JP2974763B2 - キモシンの回収および精製 - Google Patents
キモシンの回収および精製Info
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- JP2974763B2 JP2974763B2 JP2509308A JP50930890A JP2974763B2 JP 2974763 B2 JP2974763 B2 JP 2974763B2 JP 2509308 A JP2509308 A JP 2509308A JP 50930890 A JP50930890 A JP 50930890A JP 2974763 B2 JP2974763 B2 JP 2974763B2
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6481—Pepsins (3.4.23.1; 3.4.23.2; 3.4.23.3)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、酵素の水性混合物、特に、発酵工程により
産出される酵素の水性混合物からのキモシンの回収およ
び精製に関する。
産出される酵素の水性混合物からのキモシンの回収およ
び精製に関する。
技術的背景 キモシンは、種々の技術を使用して分離および精製さ
れてきた。例えば、ウシレンネットあるいはレンネット
抽出物を、Subramanianの米国特許第4,666,843号では、
青色染料親和配位子を使用して、Birschbachの米国特許
第4,745,551号では、セルロース樹脂カラムを使用して
精製している。Subramanianの米国特許第4,743,551号お
よびUren等の米国特許第4,721,673号では、微生物によ
り産出されるキモシンの回収と精製のために、同様の方
法を使用している。これらの特許の開示を参考として本
明細書に記載する。
れてきた。例えば、ウシレンネットあるいはレンネット
抽出物を、Subramanianの米国特許第4,666,843号では、
青色染料親和配位子を使用して、Birschbachの米国特許
第4,745,551号では、セルロース樹脂カラムを使用して
精製している。Subramanianの米国特許第4,743,551号お
よびUren等の米国特許第4,721,673号では、微生物によ
り産出されるキモシンの回収と精製のために、同様の方
法を使用している。これらの特許の開示を参考として本
明細書に記載する。
しかし、微生物活性によるキモシンの工業および商業
規模での生産には、これらのキモシン回収および精製法
は不適切である、商業規模での工業生産には、もっと効
率が高く、経済的なキモシン回収および精製法が必要で
ある。また、このような処理工程が、商業ベースでの生
産の利益の増額に適することが重要である。
規模での生産には、これらのキモシン回収および精製法
は不適切である、商業規模での工業生産には、もっと効
率が高く、経済的なキモシン回収および精製法が必要で
ある。また、このような処理工程が、商業ベースでの生
産の利益の増額に適することが重要である。
キモシンの微生物による工業生産において特に興味深
いことは、1988年２月26日に出願されたLawlis等の米国
特許出願番号第163,219に開示されており、本明細書に
参考として引用する、キモシンの発現および分泌のため
に遺伝子を改変した糸状菌の発酵によるキモシン生産で
ある。
いことは、1988年２月26日に出願されたLawlis等の米国
特許出願番号第163,219に開示されており、本明細書に
参考として引用する、キモシンの発現および分泌のため
に遺伝子を改変した糸状菌の発酵によるキモシン生産で
ある。
本発明の目的は、キモシンの商業規模での生産のため
に、酵素の水性混合物、特に発酵あるいは他の微生物活
性により産出される水性混合物からキモシンを回収およ
び精製するための効率のよい処理工程を提供することに
ある。
に、酵素の水性混合物、特に発酵あるいは他の微生物活
性により産出される水性混合物からキモシンを回収およ
び精製するための効率のよい処理工程を提供することに
ある。
発明の要約 本発明は、酵素の水性混合物をフェニル−セファロー
ス樹脂と接触させてキモシンとフェニル−セファロース
樹脂とを結合させ、その樹脂とそれに結合したキモシン
とを水性混合物の残液から分離することによって、酵素
の水性混合物からキモシンを分離する方法に関する。次
に、キモシンをフェニル−セファロース樹脂から、水あ
るいは希塩溶液で溶離する。酵素の水性混合物をフェニ
ル−セファロース樹脂に接触させる前に、その水性混合
物に対して、２種類の方法のうちの１つで樹脂接触させ
るための準備をする。１つの方法においては、水性混合
物に濃塩溶液を加えて水性混合物の塩含有量を高める。
それがキモシンとフェニル−セファロース樹脂との効率
的な結合を促進する。もう１つの方法においては、酵素
の水性混合物をフェニル−セファロース樹脂と接触させ
る前に、酵素の水性混合物のpHを約３未満に低下させ
る。
ス樹脂と接触させてキモシンとフェニル−セファロース
樹脂とを結合させ、その樹脂とそれに結合したキモシン
とを水性混合物の残液から分離することによって、酵素
の水性混合物からキモシンを分離する方法に関する。次
に、キモシンをフェニル−セファロース樹脂から、水あ
るいは希塩溶液で溶離する。酵素の水性混合物をフェニ
ル−セファロース樹脂に接触させる前に、その水性混合
物に対して、２種類の方法のうちの１つで樹脂接触させ
るための準備をする。１つの方法においては、水性混合
物に濃塩溶液を加えて水性混合物の塩含有量を高める。
それがキモシンとフェニル−セファロース樹脂との効率
的な結合を促進する。もう１つの方法においては、酵素
の水性混合物をフェニル−セファロース樹脂と接触させ
る前に、酵素の水性混合物のpHを約３未満に低下させ
る。
図の簡単な説明 図は、塩濃度に応じたフェニル−セファロース樹脂か
らのキモシンの溶離を示す。
らのキモシンの溶離を示す。
発明の説明 本発明は、キモシンを含有する酵素の水性混合物の観
点から記載する。本発明の方法は、キモシンが細胞内産
出される微生物発現、あるいはキモシンが細胞で産出さ
れて細胞から分泌される微生物発現から得られる酵素の
水性混合物に使用するのに特に有益である。本発明に有
用な好適な酵素の水性混合物は、キモシンを分泌し、そ
の結果細胞外キモシンを産生する微生物発現宿主の発酵
から得られる。本発明の方法は、ウシレンネット抽出液
等の他の供給源から得られる酵素の水性混合物からキモ
シンを分離するためにも使用される。
点から記載する。本発明の方法は、キモシンが細胞内産
出される微生物発現、あるいはキモシンが細胞で産出さ
れて細胞から分泌される微生物発現から得られる酵素の
水性混合物に使用するのに特に有益である。本発明に有
用な好適な酵素の水性混合物は、キモシンを分泌し、そ
の結果細胞外キモシンを産生する微生物発現宿主の発酵
から得られる。本発明の方法は、ウシレンネット抽出液
等の他の供給源から得られる酵素の水性混合物からキモ
シンを分離するためにも使用される。
本発明を実施する好適な１方法では、黒色変株あわも
り（アスペルギルスニガー）の発酵等による発酵ブロス
を、硫酸で処理してpHを約２に低下させる。約１〜２重
量％（総混合物の重量を基準とする）の酢酸を加えて発
酵を止め、実質的に完全に細胞を死滅させる。水酸化ア
ンモニウムを加えて約pH5.9とする。次に、この混合物
を元の容量の２倍に水で希釈し、細胞の残骸および他の
固形物を除去するために濾過する。塩、好ましくは塩化
ナトリウムを濾過の前あるいは後に加え、水性濾過を約
2Mの塩濃度とする。pHを約5.9に保持し、水性濾液をフ
ェニル−セファロース樹脂カラムに接触させる。他の酵
素と塩溶液はフェニル−セファロース樹脂カラムを通過
して廃棄されるが、キモシンは樹脂と結合する。次に、
樹脂カラムを2M塩化ナトリウムおよび50mM燐酸塩で洗浄
し、pHを約5.9に保持する。洗浄後、キモシンを、水あ
るいは50mM燐酸塩等の希塩溶液で、フェニル−セファロ
ース樹脂カラムより溶離する。キモシンはバルク溶離さ
れる。キモシンは、このような酵素混合物中で、フェニ
ル−セファロース樹脂と結合する唯一の主要な酵素であ
るため、傾斜溶離あるいは段階的溶離の必要がない。こ
の処理工程で産出されるキモシンは、実質的に純粋であ
って、通常は食品グレードであり、工業用キモシン最終
製品として市販するための所望の仕様に本製品を適合さ
せるためには、水で希釈して濾過し、塩化ナトリウムと
保存剤で処理することのみが必要なだけである。次に、
樹脂カラムを0.1〜約1Mの水酸化ナトリウムで洗浄し、
その後水で洗浄して調製濾液の別のバッチのために再利
用する。
り（アスペルギルスニガー）の発酵等による発酵ブロス
を、硫酸で処理してpHを約２に低下させる。約１〜２重
量％（総混合物の重量を基準とする）の酢酸を加えて発
酵を止め、実質的に完全に細胞を死滅させる。水酸化ア
ンモニウムを加えて約pH5.9とする。次に、この混合物
を元の容量の２倍に水で希釈し、細胞の残骸および他の
固形物を除去するために濾過する。塩、好ましくは塩化
ナトリウムを濾過の前あるいは後に加え、水性濾過を約
2Mの塩濃度とする。pHを約5.9に保持し、水性濾液をフ
ェニル−セファロース樹脂カラムに接触させる。他の酵
素と塩溶液はフェニル−セファロース樹脂カラムを通過
して廃棄されるが、キモシンは樹脂と結合する。次に、
樹脂カラムを2M塩化ナトリウムおよび50mM燐酸塩で洗浄
し、pHを約5.9に保持する。洗浄後、キモシンを、水あ
るいは50mM燐酸塩等の希塩溶液で、フェニル−セファロ
ース樹脂カラムより溶離する。キモシンはバルク溶離さ
れる。キモシンは、このような酵素混合物中で、フェニ
ル−セファロース樹脂と結合する唯一の主要な酵素であ
るため、傾斜溶離あるいは段階的溶離の必要がない。こ
の処理工程で産出されるキモシンは、実質的に純粋であ
って、通常は食品グレードであり、工業用キモシン最終
製品として市販するための所望の仕様に本製品を適合さ
せるためには、水で希釈して濾過し、塩化ナトリウムと
保存剤で処理することのみが必要なだけである。次に、
樹脂カラムを0.1〜約1Mの水酸化ナトリウムで洗浄し、
その後水で洗浄して調製濾液の別のバッチのために再利
用する。
本発明の処理工程を実施する別の好適な方法では、発
酵混合物のpHを硫酸で約２まで下げ、約１〜２重量％の
酢酸を加えて発酵工程を止めて、細胞を死滅させる。こ
の方法では、混合物を濾過して細胞残骸およびその他の
固形物を除去し、酵素混合物を包含する水性濾液を産出
する間、混合物を約pH2に保持する。濾過段階で濾液を
得た後でも、濾液をフェニル−セファロース樹脂カラム
に接触する間は、pHを約２に保持する。所望ならば、濾
液を樹脂カラムに接触させる前に、塩を濾液に加えるこ
とがある。塩の添加は、キモシンと樹脂カラムの結合を
促進することがある場合もある。このような塩の例とし
ては、0.5M硫酸アンモニウムあるいは0.5M硫酸ナトリウ
ムがある。濾液がフェニル−セファロース樹脂カラムと
接触するとすぐに、キモシンはカラム内の樹脂と結合
し、一方、他の酵素と濾液とはカラムを通過して廃棄さ
れる。次に、結合したキモシンを包含するフェニル−セ
ファロース樹脂カラムを、0.2M塩化ナトリウム溶液で洗
浄する。pHを約２に保持して溶離後には約5.9の所望の
値に上昇させることも可能だが、処理工程のこの時点で
pHを0.2M燐酸塩で約5.9に上昇させることが好ましい。
樹脂カラムを洗浄し、pH調整後に、もし所望ならば、キ
モシンを、水あるいは50mMの燐酸塩溶液等の弱塩溶液で
バルク溶離する。前述のように、溶離キモシンは、実質
的に純粋であり、食品グレードの使用が可能である。溶
離キモシンを所望の濃度に希釈し、塩化ナトリムウおよ
び保存剤を添加し、その溶液を濾過して所望の市販製品
を提供する。また前述のように、次に樹脂カラムを0.1
〜1Mの水酸化ナトリウムで、ついで水で洗浄し、樹脂カ
ラムを、調製濾液の別のバッチに再使用するために準備
する。
酵混合物のpHを硫酸で約２まで下げ、約１〜２重量％の
酢酸を加えて発酵工程を止めて、細胞を死滅させる。こ
の方法では、混合物を濾過して細胞残骸およびその他の
固形物を除去し、酵素混合物を包含する水性濾液を産出
する間、混合物を約pH2に保持する。濾過段階で濾液を
得た後でも、濾液をフェニル−セファロース樹脂カラム
に接触する間は、pHを約２に保持する。所望ならば、濾
液を樹脂カラムに接触させる前に、塩を濾液に加えるこ
とがある。塩の添加は、キモシンと樹脂カラムの結合を
促進することがある場合もある。このような塩の例とし
ては、0.5M硫酸アンモニウムあるいは0.5M硫酸ナトリウ
ムがある。濾液がフェニル−セファロース樹脂カラムと
接触するとすぐに、キモシンはカラム内の樹脂と結合
し、一方、他の酵素と濾液とはカラムを通過して廃棄さ
れる。次に、結合したキモシンを包含するフェニル−セ
ファロース樹脂カラムを、0.2M塩化ナトリウム溶液で洗
浄する。pHを約２に保持して溶離後には約5.9の所望の
値に上昇させることも可能だが、処理工程のこの時点で
pHを0.2M燐酸塩で約5.9に上昇させることが好ましい。
樹脂カラムを洗浄し、pH調整後に、もし所望ならば、キ
モシンを、水あるいは50mMの燐酸塩溶液等の弱塩溶液で
バルク溶離する。前述のように、溶離キモシンは、実質
的に純粋であり、食品グレードの使用が可能である。溶
離キモシンを所望の濃度に希釈し、塩化ナトリムウおよ
び保存剤を添加し、その溶液を濾過して所望の市販製品
を提供する。また前述のように、次に樹脂カラムを0.1
〜1Mの水酸化ナトリウムで、ついで水で洗浄し、樹脂カ
ラムを、調製濾液の別のバッチに再使用するために準備
する。
前述の記述が、本発明の処理工程を実施する好適な実
施例であること、また、前述の方法の種々の変形例が、
本発明の内容に従った処理工程内で可能であることが理
解されよう。種々の処理工程条件を変えることが可能で
あり、使用する試薬を変えて、キモシンを包含する酵素
の適切な水性混合物からキモシンを回収する種々の所望
あるいは至適操作条件を提供することが可能である。し
かし、この処理工程の必須の特徴は、フェニル−セファ
ロース樹脂の使用である。フェニル−セファロース樹脂
は、種々の他の要素や酵素を包含する水性混合物の中の
キモシンと結合するための独特の活性を有して選択的で
あることが判明した。オクチル等の他の官能基を有する
セファロース樹脂は、所望のキモシン選択性を有するこ
とが判明しなかった。本発明の範囲は下記の理論により
限定的に解釈してはならないが、キモシンに対する高度
の選択性を提供するのは、セファロース樹脂上のフェニ
ル機能性であると考えられる。発酵ブロスは、広範囲の
他の要素、酵素および不純物を包含するため、発酵ブロ
スからキモシンを分離する上でフェニル−セファロース
樹脂が特に有益であることが判明した。それに反して、
このような複雑な混合物は、陰イオンおよび陽イオン交
換樹脂の作用を妨害するので、そのようなイオン交換樹
脂は発酵ブロスからキモシンを回収する上で無効とな
る。
施例であること、また、前述の方法の種々の変形例が、
本発明の内容に従った処理工程内で可能であることが理
解されよう。種々の処理工程条件を変えることが可能で
あり、使用する試薬を変えて、キモシンを包含する酵素
の適切な水性混合物からキモシンを回収する種々の所望
あるいは至適操作条件を提供することが可能である。し
かし、この処理工程の必須の特徴は、フェニル−セファ
ロース樹脂の使用である。フェニル−セファロース樹脂
は、種々の他の要素や酵素を包含する水性混合物の中の
キモシンと結合するための独特の活性を有して選択的で
あることが判明した。オクチル等の他の官能基を有する
セファロース樹脂は、所望のキモシン選択性を有するこ
とが判明しなかった。本発明の範囲は下記の理論により
限定的に解釈してはならないが、キモシンに対する高度
の選択性を提供するのは、セファロース樹脂上のフェニ
ル機能性であると考えられる。発酵ブロスは、広範囲の
他の要素、酵素および不純物を包含するため、発酵ブロ
スからキモシンを分離する上でフェニル−セファロース
樹脂が特に有益であることが判明した。それに反して、
このような複雑な混合物は、陰イオンおよび陽イオン交
換樹脂の作用を妨害するので、そのようなイオン交換樹
脂は発酵ブロスからキモシンを回収する上で無効とな
る。
本発明において驚くべきことに、キモシンは、発酵ブ
ロス内にあって、低pHおよび／または高濃度の塩の条件
下でセファロース樹脂と結合する実質的に唯一の酵素材
料であるということが判明した。通常は、多数の異なる
酵素および他の材料がセファロース型樹脂と結合し、次
に、所望の酵素を、連続的、部分的あるいは段階的溶離
により、溶離水のpHおよび／または塩濃度を漸次変える
ことによって画分として回収する。このような標準的方
法では、各酵素が異なる時間に溶離され、別々の画分が
生じ、それらの１種類以上が回収すべき所望の酵素を包
含する。分別溶離はまた、通常、得られた画分が重複
し、その結果、所望な溶離物が、少なくとも部分的に隣
接画分内に広がってしまう可能性があり、それが、少な
くとも所望の高純度で回収可能な所望物の総量を減少さ
せる。このような分別溶離工程は、経済的な商業ベース
での大規模分離に使用できる程十分効率的ではない。
ロス内にあって、低pHおよび／または高濃度の塩の条件
下でセファロース樹脂と結合する実質的に唯一の酵素材
料であるということが判明した。通常は、多数の異なる
酵素および他の材料がセファロース型樹脂と結合し、次
に、所望の酵素を、連続的、部分的あるいは段階的溶離
により、溶離水のpHおよび／または塩濃度を漸次変える
ことによって画分として回収する。このような標準的方
法では、各酵素が異なる時間に溶離され、別々の画分が
生じ、それらの１種類以上が回収すべき所望の酵素を包
含する。分別溶離はまた、通常、得られた画分が重複
し、その結果、所望な溶離物が、少なくとも部分的に隣
接画分内に広がってしまう可能性があり、それが、少な
くとも所望の高純度で回収可能な所望物の総量を減少さ
せる。このような分別溶離工程は、経済的な商業ベース
での大規模分離に使用できる程十分効率的ではない。
前述とは対照的に、本発明の処理工程においては、キ
モシンは、フェニル−セファロース樹脂と結合する、発
酵ブロス濾液の実質的に唯一の成分であることが判明し
た。したがって、傾斜溶離あるいは分別溶離は、本発明
の処理工程において必要あることも所望されることもな
く、キモシンがバルク溶離される。フェニル−セファロ
ース樹脂が、発酵ブロス濾液からキモシン全量の少なく
とも約95重量％を取り出すため、この処理工程は高い回
収率を提供する。この処理工程は、キモシンが、分別溶
離の必要もなく、一段階で迅速に樹脂カラムより溶離可
能であるため、効率的である。この結果生じたキモシン
製品は、少なくとも約90重量％の純度があり、不純物を
除去するための重要な別の処理をしなくても、市販用と
して可能である。市販のキモシン製品は通常、約５グラ
ム／ガロンあるいは１キモシン当り約1.5グラムに希釈
され、塩（通常はNaC）濃度は通常は約18％になって
おり、安息香酸ナトリウム等の保存剤が添加されてい
る。食品グレードの使用を目的とした市販用の最終製品
は、通常、所望しない固形物あるいは存在する可能性の
ある微粒子を除去するために最終濾過する。
モシンは、フェニル−セファロース樹脂と結合する、発
酵ブロス濾液の実質的に唯一の成分であることが判明し
た。したがって、傾斜溶離あるいは分別溶離は、本発明
の処理工程において必要あることも所望されることもな
く、キモシンがバルク溶離される。フェニル−セファロ
ース樹脂が、発酵ブロス濾液からキモシン全量の少なく
とも約95重量％を取り出すため、この処理工程は高い回
収率を提供する。この処理工程は、キモシンが、分別溶
離の必要もなく、一段階で迅速に樹脂カラムより溶離可
能であるため、効率的である。この結果生じたキモシン
製品は、少なくとも約90重量％の純度があり、不純物を
除去するための重要な別の処理をしなくても、市販用と
して可能である。市販のキモシン製品は通常、約５グラ
ム／ガロンあるいは１キモシン当り約1.5グラムに希釈
され、塩（通常はNaC）濃度は通常は約18％になって
おり、安息香酸ナトリウム等の保存剤が添加されてい
る。食品グレードの使用を目的とした市販用の最終製品
は、通常、所望しない固形物あるいは存在する可能性の
ある微粒子を除去するために最終濾過する。
フェニル−セファロース樹脂は周知の種類の樹脂であ
り、また、架橋フェニル−アガロース樹脂としても周知
のものである。「フェニル−セファロースCL−4B」は、
Pharmacia社,AB,の架橋フェニル−アガロース樹脂の商
標名であり、本明細書でいう「フェニル−セファロー
ス」とは、水性溶液あるいは水性懸濁液からのキモシン
と効率良く結合するのに十分なフェニル官能性を有する
架橋アガロース樹脂を呼称している。
り、また、架橋フェニル−アガロース樹脂としても周知
のものである。「フェニル−セファロースCL−4B」は、
Pharmacia社,AB,の架橋フェニル−アガロース樹脂の商
標名であり、本明細書でいう「フェニル−セファロー
ス」とは、水性溶液あるいは水性懸濁液からのキモシン
と効率良く結合するのに十分なフェニル官能性を有する
架橋アガロース樹脂を呼称している。
フェニル−セファロース樹脂は、粒度が約40〜400μ
のバルク状粒子形態で使用可能であり、酵素の水性混合
物と混合可能であって、その結果キモシンが同樹脂と結
合する。次に、同樹脂をこの水溶液から分離し、その
後、溶離を行い、前述のように再利用する。しかし、フ
ェニル−セファロース樹脂を、約40〜400μの粒度を有
する樹脂粒子を有する充填カラムの形態で使用すること
が好ましい。
のバルク状粒子形態で使用可能であり、酵素の水性混合
物と混合可能であって、その結果キモシンが同樹脂と結
合する。次に、同樹脂をこの水溶液から分離し、その
後、溶離を行い、前述のように再利用する。しかし、フ
ェニル−セファロース樹脂を、約40〜400μの粒度を有
する樹脂粒子を有する充填カラムの形態で使用すること
が好ましい。
当業者に理解されるように、本発明の処理工程に関す
る前述の記載に関連する酸、塩基および塩は、本発明の
フェニル−セファロース樹脂の作用を妨害せずに、また
キモシンを変性しない所望のpHあるいは所望の塩含有量
を提供する等価の酸、塩基あるいは塩に変える、あるい
はそれらで代用することが可能である。また、当業者に
理解されることだが、前述の記載に関連するpH値は、一
定の範囲内で変更可能であり、それでもなお、所望の結
果を得ることができる。例えば、発酵ブロスは、pH6未
満で処理して濾過することができるが、pHは約３未満が
好ましく、最も好ましくは、pHを約２に保持することで
ある。同様に、処理工程においてpHが約5.9に好ましく
調節されている場合に、処理工程におけるこれらの時点
でのpHは、約５〜６の範囲であることが可能であり、好
ましくは、約5.5〜６の間である。同様に、濃塩の濃度
を、所望の結果を提供するように変更することも可能で
ある。キモシンは、少なくとも約1Mの濃塩溶液の存在下
および／または水性混合物が約pH3未満である時にフェ
ニル−セファロース樹脂と最も良好に結合することが判
明した。通常は、塩化ナトリウムが低価格であるため、
塩化ナトリウムの使用が好ましい。他の有益な塩の例と
しては、Na2SO4および（NH4）2SO4がある。酵素の水性
混合物中の塩濃度に関して、例えば、約１〜2Mの範囲と
いうように、より高いあるいはより低いモル濃度でもキ
モシンをフェニル−セファロース樹脂に結合する上で有
効であるが、好ましい塩濃度は、約2Mである。溶離段階
において、キモシンは、水あるいは弱塩溶液を用いて、
フェニル−セファロース樹脂から一回の溶離あるいはバ
ルク溶離で容易に溶離可能であることが判明した。キモ
シンは、塩溶液のイオン濃度が高い場合にフェニル−セ
ファロース樹脂と最も良好に結合し、その後、水あるい
は希塩溶液で溶離することによってフェニル−セファロ
ース樹脂上のキモシンのイオン強度が低下した時に、キ
モシンは容易に溶離すると考えられる。
る前述の記載に関連する酸、塩基および塩は、本発明の
フェニル−セファロース樹脂の作用を妨害せずに、また
キモシンを変性しない所望のpHあるいは所望の塩含有量
を提供する等価の酸、塩基あるいは塩に変える、あるい
はそれらで代用することが可能である。また、当業者に
理解されることだが、前述の記載に関連するpH値は、一
定の範囲内で変更可能であり、それでもなお、所望の結
果を得ることができる。例えば、発酵ブロスは、pH6未
満で処理して濾過することができるが、pHは約３未満が
好ましく、最も好ましくは、pHを約２に保持することで
ある。同様に、処理工程においてpHが約5.9に好ましく
調節されている場合に、処理工程におけるこれらの時点
でのpHは、約５〜６の範囲であることが可能であり、好
ましくは、約5.5〜６の間である。同様に、濃塩の濃度
を、所望の結果を提供するように変更することも可能で
ある。キモシンは、少なくとも約1Mの濃塩溶液の存在下
および／または水性混合物が約pH3未満である時にフェ
ニル−セファロース樹脂と最も良好に結合することが判
明した。通常は、塩化ナトリウムが低価格であるため、
塩化ナトリウムの使用が好ましい。他の有益な塩の例と
しては、Na2SO4および（NH4）2SO4がある。酵素の水性
混合物中の塩濃度に関して、例えば、約１〜2Mの範囲と
いうように、より高いあるいはより低いモル濃度でもキ
モシンをフェニル−セファロース樹脂に結合する上で有
効であるが、好ましい塩濃度は、約2Mである。溶離段階
において、キモシンは、水あるいは弱塩溶液を用いて、
フェニル−セファロース樹脂から一回の溶離あるいはバ
ルク溶離で容易に溶離可能であることが判明した。キモ
シンは、塩溶液のイオン濃度が高い場合にフェニル−セ
ファロース樹脂と最も良好に結合し、その後、水あるい
は希塩溶液で溶離することによってフェニル−セファロ
ース樹脂上のキモシンのイオン強度が低下した時に、キ
モシンは容易に溶離すると考えられる。
ここまで本発明の処理工程を実施する好適な方法およ
びその変更例の観点から本発明を説明してきたが、以
下、特定の実施例を用いて本発明をさらに説明する。
びその変更例の観点から本発明を説明してきたが、以
下、特定の実施例を用いて本発明をさらに説明する。
実施例Ｉ 本実施例は、食品グレードのキモシンを生産するキモ
シン回収工程を記載する。キモシンは、黒色アスペルギ
ルス変種（Aspergillus Niger var.）、awamoriの発酵
から回収される。本処理工程を、3000の発酵槽および
約2500の集菌量の観点から記載する。発酵完了時に
は、ブロスを、硫酸でpHを2.0〜2.5に調節し、酢酸を添
加することによって、ブロスを不活化する。（1989年６
月13日に出願されたLawlis等の米国特許出願番号07/36
5,945号を、本明細書に参考として引用する）。不活化
条件は、発酵温度と、空気流で１時間維持される。この
不活化により、封じ込めを破壊するのに十分な程生存細
胞を減少させる。不活化後、水酸化アンモニウムで、pH
を5.5に調節する。不活化および、その後のpH調節に
は、硫酸約125g、氷酢酸25kgおよび28％水酸化アンモニ
ウム溶液80が必要であろう。
シン回収工程を記載する。キモシンは、黒色アスペルギ
ルス変種（Aspergillus Niger var.）、awamoriの発酵
から回収される。本処理工程を、3000の発酵槽および
約2500の集菌量の観点から記載する。発酵完了時に
は、ブロスを、硫酸でpHを2.0〜2.5に調節し、酢酸を添
加することによって、ブロスを不活化する。（1989年６
月13日に出願されたLawlis等の米国特許出願番号07/36
5,945号を、本明細書に参考として引用する）。不活化
条件は、発酵温度と、空気流で１時間維持される。この
不活化により、封じ込めを破壊するのに十分な程生存細
胞を減少させる。不活化後、水酸化アンモニウムで、pH
を5.5に調節する。不活化および、その後のpH調節に
は、硫酸約125g、氷酢酸25kgおよび28％水酸化アンモニ
ウム溶液80が必要であろう。
不活化ブロスをドラムフィルタを使用して濾過する。
ブロスをイオン除去水で2.5倍に希釈する（2500を625
0にする）。希釈した材料にManville Celite545を加
えてその３％wt/volをManville Celite 545とし、、Cel
ite 545プレコートを介して濾過する。得られたケーク
を収量を増加するために洗浄する。濾液量は、最初に送
り込んだ量と同量とする。
ブロスをイオン除去水で2.5倍に希釈する（2500を625
0にする）。希釈した材料にManville Celite545を加
えてその３％wt/volをManville Celite 545とし、、Cel
ite 545プレコートを介して濾過する。得られたケーク
を収量を増加するために洗浄する。濾液量は、最初に送
り込んだ量と同量とする。
濾液を、フエニル−セファロース樹脂接触段階前に、
２段階式パッド濾過法（two−step pad filtration）を
使用して仕上げる。濾液にNaCとHyFlo Super Celを加
えてその６％wt/volをNaC,1％wt/volをHyFlo Super C
elとし、SEN Super 200フィルタを介して濾過する。第
一段階の濾液を採集し、Super 50パッドを使用して圧縮
する。第二段階の濾過には、フィルタ補助は使用しな
い。
２段階式パッド濾過法（two−step pad filtration）を
使用して仕上げる。濾液にNaCとHyFlo Super Celを加
えてその６％wt/volをNaC,1％wt/volをHyFlo Super C
elとし、SEN Super 200フィルタを介して濾過する。第
一段階の濾液を採集し、Super 50パッドを使用して圧縮
する。第二段階の濾過には、フィルタ補助は使用しな
い。
浄化濾液を、10のフェニル−セファロース樹脂カラ
ムに通す（Pharmacia社,ABの粒子寸法40〜100μの“FAS
T FLOW L.S,"）。充填後、３カラム容量（30）の６％
NaC溶液で洗浄する。次に、カラムを、４カラム容量
（40）の50mM燐酸ナトリウム緩衝液で、pH5.5にてバ
ルク溶離する。溶離したキモシン溶液を、市販食品グレ
ード使用のために、NaCで処理してその17％をNaCと
する。
ムに通す（Pharmacia社,ABの粒子寸法40〜100μの“FAS
T FLOW L.S,"）。充填後、３カラム容量（30）の６％
NaC溶液で洗浄する。次に、カラムを、４カラム容量
（40）の50mM燐酸ナトリウム緩衝液で、pH5.5にてバ
ルク溶離する。溶離したキモシン溶液を、市販食品グレ
ード使用のために、NaCで処理してその17％をNaCと
する。
実施例II 実施例Ｉと同様の濾液とフェニル−セファロース樹脂
とを使用する本実施例では、キモシンのフェニル−セフ
ァロース樹脂からの傾斜溶離を説明する。
とを使用する本実施例では、キモシンのフェニル−セフ
ァロース樹脂からの傾斜溶離を説明する。
条件:11.4MLフェニル−セファロース樹脂 5.0ML/分での充填および溶離 キモシンの総回収率は、約85重量％である。図面は、
キモシンの溶離を、硫酸アンモニウム濃度の関数として
示し、一回の溶離操作でキモシンが容易に回収されるこ
とを示している。
キモシンの溶離を、硫酸アンモニウム濃度の関数として
示し、一回の溶離操作でキモシンが容易に回収されるこ
とを示している。
実施例III 実施例Ｉと同様の濾液を使用した場合のフェニル−セ
ファロース樹脂の下記の条件下での能力は次の通りであ
る。
ファロース樹脂の下記の条件下での能力は次の通りであ
る。
本実施例では、本発明を実施する好適な方法は、低い
pHで実施されることを示している。
pHで実施されることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａ ｔａｌｏｇ 86，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ 1986 ｂｙ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎ ｃ．，ｐ．93 Ｐ．Ｎ．Ｃｈｅｒｅｍｉｓｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａ ｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｄ 1985，ｂｙ Ｔｅｃｈｎｏｍｉ ｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉ ｎｃ．，ｐ．549−552 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】酵素の水性混合物から実質的にキモシンの
みを分離する方法であって、 （ａ）酵素の水性混合物に、フェニルーセファロース樹
脂に結合する酵素が実質的にキモシンのみとなるのに十
分な濃度の塩を加える段階と、 （ｂ）前記水性混合物をフェニルーセファロース樹脂
に、キモシンが前記フェニルーセファロース樹脂と結合
するのに充分な時間接触させて、実質的にキモシンのみ
を前記フェニルーセファロース樹脂に結合させる段階
と、 （ｃ）前記フェニルーセファロース樹脂とそれに結合し
たキモシンとを、前記水性混合物から分離する段階と、 （ｄ）キモシンを前記フェニルーセファロース樹脂から
溶離する段階とを有することを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記塩が、少なくとも約1Mの濃度を有する
無機塩溶液から成ることを特徴とする請求の範囲第１項
記載の方法。 - 【請求項３】前記溶離する段階が、約0.5M未満の濃度を
有する希塩溶液の使用を含むことを特徴とする請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】前記水性混合物が、発酵工程で作られるこ
とを特徴とする請求の範囲第１項から第３項いずれか１
項記載の方法。 - 【請求項５】酵素の水性混合物から実質的にキモシンの
みを分離する方法であって、 （ａ）前記水性混合物のpHを約３未満に調節する段階
と、 （ｂ）前記pH調節した水性混合物をフェニルーセファロ
ース樹脂に、キモシンが前記フェニルーセファロース樹
脂と結合するのに充分な時間接触させて、実質的にキモ
シンのみを前記フェニルーセファロース樹脂に結合させ
る段階と、 （ｃ）前記フェニルーセファロース樹脂とそれに結合し
たキモシンとを、前記水性混合物から分離する段階と、 （ｄ）キモシンを前記フェニルーセファロース樹脂から
溶離する段階とを有することを特徴とする方法。 - 【請求項６】前記溶離する段階の前に、前記フェニルー
セファロース樹脂とそれに結合したキモシンとを、少な
くとも約1Mの濃度を有する塩溶液で洗浄することを特徴
とする請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】前記溶離する段階が、約0.5M未満の濃度を
有する希塩溶液の使用を含むことを特徴とする請求の範
囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】前記水性混合物が、発酵工程から得られた
ものであることを特徴とする請求の範囲第５項から第７
項いずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36594489A | 1989-06-13 | 1989-06-13 | |
| US365,944 | 1989-06-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05500301A JPH05500301A (ja) | 1993-01-28 |
| JP2974763B2 true JP2974763B2 (ja) | 1999-11-10 |
Family
ID=23441043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2509308A Expired - Lifetime JP2974763B2 (ja) | 1989-06-13 | 1990-06-13 | キモシンの回収および精製 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0477277B1 (ja) |
| JP (1) | JP2974763B2 (ja) |
| AU (1) | AU629656B2 (ja) |
| CA (1) | CA2058453C (ja) |
| DE (1) | DE69018823T2 (ja) |
| DK (1) | DK0477277T3 (ja) |
| FI (1) | FI100110B (ja) |
| NO (1) | NO914886D0 (ja) |
| NZ (1) | NZ234058A (ja) |
| WO (1) | WO1990015865A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5652348A (en) * | 1994-09-23 | 1997-07-29 | Massey University | Chromatographic resins and methods for using same |
| US7390936B1 (en) | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
| ATE346856T1 (de) * | 2000-02-08 | 2006-12-15 | Upfront Chromatography As | Neue harze und ihre verwendung zur rückgewinnung von proteinen oder peptiden |
| EA025412B1 (ru) | 2006-04-13 | 2016-12-30 | ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. | Жидкая композиция, содержащая аспарагиновую протеазу |
| WO2012127005A1 (en) | 2011-03-22 | 2012-09-27 | Dsm Ip Assets B.V. | Chymosin formulation |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0123928A3 (en) * | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
| US4743551A (en) * | 1984-11-05 | 1988-05-10 | Miles Inc. | Purification of microbial rennet from Mucor miehei |
| US4745063A (en) * | 1986-10-01 | 1988-05-17 | Sanofi Bio Ingredients, Inc. | Method for separating rennet components |
| EP0477284B1 (en) * | 1989-06-13 | 1995-08-16 | Genencor International, Inc. | Processes for the recovery of naturally produced chymosin |
-
1990
- 1990-06-13 WO PCT/US1990/003377 patent/WO1990015865A1/en active IP Right Grant
- 1990-06-13 DK DK90909992T patent/DK0477277T3/da active
- 1990-06-13 JP JP2509308A patent/JP2974763B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-13 CA CA002058453A patent/CA2058453C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-13 EP EP90909992A patent/EP0477277B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-13 DE DE69018823T patent/DE69018823T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-06-13 NZ NZ23405890A patent/NZ234058A/en unknown
- 1990-06-13 AU AU58522/90A patent/AU629656B2/en not_active Expired
-
1991
- 1991-12-10 FI FI915812A patent/FI100110B/fi active
- 1991-12-12 NO NO914886A patent/NO914886D0/no unknown
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐ．Ｎ．Ｃｈｅｒｅｍｉｓｉｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．"Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ"Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ １９８５，ｂｙ Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ｐ．５４９−５５２ |
| Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃａｔａｌｏｇ ８６，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ １９８６ ｂｙ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．，ｐ．９３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| AU5852290A (en) | 1991-01-08 |
| NO914886L (no) | 1991-12-12 |
| NO914886D0 (no) | 1991-12-12 |
| AU629656B2 (en) | 1992-10-08 |
| WO1990015865A1 (en) | 1990-12-27 |
| FI100110B (fi) | 1997-09-30 |
| CA2058453A1 (en) | 1990-12-14 |
| EP0477277A1 (en) | 1992-04-01 |
| EP0477277A4 (en) | 1992-05-13 |
| EP0477277B1 (en) | 1995-04-19 |
| CA2058453C (en) | 1999-06-01 |
| JPH05500301A (ja) | 1993-01-28 |
| FI915812A0 (fi) | 1991-12-10 |
| DE69018823D1 (de) | 1995-05-24 |
| NZ234058A (en) | 1992-07-28 |
| DE69018823T2 (de) | 1995-12-07 |
| DK0477277T3 (da) | 1995-08-21 |
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