CN1336434A - 胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法 - Google Patents

Abstract

一种胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法,胰激肽原酶多数是从猪胰自溶物或猪胰丙酮粉中提取,也可以从胰酶中提取,其特征在于提取纯化的方法采用亲和层析纯化技术,利用胰激肽原酶与胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶对酶抑制剂的亲和性的差别,使抑制剂与水不溶性载体结合,以此将胰激肽原酶与其他酶分离,本发明的亲和层析分离技术,能够工业化生产,纯化胰激肽原酶的质量纯度高,达到国际先进水平,也为国内广泛应用此药打下基础。

Description

胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法

本发明公开了一种胰激肽原酶的制备和亲和层析纯化方法，属一种生物药品的制备方法。

胰激肽原酶(即血管舒缓素)能从激肽原(Kininogen)中释放激肽(Kinin)，激肽具有扩张周围血管，降低血压的功能，因此该酶被广泛地应用于高血压及动脉硬化等症的预防和治疗。

众所周知，胰激肽原酶是从哺乳动物的胰脏中提取纯化而得，提取途径为从胰脏本身，胰酶粉及胰激肽原酶粗品(中间体)中提取，并通过纯化而制得的一种循环系统的酶。

在纯化和制备方法上，已知类型的纯化方法，是使用多糖非树脂物料，其中包括一种方法是使这种粗的激肽原酶吸附到一种弱碱性阴离子交换纤维素上并分离而得。(见日本专利发行No.11697/62)；一种方法是加入一种铝盐或者锌盐于含有激肽原酶的水溶液中，将产生的激肽原酶的沉淀吸附到弱碱性的阴离子交换纤维素上或交联葡取糖(Sephadex)上，并分离之(见日本公开专利发行No.56886/73)；另一种已知类型的纯化方法是使用离子交换树脂，包括一种方法是加入一种蛋白质沉淀剂到胰脏提取液中，产生的激肽原酶吸附到大孔强碱性阴离子交换树脂上，并分离之(见日本公开专利No.103715/73)利用多糖型非树脂物料作为吸附的方法缺点是离子交换物料的物理强度不够和微生物易于发生污染，因此这些方面不能进行大规模制备，另一方面，离子交换树脂法优点在于避免上述的麻烦，但仍不能使产品在洗脱时除去不需要的杂质。

本发明对纯化激肽释放酶提供一种新方法，该法使含有激肽原酶的提取液，利用胰激肽原酶与胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶对酶抑制剂的亲和性的差别，使抑制剂与水不溶性载体的结合，而将激肽原酶与其他酶分解，制得高纯度的产品。本发明公开了从动物胰脏中提取的激肽释放酶单位效价可在250-380u/mg，比活可达800-1000iu/mg.p。产品收率为85％，本工艺顺序简单，操作方便，适宜于工业化制备。

一、猪胰自溶物中提取胰激肽原酶的工艺流程：

二、猪胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工艺流程：

胰脏—→加入5-10倍量0.5M，PH4.5-8.5醋酸溶液—→静置15℃1小时，经过板框压滤的清液(加入树脂吸附弹性酶后母液)，经过中空纤维超滤器(P10O10)超滤浓缩后加入原体积PH5.0，0.001M，PBS缓冲液(第二次超滤)浓缩后加入原体积PH6.5，0.001M，PBS缓冲液(进行第三次超滤)

三、胰酶中提取胰激肽原酶的工艺流程：

PH6.5，加入0.8倍量DEAE纤维素搅拌吸附1小时—→清水洗涤 冻干燥—→成品

我们发现按照本文的方法利用亲和凝胶柱的动态吸附后在上样流出液中，大部分不需要的(而在一般离交树脂上同样会被吸附的)杂质酶不会被吸附上亲和凝胶柱上，在洗涤步骤中，我们又可洗去凝胶表面的不纯的激肽原酶。这样已吸附的激肽原酶能够以好的纯度和效率加以洗脱和回收。

我们发现用亲和层析法制得的产品，单位效价比一般专利文献报道60-150u/mg提高到了250-380u/mg，纯度从200-300u/mg.p提高到了800-1000u/mg.p，产品的收率从40-60％提高到了85％以上。

我们又发现，用大孔强碱性阴离子交换树脂时，洗脱吸附了的激肽原酶，需要消耗大量溶剂和长时期周期，而且，杂质倾向于伴随所分离的激肽原酶，但我们用亲和层析技术，不但缩短了生产工艺，而且很容易地把杂质与激肽原酶分离。

根据本文推荐的纯化方法，含激肽原酶的水提取液，经过亲和层析胶体柱，保证水提液与亲和胶体的充分接触，使纯的激肽原酶全部亲和吸附在胶体中，吸附操作的PH最好在PH4以上，PH8.5以下尽可能在PH5.5-7.5之间，最好的PH为6.5±0.5，PH超出规定范围时激肽原酶就会失活，PH超过8.0不吸附的激肽原酶量就会增加，酶的收率和纯度降低。

已吸附到凝胶上的激肽原酶，用一种弱酸的钠盐水溶液在PH4.5-6.0条件下进行洗脱。吸附、洗脱的温度必须在5℃-10℃冷房内进行。洗脱溶液尽可能在低盐条件下洗脱，一般控制在0.05M-0.001M之间，最终产物可在P2O5的真空干燥箱内加以干燥，也可用冷冻干燥方法。

我们所使用的亲和层析胶体是以胰蛋白酶抑制剂为配基与琼脂糖4B结合的层析胶体，琼脂糖凝胶为Sigma公司产品。

为了证实亲和层析在纯化激肽释放酶的结果，以下实验是用含激肽原酶的水提液与日本专利文献中使用WA-30(见特许公报昭55-44726)DEAE纤维素及美国的大孔树脂Amberite IRA-938进行对照[见公开特许昭53-62592]。

	本文方法	WA-30	DEAE-32	AmberliteIRA-938
					上样激肽原酶粗品量	15克300万iu	15克30万iu	15克30万iu	15克30万iu
粗品总OD值280nm	75000E	75000E	75000E	75000E
					上样流出母液总OD	74000E	32000E	36800E	23680E
母液中含激肽原酶量	1500u	68700u	54360u	63500u
					纯化后单位效价	378iu/mg	103.78u/mg	60i/mg	142.3u/mg
纯度	932iumg.p	150iu/mg.p	100iu/mg.p	300i/mg.p
					产品回收率	85％	49％	69％	65％

以上实验我们是取相同量的含激肽原酶的粗品，按照文献及资料中陈述的工艺进行操作。在操作中，我们注意在各种吸附剂吸附后的母液中检查280nm波长的透光值(E为消光系数)，表示吸附剂中吸上蛋白总量。同时，测试母液中含胰激肽原酶量。

激肽原酶的省略测定及纯度计算都按照卫生部98版部颁标准中胰激肽原酶质量标准中规定的方法进行测试。

下面用实施例和说明书附图对本发明作具体说明：

附图1为胰激肽原酶生产工艺路线方框图。

附图2为猪胰自溶物中提取胰激肽原酶的工艺流程图。

附图3为猪胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工艺流程图。

附图4为胰酶中提取胰激肽原酶的工艺流程图。

实施例1：

1000克胰酶的丙酮粉，用其重量20倍的水混合均匀，调PH至5.0-6.0，加入醋酸铵200克，搅拌3小时，置5℃-10℃冷室过夜，过滤出清液(渣弃除)，加2.5倍量丙酮复沉淀，P2O5干燥后得粗制胰激肽原酶300克，测含量为7.5u/mg，总效价为225万u。

粗制胰激肽原酶，用其20倍量0.001M，PH5.5-8.5磷酸缓冲液溶解后，过滤清后再上亲和层析柱，流速每分钟20ml，亲和柱高80cm，直径15cm，床体积51。上样完毕用同样缓冲液洗涤亲和层析柱10床体积后，用PH4.0-5.0，0.001M醋酸缓冲液洗脱亲和层析柱，以紫外线监测收集峰值部分，调PH5.5-7.5后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脱水后P₂O₅干燥，再进行去热原后得成品8.6克，测效价为230.8u/mg，纯度(比活)为825u/mg.p，总活力单位为198.48万u，收率为88.21％。

实施例2：

取购买进胰激肽原酶粗品，测每毫克20.22u/mg，150克加入其重量20倍的0.001M PH5.5-8.5缓冲液在5℃±3冷房中搅拌溶解3小时后用除菌助滤板过滤清液后即上样流速为20ml/分钟，亲和柱高80cm，直径15cm，床体积51，上样完毕用同样缓冲液洗亲和层析柱，10床体积后，用PH4.0-5.0，0.001M醋酸缓冲液洗亲和层析柱，紫外监测收集峰值部分，调PH5.5-9后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脱水后P₂O₅干燥，再进行去热原后得成品7.8克，测单位效价为339u/mg，纯度(比活)为825u/mg.p，总活力单位为264.42万u，收率为87.19％。

实施例3：

将猪胰脏10公斤，切碎，放到0.05M醋酸溶液50升中，在15℃下搅拌提取5小时，加入1％-5％十二脂肠切碎液，同时使其自溶，然后将胰脏小块和脂肪小块滤除，将滤液调整PH6.5后，加入2倍量丙酮沉淀，得粗制胰酶丙酮粉1020克，1020克丙酮粉按实施列(1)方法在进行粗制激肽原酶的提取，得粗制激肽原酶325克，测含量为6.9u/mg，总活力为224.3万iu粗制激肽原酶用PH5.5-8.5，0.001M磷酸缓冲液重量的20倍量溶解后用除菌澄清滤板过滤清后，上亲和层析柱，流速20ml/分钟，亲和柱高80cm，直径15cm，床体积51，上样完毕用同样缓冲液洗涤亲和层析柱，以紫外监测收集峰值部分，调PH5.5-9后，超滤浓缩后，进行冷冻干燥，即得胰激肽原酶精品5.3克，测单位效价为368u/mg，纯度为882u/mg.p，总活力195.04万u，收率为86.95％。

实施例4：

将猪胰脏10千克，切碎，加入5-10倍量0.05MPH4.5-6.5醋酸溶液中，搅拌自溶5小时，静置在15℃容器内10小时后板框压滤，清液调至PH5.5-7.5加入吸附弹性酶的大孔树脂吸附提取1小时后，将滤出树脂的母液，用中空纤维超滤膜H₁₀P₁₀进行循环超滤浓缩，后同样方法进行第二次、第三次超滤，用除菌板滤过清液后即上样，流速为20ml/分钟。亲和柱高80cm，直径15cm，床体积51，上样完毕用同样缓冲液洗脱，紫外监测收集峰值部分，调PH5.5-9后，加入3倍量丙酮沉淀，次日沉淀物脱水后P2O5干燥，再进行去热原后，得成品8.9克，测单位效价为219.5u/mg，纯度(比活)为965u/mg.p，总活力单位为195.36万u，收率为83.89％。

实施例5：

取购进含激须原酶的胰酶粉6千克，加入10倍量PH4.5，0.001M醋酸钠缓冲液搅拌提取2小时后板框压滤，弃渣，清液用6N NaOH调至PH6.5后加入0.8倍量预先平衡好DEAE-23搅拌吸附1小时后弃除母液，过滤出纤维素，水漂洗后，用0.1M氯化钠洗涤1-2次，加入0.6N甲酸铵洗脱，过滤收集清液；2.5V丙酮沉淀五氧化二磷干燥得成品105克，测效价为26.5u/mg，总单位为278.25万单位，收率46.38万u/kg，用以上中间体，按实施例2上亲和层析柱，洗脱液冻干后得干品7.25克，单位效价为308.5u/mg，纯度(比活)为863u/mg.p，收率为79.08％。

本发明能够在工业化生产中率先使用亲和层析分离技术，纯化胰激肽原酶。不仅使产品的质量指标，纯度；收率都达到了国际先进水平，也为国内更广泛应用此药打下基础。亲和层析分离纯化技术对生物制品特别对酶的纯化，是目前生物制品分离纯化技术中最为先进纯化手段之一，本方法利用胰激肽原酶与胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶等对酶抑制剂的亲和性的差别，使抑制剂与水不溶性载体结合，以此将激肽原酶与其他酶分离，制得高纯度激肽原酶产品。本发明简化了传统的生产技术，提高了工业化生产能力，使产品工业化应用前景看好。

Claims (5)

1.一种胰激肽原酶的制备及其亲和层析纯化方法，胰激肽原酶多数是从猪胰自溶物或猪胰丙酮粉中提取，也可以从胰酶中提取，其特征在于提取纯化的方法采用亲和层析纯化技术，利用胰激肽原酶与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对抑制剂的亲和性的差别，使抑制剂与水不溶性载体结合，以此将胰激肽原酶与其他酶分离，亲和层析纯化工艺流程为：

(1)猪胰自溶物中提取胰激肽原酶的工艺流程：

胰脏在10℃条件下切碎生成胰酶粉，然后在PH2-7.5醋酸缓冲液温度2℃-25℃条件下激活激肽原酶，通过水解析提取，压滤除渣，得到清液用丙酮沉淀，制成激肽酶粗品，然后在浓度0.001M磷酸缓冲液PH5.2-8.5对粗品再溶解及除菌过滤，进入亲和层析上样，在流速为16-25ml/分钟，PH5.2-8.5进行，亲和层析上样后进行亲和洗涤，用PH5.2-8.5磷酸缓冲液，流速成20-30ml/分钟，洗涤亲和层析柱10-20床体积后，用PH4.5-8.5醋酸缓冲液洗脱亲和层析柱，再进行去热原加入丙酮沉淀，沉淀物脱水后P₂O₅干燥或冷冻干燥，最后得成品。

(2)猪胰丙酮粉中提取胰激肽原酶的工艺流程：

胰脏经加入5-10倍量0.5M，PH4.5-8.5醋酸溶液，在温度15℃条件静置10小时，经过板框压滤的清液，(加入树脂吸附弹性酶后母液)，经过中空纤维超滤器(H₁₀P₁₀)超滤浓缩后加入原体积PH6.5，0.001M.PBS缓冲液(第二次超滤)浓缩后加入原体积PH6.5，0.001M.PBS缓冲液(进行第三次超滤)，经除菌过滤后进入亲和层析上样，亲和层析上样及以后的流程同流程(1)；

(3)胰酶中提取工艺流程：

胰酶粉(含胰激肽原酶)用10倍量PH4.5，0.01M.NQAC(醋酸钠)进行溶解，在温度5℃条件搅拌2-5小时，用板柜压滤弃除滤渣，所得清液调PH6.5，加入0.8倍量DEAE纤维素搅拌吸附1小时后，弃除吸附后母液过滤出纤维素，先用清水漂洗，再用0.1M氯化钠洗涤1-2次，用0.6N甲酸铵洗脱，过滤收集清液；2.5V丙酮沉淀，沉淀物脱水后，P₂O₅干燥得中间体，再按流程(1)中亲和层析上样及以后的工艺流程操作得成品。

2.根据权利要求1所述的胰激肽原酶的亲和层纯化方法，其特征在于所述的激肽原酶的水提取液经过亲和层析胶体柱，保证水提液与亲和胶体的充分接触，使纯的激肽原酶全部亲和吸附胶体中，吸附操作的PH尽可能在PH5.5-7.5。

3.根据权利要求1所述的胰激肽原酶的亲和层析纯化方法，其特征在于所述的吸附洗脱的温度必须在5℃-10℃冷房内进行，洗脱溶液尽可能在低盐条件下洗脱，一般控制在0.05M-0.001M之间，最终产物可在P₂O₅真空干燥或者冷冻干燥箱内干燥而得。

4.根据权利要求1所述的胰激肽原酶的亲和层析纯化方法，其特征在于所述的亲和层析胶体是以胰蛋白酶抑制剂为配基与琼脂糖结合的层析胶体。

5.一种权利要求1所获得胰激肽原酶产品，其特征在于激肽释放酶单位效价≥50iu/mg，可在250-380iu/mg；比活≥300iu/mg.p，可达800-1000iu/mg.p。

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