanu, A., Legrand, D., Trif, M., Salmon, V., Motas, C., Montreuil, J., Spik, G., 1995. Lactoferrin-lipopolysaccharide interaction: involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5 lipopolysaccharide. Biochem J 312, 839-845)은 몇몇의 음전하를 갖는 LPS 분자와 강한 상호작용을 갖는다.
양이온성 단백질, 특히 락토페린에 결합된 내독소를 제거하는 방법은 WO 2009/009706(Glanbia Nutritionals)에 제안되어 있으며; 이 방법은 a) 단백질을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; b) 첨가된 계면활성제의 부재 하에 낮은 이온 강도 용액으로 내독소를 용리하는 단계; c) 높은 이온 강도 용액으로 단백질을 용리하는 단계를 포함한다. 이 방법으로 1 IU/mg 미만의 내독소를 함유하는 락토페린 단리물을 수득할 수 있다.
락토페린에 결합된 내독소를 제거하기 위한 유사한 방법은 WO 2010/112988(Jean-Paul Perraudin)에 제안되어 있으며; 이 방법으로 50 pg/mg(즉, 약 0.5 IU/mg) 미만의 내독소를 함유하는 락토페린 단리물을 수득할 수 있다.
이러한 2개의 방법은, 양이온 교환 수지와 높은 친화도를 갖는 락토페린과 같은 양이온성 단백질을 함유하는 분획으로부터, 이러한 양이온성 단백질을 이들 수지 상에 고정시킨 후, 양이온 교환 수지로부터 상기 양이온성 단백질을 탈착시키지 않으면서 이러한 양이온성 단백질에 결합된 내독소가 해리되고 낮은(low) 내지 중간(medium) 이온 강도의 용액(0.25 내지 0.5M NaCl 용액)으로 제거될 수 있음을 보여준다. 양이온 교환 수지와의 이러한 친화도는 양이온성 단백질의 구성분인 양이온성 아미노산(라이신, 아르기닌 및 히스티딘)으로부터 유래된 양전하(이의 크기 및 이의 위치)에 의존한다. 그러나, 이들 방법으로는 양이온 교환 수지와 낮은 내지 중간의 친화도를 갖는 양이온성 단백질 또는 양이온성 단백질 분획에 존재하거나 결합된 내독소를 효과적으로 제거할 수 없는데, 이들 단백질이 내독소와 함께 용리될 것이기 때문이다.
본 발명은 양전하의 크기 및 위치에 관계없이 양이온성 단백질의 분획 또는 양이온성 단백질 또는 양이온성 단백질 분획에 결합된 단백질에 존재하는 내독소를 효율적으로 제거할 수 있는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 양이온성 단백질 분획의 정제 방법에 관한 것이다:
a) 하기의 용액을 수득하는 단계로서:
- 6.5 내지 7.5의 pH를 가짐;
- 모두 등전점이 7.5 초과인 양이온성 단백질 및 등전점이 6.5 미만인 산성 단백질을 총 단백질의 중량을 기준으로 1 중량% 미만의 함량으로 포함함;
- 45 mS/cm 초과, 바람직하게는 50 mS/cm 또는 60 mS/cm 초과의 전도도를 가짐;
예를 들어 제한 없이, 이러한 용액은 하기로부터 선택될 수 있는, 단계:
· 양이온 교환 수지(예를 들어 SP Sepharose Big Beads, Cytiva Life Sciences)의 NaCl 용액 100 mS/cm로 용리된 우유로부터 유래된 락토페린을 함유하는 용액;
· 양이온 교환 수지(예를 들어 SPEC 70 SLS, Sartorius)에서 10% NaCl로 용리된 우유로부터 유래된 양이온성 단백질의 전체 분획을 함유하는 용액;
· 60 mS/cm의 전도도까지 포화 NaCl 용액으로 보충된 양이온 교환 수지(예를 들어 SP Sepharose Big Beads, Cytiva Life Sciences)의 NaCl 용액 40 mS/cm와 우유로부터 유래된 양이온성 단백질(락토퍼옥시다제, 리보뉴클레아제, 락토페린을 함유함)의 전체 분획을 함유하는 용액;
· 100 mS/cm의 용리물로부터 한외여과에 의한 소 락토페린의 농축 용액;
· 60 mS/cm의 전도도까지 포화 NaCl 용액이 보충된 미세여과된 유청 양이온성 단백질 단리물의 용액(단백질/건조 물질 >90%);
· 5% 식염수로 재구성된 카프린 락토페린 분말;
· 0.5 M NaCl 용액으로 재구성된 난백의 리소자임 분말.
b) 컷오프 역치가 5 내지 50 kDa인 한외여과막을 사용하여 내독소가 없는 물, 바람직하게는 한외여과된 삼투수로 상기 양이온성 단백질 용액을 정용여과하는 단계로서, 상기 컷오프 역치는 용액의 양이온성 단백질의 분자량의 함수로서 선택되며, 이는 일반적으로 5 내지 50 kDa이지만 20 kDa 이하 또는 1 내지 20 kDa 또는 5 내지 20 kDa 또는 20 kDa, 10 kDa 이하 또는 1 내지 10 kDa 또는 5 내지 10 kDa 또는 10 kDa, 5 kDa 이하 또는 1 내지 5 kDa 또는 5 kDa 또는 1 kDa일 수 있고, 정용여과는 전도도가 10 mS/cm 이하, 바람직하게는 5 mS/cm 이하, 더욱 바람직하게는 1 mS/cm 이하가 될 때까지 수행되고; 양이온성 단백질 용액의 전도도를 45 mS/cm 초과에서 10 mS/cm 미만으로 떨어뜨리는 이러한 정용여과 동안, 이 용액은 음이온 교환 매질, 바람직하게는 막 매질(예를 들어 Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech) 또는 모노리식(monolithic) 매질(예를 들어 CIMmultus QA, BIA Separations)을 통해 연속적으로 통과시키고, 매질은 용액에 존재하는 실질적으로 모든 내독소를 흡착시키고 제거하기 위해 입체 배제 효과가 거의 없게 하는 것인, 단계;
c) 선택적으로, 미생물 부하를 줄이기 위해 컷오프 역치가 0.2 내지 1.4 μm인 막을 이용한 미세여과 단계;
d) 선택적으로, 용액을 분무 건조 또는 동결 건조하여 분말형 양이온성 단백질 단리물을 수득하는 단계.
도 2는 본 발명에 따른 방법의 개략도를 나타낸다. 도 3a 및 3b는 본 발명에 따른 방법의 단계 b)의 구현을 가능하게 하는 다이어그램의 예를 도시한다.
대안적으로, 본 발명은 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법에 관한 것이다:
a) 하기의 용액을 수득하는 단계:
- 6.5 내지 7.5의 pH를 가짐;
- 모두 등전점이 7.5 초과인 양이온성 단백질 및 등전점이 6.5 미만인 산성 단백질을 총 단백질의 중량을 기준으로 1 중량% 미만의 함량으로 포함함;
- 1 mS/cm 미만의 전도도를 가짐;
특정 구현예에 따르면, 이러한 제2 방법은 이전 방법으로 수득된 단리물에 적용된다.
b) 상기 용액을 음이온 교환 매질, 바람직하게는 막 매질(예를 들어 Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech) 또는 모노리식 매질(예를 들어 CIMmultus QA, BIA Separations)을 통해 통과시키고, 매질은 용액에 존재하는 실질적으로 모든 내독소를 흡착시키고 제거하기 위해 입체 배제 효과가 거의 없게 하는 것이며; 상기 용액을 바람직하게는 음이온 교환 매질을 통해 바람직하게는 수회, 바람직하게는 적어도 3회 통과시키는 단계;
c) 선택적으로, 최종 생성물의 적합성(conformity)에 대해 허용 가능한 수준으로 미생물 부하를 줄이기 위해 0.2 내지 1.4 μm의 컷오프 역치를 갖는 막으로 미세여과하는 단계;
d) 선택적으로, 상기 용액을 분무 건조 또는 동결 건조하여 분말형 양이온성 단백질 단리물을 수득하는 단계.
도 4는 본 발명에 따른 대안적인 방법의 구현을 가능하게 하는 장치의 개략도를 도시한다.
본 발명은 또한 수득될 수 있거나 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되고 5 IU/mg 단백질 미만, 바람직하게는 1 IU/mg 단백질 미만, 훨씬 더 바람직하게는 0.1 IU/mg 단백질 미만의 내독소 함량을 갖는 양이온성 단백질 분획에 관한 것이다.
일 구현예에 따르면, 분획의 양이온성 단백질은 우유로부터 유래되며; 그런 다음 이는 주로 락토페린으로 구성되거나 주로 락토퍼옥시다제로 구성되거나 주로 리보뉴클레아제로 구성되거나 20 μg/g 단백질 초과, 바람직하게는 50 μg/g 초과, 가장 바람직하게는 100 내지 200 μg/g 함량의 TGF-β를 함유할 수 있다. ~로 주로 구성된다는 것은 건조 물질의 중량을 기준으로 50 중량% 이상, 90 중량% 초과 또는 95 중량% 초과의 단백질을 포함하는 분획을 의미한다. 본 발명에 따른 분획은 또한 우유 또는 유청의 양이온성 단백질의 혼합물을 주로 함유할 수 있다.
도 1: LPS의 개략도(Maeshima & Fernandez 2013)이며;
도 2: 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법의 개략도이고;
도 3: 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법의 다이어그램의 예이며; 도 3a: 정용여과와 음이온 교환 매질을 병렬로 조합하는 방법; B: 정용여과와 음이온 교환 매질을 직렬로 조합하는 방법이며;
도 4: 양이온성 단백질 단리물을 정제하기 위한 대안적인 방법의 개략도이다.
도 2: 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법의 개략도이고;
도 3: 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법의 다이어그램의 예이며; 도 3a: 정용여과와 음이온 교환 매질을 병렬로 조합하는 방법; B: 정용여과와 음이온 교환 매질을 직렬로 조합하는 방법이며;
도 4: 양이온성 단백질 단리물을 정제하기 위한 대안적인 방법의 개략도이다.
실시예
실시예 1: 액체 소 락토페린 농축물을 이용한 벤치 테스트
1) 공업용 양이온 교환 크로마토그래피법 SP Sepharose Big Beads(Cytiva Sweden)를 사용하여 방사형 유동 컬럼(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)에 저온살균된 탈지 우유를 통과시킨 후, 36 mS/cm 및 110 mS/cm에서 NaCl 용액으로 연속적으로 용리하고 최종적으로 2차 용리물을 20 kDa MWCO 한외여과에서 농축시킴으로써 우유로부터 유래된 락토페린의 액체 농축물을 수득하였다.
단백질 농도는 13 mg/mL이고, 단백질 상의 소 락토페린의 순도는 95%이며, 이 용액의 전도도는 65 mS/cm이고, pH는 6.8("농축물 LF 1")이다.
2) Start AXH 한외여과 중공사 모듈(MWCO 10 kDa)과 함께 AKTA flux s(Cytiva Sweden)를 사용하여 벤치 규모에서 65 mS/cm의 이러한 액체 소 락토페린 농축물 75 mL를 정용여과하였다. 최대 5 mS/cm까지 불연속 방식으로 Milli-Q(Millipore)에 의해 제조된 초순수 탈염수를 사용하여 정용여과를 수행하였고; 잔류물의 부피가 초기 부피의 50%에 도달하였을 때, 초순수한 물을 초기 부피까지 첨가하고 이 과정을 5회 반복하였다. 따라서, 탈염 소 락토페린 농축물을 수득하였다("농축물 LF 2").
위에서 설명한 것과 동일한 정용여과 절차를 수행하였지만, 이러한 정용여과에 의해 전도도가 65 mS/cm로부터 5 mS/cm로 점차적으로 감소하는 동안 이번에는 농축물(잔류물)을 Q 유형(4차 암모늄), Sartobind® Q nano 3 mL(Sartorius Stedim)의 음이온 교환 막 카트리지를 통해 병렬로 재순환에서 15 mL/분의 유속으로 80분 동안 통과시켰다. 따라서, 정용여과에 의해 탈염되고 음이온 교환막으로 처리된 소 락토페린 농축물이 수득되었다("농축물 LF 3").
3) 정용여과로 수득된 각각의 탈염 락토페린 농축물 내 내독소 농도를 Lonza's 키네틱 발색(kinetic chromogenic) LAL(리물루스 아베도사이트 용해물: limulus amoebocyte lysate) 분석으로 측정하였다. 병행하여, 각각의 농축물 내 소 락토페린의 농도를 HPLC PI 방법(컬럼 C18 300 Å, 0.1% TFA/CH3CN 구배, 280 nm에서 검출)으로 측정하였다. 결과를 IU/mg 소 락토페린으로 표현한다.
| 농축물 LF 1 | 농축물 LF 2 | 농축물 LF 3 | |
| 내독소 (IU/mg LF) | 55.8 | 50.9 | 0.084 |
표 1 - 소 락토페린 농축물에 존재하는 내독소
실시예 2: 소 락토페린의 액체 단리물을 사용한 벤치 테스트
1) 소 유래 락토페린의 액체 미세여과물은 공업용 양이온 교환 크로마토그래피 방법인 SP Sepharose Big Beads(Cytiva Sweden)를 사용하여 방사형 유동 컬럼(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)에서 130 g/L의 건조 물질까지의 역삼투에 의해 농축된 저온살균 탈지우유를 통과시킨 다음, 38 mS/cm에서 NaCl 용액으로 연속적으로 용리함으로써 얻었고, 10%, 제2 용리물을 20 kDa MWCO 한외여과로 농축한 다음 10 kDa MWCO 한외여과로 삼투수를 1 mS/cm까지 정용여과하고, 마지막으로 정용여과된 잔류물을 이중층의 0.8 μm 세라믹 막(Membrarox®, Pall Corporation)에서 미세여과하였다.
2) 이 액체 소 락토페린 단리물을 Milli-Q(Millipore)에서 제조한 초순수 탈이온수로 희석하였고, 단백질 농도가 16 mg/mg(w/v)이고 단백질에 대한 소 락토페린의 순도가 95%이며, 이 용액의 전도도가 0.15 mS/cm이고 pH는 6.9를 갖는다("단리물 LF 1"). 75 mL의 이 액체 락토페린 단리물을 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지(Sartorius Stedim)를 통해 90분 동안 재순환에서 13 mL/분의 유속으로 통과시켰다("단리물 LF 2").
3) Lonza's 키네틱 발색 LAL(리물로스 아메보사이트 용해물) 검정을 이용하여 각각의 락토페린 단리물 내 내독소의 농도를 측정하였다. 병행하여, 각각의 농축물 내 소 락토페린의 농도를 HPLC PI 방법(컬럼 C18 300 Å, 0.1% TFA/CH3CN 구배, 280 nm에서 검출)으로 측정하였다. 결과는 소 락토페린의 IU/mg으로 표시된다.
| 단리물 LF 1 | 단리물 LF 2 | |
| 내독소 (IU/mg LF) | 62.7 | <0.05 |
표 2 - 소 락토페린 단리물에 존재하는 내독소
실시예 3: 소 락토페린의 액체 단리물을 사용한 벤치 테스트
1) 소 유래 락토페린의 액체 미세여과물은 공업용 양이온 교환 크로마토그래피 방법인 SP Sepharose Big Beads(Cytiva Sweden)를 사용하여 방사형 유동 컬럼(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)에서 저온살균 탈지우유를 통과시킨 다음, 36 mS/cm에서 그리고 110 mS/cm에서 NaCl 용액으로 연속적으로 용리함으로써 얻었고, 제2 용리물을 20 kDa MWCO 한외여과로 농축한 다음 10 kDa MWCO 한외여과로 삼투수를 1 mS/cm까지 정용여과하고, 마지막으로 정용여과된 잔류물을 이중층의 1.4 μm 세라믹 막(Membrarox®, Pall Corporation)에서 미세여과하였다.
단백질 농도는 147 mg/mL이고, 단백질 상의 소 락토페린의 순도는 95%이고, 이 용액의 전도도는 0.8 mS/cm이고, pH는 6.8이다("단리물 LF 3").
2) 70 mL의 이 액체 락토페린 단리물을 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지(Sartorius Stedim)에 6 mL/분의 유속("단리물 LF 4")으로 통과시켰다.
회수된 락토페린 액체 단리물(65 mL)을 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지에 통과시킨 후, 회수된 락토페린 액체 단리물을 다시 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지에 통과시켰으며, 총 3회 통과시켰다("단리물 LF 5").
회수된 락토페린 액체 단리물(60 mL)을 총 6개의 등가 통과("단리물 LF 6")에서 6 mL/분의 유속으로 30분 동안 재순환하면서 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지에 통과시켰다.
회수된 락토페린 액체 단리물(55 mL)을 총 10개의 등가 통과("단리물 LF 7")에서 6 mL/분의 유속으로 37분 동안 재순환하면서 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지에 통과시켰다.
3) Lonza's 키네틱 발색 LAL(리물로스 아메보사이트 용해물) 검정을 이용하여 각각의 락토페린 단리물 내 내독소의 농도를 측정하였다. 결과는 단백질의 IU/mg로 표시된다.
| 단리물 LF 3 | 단리물 LF 4 | 단리물 LF 5 | 단리물 LF 6 | 단리물 LF 7 | |
| 내독소 (IU/mg 단백질) |
59.8 | 7.2 | 4.6 | 2.2 | 1.5 |
표 3 - 소 락토페린 단리물에 존재하는 내독소
실시예 4: 소 유래 양이온성 단백질을 함유하는 TGF-β의 액체 단리물을 이용한 벤치 테스트
1) 특허 EP 1912513의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 우유 유래 TGF-β-함유 양이온성 단백질 분획을 얻었다. ELISA 키트(Quntikine TGF-2, R&D Systems)로 분석된 분무 건조 전에 수득된 미세여과물 내 TGF-β2 함량은 115 μg/g 단백질이었다.
2) 이 TGF-β-함유 액체 양이온성 단백질 단리물을 Milli-Q(Millipore)에서 제조한 초순수 탈이온수로 단백질 농도가 2.6 mg/mg(w/v)가 되도록 희석하였으며, 이 용액의 전도도는 0.89 mS/cm이고, pH는 7.1이다("우유 양이온성 단백질 단리물 1"). 이 액체 우유 양이온성 단백질 단리물 50 mL를 Sartobind® Q nano 3 mL 카트리지(Sartorius Stedim)를 통해 5 mL/분의 유속으로 70분 동안 재순환시켰다("우유 양이온성 단백질 단리물 2")
3) Lonza's 키네틱 발색 LAL(리물로스 아메보사이트 용해물) 분석법으로 각각의 액체 우유 양이온성 단백질 단리물 내 내독소의 농도를 측정하였다. 결과는 단백질의 IU/mg로 표시된다.
| 우유 양이온성 단백질 단리물 1 | 우유 양이온성 단백질 단리물 2 | |
| 내독소 (IU/mg 단백질) |
9.75 | 0.099 |
표 4 - TGF-β를 함유하는 우유 양이온성 단백질 단리물에 존재하는 내독소
Claims (9)
- 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 양이온성 단백질 분획의 정제 방법:
a) 하기의 용액을 수득하는 단계로서:
- 6.5 내지 7.5의 pH를 가짐;
- 모두 등전점이 7.5 초과인 양이온성 단백질 및 등전점이 6.5 미만인 산성 단백질을 총 단백질의 중량을 기준으로 1 중량% 미만의 함량으로 포함함;
- 45 mS/cm 초과의 전도도를 가짐;
b) 컷오프 역치가 5 내지 50 kDa인 한외여과막을 사용하여 내독소가 없는 물, 바람직하게는 한외여과된 삼투수로 상기 양이온성 단백질 용액을, 전도도가 10 mS/cm 이하, 바람직하게는 5 mS/cm 이하, 더욱 바람직하게는 1 mS/cm 이하가 될 때까지 정용여과하는 단계로서; 이러한 정용여과 동안, 이 용액은 음이온 교환 매질, 바람직하게는 막 또는 모노리식(monolithic) 매질을 통해 연속적으로 통과하는, 단계;
c) 선택적으로, 컷오프 역치가 0.2 내지 1.4 μm인 막을 이용한 미세여과 단계;
d) 선택적으로, 용액을 분무 건조 또는 동결 건조하는 단계. - 하기 단계 a) 내지 d)를 포함하는 양이온성 단백질 단리물의 정제 방법:
a) 하기의 용액을 수득하는 단계:
- 6.5 내지 7.5의 pH를 가짐;
- 모두 등전점이 7.5 초과인 양이온성 단백질 및 등전점이 6.5 미만인 산성 단백질을 총 단백질의 중량을 기준으로 1 중량% 미만의 함량으로 포함함;
- 1 mS/cm 미만의 전도도를 가짐;
b) 상기 용액을 음이온 교환 매질, 바람직하게는 막 또는 모노리식 매질을 통해 통과시키는 단계로서; 상기 용액을 바람직하게는 음이온 교환 매질을 통해 수회, 바람직하게는 적어도 3회 통과시키는 단계;
c) 선택적으로, 컷오프 역치가 0.2 내지 1.4 μm인 막을 이용한 미세여과 단계;
d) 선택적으로, 상기 용액을 분무 건조 또는 동결 건조하여 분말형 양이온성 단백질 단리물을 수득하는 단계. - 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 양이온성 단백질 분획으로서, 0.1 IU/mg 단백질 미만의 내독소 함량을 갖는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획.
- 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 수득된 양이온성 단백질 분획으로서, 5 IU/mg 단백질 미만, 바람직하게는 1 IU/mg 단백질 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 IU/mg 단백질 미만의 내독소 함량을 갖는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획.
- 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 분획의 양이온성 단백질은 우유 유래인 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 단백질은 주로 락토페린으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 단백질은 주로 락토퍼옥시다제로 구성되는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 단백질은 주로 리보뉴클레아제로 구성되는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획. - 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 단백질은 20 μg/g 단백질 초과의 TGF-β를 함유하는 것을 특징으로 하는, 양이온성 단백질 분획.
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