SU975796A1 - Способ выделени целлюлазы - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛОЛАЗЫ

Изобретение относитс  к способам выделени  ферментных препаратов микробного происхождени  и может быть, в частности, использовано дл  получени  высокоактивных препаратов целлюла зы, примен емых в пищевой промышленности , виноделии и медицине. Известен способ выделени  ферментов , в том числе целлюлаз, из растворов , предусматривающий осаждение сульфатом аммони  из сконцентрированного упариванием раствора П 1. Недостатками этого способа  вл ютс  сложность регенерации осаждающего агента и низкое содержание целлюлаз в получаемых препаратах, поскольку вместе с целлюлазами происходит осаждение посторонних белков, углеводов , компонентов питательной среды и других примесей. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ выделени  целлюлазы из содержащих ее растворов , предусматривающий адсорбцию фермента из охлажденного до 5-13 С раствора с рН 3-6 на сорбент, представл ющий собой измельченную-целлюлозу (обычно с размером частиц 10100 мкм, вз тую в количестве 0,1-10 г на 50 ед. активности фермента), последующее фильтрование.суспензии и сушку отделенного сорбата 2Д. Недостатками известного способа  вл ютс  невозможность получени  препаратов , содержащих более 500 ед, целлюлазы на 1 г, и низка  начальна  активность получаемых препаратов при использовании дл  переработки твердых видов растительного сырь , поскольку при добавлении их к сырью первоначально происходит гидролиз сорбента , на который осаждались целлюлазы , и лишь затем возможен гидролиз самого перерабатываемого сырь . Цель изобретени  - повышение активности целлюлазы. Поставленна  цель достигаетс  спо собом выделени  целлюлазы, предусмат ривающим адсорбцию фермента на целлюлозе при рН , причем адсорбированный фермент элюируют водой или буферным раствором с рН ,,S и ионной силой 0,0001-0,01 М с последующей сушкой полученного элюата. Обычно используют культуральную жидкость продуцента целлюлазы или экстракт поверхностной культуры, или раствор технического препарата целлюлазы . В качестве адсорбента обычно используют хлопковый линт или некондиционный хлопок. Перед элюцией фермента с целлюлоз обычно осуществл ют отмывку адсорбир ванных примесей буферным раствором с рН 3,5-,5 и ионной силой 0,01-2 М. Обычно процесс ведут при . Использование воды или водного раствора с малой ионной силой дл  см вани  адсорбированной целлюлазы  вл  етс  неочевидным, поскольку уменьшение прочности адсорбции ферментов, как правило, вызываетс  повышением, а не понижением ионной силы, поэтому поведение целлюлаз в данном случае  вл етс  исключением. Близкие результаты, достигаемые при использовании чистой воды и водных растворов с ионной силой 0,00010 ,01 М, объ сн ютс  тем,, что вода обладает большей способностью к смыванию целлюлаз, но при ее использова нии сильно увеличиваетс  гидродинами ческое сопротивление целлюлозы, что может приводить к уменьшению скорост элюировани  почти до нул  еще до того , как весь фермент десорбируетс  с целлюлозы. Это может приводить к снижению выхода целлюлазы при исполь зовании в качестве адсорбента порошковых форм целлюлозы типа микрокрис таллической. Водные растворы с ионно силой 0,0001-0,01 М, хот  и обладают несколько меньшей способностью к смы ванию целлюлаз при пропускании равно го объема, однако в меньшей степени повышают гидродинамическое сопротивление порошковых форм целлюлозы, бла годар  чему элюцию ими можно проводить до полного отмывани  целлюлаз. Способ осуществл етс  следующим образом. Перед выделением фермента рН ферментного раствора довод т кислЪтой, например уксусной, до 3-6, а ионную силу - подход щей солью, например цитратом натри , ацетатом натрий, хлоридом кали  и т.п. - до 0,00010 ,01 М. Раствор фермента пропускают через охлажденную до колонку, заполненную целлюлозой, со скоростью 0,1-5 свободных объемов в час. По окончании пропускани  раствора фер мента пропускают буферный раствор с рН 3,5-,5 и ионной силой 0,01-2,0 М (1-10 объемов), а затем - воду или водный раствор с рН ,,5 и ионной силой 0,0001-0,01 М. Водную фракцию (1-3 свободных объема колонки) собирают и при необходимости (наличии осадка или сильной опалесценции) фильтруют или центрифугируют дл  удалени  осаждающихс  примесей, а затем сушат лиофильно. Полученный препарат целлюлазы содержит 1000-10000 ед. фермента на грамм и почти не содержит пигмента, балластных белков, протеаз, солей и других примесей. В качестве примеси он содержит небольшие количества растворимых Сахаров (глюкозы и целлобиозы ), стабилизирующих фермент при хранении. Ферментный препарат легко гидролизует растворимые производные целлюлозы, а также природную целлюлозу (хлопок, отходы древесины и т.д.). Выход по ферменту составл ет 80-100. Колонку с целлюлозой можно использовать дл  выделени  целлюлаз 10 и более раз без ухудшени  ее сорбционных свойств, пополн   периодически целлюлозой взамен прогидролизованной ферментом. О качестве сорбента можно использовать микрокристаллическую целлюлозу дл  хроматографии, измельченный и неизмельченный коротковолокнистый хлопок (линт), отходы производства бумаги, отходы вискозной промышленности. Пример 1.2г технического препарата целловиридина ГЗх (продуцент Trichoderma viride) с активностью 30 ед/г (по КМ-целлюлозе) раствор ют в 20 мл 0,1 М ацетатного буфера с рН 3,5 и ионной силой 0,01 М при перемешивании в течение 20 мин, затем удал ют центрифугированием нерастворившиес  примеси, В колонку объемом 10 мл (150V10 мм) с вод ной рубашкой, охлажденной до , внос т k г микрокристаллической целлюло зы дл  колоночной хроматографии(производство Chemapot, ЧССР) и уравно вешивают упом нутым буфером. Лдсорбцию целлюлазы провод т пропусканием 20 мл 10 ё-ного раствора целлюлазного препарата через колонку со скоростью 10 мл/ч. Раствор, не содержащий фермента , удал ют из колонки вытеснением упом нутым ацетатным буфером. Пос ле пропускани  100 мл буфера его замен ют на водный раствор однозамещенного фосфата натри  с ионной силой 0,001 И и рН 7, собирают выход щую фракцию объемом 10 мл и сушат ее лиофильно. Выход фермента составл ет 80%. Получают 16 мг препарата с активностью 3000 ед/г. Пример 2. Готов т 10%-рый раствор технического препарата целло бронина ГЮх с удельной активностью 100 ед/г (продуцент Trichoderma 1опgibrachiatum ) в 0,1 М ацетатном буфере (pH.AjS, ионна  сила 0,04,М), как описано в примере 1. В колонку ( мм, объем 300 мл) с вод ной рубашкой, охлажденной до , внос т 100 г хлопкового линта, измельченного гечение 5 мин на лабораторной вибромельнице, и уравновешивают упо- Минутым буфером. Пропускают 350 мл раствора целлобронина, затем lOO мл ацетатного буфера, 200 мл 0,1 М фосфатного буфера (рИ , ионна  сила 0,2 М) и, наконец, воду со скоростью 50 мл/ч. Собирают водную фракцию объемом 120 мл, центрифугируют дл  удалени  выпавших в осадок примесей и сушат лиофильно. Выход фермента 100%. Получают 600 мг препарата с ак тивностью 6000 ед/г. Пример 3. Готов т 10%-ную водную выт жку поверхностной культур Trichoderma koningii(препарат целлоконингин Пх, удельна  активность 10 ед/г), как описано в примере 1. Добавл ют в нее до рН 6 и ионной силы 2 М. В колонку, использо ванную в примере 1, термостатируемую при , внос т 8 г неизмельченного некондиционного хлопка, промывают 2 М раствором КН.Р0, затем пропускают 80 мл целлилазного раствора, а затем воду. В первых 20/мл водной фракции фермента почти нет. Их отбрасывают и собирают следующие 20 мл которые сушат лиофильно. Выход фермента 80% или 60 мг препарата с активностью 1000 ед/г. Пример 4. В культуральную жидкость продуцента Trichodernja 1 ignorun с активностью 0, ед/мл добавл ют концентрированную уксусную кислоту и ацетат натри  из расчета 0,1М ацетатного буфера (рН «,5). Дл  выделени  целлюлазы из культуральной ); идкости повторно используют колонку с измельченным линтом из примера 2, отмытую водой и уравновешенную ацетатным буфером. На колонку нанос т 1 л культуральной жидкости, далее поступают , как в примере 2. Выход фермента 95% или 95 мг с активностью 000 ед/г. Пример 5. В 100 мл и-ного раствора препарата целлокандина ГЮх (продуцент Geotrichum candidum) с удельной активностью 100 ед/г в 0,1 Н ацетатном буфере с рЙ i,5. использованного дл  гидролиза растворимой КМ-целлюлозы и содериоцего продукты гидролиза, внос т при перемешивании и охлаждении до С 15 г порошковой целлюлозы с размером частиц 150-250 мкм. Перемешивают 20 мин, затем раствор, не содержащий фермента , удал ют фильтрованием на стекл нном фильтре, а оставшуюс  целлюлозу промывают двум  порци ми воды по 20 мл. Водные выт жки объедин ют.и сушат. Выход фермента Й0% или ((О мл препарата с удельной активностью 2500 ед/г. Технико-экономическа  эффективность изобретени  заключаетс  в том, что способ позвол ет лолучить препараты целлюлазы с содержанием фермента 1000-10000 ед/г, обладающие высокой активностью по отношению к растворимым и нерастворимым формам целлюлозы . Получение препарата не требует значительных затрат, так как позвол ет многократно использовать сорбент , а в качестве сорбента использовать отходы хлопковой, целлюлознобумажной , вискозной промышленности. Дл  смывани  фермента пригодна обычна  вода. В ходе выделени  целлюлазы происходит отделение балластных белков , пигмента, компонентов среды культивировани , а также концентрирование в 2-5 раз и обессоливание. Это позвол ет исключить процедуры концентрировани  разбавленных растворов целлюлазы, культуральных жидкостей и

7

экстрактов при выделении из них фер мента, а также их обессоливание.

Claims (5)

1.Способ выделени  целлюлазы из содержащего ее раствора, предусматривающий адсорбцию фермента на целлюлозе при рН , отличающийс  тем, что, с целью повышени  активности фермента, адсорбированный фермент элюируют водой или буферным солевым раствором с рН Ц,5 7,5 и ионной силой 0,0001-0,01 Н с последующей сушкой полученного элюата .

2.Способ по п. 1, отличаю щ и и с   тем, что используют культуральную жидкость продуцента целлюлазы или экстракт поверхностной

757968

1 ультуры, или раствор технического препарата целлюлазы.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и чающийс  тем, что в качестве S адсорбента используют хлопковыйлинт или некондиционный хлопок.

k. Способ по пп. 1-3, отличающийс  тем, что перед элюцией фермента с целлюлозы осуществл  0 ют отмывку адсорбированных примесей буферным раствором с рН 3,,5 и ионной силой 0,01-2 М.

5. Способ по пп. 1-, отличающийс  тем, что процесс 1$ ведут при .

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР If , кл. С 12 О 13/10, 1973. М 2. Авторское свидетельство СССР N- 590957, кл. С 12 N , 1975.