CN111117989A - 一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法 - Google Patents

一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法，以动物胰脏为原料，经组织绞碎，激活，浸泡，过滤，超滤，阴离子交换层析，疏水层析获得高纯度胰激肽原酶；阴离子交换层析过柱液经阳离子交换层析获得弹性酶；活化Sepharose、氨基己酸接臂、邻氨基苯甲醚偶联得O‑Anisidin‑ACA‑Sepharose亲和吸附剂对阳离子交换层析过柱液进行吸附获得高纯度糜蛋白酶。该方法实现胰激肽原酶，糜蛋白酶，弹性酶三酶联产且操作简便、产品纯度高、减少了资源浪费。O‑Anisidin‑ACA‑Sepharose介质的合成及使用降低了生产成本，提高了产品质量。

Description

一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种从动物胰脏提取三种酶的工艺方法。
背景技术
胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)，又称为胰激肽释放酶、血管舒缓素，是一类内切型蛋白水解酶，存在于哺乳动物体内的多种组织，尤以胰脏中含量最为丰富。胰激肽原酶是一种由18种氨基酸、4种糖组成的糖蛋白，分子量约为26800，等电点为4.05。
糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，系从动物胰脏中提取的一种蛋白酶，属于丝氨酸肤链内切酶，等电点为8.1。
弹性酶(Elastase)，是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶，等电点为9.5，主要存在于动物胰脏、皮肤、主动脉、血小板和白血球中。
胰激肽原酶、糜蛋白酶、弹性酶在临床上有广泛运用且价格昂贵。三种酶均可从动物胰脏中获得，以往工艺提取一种酶时其他酶被当作杂质处理了且其他酶的结构已糟到很大的破坏，难于形成多酶联产。如今随着生物纯化技术的发展，多酶联产工艺得于实现。三酶联产极大地提高动物胰脏的利用率，有着巨大的经济效益和社会效益。
我国专利(CN103275948)公开了“从牛或猪胰脏中提取四种酶的生产工艺”。该专利采用组织绞碎、酸浸提取、过滤分离、超滤浓缩、一段盐析、二段盐析、溶解激活、净化、过滤、脱盐浓缩、一段层析和二段层析等步骤，获得脱氧核糖核酸酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶和激肽原酶四种酶产品。其中关键点为采用盐析得脱氧核糖核酸酶；采用二乙酰氨基琼脂糖凝胶层析得糜蛋白酶；采用双丙酰胺葡聚糖凝胶吸附得激肽原酶，通过液为胰蛋白酶。因糜蛋白酶等电点为8.1，胰激肽原酶等电点为4.05，二乙酰氨基琼脂糖凝胶层析为阴离子交换柱，纯化后的糜蛋白酶纯度不高；胰蛋白酶等电点为10.1，弹性酶的等电点为9.5，双丙酰胺葡聚糖凝胶液也为阴离子柱故该工艺存在着获得的产品纯度不高，且操作复杂等缺点。
由此可见，提供一种操作方便、产品纯度高的多酶联产的方法成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
鉴于现有技术多酶联产的操作复杂，产品纯度低等缺点。本发明提供了一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法，具体步骤如下：
(1)将动物胰脏进行绞碎处理，得到组织碎浆；
(2)在所述组织碎浆中加入氯化钙溶液，将pH调节至第一pH区间，在35℃-45℃范围进行保温；
(3)所述组织碎浆保温完毕后加入硅藻土，进行过滤处理，将得到的滤液1进行超滤浓缩处理，得到浓缩液；
(4)将所述浓缩液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液1与洗脱流出液1；
(5)将所述洗脱流出液1上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液2，所述洗脱流出液2依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液2，将所述滤液2冻干，得到高纯度胰激肽原酶；
(6)将所述过柱液1上样至平衡处理后的阳离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液2，和洗脱流出液3，将所述洗脱流出液3依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液3，将所述滤液3冻干，得的弹性酶；
(7)将所述过柱液2上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液4，所述洗脱流出液4依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液4，将所述滤液4冻干，得高纯度糜蛋白酶。
优选的，在所述步骤(2)中：
所述氯化钙溶液为1-5％的氯化钙溶液，所述第一pH区间包括pH值7，所述保温时间为2-4小时。
优选的，在所述步骤(4)中：
所述阴离子交换层析柱的层析介质为Q Sepharose FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M-0.2M HAc-NaAc溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.1M-0.2M HAc-NaAc+0.4M-0.6M NaCl溶液。
优选的，在所述步骤(5)中：
所述疏水层析柱的层析介质为Phenyl Sepharose 6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB+1.2M(NH4)2SO4溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.2M(NH4)2SO4溶液。
优选的，在所述步骤(6)中：
所述阳离子交换层析柱的层析介质为SP Sepharose 6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.3M NaCl溶液。
优选的，在所述步骤(7)中：
所述亲和层析柱的层析介质为O-Anisidin-ACA-Sepharose，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M NaAc，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M NaAc+1.5M KCl溶液。
优选的，所述超滤浓缩处理使用的是是10KD超滤膜，所述超滤除盐处理使用的是10KD超滤膜，所述膜过滤处理使用的是0.2微米除菌膜。
优选的，所述O-Anisidin-ACA-Sepharose由以下方法制备：
将载体Sepharose4B转入二氧六环有机相；
将羰基二咪唑溶于所述二氧六环中，同所述载体Sepharose4B混合进行反应；
将反应后的产物置换到水相中，得到活化的载体介质；
将所述活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中，进行缩合反应，得到氨基己酸-琼脂糖；
将所述氨基己酸-琼脂糖与邻氨基苯甲醚发生偶联反应，得到所述O-Anisidin-ACA-Sepharose介质。
优选的，所述将将载体Sepharose4B转入二氧六环有机相，具体为：
将所述载体Sepharose4B充分清洗后，再依次用浓度递增的二氧六环溶液置换到无水二氧六环中。
优选的，所述将反应后产物置换到水相中，具体为：
将反应后的产物依次用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中。
与现有技术的多酶联产工艺相比，本发明提供的以动物胰脏为原料，经组织绞碎，激活，浸泡，过滤，超滤，阴离子交换层析，疏水层析获得高纯度胰激肽原酶；阴离子交换层析过柱液经阳离子交换层析获得弹性酶；阳离子交换层析过柱液经亲和层析获得高纯度糜蛋白酶。该方法实现胰激肽原酶，糜蛋白酶，弹性酶三酶联产且操作简便、产品纯度高、减少了资源浪费。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法的流程示意图；
图2为本发明实施例提取的产物检测结果的数据图；
图3为本发明实施例亲和层析介质的制备流程示意图。
具体实施方式
鉴于现有技术多从动物胰脏中提取多种酶的多酶联产工艺，存在产品纯度低，操作复杂等缺点。本发明提供了一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法。下面将结合本发明实施例与实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1所示，本发明提供了一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法。
该方法的具体实施过程如下：
步骤101：组织搅碎：将动物胰脏进行绞碎处理，得到组织碎浆。
其中，结合具体实施场景，所述动物胰脏可选用新鲜的猪胰或牛胰，并去除脂肪及结缔组织，洗净后用绞肉机绞碎。
步骤102：激活、浸泡：在所述组织碎浆中加入氯化钙溶液，将pH调节至第一pH区间，在35℃-45℃范围进行保温。
其中，结合具体实施场景，所述氯化钙溶液的可以为1-5％的氯化钙溶液，在浸泡中氯化钙中钙离子可以激活胰激肽原酶，而且钙离子对糜蛋白酶起保护作用，抑制糜蛋白酶自溶；所述保温方式，可以选择水浴保温，将加入氯化钙溶液后的组织碎浆调节到合适的pH(例如pH值7)，保温2-4小时，每30分钟搅拌5分钟。
步骤103：过滤、浓缩：所述组织碎浆保温完毕后加入硅藻土，进行过滤处理，将得到的滤液1进行超滤浓缩处理，得到浓缩液。
其中，结合具体实施场景，所述超滤浓缩处理，使用的是10KD超滤膜；硅藻土为脱脂剂，效果好，操作简单。
步骤104：阴离子交换层析：将所述浓缩液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液1与洗脱流出液1。
其中，结合具体实施场景，所述阴离子交换层析柱的层析介质为QSepharose FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M-0.2M HAc-NaAc溶液，平衡液pH5-6，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.1M-0.2MHAc-NaAc+0.4M-0.6M NaCl溶液，洗脱液pH5-6。
步骤105：疏水层析：将所述洗脱流出液1上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液2，所述洗脱流出液2依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液2，将所述滤液2冻干，得到高纯度胰激肽原酶。
其中，结合具体实施场景，所述疏水层析柱的层析介质为Phenyl Sepharose6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB+1.2M(NH4)2SO4溶液，平衡液pH6-8，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.2M(NH4)2SO4溶液，洗脱液pH6-8。
步骤106：阳离子交换层析：将所述过柱液1上样至平衡处理后的阳离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液2，和洗脱流出液3，将所述洗脱流出液3依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液3，将所述滤液3冻干，得的弹性酶。
其中，结合具体实施场景，所述阳离子交换层析柱的层析介质为SPSepharose6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB溶液，平衡液pH6-7，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.3M NaCl溶液，洗脱液pH6-7。
步骤107：亲和层析：将所述过柱液2上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液4，所述洗脱流出液4依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液4，将所述滤液4冻干，得高纯度糜蛋白酶。
其中，结合具体实施场景，所述亲和层析柱的层析介质为O-Anisidin-ACA-Sepharose，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M NaAc，平衡液pH6-7，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M NaAc+1.5M KCl溶液，洗脱液pH9-10。上述步骤中超滤除盐处理使用的是10KD超滤膜，膜过滤处理使用的是0.2微米除菌膜。
下面将结合具体实施场景，用具体实施例进一步对本发明提供的从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法进行详细说明。
实施例2
步骤201：组织搅碎：取1000克新鲜冷冻猪除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。
步骤202：激活、浸泡：加入5升3％的氯化钙溶液，调pH为7.0，搅拌,放入40℃水浴中保温4小时。
步骤203：过滤、浓缩：保温完毕后加5％硅藻土，进行过滤，所得滤液1用10KD超滤膜超滤得300mL溶液。
步骤204：Q Sepharose FF阴离子交换层析：离子交换层析柱用平衡液(0.1M HAc-NaAc，pH5)平衡后，将上述超滤后的浓缩液调PH为5，以5ml/min流速上柱，收集过柱液1，用洗脱液(0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH5)进行洗脱，收集洗脱流出液1。
步骤205：Phenyl Sepharose 6FF疏水层析：将洗脱流出液1经过平衡好的PhenylSepharose 6FF疏水层析柱，用洗脱液(0.02M PB+0.2M(NH4)2SO4，pH7)进行洗脱，收集洗脱流出液2，将洗脱流出液2用10KD超滤滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液2冻干得到高纯度胰激肽原酶。
步骤206：SP Sepharose 6FF阳离子交换层析：将过柱液1调pH为6.5，以5ml/min流速通过已平衡好的SP Sepharose 6FF阳离子交换层析柱，收集上样过柱液2，用洗脱液(0.02M PB+0.3M NaCl，pH6)洗脱，收集洗脱流出液3，将洗脱流出液3用10KD超滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液3冻干得到弹性酶。
步骤207：O-Anisidin-ACA-Sepharose亲和层析：O-Anisidin-ACA-Sepharose介质合成，装柱，用平衡液(0.1M NaAc，pH7.5)平衡，过柱液2调pH为7.5，用洗脱液(0.02M NaAc+1.5M KCl，pH8.5)洗脱，收集洗脱流出液4，将洗脱流出液4用10KD超滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液4冻干得到高纯度糜蛋白酶。
实施例3
步骤301：组织搅碎：取10千克新鲜冷冻猪除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。
步骤302：激活、浸泡：加入50升3％的氯化钙溶液，调PH为7.0，搅拌,放入40℃水浴中保温4小时。
步骤303：过滤、浓缩：保温完毕后加5％硅藻土，进行过滤，所得滤液1用10KD超滤膜超滤得1000ml溶液。
步骤304：Q Sepharose FF阴离子交换层析：离子交换层析柱用平衡液(0.1M HAc-NaAc，pH5)平衡后，将上述超滤后的浓缩液调PH为5，以5ml/min流速上柱，收集过柱液1，用洗脱液(0.1M HAc-NaAc+0.5M NaCl，pH5)进行洗脱，收集洗脱流出液1。
步骤305：Phenyl Sepharose 6FF疏水层析：将洗脱流出液1经过平衡好的PhenylSepharose 6FF疏水层析柱，用洗脱液(0.02M PB+0.2M(NH4)2SO4，pH7)进行洗脱，收集洗脱流出液2，将洗脱流出液2用10KD超滤滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液2冻干得到高纯度胰激肽原酶。
步骤306：SP Sepharose 6FF阳离子交换层析：将过柱液1调pH为6.5，以5ml/min流速通过已平衡好的SP Sepharose 6FF阳离子交换层析柱，收集上样过柱液2，用洗脱液(0.02M PB+0.3M NaCl，pH6)洗脱，收集洗脱流出液3，将洗脱流出液3用10KD超滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液3冻干得到弹性酶。
步骤307：O-Anisidin-ACA-Sepharose亲和层析：O-Anisidin-ACA-Sepharose介质合成，装柱，用平衡液(0.1M NaAc，pH7.5)平衡，过柱液2调pH为7.5，用洗脱液(0.02M NaAc+1.5M KCl，pH8.5)洗脱，收集洗脱流出液4，将洗脱流出液4用10KD超滤膜超滤除盐后，经0.2微米膜过滤，所得滤液4冻干得到高纯度糜蛋白酶。
其中，具体实施例2和实施例3产品检测结果如图2所示。由此可见，本发明提供的以动物胰脏为原料，经组织绞碎，激活，浸泡，过滤，超滤，阴离子交换层析，疏水层析获得高纯度胰激肽原酶；阴离子交换层析过柱液经阳离子交换层析获得弹性酶；阳离子交换层析过柱液经亲和层析获得高纯度糜蛋白酶。该方法实现胰激肽原酶，糜蛋白酶，弹性酶三酶联产且操作简便、产品纯度高、减少了资源浪费。
如图3所示，上述实施例中使用的亲和层析介质O-Anisidin-ACA-Sepharose介质合成包括如下步骤：
步骤401：活化：将载体Sepharose4B转入二氧六环有机相；将羰基二咪唑溶于所述二氧六环中，同所述载体Sepharose4B混合进行反应；将反应后的产物的置换到水相中，得到活化的载体介质。
步骤402：接臂：将所述活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中，进行缩合反应，得到氨基己酸-琼脂糖。
步骤403：偶联：将所述氨基己酸-琼脂糖与邻氨基苯甲醚发生偶联反应，得到所述O-Anisidin-ACA-Sepharose介质。
下面将结合实施例2的具体实施场景对O-Anisidin-ACA-Sepharose介质合成步骤作进一步详细说明。
活化：取1升载体Sepharose4B，在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；依次用浓度递增的二氧六环置换，逐渐转入二氧六环有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再依次用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中；得到活化的载体介质。
接臂：将活化的载体介质加入到氨基己酸溶液(1千克氨基己酸溶于1升pH9.3碳酸盐溶液)中30℃搅拌，进行缩合反应，得到氨基己酸-琼脂糖；
偶联：上述氨基己酸-琼脂糖加入45克邻氨基苯甲醚，在25℃条件下，反应6小时，得O-Anisidin-ACA-Sepharose介质。
通过O-Anisidin-ACA-Sepharose在层析过程中苯甲醚结构与糜蛋白酶中丝氨酸蛋白酶结构亲和，达到提取纯化糜蛋白酶作用。苯甲醚是丝氨酸蛋白酶的广谱抑制剂，糜蛋白酶和它的抑制剂有非常专一的亲和性。另外，配基的价格比较便宜，降低了生产成本，提高了产品质量。因此配基亲和的方法对于大规模分离纯化糜蛋白酶有很大优势。
上述实施例的具体实施场景仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。上述序号仅仅为了描述，不代表实施场景的优劣。任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中，文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范作用。如非另行定义，文中所用的所有专业和科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。
以上公开的仅为本发明实施例的具体实施场景，并非是对本发明作其它形式的限制，本发明实施例并非局限于此。任何熟悉本领域的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种从动物胰脏中提取三种酶的工艺方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将动物胰脏进行绞碎处理，得到组织碎浆；
(2)在所述组织碎浆中加入氯化钙溶液，将pH调节至第一pH区间，在35℃-45℃范围进行保温；
(3)所述组织碎浆保温完毕后加入硅藻土，进行过滤处理，将得到的滤液1进行超滤浓缩处理，得到浓缩液；
(4)将所述浓缩液上样至平衡处理后的阴离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液1与洗脱流出液1；
(5)将所述洗脱流出液1上样至平衡处理后的疏水层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液2，所述洗脱流出液2依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液2，将所述滤液2冻干，得到高纯度胰激肽原酶；
(6)将所述过柱液1上样至平衡处理后的阳离子交换层析柱，进行洗脱处理，收集过柱液2，和洗脱流出液3，将所述洗脱流出液3依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液3，将所述滤液3冻干，得到弹性酶；
(7)将所述过柱液2上样至平衡处理后的亲和层析柱，进行洗脱处理，收集洗脱流出液4，所述洗脱流出液4依次进行超滤除盐处理，膜过滤处理，得到滤液4，将所述滤液4冻干，得到高纯度糜蛋白酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中：
所述氯化钙溶液浓度为1-5％的氯化钙溶液，所述第一pH区间包括pH值7，所述保温时间为2-4小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(4)中：
所述阴离子交换层析柱的层析介质为Q Sepharose FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M-0.2M HAc-NaAc溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.1M-0.2M HAc-NaAc+0.4M-0.6M NaCl溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中：
所述疏水层析柱的层析介质为Phenyl Sepharose 6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB+1.2M(NH4)2SO4溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.2M(NH4)2SO4溶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(6)中：
所述阳离子交换层析柱的层析介质为SP Sepharose 6FF，所述平衡处理中使用的平衡液为0.02M PB溶液，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M PB+0.3M NaCl溶液。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(7)中：
所述亲和层析柱的层析介质为O-Anisidin-ACA-Sepharose，所述平衡处理中使用的平衡液为0.1M NaAc，所述洗脱处理中使用的洗脱液为0.02M NaAc+1.5M KCl溶液。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩处理使用的是是10KD超滤膜，所述超滤除盐处理使用的是10KD超滤膜，所述膜过滤处理使用的是0.2微米除菌膜。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述O-Anisidin-ACA-Sepharose由以下方法制备：
将载体Sepharose4B转入二氧六环有机相；
将羰基二咪唑溶于所述二氧六环中，同所述载体Sepharose4B混合进行反应；
将反应后的产物置换到水相中，得到活化的载体介质；
将所述活化的载体介质加入到氨基己酸溶液中，进行缩合反应，得到氨基己酸-琼脂糖；
将所述氨基己酸-琼脂糖与邻氨基苯甲醚发生偶联反应，得到所述O-Anisidin-ACA-Sepharose介质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将将载体Sepharose4B转入二氧六环有机相，具体为：
将所述载体Sepharose4B充分清洗后，再依次用浓度递增的二氧六环溶液置换到无水二氧六环中。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将反应后产物置换到水相中，具体为：
将反应后的产物依次用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中。
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