WO1989011226A1 - PROCEDE DE FRACTIONNEMENT DES PROTEINES DU LAIT HUMAIN, CONDUISANT A LA PRODUCTION NOTAMMENT DE LACTOFERRINE ET D'alpha-LACTALBUMINE, ET PRODUITS OBTENUS - Google Patents

PROCEDE DE FRACTIONNEMENT DES PROTEINES DU LAIT HUMAIN, CONDUISANT A LA PRODUCTION NOTAMMENT DE LACTOFERRINE ET D'alpha-LACTALBUMINE, ET PRODUITS OBTENUS Download PDF

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WO1989011226A1
WO1989011226A1 PCT/FR1989/000255 FR8900255W WO8911226A1 WO 1989011226 A1 WO1989011226 A1 WO 1989011226A1 FR 8900255 W FR8900255 W FR 8900255W WO 8911226 A1 WO8911226 A1 WO 8911226A1
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lactoferrin
retentate
membrane
permeate
lactalbumin
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PCT/FR1989/000255
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Françoise MAYNARD
Alice Pierre
Jean-Louis Maubois
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inr
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Definitions

  • the present invention relates to a process of fractionation of proteins of human milk, leading in particular to the production of lactoferrin and human ⁇ - lactalbumin.
  • the present invention also relates to the various fractions and products obtained.
  • Lactoferrin and ⁇ - lacta Albumin are the two major proteins in human whey. Their concentrations vary respectively between approximately 1 and 2 g / l, and between approximately 3 and 4.8 g / l in mature human milk.
  • Human ⁇ -lactalbumin is a single chain protein with a molecular weight of 14,100 daltons. Representing 25% by weight of the proteins of human milk, it contributes considerably to the high biological value of this milk, by its composition in essential amino acids, in particular in tryptophan.
  • the present invention provides a process for preparing, on an industrial scale, primarily, human lactoferrin and human ⁇ - lactalbumin usable for the aforementioned needs, and secondary, in a more or less purified form, d other components of milk, such as caseins and high molecular weight proteins, and different peptides, glycosylated or not.
  • the method according to the invention involves a combination of filtration techniques on membranes having different cutting powers.
  • the present invention therefore firstly relates to a process for fractionating human milk, leading in particular to obtaining fractions enriched in human lactoferrin and in ⁇ -lactalbumin, characterized in that: (1) in a first step, human milk is subjected to microfiltration, in particular tangential microfiltration, on a membrane having a pore diameter of the order of 0.1 to 0.3 ⁇ m, to obtain: on the one hand, a permeate n ° 1, which consists of a fraction containing a preponderant proportion of ⁇ -lactalbumin; lactoferrin; albumin serum; of the peptides; on the other hand, a retentate No. 1, which consists of a fraction containing a preponderant proportion of lactoferrin; caseins; and higher molecular weight proteins; and
  • the permeate n ° 1 is subjected to an ultrafiltration on a membrane having a cutoff threshold of between approximately 80,000 and 300,000 daltons, to obtain: on the one hand, a permeate n ° 2, which consists in a fraction containing a major proportion of ⁇ lactalbumin and a minor fraction of proteins and peptides of lower molecular weight, and on the other hand, a retentate no 2, which consists of a fraction containing a preponderant proportion of lactoferrin, a proportion minor serum albumin.
  • the permeate no. 2 is subjected to ultrafiltration on a membrane having a cutoff threshold of between approximately 5000 and 50,000 daltons, to obtain: on the one hand, a permeate no. 3, essentially constituted by optionally glycosylated peptides; and on the other hand, a retentate No. 3, essentially constituted by ⁇ -lactalbumin.
  • the milk used is thawed milk, having been stored at a temperature of around 20oC, such storage can last several months.
  • the microfiltration of step (1) is carried out in tangential flow, the speed of circulation of the skimmed milk being of the order of 4 m / s to 7 m / s, preferably 6 m / s.
  • the microfiltration membrane which preferably has a pore diameter of the order of 0.2 ⁇ m, is chosen in particular from mineral membranes, among which mention may be made of zirconium oxide membranes, supported by carbon or sintered stainless steel, alumina or carbon.
  • this microfiltration is carried out at a pressure which, upstream of the microfiltration device, is between 3 and 1 relative bars, preferably between 1.5 and 1.0 relative bar, and which, downstream of the microfiltration device , is between 1.0 and 0.2 relative bar, preferably between 0.5 and 0.2 relative bar.
  • the temperature at which this microfiltration operation is carried out is less than 48 ° C. Above this temperature, the operation is technically feasible, but the components will be obtained in a more or less denatured form, that is to say inactivated. The same is true for the other membrane separations provided in accordance with the process of the invention.
  • the microfiltration of step (1) is followed by a diafiltration of retentate No. 1 to remove most of the ⁇ -lactalbumin and peptides.
  • Step (1) and this diafiltration step can moreover be carried out concomitantly.
  • an ultrafiltration membrane having a cutoff threshold of the order of 100,000 daltons.
  • the membranes which it is possible to use at this stage mention may be made of hollow fiber membranes sold by the companies AMICON and ROMI CON, flat design membranes sold by the companies TECHSEP, MILLIPORE and PASILAC.
  • step (2) The other parameters of this ultrafiltration of step (2) are conventional: one works at a pressure which, upstream of the ultrafiltration device, is between 6.0 and 1.0 bars relative depending on the membrane used, and which , downstream of the ultrafiltration device, is between 4.0 and 0.2 relative bars, and the retentate No. 1 is circulated at a speed between 4.5 and 1.5 m / s.
  • step (2) It is possible to follow the ultrafiltration of step (2) by a diafiltration of retentate No. 2, until substantially complete elimination of the ⁇ -lactalbumin.
  • This diafiltration step can be carried out concomitantly with the ultrafiltration step (2).
  • the ultrafiltration of step (3) can be carried out with the use of a membrane having a cut-off threshold preferably having a value of the order of 10,000 daltons. The other parameters of this ultrafiltration, including the nature of the membrane, are similar to those indicated for the ultrafiltration of step (2).
  • the ultrafiltration of step (3) can be followed by a diafiltration of retentate No. 3 until the peptides are substantially eliminated.
  • retentate No. 2 can be subjected to purification by ion exchange chromatography, in particular by the technique described by FOLEY AA, BATES GW, 1987, "Anal. Biochem., 162, 296-300".
  • each of the fractions obtained by the process of the invention and its variants can be dried to give a powder, which is easier to use for the therapeutic and dietetic applications provided for these substances.
  • the present invention also relates to the various fractions obtained by this process, and in particular the following fractions:
  • Fraction corresponding to permeate No. 2 which contains: ⁇ -lactalbumin at a rate of 0.04-0.08 grams per 100 grams of liquid product.
  • Fraction corresponding to retentate No. 2 which contains: lactoferrin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32-35 albumin serum. . . . . . . . . . . . . 9-12, these values being expressed in grams of protein designated for 100 grams of true proteins (N t -N sol TCA 12% ) x 6.38 Fraction corresponding to retentate No. 3, which contains ⁇ -lactalbumin at a rate of 80- 81g per 100 grams of powder making 2.5% humidity.
  • the invention also relates, in general, to the following products: a product with a high content of ⁇ -lactalbumin
  • lactoferrin having an iron fixing capacity determined according to the method of Graham and Bates (GRAHAM G., BATES GW , 1976. Approaches to the standardization of sérum unsaturated iron-binding capacity. J. Lab. Clin. Med., 88 (3), 477-486), at least equal to 60% of the theoretical capacity, i.e. at least 1, 2 ⁇ mol of iron per micromole of protein; a product with a high lactoferrin content
  • Figure 1 schematically shows the steps of the method according to this embodiment; and Figures 2 to 8 illustrate the results of the various analyzes that have been carried out.
  • a mixing milk from the Paris lactarium was used. After thawing by immersion in a water bath at 40 ° C., the milk was brought to a temperature of 37 ° C. and it was skimmed on a Wesfalia skimmer, type DD 100 Z. The volume of the skimmed milk was 60 liters.
  • Step (1) The skimmed milk was subjected to microfiltration in an SFEC pilot unit comprising two positive displacement pumps, namely a pump supply and a 15 m 3 .h -1 recirculation pump, as well as two modules fitted with CARBOSEP M14 mineral membranes.
  • the membrane surface naire was 1.6 m2.
  • the test was carried out at a temperature of 48-50 ° C, with an average transmembrane pressure of 1.45 bar.
  • the recirculation rate of the product in the membrane was 4.0 ms -1 .
  • Retentate No. 2 (10 liters) was continuously diafiltered with deionized water, until complete elimination of the ⁇ -lactalbumin. Part of the permeate n ° 2 was concentrated on the ROMICON PM10 membrane. Retentate No. 3 thus obtained was diafiltered continuously until complete elimination of the peptides, which was assessed by HPLC in gel filtration at pH 2.2 (detection at 210 nm).
  • lactoferrin was purified from retentate No. 2, by ion exchange chromatography, according to the aforementioned method of FOLEY and BATES. Different analyzes have been carried out on the various fractions obtained:
  • the polyacrylamide gel (15%) - SDS electrophoresis of the various fractions was carried out on BIORAD equipment according to the method of LAEMMLI U.K. (1978) "Nature, 227, 680-685".
  • Figure 2 the legend of which is as follows, represents the diagram obtained: A: human milk B: retentate n ° 1 C: permeate n ° 1
  • Sa albumin serum
  • Lily lysozyme
  • La ⁇ -lactalbumin
  • SIGMA Chemical Co. Saint Louis, U.S.A.
  • the different fractions were also subjected to HPLC chromatography in gel filtration, using a TSK 2000 SW column with a length of 60 cm.
  • the mobile phase consisted of 0.01M monopotassium phosphate brought to pH 2.2 with orthophosphoric acid.
  • the flow rate was 1 ml.mn -1 , and the detection was carried out at 210 nm.
  • Figure 3 the legend of which is as follows, represents the chromatograms obtained: A: huma milk in B: permeate n ° 1
  • a reverse phase HPLC analysis was also carried out of the products separated by microfiltration, of the products separated by the ultrafiltration of step (2), of the retentate No. 3 and of the lactoferrin isolated by ion exchange chromatography, the chromatograms obtained being represented in Figures respectively 4 to 7.
  • a column C 18 VYDAC 218 TP 54 was used. Elution was carried out by a gradient established using two buffers: buffer A (water-0.1% TFA) and buffer B (water-acetonitrile 20/80-0.1% TFA). The gradient, from 30 to 90% of buffer B, was carried out in 30 minutes. The flow rate was 1 ml. mn -1 , and the wavelength was fixed at 280 nm.
  • the microfiltration of skimmed milk allows a permeate n ° 1 containing peptides, ⁇ -lactalbumin and proteins of higher molecular weight than the previous ones, not identified during the HPLC analysis in gel filtration ( Figure 3B ).
  • the permeation flow and the protein retention rate vary respectively from 54.5 to 45.5 1.
  • retentate No. 1 The diafiltration of retentate No. 1 makes it possible to eliminate most of the ⁇ -lactalbumin and the peptides.
  • the final retentate No. 1 thus obtained still contains 29 to 34% of lactoferrin (FIG. 4C).
  • step (2) leads to the separation of the ⁇ -lactalbumin (permeate n ° 2).
  • the proteins of higher molecular weights namely lactoferrin and serum albumin, are retained in retentate No. 2 ( Figure 5).
  • Diafiltration eliminates almost all of the ⁇ -lactalbumin, and the final retentate No. 2 thus obtained (FIG. 5C) contains, compared to the true proteins, lactoferrin (32 to 35%) of the serum albumin (9 -12%) and other unidentified nitrogenous materials (probably peptides).
  • the ultrafiltration of step (3) concentrates the ⁇ -lactalbumin by eliminating the fractions of lower molecular weight.
  • Lactoferrin was purified from retentate # 2 using its basic properties. The technique used makes it possible to obtain this protein with a high degree of purity ( Figure 7). The comparison of its amino acid composition with that published by QUERINJEAN P., MASSON PL, HEREMANS JF 1971 "Eur. J. Biochm. 20, 420-325", gives a correlation coefficient of 0.974. The chromatographic profile obtained in reverse phase and the electrophoresis in SDS shows a homogeneity of the lactoferrin obtained. It contains 0.75 ⁇ mol of iron / ⁇ mol of protein, which represents a saturation of 37.5%.
  • Figure 8 shows the saturation curve of human lactoferrin by progressive addition of a solution of Fe (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 0.2 mM in 0.01M HCl. Saturation is reached when 0.71 ⁇ g of iron / mg of protein is added. This corresponds to the fixing of 0.96 ⁇ mo le of iron / ⁇ mo le of lactoferrin. Adsorption at 470 nm shows that the initial lactoferrin contains 0.54 ⁇ g of iron / mg of protein. The initial saturation is therefore 37.5%.
  • the total fixing capacity is 1.71 ⁇ moIe / ⁇ mole of proteins, ie 85% of the theoretical capacity.
  • the two major proteins of human whey are separated and purified without the iron sequestration capacity of lactoferrin being apparently affected.
  • the proposed method also makes it possible to recover, in a more or less purified form, other components of milk such as caseins and proteins of high molecular weight in retentate No. 1, and glycosylated peptides or not in the permeate # 3.

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Abstract

Dans une première étape (1), on soumet du lait humain à une microfiltration sur une membrane présentant un diamètre de pores de l'ordre de 0,1 à 0,3 mum, pour obtenir un perméat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante d'alpha-lactalbumine; de la lactoferrine; de la sérum albumine; des peptides; et un rétentat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine, des caséines; et des protéines de poids moléculaires plus élevés; et (2) dans une seconde étape, on soumet le perméat n° 1 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 80.000 et 300.000 daltons, pour obtenir un perméat n° 2 qui consiste en une fraction contenant une proportion majeure d'alpha-lactalbumine et une fraction mineure de protéines et peptides de plus faible poids moléculaire, et un rétentat n° 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine et une proportion mineure de sérum albumine.

Description

"Procédé de fractionnement des protéines du lait humain, conduisant à la production notamment de lactoferrine et d' α - lactalbumine, et produits obtenus" La présente invention porte sur un procédé de fractionnement des protéines du lait humain, conduisant notamment à la production de lactoferrine et d' α - lactalbumine humaines. La présente invention porte également sur les différentes fractions et produits obtenus.
La lactoferrine et l' α - lactaIbumine sont les deux protéines majeures du lactosérum humain. Leurs concentrations varient respectivement entre environ 1 et 2 g / l, et entre environ 3 et 4,8 g/l dans le lait humain mature.
La lactoferrine est une glycoprotéine à simple chaîne, riche en acides aminés basiques ( pHi = 8,7). Son poids moléculaire est. de 76.400 daltons. Elle présente la propriété de fixer deux atomes de fer par l' intermédiaire d'un complexe mettant en oeuvre deux ions bicarbonate. Partiellement saturée dans le lait (8 à 25% de sa capacité théorique de fixation), cette protéine est capable d'inhiber in vitro, par ferririvation, la croissance de microorganismes tels que Bacillus stearo thermophilus, Bacillus subtilis ou Escherichia coli. L'inhibition observée est de type bacteriostatique, la croissance des bactéries étant rétablie par addition de fer en excès dans le milieu. Toutefois, un effet bactéricide direct a été observé, un tel effet pouvant découler d'une fixation de la lactoferrine à la surface des cellules, qui entraînerait un blocage, soit des sites de transport de certains nutriments, soit des mécanismes de biosynthèse de la paroi. L' α -lactalbumine humaine est une protéine à simple chaîne, ayant une masse moléculaire de 14.100 daltons. Représentant 25% en poids des protéines du lait humain, elle contribue considérablement à la haute valeur biologique de ce lait, de par sa composition en acides aminés essentiels, notamment en tryptophane.
De nombreuses méthodes ont été mises en oeuvre pour isoler et purifier ces deux protéines, mais toujours à des fins analytiques. Ainsi différentes techniques chromatographiques ont été utilisées; on peut citer notamment les séparations chromatographiques basées sur l'échange d'ions, rapportées par BLACKBERG L., HERNELL O. 1980 "FEBS Lett.,
109 (2), 180-184", pour la lactoferrine, et par LONNERDAL B., GLAZIER C., 1985 "J. Nutr., 115, 1209-1216" pour l' α-lactalbumine, la séparation chromatographique basée sur l'affinité par chélation avec des métaux, rapportée par LONNERDAL B. CARLSSON J. PORATH J. 1977 "FEBS Lett., 75 (1), 89-92"; et la séparation chromatographique basée sur l' immuno-affinité, rapportée par KAWAKAMI H., SHINMOTO H., DOSAKO S., SOGO Y. 1987 "J. Dairy Sci., 70, 752-759.
Si ces méthodes permettent d'obtenir des protéines avec un degré de pureté élevée, elles ne sont pas adaptées à l'obtention de quantités d' α -lactalbumine et de lactoferrine humaines requises pour une utilisation thérapeutique. Les quantités obtenues sont, en effet, inférieures au gramme. Par ailleurs, les autres composants protéiques ne sont pas ou sont mal récupérés.
En France, les lactariums recueillent actuellement près de 100.000 litres/an de lait humain. Outre la redistribution du lait, la séparation des constituants protidiques, lipidiques et glucidiques permettrait de préparer des nutriments aptes à répondre à des besoins thérapeutiques de prématurés ou de nourrissons souffrant de pathologies graves de la digestion. La présente invention propose un procédé permettant de préparer, à l'échelle industrielle, à titre principal, la lactoferrine humaine et l ' α - lactalbumine humaine utilisables pour les besoins précités, et à titre secondaire, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres composants du lait, tels que les caséines et les protéines de poids moléculaires élevés, et différents peptides, glycosylés ou non. Le procédé selon l'invention met en jeu une combinaison de techniques de filtration sur membranes présentant différents pouvoirs de coupure.
La présente invention a donc d'abord pour objet un procédé de fractionnement du lait humain, conduisant notamment à l'obtention de fractions enrichies en lactoferrine et en α -lactalbumine humaines, caractérisé par le fait que: (1) dans une première étape, on soumet du lait humain à une microfiltration, notamment une microfiltration tangentielle, sur une membrane présentant un diamètre de pores de l 'ordre de 0,1 à 0,3 μm, pour obtenir: d'une part, un perméat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante d' α -lactalbumine; de la lactoferrine; de la sérum albumine; des peptides; d'autre part, un rétentat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine; des caséines; et des protéines de poids moléculaires plus élevés; et
(2) dans une seconde étape, on soumet le perméat n° 1 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 80.000 et 300.000 daltons, pour obtenir: d'une part, un perméat n° 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion majeure d' α lactalbumine et une fraction mineure de protéines et peptides de plus faible poids moléculaire, et d'autre part, un rétentat nº 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine, une proportion mineure de sérum albumine.
Conformément à un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention,
(3) dans une troisième étape, on soumet le perméat n° 2 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 5000 et 50.000 daltons, pour obtenir: d'une part, un perméat n° 3, essentiellement constitué par des peptides éventuellement glycosylés; et d'autre part, un rétentat n° 3, essentiellement constitué par de l' α - lactalbumine.
Selon l'invention, on part généralement d'un lait écréme. Par ailleurs, pour des raisons évidentes, le lait utilisé est un lait décongelé, ayant été stocké à une température de l'ordre de 20ºC, un tel stockage pouvant durer plusieurs mois.
La microfiltration de l'étape (1) est conduite en flux tangentiel, la vitesse de circulation du lait écrémé étant de l'ordre de 4 m/s à 7 m/s, de préférence de 6 m/s. La membrane de microfiltration, qui présente, de préférence, un diamètre de pores de l'ordre de 0,2 μm , est choisie notamment parmi les membranes minérales, parmi lesquelles on peut citer les membranes en oxyde de zirconium, supporté par du carbone ou de l'acier inoxydable fritte, en alumine ou en carbone.
Par ailleurs, on conduit cette microfiltration à une pression qui, en amont du dispositif de microfiltration, est comprise entre 3 et 1 bars relatifs, de préférence entre 1,5 et 1,0 bar relatif, et qui, en aval du dispositif de microfiltration, est comprise entre 1,0 et 0.2 bar relatif, de préférence, entre 0,5 et 0,2 bar relatif.
La température à laquelle est conduite cette opération de microfiltration est inférieure à 48°C. Au-delà de cette température, l'opération est techniquement réalisable, mais les composants seront obtenus sous une forme plus ou moins dénaturée, c'est-à-dire inactivée. Il en est de même pour les autres séparations sur membrane prévues conformément au procédé de l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, on fait suivre la microfiltration de l'étape (1) par un diafiltration du rétentat n° 1 pour éliminer la majeure partie de l' α -lactalbumine et des peptides. L'étape (1) et cette étape de diafiltration peuvent du reste être réalisées de façon concomitante. Pour réaliser l' ultrafiltration de l'étape (2), on utilise, de préférence, une membrane d' ultrafiltration présentant un seuil de coupure de l'ordre de 100.000 daltons. Parmi les membranes qu' il est possible d'utiliser à cette étape, on peut citer les membranes à fibres creuses commercialisées par les firmes AMICON et ROMI CON, les membranes de conception plane commercialisées par les firmes TECHSEP , MILLIPORE et PASILAC. Les autres paramètres de cette ultrafiltration de l'étape (2) sont classiques: on travaille à une pression qui, en amont du dispositif d'ultrafiltration, est comprise entre 6,0 et 1,0 bars relatifs selon la membrane utilisée, et qui, en aval du dispositif d'ultrafiltration, est comprise entre 4,0 et 0,2 bars relatifs, et on fait circuler le rétentat n° 1 à une vitesse comprise entre 4,5 et 1,5 m/s.
Il est possible de faire suivre l' ultrafiltration de l'étape (2) par une diafiltration du rétentat n° 2, jusqu'à élimination sensiblement complète de l' α -lactalbumine. Cette étape de diafiltration peut être réalisée de façon concomitante à l'étape (2) d'ultrafiltration. L' ultrafiltration de l'étape (3) peut être menée avec utilisation d'une membrane présentant un seuil de coupure présentant de préférence une valeur de l'ordre de 10.000 daltons. Les autres paramètres de cette ultrafiltration, y compris la nature de la membrane, sont analogues à ceux indiqués pour l' ultrafiltration de l'étape (2). De la même façon, on peut faire suivre l' ultrafiltration de l'étape (3) par une diafiltration du rétentat n° 3 jusqu'à élimination sensiblement complète des peptides. Par ailleurs, on peut soumettre le rétentat n° 2 à une purification par chromatographie d'échange d' ions, notamment par la technique décrite par FOLEY A. A., BATES G.W., 1987, "Anal. Biochem., 162, 296-300".
Chacune des fractions obtenues par le procédé de l'invention et ses variantes peut être séchée pour donner une poudre, plus facile à mettre en oeuvre pour les applications thérapeutiques et diététiques prévues pour ces substances.
La présente invention porte également sur les différentes fractions obtenues par ce procédé, et notamment les fractions suivantes:
Fraction correspondant au perméat n° 1, qui renferme: α - l a c t a l bum i ne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 - 78 lactoferrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 16-20 s é rum albumine .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2- 3, ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéines vraies (Nt-Nsol TCA 12 %) x 6,38 (TCA = acide trichloracétique).
Fraction correspondant au rétentat n° 1, qui renferme: de la lactoferrine à raison de 29-34 grammes pour 100 grammes de protéine vraies
(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.
Fraction correspondant au perméat n° 2, qui renferme: de l' α -lactalbumine à raison de 0,04-0,08 gramme pour 100 grammes de produit liquide.
Fraction correspondant au rétentat n° 2, qui renferme: lactoferrine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 32-35 sérum albumine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9-12, ces valeurs étant exprimées en grammes de protéine désignée pour 100 grammes de protéines vraies (Nt-Nsol TCA 12%)x 6,38 Fraction correspondant au rétentat n° 3, qui renferme de l' α -lactalbumine à raison de 80-81g pour 100 grammes de poudre faisant 2,5% d'humidité.
L'invention porte également, d'une manière générale, sur les produits suivants: un produit à haute teneur en α -lactalbumine
- au moins 80 g de la protéine pour 100 g de matière sèche - résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat n° 2 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 5000 et 50.000 daltons, de préférence, de l'ordre de 10.000 daltons, conformément à ce qui a été exposé ci-dessus; un produit à haute teneur en lactoferrine
- au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids par rapport à la matière sèche - ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates (GRAHAM G., BATES G.W., 1976. Approaches to the standardization of sérum unsaturated iron-binding capacity. J. Lab. Clin. Med., 88 (3), 477-486), au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1,2 μmole de fer par micromole de protéinés; un produit à haute teneur en lactoferrine
- au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids de la matière sèche - résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat n° 1 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 80.000 et 300.000 daltons, de préférence de l'ordre de 100.000 daltons, conformément à ce qui a été exposé ci-dessus.
Enfin, l'invention porte sur l 'utilisation de ces fractions plus ou moins purifiées à des fins thérapeutiques et diététiques, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique. L' invention sera encore illustrée par la description qui suit d'un mode de réalisation particulier, faite en référence au dessin annexé. Sur ce dessin: la Figure 1 montre schématiquement les étapes du procédé conforme à ce mode de réalisation; et les Figures 2 à 8 illustrent les résultats des diverses analyses qui ont été effectuées.
Dans cet exemple, on a utilisé un lait de mélange provenant du lactarium de Paris. Après décongélation par immersion dans un bain d'eau à 40°C, on a porté le lait à une température de 37°C et on l'a écrémé sur une écrémeuse Wesfalia, type DD 100 Z. Le volume du lait écrémé était de 60 litrès.
On a ensuite conduit un fractionnement des protéines du lait par des filtrations successives, comme illusré par la Figure 1. Etape (1): On a soumis le lait écrémé à une microfiltration dans une unité pilote SFEC comportant deux pompes volumétriques, à savoir une pompe d'alimentation et une pompe de recirculation de 15 m3.h-1, ainsi que deux modules équipés de membrane minérales CARBOSEP M14. La surface membra naire était de 1,6 m2. L'essai a été réalisé à une température de 48-50°C, avec une pression transmembranaire moyenne de 1,45 bar. La vitesse de recirculation du produit dans la membrane était de 4,0 m.s-1.
Ensuite, le rétentat obtenu (20 litres) a été diafiltré en continu avec 60 litres d'eau désionisée. Après diafiItration, le rétentat a été concentré deux fois. Etapes (2) et (3):
On a conduit deux étapes successives d'ultrafiltration sur une autre unité pilote équipée d'une pompe volumetrique avec une circulation de 4 m3. h- 1, et d'une membrame à fibres creuses ROMICON PM 100 pour l' ultrafiltration de l'étape (2) et ROMICON PM 10 pour l' ultrafiltration de l'étape (3), la surface membranaire étant, dans les deux cas, de 1,5 m2. La température était de 48-50°C, et la pression transmembranaire moyenne, de 0,6 bar.
Le rétentat n° 2 (10 litres) a été diafiltré en continu avec de l'eau désionisée, jusqu'à élimination complète de l' α -lactalbumine. Une partie du perméat n° 2 a été concentrée sur la membrane ROMICON PM10. Le rétentat n° 3 ainsi obtenu a été diafiltré en continu jusqu'à élimination complète des peptides, ce qui a été apprécié par HPLC en gel filtration à pH 2,2 (détection à 210 nm).
La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n° 2, par chromatographie d'échange d' ions, selon la méthode précitée de FOLEY et BATES. Différentes analyses ont été conduites sur les diverses fractions obtenues:
. L' électrophorèse en gel de polyacrylamide (15%) - SDS des différentes fractions a été réalisée sur un équipement BIORAD selon la méthode de LAEMMLI U.K. (1978) "Nature, 227, 680-685".
La Figure 2, dont la légende est la suivante, représente le diagramme obtenu: A : lait humain B : rétentat n° 1 C : perméat n° 1
D : rétentat n° 2 E : perméat n° 2 F : rétentat n° 3 G : lactoferrine isolée H : protéines étalons (Lf : lactoferrine;
Sa: sérum albumine; Lys : lysozyme; La : α -lactalbumine; provenant de la Société SIGMA Chemical Co., Saint Louis, U.S.A.).
Les différentes fractions ont également été soumises à une chromatographie HPLC en gel filtration, par utilisation d'une colonne TSK 2000 SW d'une longueur de 60 cm. La phase mobile était constituée par du phosphate monopotassique 0,01M amené à pH 2,2 avec de l'acide orthophosphorique. Le débit était de 1 ml.mn-1, et la détection a été effectuée à 210 nm.
La Figure 3, dont la légende est la suivante, représente les chromatogrammes obtenus: A : lait huma in B : perméat n° 1
C : perméat n° 2 D : rétentat n° 2 E : rétentat n° 3 1 : exclusion 2 : caséines 3 : α-lactalbumine
4 : fractions peptidiques.
On a également effectué une analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par microfiltration, des produits séparés par l' ultrafiltration de l'étape (2), du rétentat n° 3 et de la lactoferrine isolée par chromatographie d'échange d'ions, les chromatogrammes obtenus étant représentés sur les Figures respectivement 4 à 7. Une colonne C 18 VYDAC 218 TP 54 a été utilisée. L'élution a été réalisée par un gradient établi à l'aide de deux tampons: tampon A (eau-TFA 0,1%) et tampon B (eau-acétonitrile 20/80-TFA 0,1%). Le gradient, de 30 à 90% de tampon B, a été effectué en 30 minutes. Le débit était de l ml. mn-1, et la longueur d'onde a été fixée à 280 nm. Légende de la Figure 4:
Analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par la microfiltration de l'étape (1):
A : lait humain écrémé B : perméat n° 1 C : rétentat n° 1 1 : lactoferrine 2 : sérum albumine
3 : caséines
4 : α -lactalbumine Légende de la Figure 5:
Analyse HPLC en phase inverse des produits séparés par l' ultrafiltration de l'étape (2):
A : perméat n° 1
B : perméat n° 2
C : rétentat n° 2 1 : lactoferrine 2 : s e r um a l bum i n e
3 : α -lactalbumine Légende de la Figure 6:
Analyse HPLC en phase inverse du rétentat n° 3:
A : α -lactalbumine étalon
B : rétentat n° 3 Légende de la Figure 7:
Analyse HPLC en phase inverse de la lactoferrine isolée par chromatographie d'échange d' ions :
A : lactoferrine étalon
B : lactoferrine purifiée.
En conclusion, la microfiltration du lait écrémé permet un perméat n° 1 contenant des peptides, de l ' α -lactalbumine et des protéines de poids moléculaire plus élevés que les précédents, non identifiés lors de l ' analyse HPLC en gel filtration (figure 3B). Au cours de la microfiltration, le flux de perméation et le taux de rétention protéique varient respectivement de 54,5 à 45,5 1. h- 1.m-2 et de 33 à 42% au bout de 35 minutes, ce qui figure dans le tableau suivant:
TABLEAU 1
Rendement de l'extraction de l' α - lactalbumine lors de la microfiltration de l'étape (1)
Temps α-lacta. α-lacta Debit PerforTaux mn. rétentat perméat l.n- 1 .m-2 mance de rég/l g/l membratenne tion g.h-1.m-2 %
10 3,20 2,12 54,5 115 33
15 4,02 2,25 52,5 118 44
25 4,68 2,8 48,75 130 42
35 5,08 2,93 45,5 133 42
Les résultats démontrent que dans les conditions expérimentales utilisées, il n'y a pas de colmatage rapide de la membrane.
La diafiltration du rétentat n° 1 permet d'éliminer la majeure partie de l' α-lactalbumine et des peptides. Le rétentat n° 1 final ainsi obtenu contient encore de 29 à 34% de lactoferrine (figure 4C).
L' ultrafiltration de l'étape (2) conduit à la séparation de l' α-lactalbumine (perméat n° 2). Les protéines de poids moléculaires plus élevés, à savoir la lactoferrine et la sérum albumine, sont retenues dans le rétentat n° 2 (Figure 5). La diafiltration élimine la quasi-totalité de l' α-lactalbumine, et le rétentat n° 2 final ainsi obtenu (Figure 5C) contient, par rapport aux protéines vraies, de la lactoferrine (32 à 35%) de la sérum albumine (9-12%) et d'autres matières azotées non identifiées (probablement des peptides). L' ultrafiltration de l'étape (3) concentre l' α -lactalbumine en éliminant les fractions de plus faible poids moléculaire.
L'analyse en gel filtration du rétentat n° 3 (Figure 3E) montre la présence d'un seul pic, alors que la chromatographie HPLC en phase inverse (Figure 6B) met en évidence, outre le pic principal, un petit pic surnuméraire également présent dans la protéine purifiée de référence (Figure 6A).
La composition en acides aminés de l' α - lactalbumine isolée est en accord avec celle publiée par FINDLAY J . B .C . , BREW K. 1972 "Eur. J. Bio Chem., 27, 65-86", avec un coefficient de corrélation de 0,986.
La lactoferrine a été purifiée à partir du rétentat n° 2 en utilisant ses propriétés basiques. La technique utilisée permet d'obtenir cette protéine avec un degré de pureté élevée (Figure 7). La comparaison de sa composition en acides aminés avec celle publiée par QUERINJEAN P., MASSON P.L., HEREMANS J.F. 1971 "Eur. J. Biochm. 20, 420-325", donne un coefficient de corrélation de 0,974. Le profil chromatographique obtenu en phase inverse et l' électrophorèse en SDS montre une homogénéité de la lactoferrine obtenue. Elle contient 0,75 μ mole de fer/ μ mo l e de protéines, ce qui représente une saturation de 37,5%. La Figure 8 représente la courbe de saturation de la lactoferrine humaine par addition progressive d'une solution de Fe (NH4)2(SO4)2 0,2 mM dans HCl 0,01M. La saturation est atteinte lorsque 0,71 μ g de fer/mg de protéine sont ajoutés. Ceci correspond à la fixation de 0,96 μ mo l e de fer/ μmo l e de lactoferrine. L'adsorption à 470 nm montre que la lactoferrine initiale contient 0,54 μg de fer/mg de protéine. La saturation initiale est donc de 37,5%. La capacité de fixation totale est de 1,71 μmoIe/ μmole de protéines, soit 85% de la capacité théorique.
Ainsi, avec le procédé de l'invention, les deux protéines majeures du lactosérum humain sont séparées et purifiées sans que la capacité de séquestration du fer de la lactoferrine en soit apparemment affectée. Il est à noter que le procédé proposé permet également de récupérer, sous une forme plus ou moins purifiée, d'autres composants du lait tels que caséines et protéines de poids moléculaire élevé dans le rétentat n° 1, et peptides glycosylées ou non dans le perméat n° 3.

Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de fractionnement du lait humain, conduisant notamment à l'obtention de fractions enrichies en lactoferrine et en α -lactalbumine humaines, caractérisé par le fait que :
(1) dans une première étape, on soumet du lait humain à une microfiltration, sur une membrane présentant un diamètre de pores de l'ordre de 0,1 à 0,3 μm , pour obtenir: d'une part, un perméat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante d' α -lactalbumine; de la lactoferrine; de la sérum albumine; des peptides; d'autre part, un rétentat n° 1, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine; des caséines; et des protéines de poids moléculaires plus élevés; et
(2) dans une seconde étape, on soumet le perméat n° 1 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 80.000 et 300.000 daltons, pour obtenir: d'une part, un perméat n° 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion majeure d ' α -lactalbumine et une fraction mineure de protéines et peptides de plus faible poids moléculaire, et d'autre part, un rétentat n° 2, qui consiste en une fraction contenant une proportion prépondérante de lactoferrine et une proportion mineure de sérum albumine.
2. Procédé selon la revendication 1. ca ractérisé par le fait que:
(3) dans une troisième étape, on soumet le perméat n° 2 à une ultrafiltration sur une membrane ayant un seuil de coupure compris entre environ 5000 et 50.000 daltons, pour obtenir: d'une part, un perméat n° 3, essentiellement constitué par des peptides éventuellement glycosylés; et d'autre part, un rétentat n° 3, essentiellement constitué par de l' α -lactalbumine.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'à l'étape (l), on utilise une membrane présentant un diamètre de pores de l'ordre de 0,2 μm.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait qu'à l'étape (1), on utilise une membrane minérale en une matière choisie parmi l'oxyde de zirconium, supporté par du carbone ou de l'acier inoxydable fritte, l'alumine ou le carbone.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'à l'étape (2), un utilise une membrane présentant un seuil de coupure de l'ordre de 100.000 daltons.
6. Procédé selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé par le fait qu'à l'étape (3), on utilise une membrane présentant un seuil de coupure de l'ordre de 10.000 daltons.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'aux étapes (2) et éventuellement (3), on utilise une membrane à fibres creuses ou une membrane plane.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait que l'on fait suivre la microfiltration de l'étape (1) par une diafiltration du rétentat n° 1 pour éliminer la majeure partie de l' α -lactalbumine et des peptides.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait que l'on fait suivre l' ultrafiltration de l'étape (2) par une diafilration du rétentat n° 2 jusqu'à élimination sensiblement complète de l 'α -lactalbumine;
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé par le fait que l'on fait suivre l' ultrafiltration de l'étape (3) par une diafiltration du rétentat n° 3 jusqu'à élimination sensiblement complète des peptides.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé par le fait qu' il est conduit à une température inférieure à 48°C.
12. Procédé selon 1 'une des revendications 1 à 11, caractérisé par le fait que l'on soumet le rétentat nº 2 à une purification par chromatographie d'échange d' ions, conduisant à de la lactoferrine pratiquement pure.
13. Les différentes fractions obtenues par le procédé tel que défini à l'une des revendications 1 à 12.
14. Fraction selon la revendication 13, correspondant au perméat n° 1 et renfermant: α -lactalbumine . . . . . . . . . . . . 76 - 78 lactoferrine . . . . . . . . . . . .. . . . 16-20 sérum albumine . . . . . . . . . . . .. . 2- 3 ces valeurs étant exprimées en grammes de protéines désignée pour 100 grammes de protéines vraies
(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.
15. Fraction selon la revendication 13, correspondant au rétentat n° 1 et renfermant de la lactoferrine à raison de 29-34 grammes pour 100 grammes de protéines vraies (Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.
16. Fraction selon la revendication 13, correspondant au perméat n° 2 et renfermant de
-lactalbumine à raison de 0,04-0,08 gramme pour 100 grammes de produit liquide.
17. Fraction selon la revendication 13, correspondant au rétentat n° 2 et renfermant: lactoferrine . . . . . . . . . . . .. . . . 32-35 sérum albumine . . . . . . . . . . . .. . 9-12 ces valeurs étant exprimées en grammes de protéines désignées pour 100 grammes de protéines vraies
(Nt-Nsol TCA 12%) x 6,38.
18. Produit à haute teneur en α-lactalbumine - au moins 80 g de la protéine pour 100 g de matière sèche - résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat nº 2 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 5000 et 50.000 daltons, de préférence de l'ordre de 10.000 daltons, conformément à l'une des revendications 2, 6, 7, 10 et 11.
19. Produit à haute teneur en lactoferrine - au moins 30% poids pour poids de protéines vraies et au moins 24% poids pour poids par rapport à la matière sèche - ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1, 2 μmole de fer par micromole de protéine.
20. Produit à haute teneur en lactoferrine - au moins 30% poids pour poids des protéines vraies et au moins 24% poids pour poids de la matière sèche - résultant de la concentration par ultrafiltration du perméat n° 1 avec une membrane ayant un pouvoir de coupure compris entre 80.000 et 300.000 daltons, de préférence de l 'ordre de 100.000 daltons, conformément à l 'une des revendictions 1 , 5, 7, 9, 11 et 12, ladite lactoferrine ayant une capacité de fixation du fer déterminée selon la méthode de Graham et Bates au moins égale à 60% de la capacité théorique, soit au moins 1.2 μ mole de fer par micromole de protéine.
21. Util isation des fractions telles que définies à l 'une des revendications 13 à 20 en thérapeutique ou diététique chez l 'homme ou chez l 'animal, notamment en nutrition thérapeutique pédiatrique.
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