JPH05500301A - キモシンの回収および精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の水性混液、特に、発酵過程により産出される酵素の水性混液か らのキモシンの回収および精製に関する。

技術的背景 キモシンは、種々の技術を使用して分離および精製されてきた。例えば、ウシレ ンネットあるいはレンネット抽出物を、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎの米国特許第４ ．６６６４４３号では、青色染料親和配位子を使用して、Ｂｉ　ｒｓｃｈｂａｃ ｈの米国特許第４，７４５．５５１号では、セルロース樹脂カラムを使用して精 製している。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎの米国特許第４，７４３．５’５１号およ びＵｒｅｎ等の米国特許第４，７２１，６７３号では、微生物により産出される キモシンの回収と精製のために、同様の方法を使用している。これらの特許の開 示を参考として本明細書に記載する。

しかし、微生物活性によるキモシンの工業および商業規模での生産には、これら のキモシン回収および精製法は不適切である、商業規模での工業生産には、もっ と効率が高く、経済的なキモシン回収および精製法が必要である。また、このよ うな処理過程が、商業ベースでの生産の利益の増額に適することが重要である。

キモシンの微生物による工業生産において特に興味深いことは、１９８８年２月 ２６日に出願されたＬａνＩＩｓ等の米国特許出願番号第１８３．２１９に開示 されており、本明細書に参考として記載する、キモシンの発現および分泌のため に遺伝子を改変した糸状菌の発酵によるキモシン生産である。

本発明の目的は、キモシンの商業規模での生産のために、酵素の水性混液、特に 発酵あるいは他の微生物活性により産出される水性混液からキモシンを回収およ び精製するための効率のよい処理工程を提供することにある。

発明の要約 本発明は、キモシンと樹脂とを結合させるために酵素の水性混液をフェニル−セ ファロース樹脂と接触させ、また、その樹脂と結合キモシンとを水性混液の残液 より分離することによって、酵素の水性混液からキモシンを分離する方法である 。次に、キモシンを樹脂より、水あるいは希塩水で溶離する。酵素水性混液をフ ェニル−セファロース樹脂に接触させる前に、その水性混液を２種類の方法の１ 種類で樹脂接触させるために調製する。１調製法においては、水性混液の塩含有 量を高めるために、水性混液に濃塩水を加える。それがキモシンのフェニル−セ ファロース樹脂との効率的な結合を促進する。別の調製法においては、酵素の水 性混液をフェニル−セファロース樹脂と接触させる前に、酵素の水性混液のｐＨ を約３未満に低下させる。

図の簡単な説明 図は、キモシンのフェニル−セファロース樹脂からの、塩濃度に応じたキモシン の溶離を示す。

発明の説明 本発明は、キモシン含有酵素の水性混液の観点から記載する。本発明の方法は、 キモシンが細胞内産出される微生物発現、あるいはキモシンが細胞で産出されて 細胞から分泌される微生物発現から得られる酵素の水性混液に特に有益である。

本発明に有益な好適な酵素の水性混液は、キモシンを分泌し、その結果細胞外キ モシンを産する発酵の微生物発現宿主から得られる。本発明の方法は、ウシレン ネット抽出液等の他の供給源から得られる酵素の水性混液からキモシンを分離す るためにも使用される。

本発明を実施する好適な１方法では、黒色変株あわもりの発酵等による発酵ブロ スを、硫酸で処理してｐＨを約２に低下させる。重量の約１〜２％（総混液の重 量を基準とする）の酢酸を加えて発酵を止め、実質的に完全に細胞を死滅させる 。水酸化アンモニウムを加えて約ｐＨ５，９とする。

次に、混液を元の容量の２倍に水で希釈し、細胞の残骸および他の固形物を除去 するために一過する。塩、好ましくは塩化ナトリウムを濾過の前あるいは後に加 え、水性Ｐ液を約２Ｍの塩濃度とする。ｐＨを約５．９に保持し、水性ＰＨをフ ェニル−セファロース樹脂カラムに接触させる。他の酵素と塩水とがフェニル− セファロース樹脂力ラムヲ通過して廃棄される間に、キモシンは樹脂と結合する 。次に、樹脂カラムを２Ｍ塩化ナトリウムおよび５０ｒｎ　Ｍ燐酸塩で洗浄し、 ｐＨを約５．９に保持する。洗浄後、キモシンを、水あるいは５０ｍＭ燐酸塩等 の希塩水で、フェニル−セファロース樹脂カラムより溶離する。キモシンは大量 に溶離される。

キモシンは、このような酵素混液中で、フェニル−セファロース樹脂と結合する 唯一の主要な酵素であるため、傾斜溶離あるいは段階的溶離の必要がない。この 処理過程で産出されるキモシンは、実質的に純粋であって、通常は食品級であり 、工業用キモシン最終製品として市販するための所望の仕様に本製品を適合させ るためには、水で希釈して濾過し、塩化ナトリウムと保存剤で処理することのみ が必要なだけである。次に、樹脂カラムを０．１〜約ＩＭの水酸化ナトリウムで 洗浄し、その復水で洗浄して調製Ｐ液の別のバッチのために再利用する。

本発明の処理過程を実施する別の好適な方法では、発酵混液を約ｐＨ２にまで低 下し、重量の約１〜２％の酢酸を加えて発酵過程を止めて、細胞を死滅させる。

この方法では、混液を細胞残骸およびその他の固形物を除去するために濾過し、 酵素の混液を包含する水性Ｐ液を産出する間、混液を約ｐＨ２に保持する。−過 段階でＰ液を得た後でも、Ｐ液をフェニル−セファロース樹脂カラムに接触する 間は、ｐＨを約２に保持する。所望ならば、Ｐ液を樹脂カラムに接触させる前に 、塩をＰ液に加えることがある。塩の添加は、キモシンと樹脂カラムの結合を促 進することがある場合もある。このような塩の例としては、０．５Ｍ硫酸アンモ ニウムあるいは０．５Ｍ硫酸ナトリウムがある。ξ液がフェニル−セファロース 樹脂カラムと接触するとすぐに、キモシンはカラム内の樹脂と結合し、一方、他 の酵素と２Ｆ液とはカラムを通過して廃棄される。次に、結合キモシンを包含す るフェニル−セファロース樹脂カラムを、０．２　Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄 する。ｐＨを約２に保持可能であり、また溶離後には約５，９の所望の値に上昇 可能である間の処理過程のこの時点で、ｐＨを０．２Ｍ燐酸塩で、約５．９に上 昇させることが好ましい。樹脂カラムを洗浄し、ｐＨ調節後に、もし所望ならば 、キモシンを、水あるいは５０ｍＭの燐酸塩溶液等の弱塩水で大量溶離する。前 述のように、溶離キモシンは、本質的に純粋であり、食品級の使用が可能である 。

溶離キモシンを所望の濃度に希釈し、塩化ナトリウムおよび保存剤を添加し、そ の溶液を所望の市販製品を提供するために濾過する。また前述のように、次に樹 脂カラムを０゜１〜ＩＭの水酸化ナトリウムで、ついで水で洗浄し、樹脂カラム を、調製Ｐ液の別のバッチに再使用するために準備する。

前述の記述が、本発明の処理過程を実施する好適な実施例であること、また、前 述の方法の種々の変形例が、本発明の内容に従った処理過程内で作成可能である ことが理解されよう。種々の処理過程条件を変えることが可能であり、使用する 試薬を変えて、キモシンを包含する酵素の適切な水性混液からキモシンを回収す る種々の所望あるいは至適操作条件を提供することが可能である。しかし、この 処理過程の必須の特徴は、フェニル−セファロース樹脂の使用である。フェニル −セファロース樹脂は、種々の他の要素や酵素を包含する水性混液の中のキモシ ンと結合するために独特の活性を有して選択的であることが判明している。

オクチル等の他の官能基を有するセファロース樹脂は、所望のキモシン選択性を 有するとは認められていない。本発明の範囲は下記の理論により限定的に解釈し てはならず、キモシンに対して高度の選択性を提供するのは、セファロース樹脂 上のフェニル機能性であると考えられている。発酵ブロスは、広範囲の他の要素 、酵素および不純物を包含するため、酵素ブロスからキモシンを分離する上でフ ェニル−セファロース樹脂が特に有益であることが判明した。

それに反して、このような複雑な混液は、陰イオンおよび陽イオン交換樹脂の作 用を妨害し、それによって、酵素ブロスからキモシンを回収する上で無能となる 。

キモシンは、本質的に発酵ブロス内にあって、低ｐＨおよび／または高濃度の塩 の条件下でセファロース樹脂と結合する唯一の酵素材料であるということは、本 発明における驚くべきことであることが判明した。通常は、多数の異なる酵素お よび他の材料が、セファロース型樹脂と結合し、次に、所望の酵素を、連続的、 部分的あるいは段階的溶離により、溶離水のｐＨおよび／または塩濃度を漸次変 えることによって画分として回収する。このような標準的方法では、各酵素が異 なる時間に溶離され、別々の画分が生じ、それらの１種類以上が回収すべき所望 の酵素を包含する。

分別溶離はまた通常、産出した画分を重複させ、その結果、所望溶離物は、少な くとも部分的に隣接画分内に広がる可能性があり、それが、少なくとも、所望の 高度な純粋性を有する回収可能な所望物の総量を減少させる。このような分別溶 離過程は、経済的な商業ベースでの大規模分離の使用に十分な程効率的ではない 。

前述とは対照的に、本発明の処理過程においては、キモシンは、フェニル−セフ ァロース樹脂と結合する、本質的に酵素ブロスＰ液の唯一の要素であることが判 明した。したがって、傾斜溶離あるいは分別溶離は、本発明の処理過程において 必要であることも所望されることもなく、キモシンか大量に溶離される。フェニ ル−セファロース樹脂が、キモシンの総重量の少なくとも約９５％を、酵素ブロ スｒ液より取り出すため、この処理過程は高い回収率を提供する。

この処理過程は、キモシンが、分別溶離の必要もなく、一段階で迅速に樹脂カラ ムより溶離可能であるため、効率的である。この結果生じたキモシン製品は、少 なくとも重量の約９０％が純粋であり、不純物を除去するための重要な別の処理 をしなくても、市販用に調製可能である。市販のキモシン製品は通常、約５グラ ム／ガロンあるいは１キモシン当り約１．５グラムに希釈されており、塩（通常 はＮａＣｆ１）４度は通常は約１８％にまでもなっており、安息香酸ナトリウム 等の保存剤が添加されている。食品級の使用を目的とした市販用の最終製品は、 通常、所望しない固形物あるいは存在する可能性のある微粒子を除去するために 最終Ｐ遇する。

フェニル−セファロース樹脂は、周知の種類の樹脂であり、また、架橋フェニル −アガロース樹脂としても周知のものである。「フェニル−セファロースＣＬ− ４Ｂｊは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＡＢ、の架橋フェニル−アガロース樹脂の商 標であり、本明細書で使用しているように、「フェニル−セファロース」とは、 水性溶液あるいは水性懸濁液からのキモシンと効率良く結合するのに十分なフェ ニル機能性を有する架橋アガロース樹脂を呼称している。

フェニルーセファロース樹脂は、粒子寸法が約４０〜４００μである粒子形状で 大量に使用可能であり、酵素の水性混液と混合可能であることによって、キモシ ンを樹脂と結合させる。次に、樹脂を水性溶液より分離し、その後、溶離して前 述のように再利用する。しかし、フェニル−セファロース樹脂を、カラムが約４ ０〜４００μの粒子寸法を有する樹脂粒子を包含するところの充填カラムの形状 で使用することが好ましい。

当業者に理解されるように、本発明の処理過程に関する前述の記載に関連する酸 、塩基および塩は、本発明のフェニル−セファロース樹脂の作用を妨害せずに、 またキモシンを変性しない所望のｐＨあるいは所望の塩含有量を提供する等価の 酸、塩基あるいは塩に変える、あるいはそれらで代用することが可能である。ま た、当業者に理解されることだが、前述の記載に関連するｐＩ（値は、一定の範 囲内で変更可能であり、それでもなお、所望の結果を得ることができる。例えば 、発酵ブロスは、ｐＨ６未満で処理して濾過することができるが、ｐＨは約３未 満が好ましく、最も好ましくは、ｐｌを約２に保持することである。同様に、処 理過程においてｐＨが約５．９に好ましく調節されている場合に、処理過程にお けるこれらの時点でのｐＨは、約５〜６の範囲であることが可能であり、好まし くは、約５．５〜６の間である。同様に、製塩の濃度を、所望の結果を提供する ように変更することも可能である。キモシンは、少なくとも約ＩＭおよび／ある いは水性混液が約ｐＨ３未満である時の濃塩水の存在下で、フェニル−セファロ ース樹脂と最高に結合することが判明している。通常は、塩化ナトリウムが低価 格であるため、塩化ナトリウムの使用が好ましい。他の有益な塩の例としては、 ｐＪ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４および（ＮＨ４）２Ｓ０４がある。例えば、約１〜２Ｍ の範囲の高いあるいは低いモル濃度の酵素水性混液中の塩でもキモシンをフェニ ル−セファロース樹脂に結合する上で有効であるが、塩水の好適な濃度は、約２ Ｍである。溶離段階では、キモシンは、あるいは弱塩水で、フェニル−セファロ ース樹脂から単回であるいは大量に容易に溶離可能であることが判明している。

キモシンは、塩水のイオン濃度が高い場合にフェニル−セファロース樹脂と最高 に結合し、その後、フェニル−セファロース樹脂上のキモシンのイオン強度が、 水あるいは希塩水で溶離することによって低下した場合に、キモシンは容易に溶 離すると確信されている。

本発明の処理過程を実施する前述の好適な方法の観点から本発明を記載してきた が、本発明の変形例を下記の特別の実施例で解説する。

実施例■ 本実施例は、食品級キモシンを生産するキモシン回収過程を記載する。キモシン は、黒色アスペルギルス変種、ａｖａｍｏｒｆの発酵から回収される。本処理過 程を、３ＱＯＯＪ２の発酵槽および約２５００Ｊ！の集菌僅の観点から記載する 。発酵完了時には、ブロスを、硫酸でｐＨを２．０〜２．５に調節し、酢酸を添 加することによって、ブロスを不活化する。（１９８９年６月１３日に出願され たＬａｗｌｉｓ等の米国特許、出願番号Ｎｏ、０７／３６５．９４５号を、本明 細書に参考として記載する）不活化条件は、発酵温度と、空気流で１時間維持さ れる。この不活化により、封じ込めを破壊するのに十分な程生存細胞を減少させ る。不活化後、水酸化アンモニウムで、ｐＨを５．５に調節する。不活化および 、その後のｐＨ調節には、硫酸約１２５ｇ、氷酢酸２５ｋｇおよび２８％水酸化 アンモニウム溶液８０Ｊ２が必要であろう。

不活化ブロスをドラムフィルタを使用してＰ遇する。ブロスをイオン除去水で２ ．５倍に希釈する（２５００ｊ！を６２５０４！にする）。希釈材料は、Ｍａｎ ｖｆｌｌｅ　Ｃｅ１ｌｔｅ　５４５で、３％の容量対重さに作られ、Ｃｅ１ｌｔ ｅ　５４５プレコートを介して濾過する。ケーキを収量を増加するために洗浄す る。Ｆ　’ｉ＆量を、最初に送り込んだ量と同量とすること。

Ｐ液を、フェニル−セファ０一ス樹脂接触段階前に、２段階式バッド濾過法（ｔ ｗｏ−ｓｔｅｐ　ｐａｄ　ｒｌｌｔｒａｔｌｏｎ）を使用して研磨する。Ｐ液は 、６％の容量対重さのＮａＣｆ！と１％の容量対重さのＨｙＦｌｏ　５ｕｐｅｒ 　Ｃｅｌに作られ、ＳＥＮ　５ｕｐｅｒ　２００フイルタを介して濾過される。

第一段階のＰ液を採集し、５ｕｐｅｒ　５０パツドを使用して圧縮する。第二段 階の濾過には、フィルタ補助は使用しない。

浄化ｒ液を、１０ｆ！のフェニル−セファロース樹脂カラムを介して通過させる ＣＰｈａｒｍａｃｉａ社、ＡＢの粒子寸法４０〜１００　ｕ（１）　”ＦＡＳＴ 　ＦＬＯＷ　Ｌ、Ｓ、”　）　、充填後、３カラム容量（３０１）の６％のＮａ Ｃｆ！溶液で洗浄する。次に、カラムを、４カラム容量ｃ４０１）の５０ｍ　Ｍ 燐酸ナトリウム緩衝液で、ｐＨ５、５で大量溶離する。溶離キモシン溶液を、市 販食品級使用のために、１７％ＮａＣｊ！に調製する。

実施例１１ 実施例工と同様のＰ液とフェニル−セファロース樹脂とを使用する本実施例では 、キモシンの樹脂からの傾斜溶離を解説する。

条件＋１１．４ＭＬフェニルーセファロース樹脂５．０ＭＬ／分での充填および 溶離 ＃　下降（ＮＨ４）　ＳＯ４”　ＣＨＵ／Ｌ　容ｆｆｉ　（ＭＬ）　総ＣＨＵ　 総ＭＧｓ１　開始時材料　１　１．６２　５０００　８．１０　１０５．３０２ 　真空＋洗浄　１　０．０３　５０００　０．Ｌ５　１．９５３　ｐＨ変化　１ 　０．０３　５０　０．００　０．０２４　画分Ｉ　Ｌ　Ｏ，０３１００，００ ０，００５画分２　０．９　ＮＡ　１０　０．００　０．００Ｂ　画分３　０． ８　ＮＡ　１０　０．００　０．００γ　画分４　０．７　０　１０　０．００ 　０．００８　画分５　０．６　０．１２　１０　０．００　０．０２９　画分 ６　０．５　０．６１　１０　０．０１　０．０８１０　画分７　０．４　Ｂ、 ４８　１０　０．０Ｂ　０．８４１１　画分８　０，３　３４．０４　１０　０ ．３４　４．４３１２　画分９　０．２　９３．９　１０　０．９４　１２．２ １１３　画分１０　０．１　１７０．１　１０　１．７０　２２．１１１４　画 分１１　０　１９８．４　１０　１．９８　２５．７９１５　画分１２　０　１ ２８．９　１０　１．２９　１６．７６１６　画分１３　０　ＨＪ４　１０　０ ．１７　２．２５１７　画分１４　０　５Ｊ７　１０　（１，ｆ１５　０．７０ １８　複合物　５０．０２　１４０　７．００　９１．０４（ＣＨＵ−Ｃｈｒｊ ｓ　Ｈａｎｓｅｎ　単位）＊傾斜二図に示すように２Ｍ−〇 キモシンの総量収率は、重量の約８５％である。本明細書添付図は、キモシンの 前述の溶離を、硫酸アンモニウム濃度の機能として示し、単回溶離でのキモシン 回収の容易さを示す。

実施例ＩＩ＋ 実施例Ｉと同様のＰ液を使用するフェニル−セファロース樹脂の下記の条件下で の能力は次の通りである。

条　件　樹脂能力 （キモシンｍｇ／樹脂１） ２Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ５，８３，７９ １Ｍ　（ＮＨ４）　２　ＳＯ２，ｐＨ２，０７，３２本実施例では、本発明を実 施する好適な方法は、低いｐＨで実施されることを示している。

（ＮＨ４）ｚｓｃｌ＋ｔ＋　ｚ’ｒ’ｉ　ｎ　ｆｃ、♂レラ魁Δ」０００００口 ０ρρ　−ゴごごごごごゴごｏ−＃ｕＱｕ’ａ＋ζωψ−−励υトＣ■〜ωの〜 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）酵素の水性混液をフェニル−セファロース樹脂に、キモシンが樹脂と 結合するのに充分な時間接触させる段階と、 （ｂ）樹脂と待合キモシンとを、水性混液から分離する段階と、 （ｃ）キモシンを樹脂から溶離する段階とから成る、酵素の水性混液からキモシ ンを分離する方法。 ２．前記混液を樹脂と接触させる前に、酵素の水性混液に塩を添加することを特 徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記添加塩が、少なくとも約１Ｍの濃度を有する無機塩水から構成されるこ とを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記溶離段階が、約０．５Ｍ未満の濃度を有する希塩水の使用を包含するこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。 ５．前記最初の酵素水性混液が、発酵段階で作られることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の方法。 ６．前記最初の酵素水性混液が、発酵段階で作られることを特徴とする請求の範 囲第２項記載の方法。 ７（ａ）水性混液のｐＨを約３未満に調節する段階と、（ｂ）ｐＨ調節水性混液 を、フェニル−セファロース樹脂に、キモジンが樹脂と結合するのに充分な時間 、接触させる段階と、 （ｃ）樹脂と結合キモシンとを、水性混液より分離する段階と、 （ｄ）キモシンを樹脂より溶離する段階とから成る、キモシンを酵素の水性混液 から分離する方法。 ８．前記樹脂と結合キモシンとを、少なくとも約１Ｍの濃度を有する塩水で溶離 する段階の前に、洗浄することを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。 ９．前記溶離段階が、約０．５Ｍ未満の濃度を有する希塩水の使用を包含するこ とを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。 １０．最初の酵素水性混液が、発酵段階からであることを特徴とする請求の範囲 第７項記載の方法。 １１．最初の酵素水性混液が、発酵段階からであることを特徴とする請求の範囲 第８項記載の方法。