CN113372437A - 用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其包括(a)使新鲜的脱脂牛奶直接通过装填有阳离子交换填料的层析柱，所述阳离子交换填料具有一定的粒径和孔径；(b)用水和含第一浓度盐的水溶液清洗残留的牛奶和杂质；(c)用含第二浓度盐的水溶液或缓冲液以200‑1000cm/h的流速洗脱，得到乳铁蛋白。本发明建立了一种适用于工业级从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，提取乳铁蛋白的纯度和收率大大提高。此外，本发明的方法避免了使用大型复杂设备，同时通过简单的提取和纯化，实现低成本乳铁蛋白的提取。

Description

用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法
技术领域
本发明涉及蛋白提取和纯化领域，具体地涉及提取乳铁蛋白的方法，尤其是涉及用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法。
背景技术
乳铁蛋白(lactoferrin，LF)是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，为婴幼儿提供多种生物功能，尤其是调节免疫和对病原微生物的抵御功能。对于非母乳喂养的婴幼儿，动物奶中的乳铁蛋白含量只有0.02-0.35mg/ml，远远低于人乳中乳铁蛋白的含量，无法满足婴幼儿的喂养要求。
基于众多的研究成果和试验，在婴幼儿配方食品中添加乳铁蛋白具有重要意义，既可满足婴儿生长发育的需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。根据最新的国家标准GB14880将乳铁蛋白列为营养强化剂。因此，乳铁蛋白的提取和纯化显得尤为重要。
例如，CN210841449U公开了新型的天然牛奶乳铁蛋白提取设备，包括固定盖、反应釜、控制箱、水泵和分离器，固定架内部的底部安装有控制箱，固定架内部的一侧安装有反应釜，固定盖的一侧设置有安全管，反应釜的底部安装有水泵，反应釜的一侧安装有分离器，分离器的内部设置有加热丝，分离器之间安装有挡板，挡板的底部安装有气体管道，螺旋挡板的下方设置有过滤网，分离器的底部安装有排出口，排出口的底部安装有连接头，分离器的顶部安装有维修顶盖。该实用新型通过在底部的过滤网采用生物过滤膜可有效的对牛奶当中的乳铁蛋白进行过滤，从而对乳铁蛋白进行收集，对于大规模的乳铁蛋白提取，设备要求相对较高且复杂。
再例如，CN106008703A公开了一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。该方法能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，但是提取量级在工业级生产条件下仍不能满足提取和纯化要求。
基于此，目前仍需一种是适用于工业级的从牛奶中提取乳铁蛋白的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人进行了深入研究，发现采用特定的提取步骤，并且通过控制提取过程中的层析条件，从而建立一种适用于工业级从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，提取乳铁蛋白的纯度和收率大大提高。此外，本发明的方法避免了使用大型复杂设备，同时通过简单的提取和纯化，实现低成本乳铁蛋白的提取。至少部分地基于该发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明提供一种用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其至少包括以下步骤：
(a)使新鲜的脱脂牛奶直接通过装填有阳离子交换填料的层析柱，所述阳离子交换填料的平均粒径为60-500μm且孔径为100-500nm；
(b)用水和含第一浓度盐的水溶液清洗残留的牛奶和杂质；
(c)用含第二浓度盐的水溶液或缓冲液以200-1000cm/h的流速洗脱，得到乳铁蛋白。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，步骤(a)中，控制层析柱的柱温在30-60℃的范围内。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，进一步包括(d)用0.5-1M NaOH溶液清洗再生装填有阳离子交换填料的层析柱。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，从牛奶中提取乳铁蛋白的纯度不低于92％，乳铁蛋白的收率不低于60％，优选地，乳铁蛋白纯度为92-96％，乳铁蛋白的收率为60-90％。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述阳离子交换填料的装填高度为100-500mm。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述阳离子交换填料为多孔聚甲基丙烯酸酯球形颗粒，且表面带有磺酸根基团。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述阳离子交换填料的交联度为50％-80％。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述含盐的水溶液是氯化钠溶液。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述含盐的水溶液是硫酸钠溶液。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述第二浓度大于所述第一浓度。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述缓冲液是pH5.0-7.0的磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液。
根据本发明所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，优选地，所述牛奶为脱脂牛奶。
经过本发明方法，提取乳铁蛋白的纯度和收率大大提高。本发明的方法适用于工业级从牛奶中提取乳铁蛋白，避免了使用大型复杂设备，同时通过简单的提取和纯化，实现了低成本乳铁蛋白的提取。
附图说明
图1为示例性的根据本发明的方法的纯化图谱。
图2为示例性的根据本发明的方法的HPLC检测图谱。
图3为另一示例性的根据本发明的方法的HPLC检测图谱。
图4为另一示例性的根据本发明的方法的HPLC检测图谱。
图5为比较例1得到的产品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。
本发明中，纯度和含量具有相同的含义，可互换使用。
本发明提供一种用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其至少包括步骤(a)-(c)。其中，牛奶优选脱脂牛奶，其可以为经半脱脂形成的低脂牛奶，也可以经全脱脂形成的全脱脂牛奶。当其为半脱脂牛奶时，其含1.0-1.5％脂肪，当其为全脱脂牛奶时，其含有的脂肪低于0.5％。需要说明的是，本发明中，所述牛奶在不需要进行例如去除某些特定蛋白，例如球蛋白等的预处理的情况下直接用于后续的乳铁蛋白提取，以实现提取工艺的时间和成本的降低。
考虑到层析条件对于乳铁蛋白的提取和纯化影响较大，因此以下对层析条件进行说明，这里的层析条件包括但不限于，层析柱的选择，层析柱填料、洗脱流速、洗脱液等。需要说明的是，乳铁蛋白提取是一个复杂的过程，尤其是涉及工业级进行大量提取时，需要考虑在大量的待提取物积聚效应以及较高柱压情况下，如何实现有效的提取。因此，需要整体考虑各种因素对于乳铁蛋白纯度和收率的影响。需要说明的是这里的柱压是指工业柱压，一般为2-4bar，优选3-4bar。本领域技术人员已知，柱压是指包括待提取牛奶装填产生的压力和洗脱时洗脱液的所具有的一定流速所产生的压强，这里的柱压不同于常规实验室使用的柱压。
在本发明的步骤(a)中，使新鲜的脱脂牛奶直接通过装填有阳离子交换填料的层析柱，所述阳离子交换填料的平均粒径为60-500μm且孔径为100-500nm。本发明中，内径是指层析柱内圆的直径，层析柱柱子的内径优选10-2000mm，还优选10-1800mm，进一步优选600-1800mm，例如800mm、1000mm、1200mm、1400mm、1600mm等。装填高度优选100-500mm，还优选200-500mm，进一步优选250-400mm。
本发明的层析柱填料的平均粒径为60-500μm，优选为100-500μm，还优选100-400mm，进一步优选200-400mm。该填料优选具有100-500nm的孔径，还优选200-500nm的孔径，进一步300-400nm的孔径。
优选地，本发明的填料为阳离子交换填料，进一步优选为多孔聚甲基丙烯酸酯球形颗粒，且表面带有磺酸根基团。还优选地，阳离子交换填料的交联度为50％-80％。进一步优选地，阳离子交换填料的交联度为60％-75％。交联度过低，则填料无法承受高压而变形，甚至破碎。另一方面，如果交联度过高，则影响脱脂牛奶的流速，同样不利于交换。
本发明的层析温度优选为30-60℃的温度，还优选为30-45℃的温度。例如，31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃等。
步骤(b)中，用水和含第一浓度盐的水溶液清洗残留的牛奶和杂质，尤其是清洗吸附在层析柱填料表面的残留牛奶和杂质。杂质在此不特别限定，本领域技术人员已知其具体成分，例如可以是包括国家标准GB 5413.30-2016或非强制性国家标准IRAM 14 008-1962所测定的那些杂质。清洗的具体步骤例如可以是先使用水过柱清洗后，再使用含第一浓度盐的水溶液再次过柱清洗。
步骤(c)中，用含第二浓度盐的水溶液或缓冲液以200-1000cm/h的流速洗脱，从而得到乳铁蛋白。洗脱的流速优选为210-1000cm/h，还优选为300-900cm/h，进一步优选为400-800cm/h，例如500cm/h、600cm/h、700cm/h等。流速过小则会增加层析的时间，流速过大则导致柱压过高、载量下降，进一步影响提取和纯化的纯度和收率。
这里的含盐的水溶液可以是氯化钠溶液，也可以是硫酸钠溶液。优选为氯化钠溶液。
本发明中，所述第二浓度大于所述第一浓度。优选地，第一浓度是指0.1-0.5M的浓度范围。还优选地，第一浓度是指0.2-0.4M的浓度范围。进一步优选地，第一浓度是指0.2-0.3M的浓度范围。
优选地，第二浓度是指0.6-2M的浓度范围。还优选地，第二浓度是指0.6-1M的浓度范围。进一步优选地，第二浓度是指0.8-1M的浓度范围。
本发明中，缓冲液是pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液。pH对洗脱具有影响，例如其可以影响乳铁蛋白洗出的时间。优选地，该pH为5.5-6.5。
本发明的方法进一步包括步骤(d)用0.5-1M的NaOH溶液清洗再生装填有阳离子交换填料的层析柱。本发明的步骤(d)用于洗脱经前述步骤未洗脱的乳铁蛋白。优选地，NaOH溶液为0.5-0.6M。
经过本发明的方法从牛奶中提取乳铁蛋白的纯度不低于92，乳铁蛋白的收率不低于60％。优选地，从牛奶中提取乳铁蛋白的纯度不低于93％，例如可以是94％、95％、96％，甚至可以达到97％。优选地，乳铁蛋白的收率不低于73％，例如可以是82％、83％、84％、85％、86％、87％，甚至可以达到88％、89％或90％。而在现有技术中，例如CN1486989所公开的乳铁蛋白的分离提纯工艺，在流速较低，并采用肝素-琼脂糖层析柱时，乳铁蛋白纯度和得率较低。因此，本发明的工艺具有优异的提取效果。
需要注意的是，在本发明的步骤(a)-(d)前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。例如，使用缓冲液平衡填料的步骤。再例如，使用更高浓度的NaOH溶液清洗再生填料的步骤。
实施例1
本发明的以下实施例所使用的试剂均为色谱纯，其余药品均为分析纯，除非另有说明。
本实施例为用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，具体如下：
1)用泵将新鲜的脱脂牛奶通过装填有阳离子交换填料的层析柱，阳离子交换填料为多孔聚甲基丙烯酸酯球形颗粒，且表面带有磺酸根基团，阳离子交换填料的交联度为50％-80％；
2)用水和含盐水溶液将残留的牛奶和杂质清洗干净(氯化钠或硫酸钠溶液)；
3)用含盐的水溶液或缓冲液(如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，pH值为pH5.0-7.0)将乳铁蛋白清洗下来，收集备用；
4)用0.1-1M NaOH溶液清洗再生装填有阳离子交换填料的层析柱。
其中，层析柱柱子内径10mm，装填阳离子交换填料高度30cm，线性流速600cm/h，脱脂牛奶3L通过泵泵入层析柱，经过水和0.3M氯化钠溶液洗杂后，用2M氯化钠溶液洗脱乳铁蛋白，得到产品纯度95.13％，收率87％。其纯化图谱如图1所示，HPLC检测图谱如图2所示。
实施例2
本实施例示例性示出了用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，与实施例1不同的是，层析柱柱子内径600mm，装填阳离子交换填料高度50cm，线性流速800cm/h，脱脂牛奶500升通过泵泵入层析柱，经过水和0.2M氯化钠溶液洗杂后，用1M氯化钠溶液洗脱乳铁蛋白，其余步骤与实施例1相同。得到产品纯度94.40％，收率73％。其HPLC检测图谱如图3所示。
实施例3
本实施例示例性示出了用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，与实施例1不同的是，层析柱柱子内径1800mm，装填阳离子交换填料高度30cm，线性流速700cm/h，脱脂牛奶300吨通过泵泵入层析柱，经过水和0.25M氯化钠溶液洗杂后，用0.6M氯化钠溶液洗脱乳铁蛋白，其余步骤与实施例1相同。得到产品纯度92.56％，收率86％。其HPLC检测图谱如图4所示。
比较例1
层析柱柱子内径16mm，装填阳离子交换填料高度20cm，线性流速500cm/h，采用市售的大粒径琼脂糖凝胶基质的阳离子交换填料，脱脂牛奶6L泵入层析柱，经过0.4M氯化钠溶液下，再用1.5M氯化钠溶液洗脱乳铁蛋白，得到产品纯度79.33，收率79％，其HPLC检测图谱如图4所示。
比较例2
层析柱柱子内径10mm，装填市售的聚合物基质阳离子交换填料(粒径80微米，孔径100nm)，高度30cm，线性流速600cm/h，脱脂牛奶1L通过泵泵入层析柱，柱压力从4bar升至7bar，因超过层析系统报警压力而实验失败。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (10)

1.一种用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)使新鲜的脱脂牛奶直接通过装填有阳离子交换填料的层析柱，所述阳离子交换填料的平均粒径为60-500μm且孔径为100-500nm；
(b)用水和含第一浓度盐的水溶液清洗残留的牛奶和杂质；
(c)用含第二浓度盐的水溶液或缓冲液以200-1000cm/h的流速洗脱，得到乳铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，进一步包括(d)用0.5-1M的NaOH溶液清洗再生装填有阳离子交换填料的层析柱。
3.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，从牛奶中提取乳铁蛋白的纯度不低于92％，乳铁蛋白的收率不低于60％。
4.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述阳离子交换填料的装填高度为100-500mm。
5.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述阳离子交换填料为多孔聚甲基丙烯酸酯球形颗粒，且表面带有磺酸根基团。
6.根据权利要求5所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述阳离子交换填料的交联度为50％-80％。
7.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述含盐的水溶液是氯化钠或硫酸钠溶液。
8.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述第二浓度大于所述第一浓度。
9.根据权利要求1所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述缓冲液是pH 5.0-7.0的磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的用于从牛奶中提取乳铁蛋白的方法，其特征在于，所述牛奶为脱脂牛奶。
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