WO2022078976A1 - Procede de purification de fraction de proteines cationiques et fraction ainsi obtenue - Google Patents

Procede de purification de fraction de proteines cationiques et fraction ainsi obtenue Download PDF

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Takashi Mikogami
Carine LECHEVIN
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a process for the purification of cationic protein fractions by elimination of endotoxins; it also relates to the purified fractions thus obtained.
  • Endotoxins are the cell wall components of Gram-negative bacteria. Released during the lysis or destruction of these bacteria, they are responsible for systemic inflammatory manifestations, such as septic shock, during infections by this type of bacteria. It is for this reason that an endotoxin content limit is defined for drugs or injectable products (such as water) by authorities such as
  • Endotoxins also called lipopolysaccharides (LPS)
  • LPS lipopolysaccharides
  • the glycan part is composed of two parts, one part called central oligosaccharide (core oligosaccharide) and the other part called O side chain polysaccharide (O antigen);
  • Figure 1 illustrates their schematic representation (Maeshima & Fernandez 2013).
  • Each molecule of LPS has multiple negative charges from the phosphate and acid groups of lipid A and the central oligosaccharide.
  • Endotoxins are known to be thermally and chemically stable.
  • the endotoxin content is expressed in IU (international unit) which is equivalent to one EU (endotoxin unit) (3.4 Test for bacterial endotoxins, The International Pharmacopoeia - 9th edition); as an indication, 1 ng of LPS corresponds to approximately 10 EU (WHO International Standard, 3rd IS for endotoxin), this may be different depending on the origin of the strains of bacteria.
  • Proteinase K Digestion of Proteins Improves Detection of Bacterial Endotoxins by the LimulusAmebocyte Lysate Assay: Application for Endotoxin Removal from Cationic Proteins.Analytical Biochemistry 259, 42-47), ribonuclease A and lactoferrin (Elass-Rochard, E., Roseanu , A., Legrand, D., Trif, M., Salmon, V., Motas, C., Montreuil, J., Spik, G., 1995.
  • Lactoferrinlipopolysaccharide interaction involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5 lipopolysaccharide. Biochem J 312, 839-845) have strong interactions with LPS molecules which have several negative charges.
  • a method for eliminating endotoxins bound to a cationic protein, in particular lactoferrin has been proposed in WO 2009/009706 (Glanbia Nutritionals); this method comprises the steps of a) binding the protein to a cation exchange resin; b) eluting the endotoxin using a low ionic strength solution in the absence of added surfactant; c) eluting the protein with a high ionic strength solution. This process makes it possible to obtain a lactoferrin isolate containing less than 1 IU/mg of endotoxins.
  • the present invention proposes a method making it possible to effectively eliminate the endotoxins present in a fraction of cationic proteins or bound to a cationic protein or a fraction of cationic proteins regardless of the magnitude and location of their positive charges.
  • the present invention thus relates to a method for purifying a cationic protein fraction comprising the following steps a) to d): a) obtaining a solution:
  • such a solution can be chosen from:
  • an egg white lysozyme powder reconstituted with a 0.5 M NaCl solution • an egg white lysozyme powder reconstituted with a 0.5 M NaCl solution.
  • Figure 2 illustrates a schematic representation of the method according to the invention.
  • Figures 3 A and 3B illustrate examples of diagrams allowing the implementation of step b) of the method according to the invention.
  • the present invention relates to a process for purifying a cationic protein isolate comprising the following steps a) to d): a) obtaining a solution:
  • this second method applies to the isolate obtained by the previous method.
  • an anion exchange support preferably membrane (eg Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech) or monolithic (eg CIMmultus QA, BIA Separtions), the support being such that it has little steric exclusion effect, in order to adsorb and eliminate almost all of the endotoxins present in the solution; the solution is preferably passed several times through an anion exchange medium, preferably at least 3 times; c) optionally, microfiltration with a membrane having a cut-off threshold of between 0.2 and 1.4 ⁇ m in order to reduce the microbial load to an acceptable level for the conformity of the finished product; d) optionally, spray-drying or freeze-drying the solution to obtain a powdered cationic protein isolate.
  • membrane eg Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech
  • monolithic eg CIMmultus QA, BIA Separtions
  • Figure 4 illustrates a schematic representation of a device allowing the implementation of the alternative method according to the invention.
  • the present invention also relates to a fraction of cationic proteins capable of being obtained or such as it is obtained by the methods according to the invention and such that it has an endotoxin content of less than 5 IU/mg of protein, preferably less than 1 IU/mg protein, more preferably less than 0.1 IU/mg protein.
  • the cationic proteins of the fraction come from milk; they can then consist mainly of lactoferrin or mainly consist of lactoperoxidase or mainly consist of ribonucleases or even contain TGF-P in a content greater than 20 pg/g, preferably greater than 50 pg/g, most preferably between 100 and 200 ⁇ g/g protein.
  • a fraction comprising at least 50%, but also greater than 90% or 95% by weight of proteins relative to the weight of the dry matter.
  • the fractions according to the invention can also mainly contain a mixture of cationic milk or whey proteins.
  • Figure 1 schematic representation of an LPS (Maeshima & Fernandez 2013);
  • FIG. 2 Schematic representation of the purification process of the cationic protein isolate
  • Figure 3 Examples of Cationic Protein Isolate Purification Process Flow Chart
  • Figure 4 Schematic representation of the alternative purification process of the cationic protein isolate.
  • Example 1 bench test with a liquid concentrate of bovine lactoferrin
  • a liquid concentrate of lactoferrin from cow's milk was obtained using an industrial cation exchange chromatography process, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) in a radial flow column (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) by passing the milk of pasteurized skimmed cow, then eluting successively with a solution of NaCl at 36 mS/cm and that at 110 mS/cm, finally the 2nd eluate was concentrated on an ultrafiltration of MWCO 20 kDa.
  • the protein concentration is 13 mg/mL, the purity of bovine lactoferrin on proteins is 95%, the conductivity of this solution is 65 mS/cm, and the pH is 6.8 (“Concentrate LF 1”) .
  • Example 2 bench-top test with a liquid isolate of bovine lactoferrin
  • a liquid microfiltrate of lactoferrin from cow's milk was obtained using an industrial cation exchange chromatography process, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) in a radial flow column (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) by passing the milk pasteurized skimmed cow's milk concentrated by reverse osmosis to 130 g/L of dry matter, then eluting successively with a NaCl solution at 38 mS/cm and that at 10%, then the 2nd eluate was concentrated on an ultrafiltration of MWCO 20 kDa, then diafiltered on an ultrafiltration of MWCO 10 kDa with reverse osmosis water up to 1 mS/cm, finally the diafiltered retentate was microfiltered on a ceramic membrane at 0.8 ⁇ m in double layer (Membrarox®, Pali Corporation) .
  • Example 3 bench-top test with a liquid isolate of bovine lactoferrin
  • a liquid microfiltrate of lactoferrin from cow's milk was obtained using an industrial cation exchange chromatography process, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) in a radial flow column (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) by passing pasteurized skimmed cow's milk, then eluting successively with a NaCl solution at 36 mS/cm and that at 110 mS/cm, then the 2nd eluate was concentrated on an ultrafiltration of 20 kDa MWCO, then diafiltered on an ultrafiltration of 10 kDa MWCO with osmosed water up to 1 mS/cm, finally the diafiltered retentate was microfiltered on a ceramic membrane at 1.4 pm in double layer (Membrarox®, Pali Corporation).
  • the protein concentration is 147 mg/mL, the purity of bovine lactoferrin on proteins is 95%, the conductivity of this solution is 0.8 mS/cm, and the pH is 6.8 ("Isolat LF 3 ").
  • the recovered lactoferrin liquid isolate (60 mL) was passed through the recirculating Sartobind® Q nano 3 mL cartridge for 30 minutes at a flow rate of 6 mL/min for a total of 6 equivalent passes (“Isolat LF 6”) .
  • the recovered lactoferrin liquid isolate (55 mL) was passed through the recirculating Sartobind® Q nano 3 mL cartridge for 37 minutes at a flow rate of 6 mL/min for a total of 10 equivalent passes (“Isolat LF 7”) .
  • Example 4 bench-top test with a liquid cationic protein isolate containing
  • a cationic protein fraction containing TGF-P from cow's milk was obtained according to the method described in Example 1 of Patent EP 1912513.
  • the content of TGF-P2 analyzed by the ELISA kit (Quntikine TGF-2, R&D Systems) in the microfiltrate obtained before spray drying was 115 pg/g proteins.
  • This liquid cationic protein isolate containing TGF-P was diluted with ultrapure deionized water prepared by Milli-Q (Millipore) to have a protein concentration of 2.6 mg/mg (w/v), the conductivity of this solution is 0.89 mS/cm, and the pH is 7.1 ("Cationic Milk Protein Isolate 1"), 50 mL of this liquid cationic milk protein isolate was recirculated through a cartridge of Sartobind® Q nano 3 mL (Sartorius Stedim) at a flow rate of 5 mL/min for 70 minutes.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de purification de fractions de protéiques cationiques par élimination des endotoxines; elle se rapporte également aux fractions purifiées ainsi obtenues.

Description

PROCEDE DE PURIFICATION DE FRACTION DE PROTEINES CATIONIQUES ET FRACTION AINSI OBTENUE
La présente invention se rapporte à un procédé de purification de fractions de protéiques cationiques par élimination des endotoxines ; elle se rapporte également aux fractions purifiées ainsi obtenues.
Les endotoxines sont les composants de la paroi des bactéries à Gram négatif. Libérées lors de la lyse ou destruction de ces bactéries, elles sont responsables des manifestations systémiques inflammatoires, telles que le choc septique, lors des infections par ce type de bactéries. C’est pour cette raison qu’une limite de teneur en endotoxine est définie pour les médicaments ou les produits (tels que l’eau) injectables par les autorités comme la
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teclinical-! Même en dehors d’utilisations injectables, les utilisations telles que dans le domaine cosmétique, celui des dispositifs médicaux, ou encore de la nutrition exigent de plus en plus de réduire la teneur en endotoxines des ingrédients utilisés.
Les endotoxines, aussi appelées les lipopolysaccharides (LPS), sont constituées d'un lipide (lipide A) auquel est attachée une chaîne de glycane. La partie glycane est composée de deux parties, une partie appelée oligosaccharide central (core oligosaccharide) et l'autre partie appelée polysaccharide de chaîne latérale O (antigène O) ; la Figure 1 illustre leur représentation schématique (Maeshima & Fernandez 2013). Chaque molécule de LPS a de multiples charges négatives provenant des groupes phosphate et acide du lipide A et de l’oligosaccharide central. Les endotoxines sont connues pour être stables thermiquement et chimiquement. La teneur en endotoxine s’exprime en UI (unité internationale) qui équivaut à une UE (unité d’endotoxine) (3.4 Test for bacterial endotoxins, The International Pharmacopoeia - 9th edition) ; à titre indicatif, 1 ng de LPS correspond à environ 10 UE (WHO International Standard, 3rd IS for endotoxin), ceci peut être différent selon l’origine des souches de bactéries.
Dans le cadre du développements de médicaments à base de protéines issues de procédés biotechnologiques et mettant en œuvre du matériel biologique, diverses méthodes de purification de protéines ont été développées afin d’éliminer des endotoxines ; ces méthodes sont par exemple une extraction par solvants, la chromatographie d’affinité (telles que résines greffées de polymyxine B, traitement qui n’est toutefois pas autorisé pour la préparation de produits alimentaires), des techniques membranaires (telle qu’ultrafiltration), la chromatographie d’échangeur d’ions, la chromatographie d’interaction hydrophobe (Petsch, D., 2000. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology 76, 97-119; Ongkudon, C.M., Chew, J.H., Liu, B., Danquah, M.K., 2012. Chromatographic Removal of Endotoxins: A Bioprocess Engineer’s Perspective. ISRN Chromatography 2012, 1-9).
Cependant, il est connu que l’élimination d’endotoxines à partir d’une fraction de protéines cationiques est difficile à réaliser car la plupart des protéines cationiques telles que lysozyme (Petsch, D., Deckwer, W.-D., Anspach, F. B., 1998. Proteinase K Digestion of Proteins Improves Detection of Bacterial Endotoxins by the LimulusAmebocyte Lysate Assay: Application for Endotoxin Removal from Cationic Proteins. Analytical Biochemistry 259, 42-47), ribonucléase A et lactoferrine (Elass-Rochard, E., Roseanu, A., Legrand, D., Trif, M., Salmon, V., Motas, C., Montreuil, J., Spik, G., 1995. Lactoferrinlipopolysaccharide interaction: involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5 lipopolysaccharide. Biochem J 312, 839- 845) ont des interactions fortes avec les molécules de LPS qui possèdent plusieurs charges négatives.
Un procédé pour éliminer des endotoxines liées à une protéine cationique, notamment la lactoferrine, a été proposé dans le WO 2009/009706 (Glanbia Nutritionals) ; ce procédé comprend les étapes de a) liaison de la protéine à une résine échangeuse de cations ; b) élution de l'endotoxine à l'aide d'une solution à faible force ionique en l'absence d'agent tensioactif ajouté ; c) élution de la protéine avec une solution à forte force ionique. Ce procédé permet d’obtenir un isolat de lactoferrine contenant moins de 1 Ul/mg d’endotoxines.
Un procédé similaire d’élimination des endotoxines liées à la lactoferrine a été proposé dans le WO 2010/112988 (Jean-Paul Perraudin) ; ce procédé permet d’obtenir un isolat de lactoferrine contenant moins de 50 pg/mg (soit environ 0,5 Ul/mg) d’endotoxine.
Ces deux procédés montrent qu'à partir d'une fraction contenant une protéine cationique telle que la lactoferrine ayant une grande affinité avec les résines échangeuses de cations, après avoir fixé cette protéine cationique sur ces résines, les endotoxines liées à cette protéine cationique peuvent être dissociées et éliminées avec une solution de force ionique faible à moyenne (solution de NaCl à 0,25-0,5 M) sans détacher cette protéine cationique des résines échangeuses de cations. Cette affinité avec les résines échangeuses de cations est dépendante des charges positives (leur ampleur et leur localisation) issues des acides aminés cationiques constituants (lysine, arginine et histidine) des protéines cationiques. Cependant, ces procédés ne permettent pas d’éliminer efficacement les endotoxines présentes ou liées à une protéine cationique ou une fraction de protéines cationiques ayant une affinité faible à moyenne avec les résines échangeuses de cation, puisque ces protéines seraient alors éluées en même temps que les endotoxines.
La présente invention propose un procédé permettant d’éliminer efficacement les endotoxines présentes dans une fraction de protéines cationiques ou liées à une protéine cationique ou une fraction de protéines cationiques quelles que soient l’ampleur et localisation de leurs charges positives.
La présente invention se rapporte ainsi à un procédé de purification d’une fraction de protéines cationiques comprend les étapes a) à d) suivantes : a) obtention d’une solution :
- de pH compris entre 6,5 et 7,5 ;
- comprenant des protéines cationiques ayant toutes un point isoélectrique supérieur à 7,5 et des protéines acides ayant un point isoélectrique inférieurs à 6,5 en une teneur inférieure à 1% en poids par rapport aux poids des protéines totales ;
- de conductivité supérieure à 45 mS/cm, de préférence supérieure à 50 mS/cm ou 60 mS/cm ;
A titre d’illustration et sans caractère limitatif, une telle solution peut être choisie parmi :
• une solution contenant la lactoferrine issue de lait de vache éluée avec 100 mS/cm de solution de NaCl à partir de résines échangeuses de cations (ex. SP Sepharose Big Beads, Cytiva Life Sciences) ;
• une solution contenant une fraction totale des protéines cationiques issues de lait de vache éluée avec 10% de NaCl à partir de résines échangeuses de cations (ex. SPEC 70 SLS, Sartorius) ;
• une solution contenant une fraction totale des protéines cationiques issues de lait de vache (contenant la lactoperoxydase, les ribonucléases, la lactoferrine) avec 40 mS/cm de solution de NaCl à partir de résines échangeuses de cations (ex. SP Sepharose Big Beads, Cytiva Life Sciences), supplémentée avec la solution saturée de NaCl jusqu’à la conductivité de 60 mS/cm ;
• une solution concentrée de lactoferrine bovine par une ultrafiltration à partir d’un éluat à 100 mS/cm ;
• une solution d’isolat de protéines cationiques de lactosérum microfiltré (protéines/matière sèche >90%), supplémentée avec la solution saturée de NaCl jusqu’à la conductivité de 60 mS/cm ; • une poudre de la lactoferrine caprine reconstituée avec une solution saline à 5% ;
• une poudre de lysozyme de blanc d’œuf reconstituée avec une solution NaCl à 0,5 M. b) diafiltration de ladite solution de protéines cationiques avec l’eau exempte d’endotoxines, de préférence de l’eau osmosée ultrafiltrée, en utilisant une membrane de ultrafiltration de seuil de coupure de 5 à 50 kDa, la valeur de seuil de coupure est choisie en fonction de poids moléculaire de protéines cationiques de la solution, il est généralement compris entre 5 et 50 kDa mais peut être inférieur ou égal à 20 kDa ou entre 1 et 20 kDa ou entre 5 et 20 kDa ou de 20 kDa, inférieur ou égal à 10 kDa ou entre 1 et 10 kDa ou entre 5 et 10 kDa ou de 10 kDa, inférieur ou égal à 5 kDa ou entre 1 et 5 kDa ou de 5 kDa, ou de 1 kDa, la diafiltration est conduite jusqu’à l’obtention d’une conductivité inférieure ou égale à 10 mS/cm, de préférence inférieure ou égale 5 mS/cm, encore de préférence inférieure ou égale 1 mS/cm ; durant cette diafiltration faisant baisser la conductivité de la solution des protéines cationiques de supérieure à 45 mS/cm à inférieure à 10 mS/cm, cette solution passe continuellement au travers d’un support d’échange d’ anions, de préférence membranaire (ex. Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech) ou monolithique (ex. CIMmultus QA, BIA Separations), le support étant tel qu’il a peu d’effet d’exclusion stérique, afin d’adsorber et d’éliminer la quasi-totalité d’endotoxines présentes dans la solution ; c) optionnellement, microfiltration avec une membrane de seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm afin de réduire la charge microbienne ; d) optionnellement, un séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution afin d’obtenir un isolat de protéines cationiques en poudre.
La Figure 2 illustre une représentation schématique du procédé selon l’invention. Les Figure 3 A et 3B illustrent les exemples de diagramme permettant la mise en œuvre de l’étape b) du procédé de selon l’invention.
Alternativement, la présente invention se rapporte à un procédé de purification d’un isolat de protéines cationiques comprend les étapes a) à d) suivantes : a) obtention d’une solution :
- de pH compris entre 6,5 et 7,5 ;
- comprenant des protéines cationiques ayant toutes un point isoélectrique supérieur à 7,5 et des protéines acides ayant un point isoélectrique inférieurs à 6,5 en une teneur inférieure à 1% en poids par rapport aux poids des protéines totales ;
- de conductivité inférieure à 1 mS/cm ; Selon un mode de réalisation particulier, ce second procédé s’applique à l’isolat obtenu par le précédent procédé. b) passage de ladite solution à travers d’un support d’échange d’ anions, de préférence membranaire (ex. Sartobind Q, Sartorus Stedium Biotech) ou monolithique (ex. CIMmultus QA, BIA Separtions), le support étant tel qu’il a peu d’effet d’exclusion stérique, afin d’adsorber et d’éliminer la quasi -totalité d’endotoxines présentes dans la solution ; la solution est de préférence passée plusieurs fois à travers d’un support d’échange d’anions, de préférence, au moins 3 fois ; c) optionnellement, microfiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm afin de réduire la charge microbienne à un niveau acceptable pour la conformité du produit fini ; d) optionnellement, un séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution afin d’obtenir un isolat de protéines cationiques en poudre.
La Figure 4 illustre une représentation schématique d’un dispositif permettant la mise en œuvre du procédé alternatif selon l’invention.
La présente invention se rapporte encore à une fraction de protéines cationiques susceptible d’être obtenue ou telle qu’elle est obtenue par les procédés selon l’invention et telle qu’elle a une teneur en endotoxine inférieure à 5 Ul/mg de protéines, de préférence inférieur à 1 Ul/mg de protéines, encore de préférence inférieur à 0,1 Ul/mg de protéines.
Selon un mode de réalisation les protéines cationiques de la fraction sont issues du lait ; elles peuvent alors être majoritairement constituées de lactoferrine ou majoritairement constituées de lactopéroxydase ou majoritairement constituées de ribonucléases ou encore contenir du TGF-P en une teneur supérieure à 20 pg/g, de préférence, supérieure à 50 pg/g, tout préférentiellement entre 100 et 200 pg/g de protéines. Par majoritairement constitué, on entend une fraction comprenant au moins 50%, mais également supérieur à 90% ou 95% en poids de protéines par rapport au poids de la matière sèche. Les fractions selon l’invention peuvent également contenir majoritairement un mélange de protéines cationiques du lait ou du lactosérum.
Figure 1 : représentation schématique d’un LPS (Maeshima & Fernandez 2013) ;
Figure 2 : Représentation schématique du procédé de purification de l’isolat de protéines cationiques ; Figure 3 : Exemples de diagramme du procédé de purification de l’isolat de protéines cationiques ; A : procédé combinant diafiltration et support échangeur d’ anions en parallèle ; B : procédé combinant diafiltration et support échangeur d’ anions en série
Figure 4 : Représentation schématique du procédé alternatif de purification de l’isolat de protéines cationiques.
EXEMPLES
Exemple 1 : essai en paillasse avec un concentrât liquide de lactoferrine bovine
1) Un concentrât liquide de la lactoferrine issue de lait de vache a été obtenu selon un procédé industriel de chromatographie échangeuse de cations, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) dans une colonne à flux radial (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) en passant le lait de vache écrémé pasteurisé, puis en éluant successivement avec une solution de NaCl à 36 mS/cm et celle à 110 mS/cm, enfin le 2e éluat a été concentré sur une ultrafiltration de MWCO 20 kDa.
La concentration en protéines est de 13 mg/mL, la pureté de lactoferrine bovine sur protéines est de 95%, la conductivité de cette solution est de 65 mS/cm, et le pH est de 6,8 (« Concentrât LF 1 »).
2) 75 mL de ce concentrât liquide de la lactoferrine bovine à 65 mS/cm a été diafiltré à l’échelle paillasse en utilisant ÀKTA flux s (Cytiva Sweden) avec un module fibre creuse d’ultrafiltration Start AXH (MWCO de 10 kDa). Une diafiltration a été réalisé avec de l’eau déminéralisé ultrapure préparée par Milli-Q (Millipore) de façon discontinue jusqu’à 5 mS/cm ; lorsque le volume du rétentat a atteint 50 % du volume initial, de l'eau ultrapure a été ajoutée au volume initial, ce qui a été répété 5 fois. Ainsi, le concentrât de lactoferrine bovine déminéralisé a été obtenu (« Concentrât LF 2 »). La même procédure de diafiltration décrit ci-dessus a été réalisée, mais cette fois, le concentrât (rétentat) a été passé en parallèle à travers d’une cartouche de membrane échangeuse d’ anions de type Q (ammonium quaternaire), Sartobind® Q nano 3 mL (Sartorius Stedim) au débit de 15 mL/min en recirculation pendant 80 minutes durant une baisse progressive de conductivité de 65 à 5 mS/cm par cette diafiltration. Ainsi, le concentrât de lactoferrine bovine déminéralisé par diafiltration et traité par membrane échangeuse d’ anions a été obtenu (« Concentrât LF 3 »).
3) La concentration d’endotoxines dans chaque concentrât déminéralisé de lactoferrine obtenu par diafiltration a été mesurée par le test LAL (lysat d’amoebocytes de limules) en chromogénie cinétique de Lonza. Parallèlement, la concentration en lactoferrine bovine dans chaque concentrât a été mesurée par la méthode HPLC PI (colonne Cl 8 300 Â, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Les résultats sont exprimés en Ul/mg de lactoferrine bovine.
Figure imgf000008_0001
Tableau 1 - Endotoxines présentes dans les concentrats de lactoferrine bovine
Exemple 2 : essai en paillasse avec un isolat liquide de lactoferrine bovine
1) Un microfiltrat liquide de la lactoferrine issue de lait de vache a été obtenu selon un procédé industriel de chromatographie échangeuse de cations, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) dans une colonne à flux radial (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) en passant le lait de vache écrémé pasteurisé concentré par osmose inverse à 130 g/L de matière sèche, puis en éluant successivement avec une solution de NaCl à 38 mS/cm et celle à 10%, ensuite le 2e éluat a été concentré sur une ultrafiltration de MWCO 20 kDa, puis diafiltré sur une ultrafiltration de MWCO 10 kDa avec l’eau osmosée jusqu’à 1 mS/cm, enfin le rétentat diafiltré a été microfiltré sur une membrane céramique à 0,8 pm en double couche (Membrarox®, Pali Corporation).
2) Cet isolat liquide de lactoferrine bovine a été dilué avec de l’eau déminéralisé ultrapure préparée par Milli-Q (Millipore) pour avoir la concentration en protéines est de 16 mg/mg (p/v) et la pureté de lactoferrine bovine sur protéines est de 95%, la conductivité de cette solution est de 0,15 mS/cm, et le pH est de 6,9 (« Isolat LF 1 »). 75 mL de cet isolat liquide de lactoferrine a été passé à travers d’une cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL (Sartorius Stedim) au débit de 13 mL/min en recirculation pendant 90 minutes. (« Isolat LF 2 »)
3) La concentration d’endotoxines dans chaque isolat de lactoferrine a été mesurée par le test LAL (lysat d’amoebocytes de limules) en chromogénie cinétique de Lonza. Parallèlement, la concentration en lactoferrine bovine dans chaque concentrât a été mesurée par la méthode HPLC PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Les résultats sont exprimés en Ul/mg de lactoferrine bovine.
Figure imgf000008_0002
Tableau 2 - Endotoxines présentes dans les isolats de lactoferrine bovine
Exemple 3 : essai en paillasse avec un isolat liquide de lactoferrine bovine
1) Un microfiltrat liquide de la lactoferrine issue de lait de vache a été obtenu selon un procédé industriel de chromatographie échangeuse de cations, SP Sepharose Big Beads (Cytiva Sweden) dans une colonne à flux radial (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) en passant le lait de vache écrémé pasteurisé, puis en éluant successivement avec une solution de NaCl à 36 mS/cm et celle à 110 mS/cm, ensuite le 2e éluat a été concentré sur une ultrafiltration de MWCO 20 kDa, puis diafiltré sur une ultrafiltration de MWCO 10 kDa avec l’eau osmosée jusqu’à 1 mS/cm, enfin le rétentat diafiltré a été microfiltré sur une membrane céramique à 1,4 pm en double couche (Membrarox®, Pali Corporation).
La concentration en protéines est de 147 mg/mL, la pureté de lactoferrine bovine sur protéines est de 95%, la conductivité de cette solution est de 0,8 mS/cm, et le pH est de 6,8 (« Isolat LF 3 »).
2) 70 mL de cet isolat liquide de lactoferrine a été passé à travers d’une cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL (Sartorius Stedim) au débit de 6 mL/min (« Isolat LF 4 »). L’isolat liquide de lactoferrine récupéré (65 mL) a été passé à travers de la cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL, puis à nouveau l’isolat liquide de lactoferrine récupéré a été passé à travers de la cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL, en tout 3 passages (« Isolat LF 5 »).
L’isolat liquide de lactoferrine récupéré (60 mL) a été passé à travers de la cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL en recirculation pendant 30 minutes au débit de 6 mL/min en tout 6 passages équivalents (« Isolat LF 6 »).
L’isolat liquide de lactoferrine récupéré (55 mL) a été passé à travers de la cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL en recirculation pendant 37 minutes au débit de 6 mL/min en tout 10 passages équivalents (« Isolat LF 7 »).
3) La concentration d’endotoxines dans chaque isolat de lactoferrine a été mesurée par le test LAL (lysat d’amoebocytes de limules) en chromogénie cinétique de Lonza. Les résultats sont exprimés en Ul/mg de protéines.
Figure imgf000009_0001
Tableau 3 - Endotoxines présentes dans les isolats de lactoferrine bovine
Exemple 4 : essai en paillasse avec un isolat liquide de protéines cationiques contenant
TGF-p issues lait de vache
1) Une fraction de protéines cationique contenant TGF-P issues de lait de vache a été obtenue selon le procédé écrit dans l ’Exemple 1 du Brevet EP 1912513. La teneur en TGF-P2 analysé par le kit ELISA (Quntikine TGF-2, R&D Systems) dans le microfiltrat obtenu avant le séchage par atomisation était 115 pg/g protéines.
2) Cet isolat liquide de protéines cationiques contenant du TGF-P a été dilué avec de l’eau déminéralisé ultrapure préparée par Milli-Q (Millipore) pour avoir une concentration en protéines de 2.6 mg/mg (p/v), la conductivité de cette solution est de 0,89 mS/cm, et le pH est de 7,1 (« Isolat de protéines cationiques de lait 1»), 50 mL de cet isolat liquide de protéines cationiques de lait a été passé en recirculation au travers d’une cartouche de Sartobind® Q nano 3 mL (Sartorius Stedim) au débit de 5 mL/min pendant 70 minutes. (« Isolat de protéines cationiques de lait 2») 3) La concentration d’endotoxines dans chaque isolat liquide de protéines cationiques de lait a été mesurée par le test LAL (lysat d’amoebocytes de limules) en chromogénie cinétique de Lonza. Les résultats sont exprimés en Ul/mg de protéines.
Figure imgf000010_0001
Tableau 4 - Endotoxines présentes dans les isolats de protéines cationiques de lait contenant TGF-fl

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de purification d’une fraction de protéines cationiques comprenant les étapes suivantes : a) obtention d’une solution :
- de pH compris entre 6,5 et 7,5 ;
- comprenant des protéines cationiques ayant toutes un point isoélectrique supérieur à 7,5 et des protéines acides ayant un point isoélectrique inférieurs à 6,5 en une teneur inférieure à 1% en poids par rapport aux poids des protéines totales ;
- de conductivité supérieure à 45 mS/cm ; b) diafiltration de ladite solution de protéines cationiques avec l’eau exempte d’endotoxines, de préférence de l’eau osmosée ultrafiltrée, en utilisant une membrane de ultrafiltration de seuil de coupure de 5 à 50 kDa jusqu’à l’obtention d’une conductivité inférieure ou égale à 10 mS/cm, de préférence inférieure ou égale 5 mS/cm, encore de préférence inférieure ou égale 1 mS/cm ; durant cette diafiltration, cette solution passe continuellement à travers d’un support d’échange d’ anions, de préférence membranaire ou monolithique ; c) optionnellement, microfiltration avec une membrane de seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm ; d) optionnellement, un séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution.
2. Procédé de purification d’un isolat de protéines cationiques comprenant les étapes suivantes : a) obtention d’une solution :
- de pH compris entre 6,5 et 7,5 ;
- comprenant des protéines cationiques ayant toutes un point isoélectrique supérieur à 7,5 et des protéines acides ayant un point isoélectrique inférieurs à 6,5 en une teneur inférieure à 1% en poids par rapport aux poids des protéines totales ;
- de conductivité inférieure à 1 mS/cm ; b) passage de ladite solution à travers d’un support d’échange d’anions, de préférence membranaire ou monolithique; la solution est de préférence passée plusieurs fois à travers d’un support d’échange d’anions, de préférence, au moins 3 fois ; c) optionnellement, microfiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm ; d) optionnellement, un séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution afin d’obtenir un isolat de protéines cationiques en poudre.
3. Fraction de protéines cationiques susceptible d’être obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu’elle a une teneur en endotoxine inférieure à 0,1 Ul/mg de protéines.
4. Fraction de protéines cationiques obtenue par le procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu’elle a une teneur en endotoxine inférieure à 5 Ul/mg de protéines, de préférence inférieur à 1 Ul/mg de protéines, encore de préférence inférieur à 0, 1 Ul/mg de protéines.
5. Fraction de protéines cationiques selon la revendication 3 ou la revendication 4, caractérisée en ce que les protéines cationiques de la fraction sont issues du lait.
6. Fraction de protéines cationiques selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les protéines cationiques sont majoritairement constituées de lactoferrine.
7. Fraction de protéines cationiques selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les protéines cationiques sont majoritairement constituées de lactopéroxydase.
8. Fraction de protéines cationiques selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les protéines cationiques sont majoritairement constituées de ribonucléases.
9. Fraction de protéines cationiques selon l’une quelconque des revendications 3 à 5, caractérisée en ce que les protéines cationiques contiennent du TGF-P supérieure à 20 pg/g de protéines.
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992000994A1 (fr) * 1990-07-13 1992-01-23 Gropep Pty. Ltd. Agent promoteur de croissance
EP0509989A1 (fr) * 1990-01-08 1992-10-28 Nika Health Products Ltd Procede de preparation de dimeres de ribonuclease.
US5849885A (en) * 1994-02-16 1998-12-15 Gene Pharming Europe B.V. Isolation of lactoferrin from milk
US6010698A (en) * 1997-03-27 2000-01-04 Campina Melkunie B. V. Process for recovering growth factors, or a composition containing one or more growth factors, from milk or a milk derivative
EP1409539A1 (fr) * 2001-07-13 2004-04-21 Pierre Jouan Biotechnologies S.A. Procede d'obtention d'une fraction proteique enrichie en tgf-beta sous forme activee, fraction proteique et applications therapeutiques
EP1912513A2 (fr) 2005-07-29 2008-04-23 Compagnie Laitiere Europeenne Nouvelles fractions proteiques laitieres et leur utilisation pour la prevention ou le traitement des maladies inflammatoires chroniques
WO2009009706A1 (fr) 2007-07-10 2009-01-15 Glanbia Nutritionals Procédé d'élimination d'endotoxines de protéines
WO2010112988A1 (fr) 2009-01-28 2010-10-07 Jean-Paul Perraudin Procédé de production de lactoferrine
WO2014056025A1 (fr) * 2012-10-08 2014-04-17 Murray Goulburn Co-Operative Co. Limited Procédé amélioré pour la purification de lactoferrine à partir de lait et produits de celle-ci
WO2020094731A1 (fr) * 2018-11-06 2020-05-14 Arhel Projektiranje In Inzeniring D.O.O. Procédé de fabrication de lactoferrine et de lactoperoxydase hautement purifiées à partir de lait, de colostrum et d'acide ou de lactosérum doux

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0509989A1 (fr) * 1990-01-08 1992-10-28 Nika Health Products Ltd Procede de preparation de dimeres de ribonuclease.
WO1992000994A1 (fr) * 1990-07-13 1992-01-23 Gropep Pty. Ltd. Agent promoteur de croissance
US5849885A (en) * 1994-02-16 1998-12-15 Gene Pharming Europe B.V. Isolation of lactoferrin from milk
US6010698A (en) * 1997-03-27 2000-01-04 Campina Melkunie B. V. Process for recovering growth factors, or a composition containing one or more growth factors, from milk or a milk derivative
EP1409539A1 (fr) * 2001-07-13 2004-04-21 Pierre Jouan Biotechnologies S.A. Procede d'obtention d'une fraction proteique enrichie en tgf-beta sous forme activee, fraction proteique et applications therapeutiques
EP1912513A2 (fr) 2005-07-29 2008-04-23 Compagnie Laitiere Europeenne Nouvelles fractions proteiques laitieres et leur utilisation pour la prevention ou le traitement des maladies inflammatoires chroniques
WO2009009706A1 (fr) 2007-07-10 2009-01-15 Glanbia Nutritionals Procédé d'élimination d'endotoxines de protéines
WO2010112988A1 (fr) 2009-01-28 2010-10-07 Jean-Paul Perraudin Procédé de production de lactoferrine
WO2014056025A1 (fr) * 2012-10-08 2014-04-17 Murray Goulburn Co-Operative Co. Limited Procédé amélioré pour la purification de lactoferrine à partir de lait et produits de celle-ci
WO2020094731A1 (fr) * 2018-11-06 2020-05-14 Arhel Projektiranje In Inzeniring D.O.O. Procédé de fabrication de lactoferrine et de lactoperoxydase hautement purifiées à partir de lait, de colostrum et d'acide ou de lactosérum doux

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELASS-ROCHARD, E.ROSEANU, A.LEGRAND, D.TRIF, M.SALMON, V.MOTAS, C.MONTREUIL, J.SPIK, G.: "Lactoferrin-lipopolysaccharide interaction: involvement of the 28-34 loop region of human lactoferrin in the high-affinity binding to Escherichia coli 055B5 lipopolysaccharide", BIOCHEM J, vol. 312, 1995, pages 839 - 845, XP009041908
JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 76, pages 97 - 119
ONGKUDON, C.M.CHEW, J.H.LIU, B.DANQUAH, M.K.: "Chromatographie Removal of Endotoxins: A Bioprocess Engineer's Perspective", ISRN CHROMATOGRAPHY, 2012, pages 1 - 9, XP055437755, DOI: 10.5402/2012/649746
PETSCH, D.DECKWER, W.-D.ANSPACH, F.B.: "Proteinase K Digestion of Proteins Improves Détection of Bacterial Endotoxins by the LimulusAmebocyte Lysate Assay: Application for Endotoxin Removal from Cationic Proteins", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 259, 1998, pages 42 - 47, XP002277870, DOI: 10.1006/abio.1998.2655

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