FR2631785A1 - Procede de fractionnement des proteines du lait humain, conduisant a la production, notamment de lactoferrine et d'(alpha)-lactalbumine, et produits obtenus - Google Patents

Abstract

Dans une première étape, on soumet du lait humain à une microfiltration sur une membrane présentant un diamètre de pores de l'ordre de 0,1 à 0,3 mum, pour obtenir, un perméat ndegre(s) 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante d'alpha-lactalbumine; de la lactoferrine; de la sérum albumine; des peptides; et un rétentat ndegre(s) 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine, des caséines; et des protéines de poids moléculaires plus élevés; et dans une seconde étape, on soumet le perméat ndegre(s) 1 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 80 000 et 300 000 daltons, pour obtenir un perméat ndegre(s) 2 qui consiste en une fraction contenant une proportion majeure d'alpha-lactalbumine et une fraction mineure de protéines et peptides de plus faible poids moléculaire, et un rétentat ndegre(s) 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine et une proportion mineure de sérum albumine.

Description

La présente invention porte sur un procédé de fractionnement des protéines du lait humain, conduisant notamment à la production de lactoferrine et d'α-lactalbumine humaines. La présente invention porte également sur les différentes fractions et produite obtenus,
La lactoferrine et l'α-lactalbumine sont les deux protéines majeures du lactosérum humain. Leurs concentrations varient respectivement entre environ l et 2 g/l, et entre environ 3 et 4,5 g/l dans le lait humain tu mature.

La lactoferrine est une glycoprotéine a simple chalne, riche en acides aminé, basiques (pHi = 8,7). Son poids moléculaire est de 75 400 daltons. Elle présente la propriété de fier deux atomes de fer par l'intermédiaire d'un complexe mettant en oeuvre deux ions bicarbonate.

Partiellement saturée dans le lait (8 à 25% de sa capacité théorique de fixation?, cette protéine est capable d'inhiber n vitro, par ferriprivation, la croissance de microorganismes tels que Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bscherichia coli. L'inhibition observée est de type bactériostatique, la croissance des bactérieries étant rétablie par addition de fer en excès dans le milieu.

Toutefois, un effet bactéricide direct a etc observé, un tel effet pouvant découler d'une fixation de la lactoferrine à la surface des cellules, qui entrairerait un blocage, soit des sites de transport de certains nutriments, soit des mécanismes de biosynthése de la paroi.

L'a-lactalbumine humaine est une protéine å simple ha ne, ayant une masse moléculaire de 14 100 daltons.

Représentant 25% en poids des protéines du lait humain, elle contribue considérablement à la haute valeur biologique de ce lait, de par sa composition en acides amis essentiels, notamment en tryptophane.

De nombreuses méthodes ont été mises en oeuvre pour isoler et purifier ces deux protéines, mais toujours a des fins analytiques. Ainsi différentes techniques chromatographiques ont été utilisées ; on peut citer notamment
les séparations chromatographiques basées sur l'échange
d'ions, rapportées par BLACKBERG L., HERNELL O. 1980
"FEES Lett., 102 (2), 180-184", pour la lactoferrine,
et par LONNERDAL B., GLAZIER C., 1985 "J. Nutr., 115,
1209-1216", pour l'α-lactalbumine, la séparation chromatographique basée sur l'affinité
par chêlation avec des métaux, rapportée par LONNERDAL
3.CARLSSON J. FORATB J. 1977 UFEBS Lett., 75 (1),
89-92" : et la séparation chromatorgaphique basée sur l'immuno-
affinité, rapportée par KAWAKAMI H., SHINMOTO H.,
DOSAKO S., SOGO Y. 1987 "J. Dairy Sci., 70, 752-759.

Si ces méthodes permettent d'obtenir des protéines avec un degré de pureté élevée, elles ne sont pas adaptées à l'obtention de quantités d'α-lactalbumine et de lactoferrine humaines requises pour une utilisation thérapeutique. Les quantités obtenues sont, en effet, inférieures au gramme.

Par ailleure, les autres composants protéiques ne sont pas ou sont mal récupérés.

En France, les lactariums recueillent actuellement prés de 100 000 litres/an de lait humain. Outre la redistribution du lait, la séparation des constituants protidiques, lipidiques et glucidiques permettrait de préparer des nutriments aptes à répondre à des besoins thérapeutiques de prématurés ou de nourrissons souffrant de pathologies graves de la digestion.

a présente invention propose un procédé permettant de préparer, à l'échelle industrielle, a titre principal, la lactoferrine humaine et l'a-lactalbumine humaine utilisables pour les besoins précités, et à titre secondaire, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres composants du lait, tels que les caséines et les protéines de poids moléculaires élevés, et différents peptides, glycosylés ou non. Le procédé selon l'invention met en jeu une combinaison de techniques de filtration sur membranes pré entant d-fftrents pouvoirs de coupure.

La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé de fractionnement du lait humain, conduisant notamment à l'obtention de fractions enrichies en lactcferrine et en a-lactalbumine humaines, caractérisé par le fait que (1) dans une première étape, on soumet du lait humain a une
microfiltration, notamment une microfiltration
tangentielle, sur une membrane présentant un diamètre
de pores de l'ordre de 0,1 a 0,3 m. pour obtenir
d'une part, un perméat n' 1, qui consiste en une
fraction contenant une proportion prépondérante
d'a-lactalbunine ; de la lactoferrine de la sérum
albumine ; des peptides
d'autre part, un rétentat n 1, qui consiste en une
fraction contoont une proportion prépondérante de
lactoferrine ; des caséines ; et des protéines de poids
moléculaires plus élevés tt (2) dans une seconde étant, on soumet le perméat n' 1 à une
ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de cou-
pure compris entre environ S0 000 et 300 000 daltons,
pour obtenir
d'une part, un perméat n 2, qui consiste n une
fraction contenant une proportion majeure
d'a-lactalbumine et une fraction mineure de protéines
et peptides de plus faible poids moléculaire, et
d'autre part, un rétentat n' 2, qui consiste en une
fraction contenant une proportion prépondérante de
lactoferrine, une proportion mineure de sérum albumine.

Conformément à un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, (3) dans une troisième étape, on soumet le perméat n 2 a
une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de
coupure compris entre environ 5000 et 50 000 daltons,
pour obtenir
d'une part, un perméat n 3, essentiellement constitué
par des peptides éventuellement glycosylés et
d'autre part, un rétentat n' 3, essentiellement
constitué par de l'a-lactalbumine.

Selon l'invention, on part généralement d'un lait écréme. Par ailleurs, pour des raisons évidentes, le lait utilis est un lait décongelé, ayant été stocké a une température de l'ordre de -20 C, un tel stockage pouvant durer plusieur mois.

La microfiltration de l'étape (1) est conduite en flux tangentiel, la vitesse de circulation du lait écrémé entant de l'ordre de 4 m/s å 7 m/s > de préférence de 6 m/s.

La membrane de microfiltration, qui présente, de préférence, un diametre de pores de l'ordre de 0,2 m, est choisie notamment parmi les membranes minérales, parmi lesquelles on peut citer les membranes en oxyde de zirconium, supporté par du carbone ou de l'acier inoxydable fritté, en alumine ou en carbone.

Far ailleurs, on conduit cette microfiltration à une pression qui, en amont du disposition de microfiltration, est comprise entre 3 et 1 bars relatifs, de préférence entre 1,5 et 1,0 bar relatif, et qui, en aval du dispositif de microfiltration, est comprise entre 1,0 et 0,2 bar relatif, de préférence, entre 0,5 et 0,2 bar relatif.

La température à laquelle est conduite cette opération de microfiltration est inférieure d 48 C. Au-delà de cette temprature, l'opération est techniquement réalisable, mais les composants seront obtenus sous une forme plus ou moins dénaturée, c'elst-à-dire inactivée. Il en est de même pour les autres séparations sur membrane prévues conformément au procédé de l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré, on fait suivra la microfiltration de l'étape (1) par une diafiltration du rétentat n 1 pour éliminer la majeure partie de l'α-lactalbumine et des peptides. L'étape (1) et cette étape de diafiltration peuvent du reste être réalisées de façon concomitante.

Pour réaliser l'ultrafiltration de l'étape (2), on utilise, de préférence, une membrane d'ultrafiltration présentant un seuil de coupure de l'ordre de 100000 caltons.

Parmi les membranes qu'il est possible d'utiliser à cette étape, or peut citer les membranes a fibres creuses commercialisées par les firmes AMICON et ROMICON, les membranes de conception plane commercialisées par les firmes
TECHSEP, MILLIPORE et PASILAC.

Les autres paramètres de cette ultrafiltration de l'étape (2) sont classiques : on travaille à une pression qui, en amont du dispositif d'ultrafiltration, est comprise entre 6,0 et 1,0 bars relatifs selon la membrane utilisée, et qui, en aval du dispositif d'ultrafiltration, est comprise entre 4,0 et 0,2 bars relatifs, et or fait circuler le rétentat n' 1 à une vitesse comprise entre 4,5 et 1,5 m/s
Il est soss-ble de faire suivre l'ultrafiltration de l'étapè (2) par une diafiltration du rétentat n 2, jusqu'à élimination sensiblement complète de l'α-lactabumine. Cette étape de diafiltration peut être réalisée de façon concomitante à l'étape (2) d'ultrafiltration.

L'ultrafiltration de l'étape (3) peut être menée avec utilisation d'une membrane présentant un seuil de cqupure présentant de préférence une valeur de l'ordre de 10000 daltons. Les autres paramètres de cette ultrafiltration, y compris la nature de la membrane, sont analogues å ceux indiqués pour l'ultrafiltration de l'étape (2).

De la même façon, on peut faire suivre l'ultrafiltration de l'étape (3) par une diafiltration du rétentat n' 3 Jusqu'à élimination sensiblement complète des peptides.

rar ailleurs, on peut soumettre le rétentat n 2 a une purification par chromatographie d'échange d'ions, notamment par la technique décrite par FOLEY A.A., BATES
G.W., 1987, "Anal. Biochem., 162, 296-300".

Chacune des fractions obtenues par le procédé de l'invention et ses variantes peut être séchée pcur donner une poudre, plus facile à mettre en oeuvre pour les applications thérapeutiques et diététiques prévues pour ces substances.

La présente invention porte également sur les différentes fractions obtenues par ce procédé, et notamment les fractions suivantes Fraction correspondant au perméat n- 1, oui renferme
α-lactalbumine ...................... 76-78
lactoferrine .............................. 16-20
srum albumine ....................... 2- 3,
ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine
désignée pour 100 grammes de protéines vraies
(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38 (TCA = acide trichloracétique)
Praction correspondant au rétentat n 1; qui renferme :
de la 'aetsferrine à raison de 29-34 grammes pour
100 grammes de protéine vraies (Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38 Fraction correspondant au perméat n 2, qui renferme
de l'α-lactalbumine à raison de 0,04-0,08 gramme
pour 100 grammes de produit liquide b Fraction correspondant au rétentat n 2, qui renferme
lactoferrine .................... 32-35
sérum albumine 9-12,
ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine
désignée pour 100 grammes de protéines vraies
(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38 .Eraction correspondant au rétentat n 3, qui renferme
de l'α-lactalbumine à raison de 80-81 g pour
10Q grammes de poudre faisant 2,5% d'humidité.

L'invention porte également, d'une manière générale, sur les produits suivants : - un produit à haute teneur en a-lactalbunine - au moins
80 g de la protéine pour 100 g de matière sèche
résultant de la concentration par ultrafiltration du
perméat n 2 avec une membrane ayant un pouvoir de
coupure compris entre 5000 et 50 000 daltons, de
préférence, de l'ordre de 10 000 daltons, conformément
à ce qui a été exposé ci-dessus ; - un produit à haute teneur en lactoferrine - au moins
30% poids pour poids des protéines vraies et au moins
24% poids pour poids par rapport à la matière sèche
ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du
fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates
(GRAHAM G., BATHS G.W., 1976. Approaches to the
standardization of serum unsaturated iron-binding
capacity. J. Lab. Clin.Med., 88 (3), 477-486), au
moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au
moins 1,2 mole de fer par micromole de protéines ; - un produit à haute teneur en lactoferrine - au moins
30% poids pour poids des protéines vraies et au moins
24% poids pour poids de la matière sèche - résultant de
la concentraton par ultrafiltration du perméat n 1
avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris
entre 80 000 et 300 000 daltons, de préférence de
l'ordre de 100 00 daltons, conformément à ce qui a été
exposé ci-dessus.

Enfin, l'invention porte sur l'utilisation de ces fractions plus ou moins purifiées à des fins thérapeutiques et diététiques, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique.

L'invention sera encore illustrée par la description qui suit d'un mode de réalisation particulier, faite en référence au dessin annexé.

Sur ce dessin - la figure 1 montre schématiquement les étapes du
procédé conforme à ce mode de réalisation ; et - les figures 2 à 8 illustrent les résultats des diverses
analyses qui ont été effectuées.

Dans cet exemple, on a utilisé un lait de mélange provenant du lactarium de Paris. Après décongélation par immersion dans un bain d'eau à 40 C, on a porté ie lait à une température de 37 C et on l'a écrémé sur une écrémeuse
Westfalia, type DD 100 Z. Le volume du lait écrémé était de 50 litres.

On a ensuite conduit un fractionnement des protéines du lait par des filtrations successives, comme illustré par la figure 1.

Etape (1)
On a soumis le lait écrémé à une microfiltration dans une unit pilote SFEC comportant deux pompes volumétriques, à savoir une pompe d'alimentation et une pompe de recirculation de 15 m .h-1, ainsi que deux modules équipés de membranes minérales CARBOSEF K14. La surface membranaire était de 1,6 m. . L'essai a été réalisé à une température de 48-50 C, avec une pression transmembranaire moyenne de 1,45 bar. La vitesse de recirculation du produit dans la membrane était de 4,0 m. s-1
Ensuite, le rétentat obtenu (20 litres) a été diafiltré en continu avec 60 litres d'eau désionisée. Après diafiltration, le rétentat a été concentré deux fois.

tapes (2) et (3)
On a conduit deux étapes successives d'ultrafiltration sur une autre unité pilote équipée d'une pompe volumétrique avec une circulation de 4 m .h-1, et d'une membrane à fibres creuses ROMICON PX 100 pour l'ultrafiltration de l'étape (2) et ROMICON PM 10 pour l'ultrafiltration de l'étape (3). la surface membranaire étant, dans les deux cas, de 1,5 m. La température était de 48-50 C, et la pression transmembranaire moyenne, de 0,6 bar.

Le rétentat n- 2 (10 litres) a été diafiltre en continu avec de l'eau désionisée, jusqu'à élimination complète de l'α-lactalbumine.

Une partie du perméat n- 2 a été concentrée sur la membrane ROMICON PM10, Le réte-ntat n' 3 ainsi obtenu a été diafiltré en continu jusqu'à élimination complète des peptides, ce qui a été apprécié par HPLC en gel filtration à pH 2,2 (détection à 210 nm?.

La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n' 2, par chromatographie d'échange d'ions, selon la méthode précitée de FOLEY et BATES
Différentes analyses ont été conduites sur les diverses fractions obtenues
L'électrophorèse en gel de polyacrylamide (15%) - SDS des différentes fractions a été réalisée sur un équipement BICRAD selon la méthode de LAEMMLI U.K. (1978) "Nature, 227, 680-685".

La figure 2, dont la légende est la suivante, représente le diagramme obtenu
A : lait humain
3 : rétentat n' 1
C : perméat n- 1
D : rétentat n- 2
E : perméat n
F rétentat n- 3
G : lactoferrine isolée
H : proteines étalonse (Lf : lactoferrine
Sa : sérum albumine ; Lys : lysozyme ; La : a-lactalbumine provenant de la Société SIGMA Chemical Co., Saint Louis,
U.S.A.).

* Les différentes fractions ont également été soumises à une chromatographie HPLC en gel filtration, par utilisation d'une colonne TSK 2000 SW d'une longueur de d0 cm La phase mobile était constituée par du phosphate monopotassique 0,01M amene a pn 2,2 avec de l'acide orthophosphorique. Le débit était de 1 1. mn 1, et la détection a ét effectuée à 210 nm.

La figure 3, dont la légende est la suivante, représente les chromatogrammes obtenus
A : lait humain
B : perméat n 1
C : perméat n' 2
D : rêtentat n
w rétentat n' 3
1 : exclusion
2 : caséines
3 : a-lactalbumine
4 : fractions peptidiques.

On a également effectué une analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par microfiltration, des produits séparés par l'ultrafiltration de l'étape (2), du rétentat n' 3 et de la lactoferrine isolée par chromatographie d'échange d'ions, les chromatogrammes obtenus étant représenté sur les figures respectivement 4 à 7. Une colonne C 18 VYDAC 218 TF 54 a été utilisée. L'élution a été réalisée par un gradient établi à l'aide de deux tampons: tampon A (eau-TFA 0,1%) et tampon B (eauacetonitrile 20/80-TFA 0,1%), Le gradient, de 30 à 90% de tampon B, a été effectué en 30 minutes. Le débit était de 1 ml. mn-1, et la longueur d'onde a été fixée à 280 nm.

Légende de la figure 4
Analyse HPLC en phase inverse des produits séparés per la microfiltration de l'étape (1)
A : lait humain écrémé
B * perméat n' 1
C : rétentat n' 1
1 : lactoferrine
2 : sérum albumine
3 : caséines
4 : a-lactalbumine.

Legende de la figure 5
Analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par l'ultrafiltration de l'étape (2)
A : perméat n
B : perméat n' 2
C : rétentat n' 2
1 : lactoferrine
9 : sérum albumine
3 : α-lactalbumine
Légende de la figure 6 :
Analyse HPLC en phase inverse du rétentat n' 3
A : α-lactalbumine étalon
B : rétentat n 3
Légende de la figure 7 :
Analyse HPLC en phase inverse de la lactoferrine isolée par chromatographie d'échange d'ions
A : lactoferrine étalon
3 : lactoferrine purifiée
En conclusion, la microfiltration du lait écrémé permet d'obtenir un perméat n' 1 contenant des peptides, de l'α-lactalbumine et des protéines de poids moléculaire plus élevés cue les précédents, non identifiés lors de l'analyse
HPLC en gel filtration (figure 3B).

Au cours de la microfiltration, le flu de perméation et le tau de rétention proteique varient respectivement de 54,5 à 45,5 1. h-1,m-2 et de 33 à 42% au bout de 35 minutes, ce qui. figure dans le tableau suivant
Tableau 1
Rendement de l'extraction de l'α-lactalbumine lors de la
microfiltration de l'étape (1 > .

Temps α-lacta. α-lacta. Débit Performance Taux de
m n. rétentant perméat 1.n-1,m-2 membrane rétention
g/l g/l g.h-1.m-2 %
10 3,20 2,12 54,5 115 33
15 4,02 2,25 52,5 118 44
25 4,68 2,8 4S,75 130 42
35 5,08 2,93 45,5 133 42
Les résultats démontrent que dans les conditions expérimentales utilisées, il n'y a pas de colmatage rapide de la membrane.

La diafiltration du rétentat n' 1 permet d'éliminer la majeure partie de l'α-lactalbumine et des peptides. Le rétentat n 1 final ainsi obtenu contient encore de 29 à 34% ds lactoferrine (figure 4C).,
L'ultrafiltration de l'étape (2) conduit à la séparation de l'α-lactalbumine (perméat n 2). Les protéines de poids moléculaires plus élevés, à savoir la lactoferrine et la sérum albumine, sont retenues dans le rétentat n' 2 (figure 5). La diafiltration élimine la quasi-totalité de l'a-lactalbumine, et le rétentat n' 2 final ainsi obtenu (figure 5C) contient, par rapport aux protéines vraies, de la lactoferrine (32 à 35%) de la sérum albumine (9-12%) et d'autres matières azotées non identifiées (probablement des peptides?.

L'ultrafiltration de l'étape (3) concentre l'a-lactalbumine en éliminant les fractions de plus faible poids moléculaire.

L'analyse en gel filtration du rétentat n figure SE) montre la présence d'un seul pic, alors que la chromatographie HPLC en phase inverse (figure 63? met en évidence, outre le pic principal, un petit pic surnuméraire également présent dans la protéIne purifiée de référence (figure 6A).

La composition en acides aminés de l'α-lactalbumine isolée est en accord avec celle publiée par FIBDLAY J.B.C., BREW K. 1972 "Eur. J. Bio Chem., 27, 65-86", avec un coefficient de corrélation de O,9S6.

La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n' 2 en utilisant ses propriétés basiques. La technique utilisée permet d'obtenir cette protéine avec un degré de pureté élevée figure 7). La comparaison ce sa composition en acides aminés avec celle publiée par
QUERINJBAN P., MASSON P.L., HEREKANS J.F. 1971 "Eur. J.

Biochm. 20, 420-325", donne un coefficient de corrélation de 0,974. Le profil chromatographique obtenu en phase inverse et l'électrophorèse en SDS montre une homogénéité de lactoferrine obtenue. Elle contient 0,75 mole de fer/ mole de protéines, ce qui représente une saturation de 37,5%.

La figure 8 représente la courbe de saturation de la lactoferrine humaine par addition progressive d'une solution de Fe (NH4)2(SO4)2 0,2mM dans HCl 0,01M. La saturation est atteinte lorsque 0,71 g de fer/mg de protéine sont ajoutés. Ceci correspond à la fioxation de 0,96 mole de fer/u mole de lactoferrine. L'adsorption à 470 nm montre que la lactoferrine initiale contient 0,54 g de fer/mg de protéine. La saturation initiale est donc de 37,5 . La capacité de fixation totale est de 1,71 p mole/ p mole de protéines, soit 85% de la capacité théorique.

Ainsi, avec le procédé de l'invention, les deux protéines majeures du lactosérum humain sont séparées et purifiées sans que la capacité de séquestration du fer de la lactoferrine en soit apparemment affectée. Il est à noter que le procédé proposé permet également de recuperer, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres composants du lait tels que caséines et protéines de poids moléculaire élevé dans le rétentat n' 1, et peptides glycosylées ou non dans le perméat n 3.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de fractionnement du lait humain, conduisant notamment à l'obtention de fractions enrichies en lactoferrine et en a-lactalbumine humaines, caractérisé par le fait que (1) dans une première étape, on soumet du lait humain à une

microfiltration sur une membrane présentant un diamètre

de pores de l'ordre de 0,1 a 0,3 pm, pour obtenir

r d'une part, un perméat n' 1, qui consiste en une

fraction contenant une proportion prépondérante

d'α-lactalbumine de la lactoferrine ; de la sérum

albumine des peptides

. d'autre part, un rétentat n' 1, qui consiste en une

fraction contenant une proportion prépondérante de

lactoferrine ; des caséines ; et des protéines de poids

moléculaires plus élevés ; et (2) dans une seconde étape, on soumet le perméat n' 1 a une

ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de cou-

pure compris entre environ 80 000 et 300 000 daltons,

pour obtenir

, d'une par t, un perméat n' 2, qui consiste en une

fraction contenant une proportion majeure

d'α-lactalbumine et une fraction mineure de protéines

et peptides de plus faible poids moléculaire, et

d'autre part, un rétentat n' 2, qui consiste en une

fraction contenant une proportion prépondérante de

lactoferrine et-une proportion mineure de sérum lbumi.ne.

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que < 3 > dans une troisième étape, on soumet le perméat n' 2 à

une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de

coupure compris entre environ 5000 et 50 000 daltons,

pour obtenir

b. d'une part, un perméat n' 3, essentiellement constitué

par des peptides éventuellement glycosylés ; et

d'autre part, un rétentat n' 3, essentiellement

constitué par de l'&alpha;-lactalbumine.

3 - Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'à l'étape (1), on utilise une membrane présentant un diamétre de pores de l'ordre de 0,2 pm.

4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'à l'étape (1), on utilise une membrane minérale en une matière choisie parmi l'oxyde de zirconium, supporté par du carbone ou de l'acier inoxydable fritté, l'alumine ou le carbone.

5 - Procédé selon l'une des revendications 1 4, caractérisé par le fait qu'à l'étape (2), on utilise une membrane présentant un seuil de coupure de l'ordre de 100 000 daltons.

6 - Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait qu'à l'étape (3), on utilise une membrane présentant un seuil de coupure de l'ordre de 10 000 dalton.

7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'aux étapes (2) et éventuellement (:3? > on utilise une membrane à fibres creuses ou une membrane plane.

S - Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'on fait suivre la microfiltration de l'étape (1) par une diafiltration du rétentat n' 1 pour éliminer la majeure partie de l'a-lactalbumine et des peptides.

9 - Procédé selon l'une des revendications a à 8, caractérisé par le fait que l'on fait suivre l'ultrafiltration de l'étape (2) par une diafiltration du rétentat n 2 jusqu'à élimination sensiblement complète de l'&alpha;-lactalbumine.

10 - Procédé selon l'une des revendications 1à 9, caractérisé par le fait que l'on fait suivre l'ultra filtration de l'étape (3) par une diafiltration du rétectat n 3 jusqu'à élimination sensiblement compléte des peptides

11 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu'il est conduit à une température inférieure à 45 C.

12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caracterisé par le fait que l'on soumet le rétentat n 2 à une purification par chromatographie d'échange d'ione, conduieant à de la lactoferrine pratiquement pure.

13 - Les différentes fractions obtenues par procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 12.

14 - Fraction selon la revendication 13.

correspondant au perméat n 1 et renferment :

&alpha;-lectalbumine .................... 76-78

lactoferrine ............................ 16-20

serum albumine ...........................2- 3 ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéines vraies

(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38

15 - Fraction selon la revendication 13, correspondant au rétentat n 1 et renfermant de la lactoferrine à raison de 29-34 grammes pour 100 grammes de protèines vraies (Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.

16 - Fraction selon la revendication 13, correspondant au perméat n' 2 et renfermant de &alpha;-lactalbumine à raison de 0,04-0,08 gramme pour. 100 grammes de produit liquide.

17 - Fraction selon la revendication 13, correspondant au rétentat n 2 et

lactoferrine ................... 32-35

sérum albumine ................. 9-13 ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéines vraies (Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.

18 - Produit à haute teneur en &alpha;-lactalbumine - au moine 80 g de la protéine pour 100 g de matière sèche résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat n 2 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 5000 et 50 000 daltons, de préférence de l'ordre de 10 000 daltons, conformément à l'une des revendications 2, 6, 7, 10 et 11.

19 - Froduit à haute teneur en lactoferrine - au moins 30% poids pour poids de protéines vraies et au moins 24% poids pour poids par rapport a la matière sèche - ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1,2 p mole de fer par micromole de protéine.

20 - Produit à haute teneur en lactoferrine - au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids de la matière sèche - résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat n 1 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 80 000 et 300 000 daltons, de préférence de l'ordre de 100000 daltons, conformément à l'une des revendications 1, 5, 7, 9, 11 et 12, ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1,2 mole de fer par micromole de protéine.

21 - Utilisation des fractions telles que définies à l'une des revendications 13 à 20 en thérapeutique ou diététique chez l'homme ou chez l'animal, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique.