CN102757516B - 依诺肝素钠的脱色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种依诺肝素钠的脱色方法：①将待脱色的依诺肝素钠中间体溶解于硫酸铵溶液中得到依诺肝素钠溶解液；疏水层析柱以硫酸铵溶液平衡后，将依诺肝素钠溶解液上样至疏水层析柱，收集穿透液；②阴离子交换层析柱以纯化水平衡后，将穿透液用纯化水稀释后上样至阴离子交换层析柱，上样结束后依次以纯化水和低浓度氯化钠溶液洗涤柱体，再以高浓度氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；③洗脱液进行纳滤脱盐浓缩，直至浓缩液中依诺肝素钠的浓度为5wt%～20wt%；④浓缩液沉淀、干燥即得依诺肝素钠成品。本发明的脱色方法脱色效果好，所得成品的颜色浅于BY6号比色液，符合《欧洲药典7.0》的规定，且此法安全性高，可控性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱色方法，具体涉及一种依诺肝素钠的脱色方法。
背景技术
依诺肝素钠是由来源于猪肠粘膜的肝素钠经成盐、酯化后得到肝素-苄索氯铵盐的苄基酯衍生物，然后在碱性条件下发生beta-消除反应裂解生成低分子量肝素钠，再经脱色得到成品。其主要特征为在糖链的非还原末端具有4-烯醇吡喃糖酸，在糖链的还原末端具有1,6-脱水结构，后者占全部糖的15wt%～25wt%。依诺肝素钠主要用于预防深静脉血栓形成及肺栓塞；治疗已形成的静脉血栓；预防血液透析时体外循环中血栓的形成等。
肝素钠原料药经成盐、酯化、降解后得到的产物，即为未经过脱色纯化处理的依诺肝素钠中间体。衡量依诺肝素钠成品质量的一个重要的指标就是其溶液颜色，药物溶液的颜色在一定程度上能反映药物的纯度。
《欧洲药典7.0》中对于依诺肝素钠的质量标准规定：其溶液颜色不得比最接近色调的6号比色液更深。
中国专利文献CN1850865A公开了一种依诺肝素钠的纯化生产方法，其中公开了对依诺肝素钠粗品进行脱色的方法，该脱色方法是将大孔树脂脱色与活性炭脱色结合起来，即先将依诺肝素钠加水溶解后，经活性炭脱色，再上树脂柱，冻干后即可；或者先将依诺肝素钠样品先上树脂柱，经收集目标组分、沉淀、过滤后，再经活性炭脱色，经沉淀冻干后即可。该脱色方法得到的成品比色优于欧洲药典4.0规定的黄色5号色。
该文献公开的脱色方法存在以下不足：（1）采用活性炭脱色容易产生无法过滤的微晶，使产品存在一定安全风险，且活性炭在吸附色素的同时也会吸附一定的有效成分，降低收率。（2）采用某些大孔树脂脱色则可能会残留苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯等杂质，也存在一定安全风险。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种脱色效果好、安全性高的依诺肝素钠的脱色方法。
实现本发明目的的技术方案是：一种依诺肝素钠的脱色方法，具有以下步骤：①将待脱色的依诺肝素钠中间体溶解于硫酸铵溶液中得到依诺肝素钠溶解液；疏水层析柱以硫酸铵溶液平衡后，将所述的依诺肝素钠溶解液上样至疏水层析柱，收集穿透液；②阴离子交换层析柱以纯化水平衡后，将步骤①的穿透液用纯化水稀释后上样至阴离子交换层析柱，上样结束后先以纯化水洗涤柱体，再以浓度为0.02mol/L～0.2mmol/L的氯化钠溶液洗涤柱体直至钡盐溶液检测无白色浑浊，最后以浓度为0.5mol/L～5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；③将步骤②收集的洗脱液进行纳滤脱盐浓缩，直至浓缩液中依诺肝素钠的浓度为 5wt%～20wt%；④将步骤③得到的浓缩液沉淀、干燥即得依诺肝素钠成品。
上述步骤①中所述的依诺肝素钠溶解液中硫酸铵的浓度为2mol/L～4mol/L；所述用以平衡疏水层析柱的硫酸铵溶液的浓度为2mol/L～4mol/L。
上述步骤①中所述的疏水层析柱中采用的疏水树脂可以为GE healthcare公司生产的Phenyl FF/HP系列（如Phenyl Sepharose FF、Phenyl Sepharose HP）、Octyl FF/HP系列（如Octyl Sepharose FF、Octyl Sepharose HP）或者Butyl FF/HP系列（如Butyl Sepharose FF、Butyl Sepharose HP）。也可以为TOSOH公司生产的Phenyl 650系列（如Toyopearl Phenyl 650M）或者Butyl 650系列（如Toyopearl Butyl 650M）。优选GE healthcare公司生产的Phenyl Sepharose FF。
上述步骤②中所述的穿透液用纯化水稀释至依诺肝素钠能吸附于疏水层析柱柱体。
上述步骤②中所述的阴离子交换层析柱中采用的阴离子交换树脂可以为GE healthcare公司生产的Q FF/HP系列（如Q Sepharose FF、Q Sepharose HP）或者TOSOH公司生产的SuperQ-650系列等强阴离子交换树脂。也可以为GE healthcare公司生产的DEAE FF/HP系列（如DEAE Sepharose FF、DEAE Sepharose HP）或者TOSOH公司生产的DEAE-650系列等弱阴离子交换树脂。优选GE healthcare公司生产的Q Sepharose FF。
上述步骤③中所述的纳滤采用的纳滤膜的孔径截留分子量≤1000道尔顿。
本发明具有的积极效果：（1）肝素钠原料药经成盐、酯化、降解得到依诺肝素钠中间体含有较多有色杂质，而本发明的方法根据在高浓度硫酸铵条件下有色杂质和依诺肝素钠疏水性的差异，采用疏水层析色谱将有色杂质除去，脱色效果好。（2）本发明的方法采用阴离子交换层析法将收集的依诺肝素钠溶液中的高浓度硫酸铵去除，同时该步骤还具有进一步除去依诺肝素钠中色素的作用，进一步提高脱色效果。（3）本发明的方法采用纳滤脱除依诺肝素钠中的一部分氯化钠，达到脱盐和浓缩的作用。（4）本发明的脱色方法脱色效果好，所得到的依诺肝素钠成品的颜色浅于BY6号比色液，符合《欧洲药典7.0》的规定，而且通过《欧洲药典7.0》与《中国药典》标准比色液借助色差计进行比较并转换后，成品颜色浅于《中国药典》的黄色2号色。（5）本发明得到的依诺肝素钠成品杂质含量少，安全性高，可控性好。
具体实施方式
（实施例1）
本实施例的依诺肝素钠的脱色方法具有以下步骤：
①称取依诺肝素钠中间体75g和分析纯硫酸铵297.3g溶解于600mL纯化水中，并用纯化水定容至750mL，搅拌均匀后静置30min，得到依诺肝素钠溶解液，该溶解液中硫酸铵的浓度为3mol/L。
将GE healthcare公司生产的苯基疏水层析柱（疏水树脂为Phenyl Sepharose FF，柱体积为375ml）以1.5L浓度为3mol/L的硫酸铵溶液平衡后，将上述依诺肝素钠溶解液上样至该层析柱，监测A232nm紫外吸收，至232nm紫外吸收降至基线平稳时停止收集，收集1.6L穿透液。
Phenyl Sepharose FF树脂的各项技术参数见表1。
表1
| 树脂 | Phenyl Sepharose FF |
| 配基 | 苯基 |
| 基质 | 6%交联琼脂糖 |
| 平均粒径 | 90μm |
| 配体密度 | 40μmol/mL |
| 工作pH | 3～13 |
| 推荐流速 | 300cm/h |
| 存储条件 | 20%乙醇溶液/4℃～30℃ |
| 化学稳定性 | 对通用的水性缓冲液稳定；1M NaOH；8M尿素；8M盐酸胍；70%乙醇 |
②将GE healthcare公司生产的强阴离子交换层析柱（离子交换树脂为Q Sepharose FF，柱体积1.5L）以6L纯化水平衡后，在步骤①的穿透液中加入14.4L纯化水稀释，然后上样至该层析柱。
上样结束后，先以6L纯化水洗涤柱体，至洗涤流出液电导降至基线平稳。然后以6L浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液洗涤柱体，至洗涤流出液电导基线平稳且用10wt%醋酸钡溶液检测无白色浑浊。最后再以浓度为2mol/L的氯化钠溶液洗脱柱体，收集1.1L洗脱液，洗脱终点为232nm紫外吸收降至基线平稳。
Q Sepharose FF树脂的各项技术参数见表2。
表2
| 树脂 | Q Sepharose FF |
| 阴离子交换体类型 | 强阴 |
| 载量（mmol/ml） | 0.18～0.25 |
| 基质 | 6%交联琼脂糖 |
| 粒径 | 45～165μm |
| 工作pH | 2～12 |
| 25℃线性流速 | 400～700cm/h |
| 存储条件 | 20%乙醇溶液/4℃～30℃ |
| 化学稳定性 | 对通用的水性缓冲液稳定；1M NaOH；8M尿素；8M盐酸胍；70%乙醇 |
③将步骤②收集的洗脱液用孔径截留分子量200道尔顿左右的纳滤膜进行纳滤脱盐浓缩，直至浓缩液中依诺肝素钠的浓度为10wt%，得浓缩液700mL。
④搅拌下向步骤③得到的浓缩液中缓慢加入1400mL乙醇进行沉淀，加完后继续搅拌10min，放入6℃冰箱中静置18h，弃去上清液，沉淀经无水乙醇脱水处理后，用700mL水溶解，冻干即得依诺肝素钠成品。
本实施例最终得到的依诺肝素钠成品的颜色浅于《欧洲药典7.0》规定的BY6号比色液。
（实施例2～实施例5）
各实施例的脱色方法与实施例1基本相同，不同之处见表3。
表3
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | |
| 依诺肝素钠溶解液中硫酸铵溶液的浓度 | 3mol/L | 3mol/L | 2mol/L | 4mol/L | 2.5mol/L |
| 用以平衡疏水层析柱的硫酸铵溶液的浓度 | 3mol/L | 3mol/L | 2mol/L | 4mol/L | 2.5mol/L |
| 疏水树脂 | Phenyl Sepharose FF | Phenyl Sepharose FF | Toyopearl Phenyl 650M | Phenyl Sepharose FF | Phenyl Sepharose FF |
| 阴离子交换树脂 | Q Sepharose FF | DEAE Sepharose FF | Q Sepharose FF | DEAE-650S | Q Sepharose FF |
| 洗涤用氯化钠浓度 | 0.1mol/L | 0.08mol/L | 0.2mol/L | 0.02mol/L | 0.1mol/L |
| 洗脱用氯化钠浓度 | 2mol/L | 0.5mol/L | 5mol/L | 2mol/L | 1mol/L |
| 依诺肝素钠成品的颜色 | 浅于BY6号比色液 | 浅于BY6号比色液 | 浅于BY6号比色液 | 浅于BY6号比色液 | 浅于BY6号比色液 |
Claims (8)
1.一种依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于具有以下步骤：
①将待脱色的依诺肝素钠中间体溶解于硫酸铵溶液中得到依诺肝素钠溶解液；疏水层析柱以硫酸铵溶液平衡后，将所述的依诺肝素钠溶解液上样至疏水层析柱，收集穿透液；
②阴离子交换层析柱以纯化水平衡后，将步骤①的穿透液用纯化水稀释后上样至阴离子交换层析柱，上样结束后先以纯化水洗涤柱体，再以浓度为0.02mol/L～0.2mmol/L的氯化钠溶液洗涤柱体直至钡盐溶液检测无白色浑浊，最后以浓度为0.5mol/L～5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液；
③将步骤②收集的洗脱液进行纳滤脱盐浓缩，直至浓缩液中依诺肝素钠的浓度为 5wt%～20wt%；
④将步骤③得到的浓缩液沉淀、干燥即得依诺肝素钠成品。
2.根据权利要求1所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤①中所述的依诺肝素钠溶解液中硫酸铵的浓度为2mol/L～4mol/L；所述用以平衡疏水层析柱的硫酸铵溶液的浓度为2mol/L～4mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤①中所述的疏水层析柱采用的疏水树脂为Phenyl FF/HP系列、Octyl FF/HP系列、Butyl FF/HP系列、Phenyl 650系列、Butyl 650系列中的一种。
4.根据权利要求3所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤①中所述的疏水层析柱中的疏水树脂为Phenyl FF/HP系列中的Phenyl Sepharose FF。
5.根据权利要求1所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤②中所述的穿透液用纯化水稀释至依诺肝素钠能吸附于阴离子交换层析柱柱体。
6.根据权利要求1或5所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤②中所述的阴离子交换层析柱中的阴离子交换树脂为Q FF/HP系列、DEAE FF/HP系列、SuperQ-650系列、DEAE-650系列中的一种。
7.根据权利要求6所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤②中所述的阴离子交换层析柱中的阴离子交换树脂为Q FF/HP系列中的Q Sepharose FF。
8.根据权利要求1所述的依诺肝素钠的脱色方法，其特征在于：步骤③中所述的纳滤采用的纳滤膜的孔径截留分子量≤1000道尔顿。
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